Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Оптимизация гемотрансфузионной терапии в онкогематологии с использованием физико-химических методов обработки тромбоконцентратов

На правах рукописи

ОГОРОДНИКОВА Мария Дмитриевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ГЕМОТРАНСФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОБРАБОТКИ ТРОМБОКОНЦЕНТРАТОВ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 5 ОКТ 2012

Москва, 2012

005053754

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении «Главный военный клинический госпиталь имени академика Н.Н.Бурденко Министерства обороны Российской Федерации»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Олег Анатольевич Рукавицын

доктор биологических наук Татьяна Николаевна Заботина

Официальные оппоненты:

Ольга Андреевна Майорова доктор медицинских наук, профессор,

заведующая кафедрой поликлинической педиатрии Московского факультета ГБОУ РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Джелил Шевкетович Османов доктор медицинских наук, профессор,

заведующий отделением химиотерапии гемобластозов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медико-хирургический центр имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « » _ 2012 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д.208.050.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 117198, г. Москва, ул. Саморы Машела, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ ФНКЦ ДГОИ и на сайте wwvv.niidg.ru

Автореферат разослан « /»^^^2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чернов Вениамин Михаилович

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Трансфузии донорских тромбоцитов применяются у онкогематологических пациентов с тромбоцитопенией, индуцированной проведением интенсивной химиотерапии, с целью профилактики жизнеугрожающих геморрагических осложнений у контингента с высоким риском их развития, а также для осуществления гемостатического эффекта у пациентов с уже имеющимся геморрагическим синдромом [Apelseth Т.О., 2010; Perrotta P.L., 2007; Stanworth S.J., 2004; McClelland В., 2001].

Важной задачей трансфузионной медицины является совершенствование системы обеспечения безопасности компонентов крови, в том числе донорских тромбоцитов. Проводимые на сегодняшний день мероприятия по селекции доноров, лабораторному скринингу, методикам заготовки компонентов крови не гарантируют полной защиты реципиента от различных, ассоциированных с гемотрансфузиями, осложнений.

Гемотрансфузионные осложнения разделяют на неиммунологические и иммунологические [McCullough J., 2005]. Основная группа неиммунологических осложнений представлена гемотрансмиссивными инфекциями (вирусными, бактериальными, протозойными).

К иммунологическим осложнениям относятся гемолитические реакции (острые и отсроченные), аллергические реакции различной степени тяжести, а также широкий спектр эффектов, обусловленных контаминацией компонентов крови аллогенными лейкоцитами. Лейкоцитассоциированными иммунологическими осложнениями являются: фебрильные негемолитические трансфузионные реакции (ФНТР), HLA-аллоиммунизация и формирование рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов, реакция трансплантат против хозяина, ассоциированная с трансфузиями (РТПХ-АТ), отторжение трансплантата и иммуномодуляция. Также с присутствием лейкоцитов в компонентах крови связана передача внутриклеточных лимфотропных вирусов (цитомегаловируса - CMV, Эпштейн-Барр вируса -

ЕВУ, Т-лимфотропного вируса человека типа 1 — НТЪ V-1) [МсСиИои^ I., 2005; РороУБку М., ес1. 2001; НиБеЬекк А., 2009].

В этой связи актуален поиск оптимальной технологии обработки компонентов крови с целью минимизации риска гемотрансфузионных реакций.

На сегодняшний день в России стала доступна технология фотохимической обработки (ФХО) с применением ультрафиолета (УФ) в сочетании с. фотосенсибилизатором для тромбоцитсодержащих сред, при использовании которой происходит неизбирательная «сшивка» цепей ДНК или РНК. Реализация подобного эффекта открывает новые перспективы в достижении большей безопасности гемотрансфузий - инактивацию патогенов различной природы и устранение вероятности развития реакций, связанных с аллогенными лейкоцитами за счет блока генетического материала резидуальных лейкоцитов в компонентах крови [РороУБку М., ес1. 2001]. Новая технология может быть альтернативой гамма-облучению компонентов крови, которое много лет было «золотым стандартом» для профилактики РТПХ-АТ.

Поскольку тромбоциты являются чрезвычайно чувствительными к своему микроокружению, представляют интерес исследования индукции их апоптоза и активации в результате физико-химических воздействий. Технологии физико-химической обработки компонентов крови наряду с эффективной инактивацией патогенов должны обеспечивать максимальное сохранение функциональных свойств целевых клеток крови при трансфузиях. Поэтому необходимо оценить клиническую эффективность концентратов тромбоцитов, обработанных различными методами.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить возможности применения физико-химических методов обработки донорских тромбоконцентратов (ТК) для оптимизации гемотрансфузионной терапии в онкогематологии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1) Изучить динамику экспрессии маркеров активации и апоптоза донорских тромбоцитов в результате процесса заготовки.

2) Изучить влияние ФХО и гамма-облучения в дозе 25 Гр на экспрессию маркеров активации и апоптоза тромбоцитов в ТК на разных сроках хранения.

3) Изучить эффекты воздействия ФХО и гамма-облучения в дозе 25 Гр на контаминирующие ТК лимфоциты: динамику экспрессии маркера апоптоза лимфоцитов и их субпопуляционной структуры на разных сроках хранения.

4) Провести сравнительную оценку клинической эффективности трансфузий ТК, обработанных фотохимическим методом, гамма-облученных и не подвергавшихся воздействиям.

5) Исследовать частоту возникновения постгрансфузионных реакций при использовании донорских концентратов тромбоцитов, фотохимически обработанных, гамма-облученных и не подвергавшихся обработке.

6) Оценить значение метода проточной цитометрии в исследовании донорских ТК.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в России было проведено сравнительное исследование, посвященное оценке влияния двух высокотехнологичных методик обработки донорских тромбоцитов - фотохимической и радиационной на in vitro показатели активации (Р-селекгин) и апоптоза (Annexin V) тромбоцитов, а также на клинико-лабораторные показатели эффективности их трансфузии пациентам с онкогематологическими заболеваниями.

Впервые выполнено экспериментальное исследование, посвященное изучению и сравнению влияния ФХО и гамма-облучения ТК на контаминирующие аллогенные лейкоциты.

Впервые в нашей стране был использован метод проточной цитометрии для оценки влияния физико-химических факторов предтрансфузионной обработки на донорские ТК.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

При изучении маркеров активации и апоптоза тромбоцитов, как предикторов посттрансфузионной эффективности, было установлено, что ФХО не оказывает негативного воздействия на донорские ТК. Клинические исследования показали, что фотохимически обработанные аферезные тромбоконцентраты (ФХО АТК) сохраняют лечебный потенциал и по эффективности не уступают гамма-облученным и необработанным ТК. Таким образом, полученные результаты проведенного исследования формируют дополнительные возможности для оптимизации гемостатической терапии в онкогематологии.

Оценка маркеров активации и апоптоза тромбоцитов с помощью проточной цитометрии может быть использована как дополнительный критерий контроля качества ТК, предназначенных для трансфузии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1) ФХО АТК равноценны гамма-облученным и необработанным аферезным тромбоконцентратам (АТК), как на основании in vitro маркеров жизнеспособности и функциональности тромбоцитов, так и на основании показателей их клинической эффективности, и могут применяться для адекватной гемостатической терапии онкогематологических пациентов.

2) ФХО и гамма-облучение ТК в дозе 25 Гр не приводят к индукции апоптоза CD45+ клеток в течение 5 суток хранения ТК и не оказывают существенного влияния на субпопуляционную структуру контаминирующих лимфоцитов. Наиболее чувствительными к действию физико-химической обработки являются NK-клетки.

3) Изменения in vitro показателей функциональности и жизнеспособности тромбоцитов происходят как в результате процессов заготовки, так и в течение хранения, и наиболее выражены на 5-е сутки.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы работы доложены на симпозиумах и конференциях: Конференция «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи», 29-30 марта 2010 г., Москва.

15th Congress of the European Hematology Association, 10-13 июня, 2010 г., Барселона, Испания.

37th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, 3-6 апреля 2011 г., Париж, Франция.

21st Regional Congress of the International Society of Blood Transfusion, 18-22

июня, 2011 г., Лиссабон, Португалия.

Конгресс гематологов России, 2-4 июля 2012 г., Москва

32nd International Congress of the International Society of Blood Transfusion, 7-12

июля, 2012 г., Канкун, Мексика

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 10 тезисов, 6 из которых в иностранных изданиях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 16 рисунками. Представлены ссылки на 165 литературных источника (7 отечественных и 158 зарубежной литературы).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пациенты

Работа проводилась на базах Гематологического центра ФБУ «Главный военный клинический госпиталь имени им. ак. Н.Н. Бурденко Минобороны России» и отделений ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. В исследование были включены 54 онкогематологических пациента с постцитостатической тромбоцитопенией. Проводили сравнительную оценку клинико-лабораторных показателей эффективности трансфузий и частоту развития острых постгрансфузионных реакций ФХО АТК, гамма-облученных и необработанных АТК. Всего было проанализировано 163 трансфузии совместимых по системе АВО АТК, которые проводились в течение 48 часов после заготовки ТК. Получение ТК и пулов тромбоцитов

Все ТК для клинического использования были получены в идентичных условиях от здоровых доноров методом афереза на сепараторе клеток крови Amicus («Fenwal Inc.», США) с автоматизированным добавлением в конечный продукт раствора InterSol («Fenwal Inc.», США). От одного донора получали двойную терапевтическую дозу тромбоцитов: 5,0-7,0x10".

Пулы тромбоцитов для экспериментального исследования, каждый от 5 доноров (идентичных по системе АВО и Rh-фактору), получали из лейкотромбослоя (ЛТС) путем поэтапного фракционирования цельной крови на центрифуге.

Фотохимическая обработка тромбоцитов

ФХО пулов и АТК выполнялась на аппарате INTERCEPT Blood System («Cerus Corporation», США), с применением фотосенсибилизатора Амотосалена НС1 и длинноволнового ультрафиолета А (УФА) - 320-400 нм. Гамма облучение тромбоцитов

Гамма-облучение ТК выполняли на установке Beobeam 8000 («BEBIG Isotopen-und Medizinntechnik GmbH», Германия) с радиоактивным

источником mCs в дозе 25 Гр на все участки объема ТК, в течение 24 ч после

тромбоцитафереза.

Подсчет остаточных лейкоцитов

Подсчет остаточных лейкоцитов в ТК осуществляли с помощью микроскопа в камере Nageotte («Biotrans GmbH», Германия).

Подсчет тромбоцитов в АТК и пулах

Подсчет количества тромбоцитов в АТК и пулах выполняли с использованием фазово-контрастного микроскопа в камере Горяева.

Исследование тромбоконцентратов методом проточной цитомерии

In vitro исследование АТК и пулов тромбоцитов проводили методом проточной цитометрии на основании маркеров апоптоза (экстернализации фосфатидилсерина - PS, или связывания Annexin V) и активации (экспрессии Р-селектина, или CD62P) тромбоцитов. Для определения экспрессии Р-селектина на поверхности тромбоцитов использовали моноклональные антитела (МКА), коньюгированные с фикоэритрином. - IOTest® CD62P-PE («Beckman Coulter», США). Экстернализацию PS на поверностной мембране тромбоцитов выявляли с помощью ANNEXES! V-FITC Kit (Apoptosis Detection Kit, «Beckman Coulter», США). Для выделения контаминирующих лимфоцитов и изучения их иммунофенотипа использовали МКА («Beckman Coulter», США) к поверхностным дифференцировочным антигенам лимфоцитов периферической крови человека, коньюгированные с флуорохромами FITC, РЕ и РЕ Су-7. Также с помощью ANNEXIN V- FITC Kit (Apoptosis Detection Kit, «Beckman Coulter», США) определяли маркер апоптоза на лимфоцитах. Проточно-цитометрический анализ

Проточно-цитометрический анализ проводили на 6-ти параметровом 2-лазерном проточном цитометре аналитического типа FACSCalibur («BD Biosciences», США). Сбор и анализ материала проводили с использованием коммерческого программного обеспечения BD CellQuest™PRO software.

Клетки анализировали на основе параметров, измеряемых проточной цитометрией. Выделение «гейта» клеток для анализа осуществляли в двухмерной системе координат. В дальнейшем применяли гистограммный анализ интенсивности флуоресценции.

Экспрессию маркеров активации (Р-селектина или CD62P) и апоптоза (PS или связывание Annexin V) тромбоцитов исследовали в следующих видах образцов: периферической крови (ПК) здоровых доноров до процедуры тромбоцитафереза и кроводачи; необработанных, гамма-облученных и фотохимически обработанных образцах АТК и пулов тромбоцитов на 1-е и 5-е сутки хранения. Контаминирующие лимфоциты исследовали в образцах пулов тромбоцитов, подвергавшихся ФХО, гамма-облучению и необработанных - на 1 -е и 5-е сутки хранения. Параметры клинической эффективности

После переливания ТК проводилось мониторирование пациентов, оценивали клинико-лабораторные показатели эффективности трансфузии: абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ) через 24 часа после переливания, скорректированный прирост тромбоцитов (СНГ) через 24 часа после переливания, продолжительность межтрансфузионных интервалов (МТИ), количество трансфузий на одного пациента, гемостатический эффект и динамику геморрагического синдрома (2 раза в сутки), а также частоту острых посттрансфузионных реакций.

АПТ через 24 часа вычисляли как разность между посттрансфузионным значением тромбоцитов через 24 часа после переливания АТК и уровнем тромбоцитов пациента перед трансфузией. СПТ через 24 часа после трансфузии вычисляли по формуле:

АПТ (109/л) х Площадь поверхности тела (м2)

СПТ = -------------------------------------------------------------

Доза перелитых тромбоцитов (10 )

и выражали в расчетных единицах (РЕ).

Общий анализ крови пациентов выполняли на гематологическом анализаторе Advia 60 («Siemens Healthcare Diagnostics», США). Статистический анализ полученных данных

Анализ данных проводили с помощью программного пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние физико-химических факторов заготовки, хранения и обработки тромбоконцентратов на маркеры активации и апоптоза тромбоцитов

Маркеры активации и апоптоза тромбоцитов являются важными in vitro показателями качества ТК: предикторами восстановления, жизнеспособности и функциональности тромбоцитов in vivo [Rinder Н.М., et al., 1991; Cookson P., et al., 2010; Picker S.M., et al., 2009].

Анализировали влияние способов заготовки (аппаратного тромбоцитафереза и получение пулов тромбоцитов из ЛТС цельной крови) и способов обработки (гамма-облучения в дозе 25 Гр и ФХО) ТК на экспрессию маркеров активации (Р-селектин) и апоптоза (PS) на тромбоцитах в 1-е и 5-е сутки хранения. Всего были исследованы 40 АТК и 16 пулов тромбоцитов.

Полученные данные по изучению экспрессии Р-селектина и PS продемонстрировали низкий уровень активации и апоптоза тромбоцитов ПК здоровых доноров перед процедурами кроводач и тромбоцитаферезов. При исследовании АТК и пулов тромбоцитов в 1-е сутки хранения после заготовки было выявлено статистически значимое увеличение экспрессии этих маркеров на поверхности тромбоцитов.

Экспрессия Р-селектина и PS в необработанных АТК, исследованных в 1-е сутки хранения увеличилась в 5,3 и в 1,6 раза соответственно по отношению к показателям ПК доноров перед процедурой. Процесс

приготовления пулов привел к еще большей степени активации и апоптоза тромбоцитов: количество СБ62+ тромбоцитов увеличилась в 6 раз, а экспрессирующих РБ в 2,5 раза (табл. 1). Следовательно, процесс приготовления пулов обладает более выраженной индукторной активностью в плане инициации апоптоза тромбоцитов, по сравнению с автоматическим тромбоцитаферезом.

Таблица 1. Влияние процесса заготовки на уровень экспрессии СБ62Р и РБ на тромбоцитах

Маркеры Периферическая кровь (ПК) доноров Тромбоциты после заготовки (1-е сутки)

Пулы (п=80) АТК (п=40) Пулы (п=16) АТК (п=40)

СБ62Р(%) М±8Б 3,07 ±0,64 3,18+0,58 18,23±3,7 * 16,96+5,19 **

РБ(%) М±БО 5,11+2,01 4,85+2,05 12,76+4,92 * 7,86+3,49

* р<0,05 для ПК доноров пулов уэ пулы , ** р<0,05 для ПК доноров АТК УБ АТК

При проведении анализа результатов экспрессии маркера активации и апоптоза на тромбоцитах в АТК не отмечено влияния ФХО и гамма-облучения на показатели этих маркеров в 1-е сутки после заготовки и обработки. Было зафиксировано статистически значимое увеличение экспрессии Р-селектина к 5-м суткам хранения во всех группах образцов: в 2,3 раза в ФХО образцах АТК, в 2 раза в гамма-облученных и в 1,9 раза в необработанных; статистически достоверное увеличение доли апоптотически-измененных тромбоцитов к 5-м суткам в ФХО образцах АТК в 2,3 раза, в гамма-облученных в 1,7 и в необработанных в 1,9 раз; более высокая степень индукции активации и апоптоза при хранении в течение 5 суток в ФХО АТК (табл. 2). Это свидетельствует о важной роли фактора времени хранения для качества ТК.

Таблица 2. Влияние ФХО, гамма облучения 25 Гр и хранения (5 суток) на экспрессию СБ62Р и РБ на тромбоцитах в АТК (п=40)

Маркеры Необработанные АТК у-облученные АТК ФХО АТК

1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки

СБ62Р, (%) МіББ* 16,96± 5,19 32,22± 7,63 * 16,13± 5,74 33,77± 8,19 * 15,26± 4,36 35,08± 5,86 *

Рв, (%) 7,86± 3,49 14,92± 5,14 * 8,39± 2,50 13,86± 4,29 * 7,79± 2,96 18,18± 5,10*

*р<0,05 1-е сутки уб 5-е сутки

Был также проведен анализ динамики количественного содержания тромбоцитов в АТК и пулах тромбоцитов в ходе хранения и в результате физико-химической обработки.

Выявлено небольшое снижение содержания тромбоцитов в результате процедуры ФХО в 1-е сутки хранения, что объясняется их механическими потерями в ходе процедуры, а также достоверное снижение количества тромбоцитов, как в фотохимически обработанных и гамма-облученных, так и в необработанных образцах к 5-м суткам хранения (табл. 3).

Таблица 3. Количество тромбоцитов в АТК и пулах

Тромбоциты Без обработки Г-облучение ФХО

1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки

АТК ,(хЮи), КШО, п=40 3,05± 0,25 2,86± 0,2* 2,99± 0,26 2,83± 0,22* 2,84± 0,18 2,67± 0,16*

Пул (хЮи),М±8В п=16 2,45± 0,24 2,25± 0,25* 2,41± 0,32 2,27± 0,23* 2,30± 0,25 2,19± 0,24*

*р<0,05 1-е сутки уб 5-е сутки

Анализ результатов исследования пулов тромбоцитов показал: ФХО и гамма-облучение пулов не влияют на экспрессию Р-селектина и РБ в 1-е сутки после заготовки и обработки (табл. 4).

Таблица 4. Влияние ФХО, гамма-облучения и хранения 5 суток на экспрессию СБ62Р и РБ тромбоцитов пулов (п=16)

Маркеры Необработанные пулы тромбоцитов у-облученные пулы тромбоцитов ФХО пулы тромбоцитов

1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки

СВ62?, % М±8Б* 18,23± 3,7 37,36± 5,45* 17,76± 3,53 38,53± 6,67* 16,92± 3,83 38,96± 5,44*

РБ, % М±8Б 12,76± 4,92 21,77± 5,2* 13,26± 2,47 19,33± 3,31* 13,36± 4,0 23,58± 3,73*

*р<0,05 1-е сутки уб 5-е сутки

Наблюдалось статистически значимое увеличение количества активированных и вошедших в апоптоз тромбоцитов к 5-м суткам хранения в фотохимически обработанных, гамма-облученных и необработанных образцах пулов, причем с одинаковой степенью во всех группах.

Был проведен сравнительный анализ результатов исследования АТК и пулов тромбоцитов. При сравнении количества активированных тромбоцитов в образцах пулов и АТК, подвергшихся различным видам обработки, в 1-е сутки не было выявлено статистически достоверных отличий (р=0,4 для необработанных, р=0,33 для гамма-облученных, р=0,36 для фотохимически обработанных образцов). К 5-м суткам хранения, уровень экспрессии Р-селектина на тромбоцитах в гамма-облученных и фотохимически обработанных образцах пулов был выше по сравнению с соответствующими группами образцов АТК, хотя статистические различия между группами имели лишь тенденцию к достоверности (р=0,09 для гамма-облученных и р=0,08 для ФХО АТК и пулов тромбоцитов), группы необработанных образцов АТК и пулов тромбоцитов достоверно не отличались (р=0,11).

Количество апоптотически измененных тромбоцитов, оцененное в 1-е сутки после заготовки, было значительно выше (р=0,01) в необработанных пулах тромбоцитов, приготовленных из ЛТС цельной крови, чем в АТК. Уровень экспрессии маркера апоптоза РБ на тромбоцитах был также достоверно выше во всех других изученных группах образцов пулов по сравнению с соответствующими группами образцов АТК: гамма-облученных (р=0,0003) и фотохимически обработанных (р=0,002) в 1-е сутки хранения, а также в необработанных (р=0,007), гамма-облученных (р=0,002) и ФХО (р=0,01) образцах пулов к 5-м суткам хранения.

Оценка влияния методов физико-химической обработки на контаминирующие лейкоциты

Физико-химические методы обработки ТК направлены на блокирование генетического материала клеток-патогенов, в том числе контаминирующих лейкоцитов. При этом, в зависимости от степени повреждения ДНК, возможно полное прекращение экспрессия генов и запуск процесса апоптоза клеток [ЛУоШ^й Б., 2001; ЯоЬаск 1.0., е! а1„ 2003].

С целью получения практической возможности выделения достаточного количества контаминирующих лимфоцитов и исследования влияния на них физико-химических факторов использовали экспериментальную модель ТК в виде пулов тромбоцитов (п=16). Содержание лейкоцитов в приготовленных пулах варьировало в пределах от 0,9х108 до 7,1х108, что соответствовало экспериментальной задаче.

Оценивали действие гамма-облучения и ФХО на контаминирующие лимфоциты в течение всего срока хранения ТК. Определяли: относительное (%) содержание СБ45+ клеток и маркер их апоптоза - экстернализацию фосфатидилсерина РБ (связывание Аппехт V).

В 1-е сутки хранения после ФХО и гамма-облучения не было выявлено достоверного снижения (р=0,26 и р=0,77 соответственно) количества СБ45+

клеток и статистически значимого изменения (р=0,78 для ФХО и р=0,94 для гамма-облученных) уровня экспрессии маркера апоптоза на них по отношению к таковому до обработки (табл. 5).

Таблица 5. Влияние физико-химических методов обработки на контаминирующие лейкоциты в пулах тромбоцитов (п=16)

Парам. Оценки Без обработки у-облучение ФХО

1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки

СБ45+ (%) М±БО 1,44± 0,92 1,27± 0,99 1,50± 0,95 1,18± 1,0* 1,20± 0,87 1,29± 1,05

РБ (%) М±8Б 10,32± 3,79 10,84± 2,81 10,34± 3,95 13,22± 3,16* 10,62± 4,8 12,63± 4,95

*р< 0,05 1-е сутки уб 5-е сутки

Установлено, что хранение необработанных пулов тромбоцитов, а также их ФХО обработка не приводят к запуску апоптотической гибели СБ45+ клеток (уменьшению количества и увеличению экспрессии на них Р8) в течение 5-ти суток, в то время, как гамма-облучение в дозе 25 Гр к 5-му дню хранения вызывает статистически достоверное (р=0,04) снижение числа контаминирующих СЭ45+ клеток и повышение (р=0,007) экспрессии маркера апоптоза на их поверхности (табл. 5).

При изучении субпопуляционной структуры контаминирующих лимфоцитов было выявлено, что гамма-облучение в дозе 25 Гр и ФХО не привели к достоверному изменению количества Т-лимфоцитов ни в 1-е сутки хранения (р=0,68 и р=0,37 соответственно), ни к 5-м суткам хранения (р=0,68 и р=0,86 соответственно).

После ФХО при исследовании в 1-е сутки не было выявлено достоверного (р=0,14) изменения уровня В-лимфоцитарного маркера, но определялось снижение количества Ж-клеток, при этом, статистические различия имели лишь тенденцию к достоверности (р=0,05). Гамма-облучение

в 1-е сутки хранения не привело к статистически значимому изменению содержания В-лимфоцитов (р=0,11) и МС-клеток (р=0,11) клеток в образцах. Хранение необработанных образцов до 5-ти суток не вызвало достоверных изменений процентного содержания В-лимфоцитов (р=0,17) и МС-клеток (р=0,59). К 5-м суткам после ФХО (по сравнению с необработанными образцами в 1-е сутки) наблюдалось достоверное (р=0,007) относительное увеличение доли СБ 19+ лимфоцитов (табл. 6).

При оценке результатов исследования иммунофенотипа лимфоцитов в обработанных образцах пулов тромбоцитов на 5-е сутки по сравнению с необработанными образцами в 1-е и 5-е сутки хранения, было выявлено: статистически достоверное снижение содержания СШ6+С056+ клеток к 5-му дню хранения в группе гамма-облученных образцов (р=0,01 и 0,03) и в группе фотохимически обработанных образцов (р=0,008 и 0,02).

Таблица 6. Влияние физико-химической обработки и хранения 5 суток на субпопуляции лимфоцитов (п=16) в пулах тромбоцитов

Субпопуляц ИИ лимфоцитов Без обработки у-облучение ФХО

1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки 1-е сутки 5-е сутки

СБЗ+, % М+ЗБ 59,06+ 8,75 58,63± 6,31 58,3+ 9,75 59,47+ 6,42 60,87+ 9,65 61,16+ 6,46

СБ 19+, % М+ЯО 20,3+ 7,79 21,77± 7,33 22,04± 7,24 24,36+ 3,83 22,83+ 5,52 23,94+ 6,74**

(СБ 16+ СБ56+), % М+БО 12,86+ 4,39 13,47± 6,46 10,18± 6,56 8,96+ 3,96** 10,07+ 3,8* 9,36+ 3,65**

*р=0,05 без обработки 1-е сутки уб ФХО 1-е сутки, **р<0,05 без обработки 1-е сутки уб ФХО/у-облучение 5-е сутки

Таким образом, гамма-облучение в дозе 25 Гр и ФХО с помощью амотосалена и УФА не вызывает существенного изменения иммунофенотипа лимфоцитов (структуры их субпопуляций), при этом, Т- и В- лимфоциты

являются самыми устойчивыми, а МС-клетки -наиболее чувствительными к физико-химическому воздействию обработки.

Клиническое применение фотохимически обработанных и гамма-облученных аферезных тромбоконцентратов у онкогематологических пациентов

В исследование были включены 54 онкогематологических пациента с тромбоцитопенией, обусловленной проведением, химиотерапии. Из них выделили три группы: пациентов получавших только ФХО АТК (п=23); пациентов, которым переливали только гамма-облученные АТК (п=10) и группу реципиентов необработанных АТК (п=21). Всего было проанализировано 163 трансфузии АТК: 66 трансфузий необработанных АТК; 61 трансфузия ФХО АТК; 36 гамма-облученных АТК. Внутри каждой группы было выделено по две подгруппы пациентов (относительно однородные по показаниям к трансфузии АТК): подгруппа пациентов с состояниями, связанными с повышенным потреблением тромбоцитов (ДВС, инфекция, лихорадка и др.) [Жибурт Е.Б., 2002], условно обозначенными как синдром потребления (СП), и подгруппа без СП. В группе, получивших необработанные АТК: 12 пациентов были без повышенного потребления тромбоцитов и получили 30 трансфузий, 9 пациентов с СП - 36 трансфузий; в группе больных, получавших ФХО АТК: 12 человек, не имели СП, получили 34 трансфузии, 11 пациентов с СП - 27; среди реципиентов гамма-облученных АТК: 6 больных не имели причин потребления тромбоцитов, а у 4 — было сочетание нескольких факторов повышенного расхода тромбоцитов, в этой группе провели 19 и 17 трансфузий соответственно.

Сравнивали эффективность трансфузий в подгруппах пациентов с факторами повышенного потребления тромбоцитов и без них внутри групп пациентов (табл. 7).

Таблица 7. Клинико-лабораторные показатели эффективности трансфузий АТК (ШвБ)

Необработанные ФХО АТК, у-облученные

АТК, перелитые перелитые АТК, перелитые

Показатель пациентам пациентам пациентам

без СП с СП без СП с СП без СП с СП

(п=30) (п=36) (п=34) (п=27) (п=19) (п=17)

24 ч АПТ 12,57± 5,06± 10,97± 6,04± 11,53± 4,35±

(х109/л) 4,31 4,65* 3,81 4,42* 2,9 6,36*

24ч СПТ 8,39± 3,18± 7,59± 3,96± 7,22± 2,87±

(РЕ) 3,02 3,1* 2,57 3,02* 1,9 4,63*

МТИ (дни) 1,77± 1,78± 1,68± 1,4± \,п± 1,54±

0,87 0,64 0,78 0,63*** 0,6 0,78

Трансфуз./ 2,5± 4± 2,8± 2,45± 3,2± 4,25±

пациент 1,3 0,87 1,4 1,91** 0,99 0,96

*р<0,05 без СП уэ с СП **р<0,05 и ***0,05<р<0,1 для необработанных АТК, перелитых пациентам с СП уэ ФХО АТК, перелитых пациентам с СП

Трансфузии АТК пациентам без повышенного потребления тромбоцитов и пациентам с СП проводили при одинаковой степени выраженности тромбоцитопении. Перелитые АТК содержали терапевтически адекватное количество (2,5-3,5х10п) тромбоцитов в дозе.

Во всех изученных группах больных (реципиентов фотохимически обработанных, гамма-облученных и необработанных АТК) уровень тромбоцитов, а также показатели АПТ и СПТ через 24 часа были достоверно более низкими в подгруппах пациентов с СП, по сравнению с этими же показателями в подгруппах без СП. Продолжительность МТИ и число трансфузий фотохимически обработанных и гамма-облученных АТК, проведенных каждому реципиенту, не отличались в выделенных подгруппах больных с СП и без него (табл. 7).

При сравнении клинико-лабораторных показателей эффективности трансфузий между подгруппами пациентов без СП, получавших необработанные, ФХО и гамма-облученные АТК, не было выявлено достоверных различий между исследованными подгруппами.

Также проводили сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей эффективности трансфузий между подгруппами пациентов с СП, получавших необработанные, ФХО и гамма-облученные АТК: при анализе полученных результатов также не было выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми подгруппами (табл. 7).

Полученные результаты позволяют говорить об адекватной выживаемости и жизнеспособности тромбоцитов in vivo и об отсутствии негативного влияния на эти показатели ФХО и гамма-облучения АТК.

Сравнивали гемостатический эффект трансфузий АТК, подвергавшихся различным методам обработки, в подгруппах пациентов без повышенного расхода тромбоцитов. Среди пациентов без СП, которым переливали только необработанные АТК, количество геморрагических элементов не увеличивалось после 28 (93%) трансфузий из 30, а тенденция к улучшению наблюдалась после 2 (7%) трансфузий. В подгруппе пациентов, получавших ФХО АТК, не наблюдалось нарастания геморрагического синдрома после 28 (82%) из 34 трансфузий, улучшение было зафиксировано после 6 (18%) трансфузий. Переливания гамма-облученных АТК были эффективными в 18 (95%) случаях из 19 и только в 1 (5%) случае наблюдалось увеличение количества петехий на коже и слизистой ротовой полости. Таким образом, все, кроме одной трансфузии, обеспечили гемостатический эффект независимо от способа приготовления АТК.

Далее оценивали гемостатический эффект от трансфузий в подгруппах пациентов с СП. В подгруппе больных с причинами повышенного расхода тромбоцитов, которым проводили переливания необработанных АТК, стабилизация геморрагического синдрома наблюдалась после 22 (61%) трансфузий, а геморрагический синдром сохранялся после 14 (39%) трансфузий. После 19 (70%) переливаний ФХО АТК геморрагический синдром не прогрессировал, а после 8 (30%) трансфузий гемостатический эффект не был достигнут. Положительный эффект наблюдался после 13 (76%) трансфузий гамма-облученных АТК пациентам с СП, в 4 (24%)

случаях эффекта не было получено. Достаточно высокий процент неэффективности однократного переливания АТК был обусловлен тяжестью состояния пациентов, в большинстве случаев имевших сочетание нескольких причин повышенного потребления тромбоцитов (табл. 8).

Таблица 8. Гемостатический эффект и посттрансфузионные реакции

Посттрансфузионный Эффект Необработанные АТК, перелитые пациентам ФХО АТК, перелитые пациентам у-облученные АТК, перелитые пациентам

без СП (п=30) с СП (п=36) без СП (п=34) с СП (п=27) без СП (п=19) с СП (п=17)

Улучшение или стабилизация 30 (100%) 22 (61%) 34 (100%) 19 (70%) 18 (95%) 13 (76%)

Нет эффекта, прогрессир. - 14 (39%) - 8 (30%) 1 (5%) 4 (24%)

Посттрансфузионные реакции 6 (9%) 5 (8,2%) 2 (5,5%)

Количество острых посттрансфузионных реакций во всех исследуемых группах пациентов не превышало 10%. При трансфузии необработанных АТК 6 (9%) процедур сопровождались осложнениями. В группе пациентов, получавших ФХО АТК было зафиксировано 5 (8,2%) случаев реакций на трансфузию), а в группе больных, которым переливали гамма-облученные АТК - 2 (5,5%) реакции (р=0,56 и р=0,42 при сравнении с необработанными АТК). Все реакции были легкой степени тяжести в виде ФНТР, в двух случаях с проявлением крапивницы.

Таким образом, нами установлено, что фотохимически обработанные АТК не отличаются от гамма-облученных и необработанных АТК на основании клинико-лабораторных показателей эффективности их трансфузий. ФХО АТК обеспечивают эффективную и безопасную трансфузионную поддержку и выполняют адекватную гемостатическую функцию у пациентов с тромбоцитопенией при выявленных уровнях

экспрессии маркеров активации (Р-селектина) и апоптоза (экстернализации РБ) на тромбоцитах.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что тромбоциты ПК доноров имеют низкий уровень экспрессии маркеров активации и апоптоза. Технологические процессы заготовки донорских тромбоцитов приводят к активации тромбоцитов и инициации их апоптоза. Процесс приготовления пулов обладает более сильной индукторной активностью в плане запуска апоптоза тромбоцитов, по сравнению с автоматическим тромбоцитаферезом.

2. Фотохимическая обработка ТК не приводит к увеличение уровня экспрессии маркеров активации (Р-селектина) и апоптоза (Аппехт V) на тромбоцитах, по сравнению с необработанными ТК в 1-е сутки хранения. На 5-е сутки наблюдается более высокий уровень экспрессии Р-селектина и Аппехт V на тромбоцитах в фотохимически обработанных АТК, чем в необработанных и гамма-облученных образцах.

3. Гамма-облучение в дозе 25 Грей ТК не влияет на уровень экспрессии маркеров активации (Р-селектина) и апоптоза (Аппехт V) тромбоцитов. Гамма-облученные ТК не отличаются от необработанных по количеству тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин и Аппехт V как в 1-е, так и на 5-е сутки хранения.

4. С045+ клетки идентифицируются как в необработанных, так и в гамма-облученных и фотохимически обработанных образцах донорских тромбоцитов на 5 сутки. Гамма-облучение и ФХО не вызывают существенного изменения субпопуляционной структуры контаминирующих лимфоцитов. Т- и В- лимфоциты являются самыми устойчивыми, а КЕС-клетки самьми чувствительными к физико-химическому воздействию.

5. Фотохимически обработанные АТК равноценны гамма-облученным и необработанным на основании клинико-лабораторных показателей эффективности трансфузий и гемостатической функции.

6. Трансфузии фотохимически обработанных и гамма-облученных АТК не приводят к увеличению числа острых посттрансфузионных реакций в исследованных группах пациентов по сравнению с группой пациентов, получавших трансфузии необработанных тромбоцитов.

7. Проточная цитометрия является адекватным методом оценки ультраструктурных изменений тромбоцитов и динамики субпопуляционной структуры аллогенных контаминирующих лимфоцитов, наступивших под влиянием физико-химических воздействий.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

М.Д. Огородникова, Т.Н. Заботина, А.А. Борунова, Н.Ю. Очеева, З.Г. Кадагидзе, А.Д. Онуфриевич, О.А. Рукавицын. Влияние фотохимической обработки тромбоконцентратов на активацию и апоптоз тромбоцитов. Тезисы научно-практической конференции «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи», 29-30 марта 2010 г., Москва. Лаборатория. - 2010. - № 2.- С. 14.

М.Д. Огородникова, Т.Н. Заботина, А.А. Борунова, Н.Ю. Очеева, З.Г. Кадагидзе, О.А. Рукавицын, А.Д. Онуфриевич. Активация и апоптоз тромбоцитов при гамма-облучении. Тезисы IX Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Нижний Новгород, 18-19 мая 2010. Российский биотерапевтический журнал 2010; №3/Том 9 С. 100.

M.Ogorodnikova, T.Zabotina, A.Borunova, N.Ocheeva, Z.Kadagidze, O.Rukavitzin. Evaluation of activation and apoptosis photochemical treated and gamma-irradiated platelet concentrâtes. lS^ongress of the European Hematology Association, Spain, Barcelona June 10-13, 2010. Haematologica (Abstract book) 2010; 95(S2):414 Abstract 1001.

М.Д. Огородникова, Т.Н.Заботина, А.А.Борунова, З.Г.Кадагидзе, А.Д.Онуфриевич, О.А.Рукавицын. Оценка качества аферезных тромбоконцентратов, подвергшихся физико-химическим воздействиям, на основании маркера апоптоза тромбоцитов. Тезисы Всероссийской юбилейной научно-практической конференции, посвященной 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова «Комбинированная и сочетанная патология:

проблемы диагностики и лечения в условиях крупных военных лечебных объединений», 2-3 декабря 2010 г.; с. 59.

5. В.Р. Городецкий, Н.А. Пробатова, О.А. Логвиненко, В.И. Васильев, М.Д. Огородникова, С.Х. Седышев, М.В. Симонова, Т.Н. Сафонова, Е. Ю. Варламова, Л.В. Мехеда, Н.В. Малахова, Е.Л. Насонов. Ревматоидный артрит с синдромом Шегрена и MALT-лимфомой околоушной слюнной железы, ассоциированный с множественной миеломой. Научно-пратическая ревматология 2010; 2:103-106.

6. M. Ogorodnikova, T. Zabotina, A. Borunova, A. Onufrievich, О. Rukavitzin. Platelet apoptosis measurement as a quality control of physicochemically treated apheresis platelet concentrates used for transfusion to patients after haematopoietic stem cell transplantation. 37th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, Paris, France, 3-6 April 2011. Bone Marrow Transplantation (Abstract Book) 2011; 46(1): S186-7 (P700).

7. Ogorodnikova M.D., Zabotina T.N., Borunova A.A., Onufrievich A.D., Ogorodnikova E .V., Rukavitzin O.A. Evaluation of functional quality of apheresis platelet concentrates used for transfusion to hematological patients on the base of activation and apoptosis markers. 21st Regional Congress of the International Society of Blood Transfusion, Lisbon, Portugal, June 18-22, 2011. Vox Sanguinis (Abstracts) 2011; 101(1): 171-2 (P-236).

8. M. Ogorodnikova, S. Shamansky, A. Onufrievich, E. Ogorodnikova, T. Zabotina, O. Rukavitzin. Comparative evaluation of therapeutic efficacy of photochemically treated and gamma-irradiated platelet concentrates transfused to patients after autologous hematopoietic stem cell transplantation. 16th Congress of the European Hematology Association, London, United Kindom, June 9-12, 2011. Haematologica (Abstract book) 2011; 96(S2): 644-5(1648).

9. М.Д. Огородникова, Т.Н. Заботина, A.A. Борунова, Н.Ю. Очеева, З.Г. Кадагидзе, О.А. Рукавицын. Влияние фотохимической обработки и гамма-облучения на экспрессию маркеров активации и апоптоза тромбоцитов. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2011. -Том 10, №1.-С. 15-20.

10. М. Ogorodnikova, Т. Zabotina, A. Borunova, A. Onufrievich, Е. Ogorodnikova, О. Rukavitzin. Study of residual lymphocytes immunophenotype in the photochemicaly treated platelet concentrates transfused to oncohematological patients. 17th Congress of the European Hematology Association, Amsterdam, The Netherlands, June 14-17, 2012. Haematologica (Abstract book) 2012; 97(S1): 736 (1919).

11. М.Д. Огородникова, Т.Н. Заботина, A.A. Борунова, З.Г. Кадагидзе, Е.В. Огородникова, А.Д. Онуфриевич, О.А. Рукавицын. Оценка влияния фотохимической обработки и у-облучения тромбоконцентратов на экспрессию маркера апоптоза контаминирующих лимфоцитов. Материалы Конгресса гематологов России, Москва, 2-4 июля 2012, Гематология и трансфузиология 2012 - №3. - С.18.

12. Ogorodnikova M., Zabotina T.N., Borunova A.A., Onufrievich A.D., Ogorodnikova E.V., Rukavitzin O.A. Evaluation of apoptosis marker at the

membrane surface of residual lymphocytes in photochemicaly treated platelet concentrates. 32s1 Internal Congress of the International Society of Blood Transfusion in joint cooperation with the 10th Congress of AMMTC, Cancun, Mexico, July 7-12, 2012. Vox Sanguinis (Abstracts) 2012; 103(1): 144 (P-244).

3. М.Д. Огородникова, Т.Н. Заботина, A.A. Борунова, E.B. Огородникова, А.Д. Онуфриевич, C.B. Шаманский, О.А. Рукавицын. Опыт применения фотохимически обработанных тромбоконцентратов в онкогематологичекой практике. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. -2012.-Том 11, №2.-С. 6-11.

ОГОРОДНИКОВА Мария Дмитриевна

ОПТИМИЗАЦИЯ ГЕМОТРАНСФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИ В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОБРАБОТКИ ТРОМБОКОНЦЕНТРАТОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 26.09.12 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БУ^оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 920

Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦим. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Актуальность темы

Трансфузии донорских тромбоцитов применяются у онкогематологических пациентов с тромбоцитопенией, индуцированной проведением интенсивной химиотерапии, с целью профилактики жизнеугрожающих геморрагических осложнений у контингента с высоким риском их развития, а также с целью осуществления гемостатического эффекта у пациентов с уже имеющимся геморрагическим синдромом [Apelseth Т.О., 2010; Perrotta P.L., 2007; Stanworth S.J., 2004; McClelland В., 2001].

Важной задачей трансфузионной медицины является совершенствование системы обеспечения безопасности компонентов крови, в том числе донорских тромбоцитов. Проводимые на сегодняшний день мероприятия по селекции доноров, лабораторному скринингу, а также применяемые методики заготовки компонентов крови не обеспечивают полной защиты реципиента от различных, ассоциированных с гемотрансфузиями, осложнений.

Все гемотрансфузионные осложнения можно разделить на неиммунологические и иммунологические [McCullough J., 2005; Popovsky M., ed. 2001]. Основная группа неиммунологических осложнений представлена гемотрансмиссивными инфекциями (вирусными, бактериальными, протозойными).

К иммунологическим осложнениям относятся гемолитические реакции (острые и отсроченные), аллергические реакции различной степени тяжести, а также широкий спектр эффектов, обусловленных контаминацией компонентов крови аллогенными лейкоцитами.

Лейкоцитассоциированными иммунологическими осложнениями являются: фебрильные негемолитические трансфузионные реакции (ФНТР), HLA-аллоиммунизация и формирование рефрактерности к трансфузиям тромбоцитов, реакция трансплантат против хозяина, ассоциированная с трансфузиями (РТПХ-АТ), отторжение трансплантата и иммуномодуляция, играющая роль в повышении чувствительности к инфекциям и рецидивировании опухолевых заболеваний [МсСиПогщИ ]., 2005; АЬгепБ Ы., 2009; НиБеЬекк А., 2009; Ророуэку М.А., 2006]. Также с лейкоцитами в компонентах крови связана передача внутриклеточных лимфотропных вирусов (цитомегаловируса - СМУ, Эпштейн-Барр вируса - ЕВУ, Т-лимфотропного вируса человека типа 1 - НТЬУ-1) [МсСиПо^И ]., 2005; РороУБку М., её. 2001].

Таким образом, существует целый ряд определенных рисков, ассоциированных с переливанием донорских тромбоконцентратов (ТК).

Важным шагом на пути к снижению рисков, связанных с присутствием в ТК аллогенных лейкоцитов, является выполнение лейкоредукции в рамках процедуры заготовки до уровня, не превышающего 1 х 106 лейкоцитов в дозе компонентов, предназначенных для трансфузии. Тем не менее, применение методики лейкоредукции не позволяет полностью предупредить развитие всех трансфузионных осложнений [МсСи11о1^111., 2005; 8е§Ьа1сЫап Т, 2000].

Решение вышеперечисленных проблем может быть осуществлено путем применения принципиально новых подходов к обработке компонентов крови в процессе подготовки их для трансфузии. В этой связи весьма актуален поиск оптимальной технологии обработки компонентов крови с целью минимизации риска гемотрансфузионных реакций и осложнений. Такая технология должна быть безопасной для реципиента и выполняться с максимальным сохранением функциональных свойств целевых клеток крови, например, тромбоцитов.

В международной медицинской науке и практике исследовались различные способы воздействия на компоненты крови. На сегодняшний день в России стала доступна технология фотохимической обработки (ФХО) с применением ультрафиолета (УФ) в сочетании с фотосенсибилизатором для тромбоцитсодержащих сред и плазмы, при использовании которой происходит неизбирательное воздействие на цепи нуклеиновых кислот. «Сшивка» цепей ДНК или РНК устраняет возможность репликации генетического материала. Реализация подобного эффекта открывает новые перспективы в достижении большей безопасности гемотрансфузий -инактивацию патогенов различной природы и устранение вероятности развития реакций, связанных с аллогенными лейкоцитами за счет блока генетического материала резидуальных лейкоцитов в компонентах крови [Popovsky M., ed. 2001;BCSH Blood transfusion Task Force. 1996]. Новая технология также является альтернативой гамма-облучению компонентов крови, которое много лет было «золотым стандартом» для профилактики РТПХ-АТ.

Оценка влияния технологии ФХО на функциональное качество донорских тромбоцитов является актуальной задачей.

Поскольку тромбоциты являются чрезвычайно чувствительными к своему микроокружению, представляют интерес исследования индукции их апоптоза и активации в результате физико-химических воздействий. Технологии физико-химической обработки компонентов крови наряду с эффективной инактивацией патогенов должны обеспечивать максимальное сохранение функциональных свойств целевых клеток крови при трансфузиях. Поэтому необходимо оценить клиническую эффективность концентратов тромбоцитов, обработанных различными методами.

Цель исследования

Изучить возможности применения физико-химических методов обработки донорских ТК для оптимизации гемотрансфузионной терапии в онкогемато л огии.

Задачи исследования

1) Изучить динамику экспрессии маркеров активации и апоптоза донорских тромбоцитов в результате процесса заготовки.

2) Изучить влияние ФХО и гамма-облучения в дозе 25 Гр на экспрессию маркеров активации и апоптоза тромбоцитов в ТК на разных сроках хранения.

3) Изучить эффекты воздействия ФХО и гамма-облучения в дозе 25 Гр на контаминирующие ТК лимфоциты: динамику экспрессии маркера апоптоза лимфоцитов и их субпопуляционной структуры на разных сроках хранения.

4) Провести сравнительную оценку клинической эффективности трансфузий ТК, обработанных фотохимическим методом, гамма-облученных и не подвергавшихся воздействиям.

5) Исследовать частоту возникновения посттрансфузионных реакций при использовании донорских концентратов тромбоцитов, фотохимически обработанных, гамма-облученных и не подвергавшихся обработке.

6) Оценить значение метода проточной цитометрии в исследовании донорских ТК.

Научная новизна

Впервые в России было проведено сравнительное исследование, посвященное оценке влияния двух высокотехнологичных методик обработки донорских тромбоцитов - фотохимической и радиационной на in vitro показатели активации (Р-селектин) и апоптоза (Annexin V) тромбоцитов, а также на клинико-лабораторные показатели эффективности их трансфузии пациентам с онкогематологическими заболеваниями.

Впервые выполнено экспериментальное исследование, посвященное изучению и сравнению влияния ФХО и гамма-облучения ТК на контаминирующие аллогенные лейкоциты.

Впервые в нашей стране был использован метод проточной цитометрии для оценки влияния физико-химических факторов предтрансфузионной обработки на донорские ТК.

Положения, выносимые на защиту

1) ФХО АТК равноценны гамма-облученным и необработанным аферезным тромбоконцентратам (АТК), как на основании in vitro маркеров жизнеспособности и функциональности тромбоцитов, так и на основании показателей их клинической эффективности и могут применяться для адекватной гемостатической терапии онкогематологических пациентов.

2) ФХО и гамма-облучение ТК в дозе 25 Гр не приводят к индукции апоптоза CD45+ клеток в течение 5 суток хранения ТК и не оказывают существенного влияния на субпопуляционную структуру контаминирующих лимфоцитов. Наиболее чувствительными к действию физико-химической обработки являются NK-клетки.

3) Изменения in vitro показателей функциональности и жизнеспособности тромбоцитов происходят как в результате процессов заготовки, так и в течение хранения, и наиболее выражены на 5-е сутки.

Практическая значимость работы

При изучении маркеров активации и апоптоза тромбоцитов, как предикторов посттрансфузионной эффективности, было установлено, что ФХО не оказывает негативного воздействия на донорские ТК.

Клинические исследования показали, что фотохимически обработанные аферезные тромбоконцентраты (ФХО АТК) сохраняют лечебный потенциал и по эффективности не уступают гамма-облученным и необработанным ТК. Таким образом, полученные результаты проведенного исследования формируют дополнительные возможности для оптимизации гемостатической терапии в онкогематологии.

Оценка маркеров активации и апоптоза тромбоцитов с помощью проточной цитометрии (ПЦ) может быть использована как дополнительный критерий контроля качества ТК, предназначенных для трансфузии.

выводы

1. Установлено, что тромбоциты ПК доноров имеют низкий уровень экспрессии маркеров активации и апоптоза. Технологические процессы заготовки донорских тромбоцитов приводят к активации тромбоцитов и инициации их апоптоза. Процесс приготовления пулов обладает более сильной индукторной активностью в плане запуска апоптоза тромбоцитов, по сравнению с автоматическим тромбоцитаферезом.

2. Фотохимическая обработка ТК не приводит к увеличению уровня экспрессии маркеров активации (Р-селектина) и апоптоза (Аппехт V) на тромбоцитах, по сравнению с необработанными ТК в 1-е сутки хранения. На 5-е сутки наблюдается более высокий уровень экспрессии Р-селектина и Аппехт V на тромбоцитах в фотохимически обработанных АТК, чем в необработанных и гамма-облученных образцах.

3. Гамма-облучение в дозе 25 Грей ТК не влияет на уровень экспрессии маркеров активации (Р-селектина) и апоптоза (Аппехт V) тромбоцитов. Гамма-облученные ТК не отличаются от необработанных по количеству тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин и Аппехт V как в 1-е, так и на 5-е сутки хранения.

4. СБ45+ клетки идентифицируются как в необработанных, так и в гамма-облученных и фотохимически обработанных образцах донорских тромбоцитов на 5 сутки. Гамма-облучение и ФХО не вызывают существенного изменения субпопуляционной структуры контаминирующих лимфоцитов. Т- и В- лимфоциты являются самыми устойчивыми, а ЫК-клетки самыми чувствительными к физико-химическому воздействию.

5. Фотохимически обработанные АТК равноценны гамма-облученным и необработанным на основании клинико-лабораторных показателей эффективности трансфузий и гемостатической функции.

6. Трансфузии фотохимически обработанных и гамма-облученных АТК не приводят к увеличению числа острых посттрансфузионных реакций в исследованных группах пациентов по сравнению с группой пациентов, получавших трансфузии необработанных тромбоцитов.

7. Проточная цитометрия является адекватным методом оценки ультраструктурных изменений тромбоцитов и динамики субпопуляционной структуры аллогенных контаминирующих лимфоцитов, наступивших под влиянием физико-химических воздействий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод фотохимической обработки донорских тромбоцитов можно широко использовать с целью оптимизации гемотрансфузионной терапии пациентов в онкогематологической клинике, поскольку фотохимическая обработка комплексно решает проблему повышения безопасности трансфузий донорских тромбоцитов за счет инактивации патогенов инфекционной и лейкоцитарной природы.

2. Метод фотохимической обработки является эффективной и безопасной альтернативой гамма-облучению донорских концентратов тромбоцитов, так как обработка ионизирующей радиацией является способом профилактики РТПХ-АТ, но не обеспечивает инфекционную безопасность трансфузий.

3. При организации гемостатической терапии тромбоцитопенических состояний возможно использование донорских тромбоцитов в течение всего регламентированного срока хранения - 5 суток. Необходимо учитывать, что фактор продолжительности хранения вносит определенный вклад в развитие апоптотических и активационных изменений тромбоцитов независимо от метода предтрансфузионной обработки. Поэтому следует отдавать предпочтение использованию аферезных донорских тромбоцитов, подвергшихся физико-химическим методам обработки и с минимальными сроками хранения.

4. Метод проточной цитометрии можно полноценно использовать для адекватной оценки изменений тромбоцитов и лейкоцитов, произошедших в результате процессинга с помощью обработки физико-химическими методами.