Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Оптимизация дифференциальной диагностики первичного и вторичного гломерулонефритов

Гасанов Митхат Зульфугар-оглы

ОПТИМИЗАЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПЕРВИЧНОГО И ВТОРИЧНОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОВ

14.01.04 — внутренние болезни

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2013

005057731

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Батюшки Михаил Михайлович

Официальные оппоненты: Фомин Виктор Викторович

доктор медицинских наук Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры терапии и профболезней

Яковлев Алексей Александрович

доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 14 мая 2013 г. в /о часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан «/Й» РС^^.Ь&ЛЛ^. 2013 г. Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Пшеничная Н.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние десятилетия в мире наблюдается неуклонный рост распространенности хронических заболеваний почек. В 2012 году в общей популяции доля таких пациентов составила около 11%. При этом распространенность хронических гломерулонефритов (ХГН) достигает 50 случаев на 10000 населения (Российский статистический ежегодник 2012, официальный сайт федеральной службы государственной статистики РФ -gks.ru).

Несмотря на достигнутые успехи в диагностике заболеваний почек, и в частности нефритов, число диагностических ошибок остается высоким. Так, в 2011 году, процент ошибок диагностики ХГН среди заболеваний внутренних органов в терапевтических стационарах в отдельных случаях достигал 75% (Мухин Н. А. и соавт., 2011). Несомненно, это обстоятельство приводит к поздней диагностике, неадекватной терапии и, как следствие, ухудшению прогноза заболевания.

Одной из наиболее частых причин ошибочной диагностики является появление паранеопластических почечных манифестов. Распространенность паранеопластического синдрома среди клинических проявлений опухолевого процесса составляет от 5 до 20% (Santacroce L. et al., 2011). Важно отметить, что в 35-70% наблюдений рак почки характеризуется бессимптомным течением (Мухин Н.А. и соавт., 2009). Это приводит к тому, что более 50% больных данной группы обращаются в медицинские учреждения на поздних стадиях болезни (Сарвилина И.В. и соавт., 2007). Многообразие терапевтических масок неоплазий и низкая диагностическая специфичность снижают онкологическую настороженность терапевтов и создают прецеденты для поздней диагностики запущенных форм.

По данным Richie J.P. et al. (2011) заподозрить рак почки можно по паранеопластическим проявлениям, в том числе по изменениям в моче, характерным для гломерулонефрита. Вместе с тем, 25-40% всех случаев рак почки выявляется лишь при радиологическом исследовании. За последние 20 лет частота заболеваемости раком почки увеличилась на 30% (Jerome Р. Richie et al., 2011). Несмотря на это, способы первичной ранней неинвазивной дифференциальной диагностики первичных и вторичных форм ХГН разработаны не достаточно (Мухин Н.А. и соавт., 2012).

В современной терапевтической практике на этапе первичного звена здравоохранения экспресс-методы диагностики заболевания почек малочисленны и, нередко, дорогостоящи, а алгоритмы дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН требуют постоянной актуализации.

Для верификации диагноза ХГН в настоящее время используется нефробиопсия как обязательное и наиболее достоверное исследование, с помощью которого возможно точно установить диагноз (Шилов Е.М., 2010).

Использование современных неинвазивных методик и инновационных технологий обеспечит раннюю диагностику и прогнозирование риска развития почечной патологии, позволит своевременно модулировать меры профилактики и лечения.

Дифференциальная диагностика первичных и вторичных ХГН является неотъемлемой частью на этапе постановки диагноза. Существующие на сегодняшний день алгоритмы обследования больных данной патологией не в полной мере удовлетворяют потребностям врача и требуют модернизации. На современном этапе необходим поиск биомаркеров поражения почек, что, в свою очередь, позволит мониторировать состояние пациента, оценивать прогноз, определять возможности биотаргетной терапии, а также углубиться в молекулярные основы патогенеза ХГН. В этом аспекте масс-спектрометрия является методом научного анализа, на основании которого можно обнаружить ряд белков, маркирующих различные звенья патогенеза первичных и вторичных ХГН, предположительно позволяющих дифференцировать формы и стадии болезни. Возможность детально изучить «протеомное зеркало» мочи пациентов позволит выявить особенности течения ХГН и оптимизировать дифференциальную диагностику (Sethi S. et al„ 2013).

Цель исследования

Оптимизация существующих алгоритмов дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН с использованием масс-спектрометрической оценки молекулярного спектра мочи.

Задачи исследования

1. Выявить клинические особенности поражения почек при первичных и вторичных ХГН.

2. Выявить особенности белкового паттерна биообразца в зависимости от клинико-морфологической формы первичного ХГН, стадии хронической болезни почек и этиологии вторичного ХГН.

3. Провести сравнительный анализ белкового спектра мочи пациентов с первичным и вторичным ХГН.

4. Оценить возможную роль выявленных белков в развитии первичных и вторичных (паранеопластических) ХГН.

5. Оптимизировать существующие алгоритмы дифференциальной диагностики первичных и вторичных (паранеопластических) ХГН.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые установлены белковые спектры мочи при первичных и вторичных ХГН, оценена степень участия каждого из них в течение

патологического процесса. С использованием масс-спектрометрии выявлены белки, маркирующие отдельные клинико-морфологические формы ХГН, стадии хронической болезни почек (ХБП) и разные ХГН в зависимости от этиологии, что позволило смоделировать оригинальные алгоритмы неинвазивной дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН. Существенно расширены представления о механизмах повреждения почечной ткани на основе детального изучения белкового спектра мочи пациентов с гломерулонефритами. Уровень экспрессии полученных белков и их количественная оценка открывают перспективы оценки активности патологического процесса и на основании полученных данных создают возможности скрининговых подходов к прогнозированию и дифференциальной диагностике. Исследование белкового спектра мочи отражает обменные процессы непосредственно в мочеполовом тракте и сужает спектр белков, не фильтрующихся в мочу и встречающихся при других заболеваниях внутренних органов. Оригинальность авторского научного проекта заключается в использовании масс-спектрометрии у пациентов с различными гистологическими вариантами ХГН, а методологической особенностью — изучение в качестве биообразца мочи пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выделены универсальные механизмы повреждения почек при первичных и вторичных гломерулонефропатиях. Конкретной клинико-морфологической форме первичного ХГН соответствует специфичный белковый спектр мочи. Выделенные белки могут быть использованы в качестве потенциальных маркеров повреждения почечной ткани.

3. Определенной клинико-морфологической форме вторичного ХГН соответствует специфичный белковый спектр мочи. Выделенные белки могут быть использованы в качестве потенциальных маркеров повреждения почечной ткани, а также в качестве канцерспецифичных маркеров.

4. В зависимости от стадии ХБП в моче изменяется экспрессия определенных белков, которые могут служить потенциальными маркерами для прогнозирования скорости потери функции почек.

5. Верифицированные белки в моче пациентов могут быть использованы в качестве потенциальных маркеров дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН. Разработаны алгоритмы дифференциальной диагностики ХГН.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 журнальных статьи в изданиях, рекомендованных ВАК и 1 монография.

Апробация работы

Основные положения диссертации обсуждены на совместном заседании кафедры внутренних болезней № 1 и научного координационного совета «Научно-организационные основы профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний внутренних органов» ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. Материалы диссертации представлены на 1У-УИ Национальных конгрессах терапевтов (г. Москва, 2009, 2010 и 2011), III съезде нефрологов Юга России «Актуальные проблемы региональной нефрологии» (г. Ростов-на-Дону, 2010г.), на У-УП научно-практической конференции молодых учёных с международным участием «Завадские чтения» (г. Ростов-на-Дону, 2010, 2011 и 2012г.), на 7-м Международном Российско-Германском научном симпозиуме «Улучшение научной деятельности для общего будущего» (Кёльн, Германия, 2012), российско-германском научном симпозиуме «Генетические и метаболические болезни почек», (Ростов-на-Дону, 2012).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах терапевтического профиля ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. По материалам диссертации издана монография «Паранеопластический синдром» (Батюшин М.М., Терентьев В.П., Дерижанова И.С., Гасанов М.З., 2010) (утверждено на ЦМК Рост ГМУ). Результаты диссертационного исследования также отражены в руководстве для врачей «Клиническая нефрология» в разделе «Паранеопластическая нефропатия» (Батюшин М.М., 2009). Разработанные алгоритмы дифференциальной диагностики первичных и вторичных гломерулонефритов вошли в материалы для чтения лекций врачам-терапевтам на кафедрах ФПК и ППС РостГМУ, внедрены в работу нефрологического отделения клиники ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

По результатам проведенного исследования диссертантом в настоящее время оформляется две заявки на изобретения: «Способ прогнозирования скорости потери почечной функции» и «Алгоритм дифференциальной диагностики первичных и вторичных гломерулонефритов».

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, иллюстрирована 55 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, состоящих из 3 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Указатель литературы включает в себя 167 работ, из них 36 отечественных и 131 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дизайн исследования

Исследование представляет собой одномоментное, когортное, контролируемое исследование - обследовалось 80 пациентов с различными морфологическими вариантами первичного хронического гломерулонефрита и 30 пациентов со вторичным ХГН при раке почки. Помимо детального сбора клинико-анамнестических данных, а также физического и лабораторно-инструментального обследования, соответствующего стандарту, всем пациентам была выполнена биопсия почки и масс-спектрометрия мочи на выявление белкового паттерна.

До операции

Вторичный ХГН

{п= 30)

Белок 1 1 1 Белок 2

ОЇ

Белок 0 Белок 2

Рисунок 1 Схема дифференциальной диагностики первичного и вторичного (паранеопластического) гломерулонефритов «Белок 1» и «Белок 2» - белковый спектр мочи пациентов с ХГН при РП «Белок 0» - исчезновение белка в моче после нефрэктомии «Белок 3» - белковый спектр мочи пациентов с первичным ХГН «Белок 4, 5, б» - качественный состав белковых молекул в протеоме «Белок 3» при первичном ХГН.

Критерий включения - забора биообразца и биопсии до начала терапии глюкокортикостероидами. Контрольную группу составили относительно здоровые люди (п=30). В этой группе критериями включения были -отсутствие соматической патологии, в том числе патологии почек и отсутствие изменений в моче (патологии мочевого осадка).

Информированное согласие на участие в исследовании и взятии у пациентов биообразцов (мочи) подписали все пациенты клинических и контрольной групп.

Клиническая характеристика обследованных и методов исследования

В группу пациентов с первичными хроническими гломерулонефритами были отобраны 80 пациентов (39 мужчин (51%) и 38 женщин (49%)). Средний возраст респондентов составил 36,6+2,2 лет. Всем пациентам была выполнена нефробиопсия и на ее основании установлен диагноз: ^А-нефропатия (44,7%), болезнь минимальных изменений (4,3%), мембранозный ГН (8,5%), мембрано-пролиферативный ГН (19,1%), фокально-сегментарный гломерулосклероз (23,4%). Респонденты группы с первичными ХГН имели нарушения функции почек различной степени. Всем пациентам была определена СКФ, что позволило распределить их по стадиям ХБП. Основу группы составили пациенты с 1-3 стадиями ХБП: 1-я стадия была у 17%, 2-я - у 31,9%, 3-я - у 36,2%, 4-я - у 8,5%, 5-я - у 6,4% респондентов. Нефритический синдром в представленной группе встречался в 51 %, нефротический синдром - в 43% и мочевой - в 6% случаев.

Во 2-ю группу вошли 30 пациентов со вторичным (паранеопластическом) ХГН, средний возраст которых составил 52,8+2,6 лет. В представленную группу отобраны респонденты, имеющие поражение почек при раке почки, проявляющиеся изменениями в моче.

Степень дифференцировки рака в этой группе была различной. Пациенты были распределены на 3 подгруппы: 1-я - больные со светлоклеточным раком (п=15), 2-я - с папиллярным (п=6) и 3-я с хромофобным раком почки (п=9).

Выявление и клиническая манифестация РП проходила достаточно поздно и лишь в 33,3% случаев - это случалось на ранних стадиях. В 56,7% случаев опухоль была найдена на стадии ТЗа, когда она уже прорастала надпочечник или паранефральную клетчатку в пределах фасции Герота, что ухудшало прогноз. При гломерулонефропатиях при раке почки также встречались маркеры ХБП - снижение СКФ и микроальбуминурия. Вторая и третья стадии ХБП у пациентов данной группы встречались достоверно чаще. Снижение СКФ ниже 30 мл/мин/1,73 м2 в группе не было.

В группе со вторичными ХГН в 58% случаев встречался мочевой синдром, нефритический синдром - у 1/3 (32%), нефротический вариант - у 11% респондентов.

Всем пациентам было выполнено морфологическое исследование препарата почки для верификации диагноза и масс-спектрометрия мочи с целью определения белкового спектра.

Статистическая обработка данных. Статическая обработка полученных результатов проводилась с помощью набора прикладных

программ «Microsoft Office 2010» for Windows 7 на ПК «PC Intel Pentium Inside». Статистический анализ выполнялся с помощью компьютерной программы «STATISTICA 8.0». Отбор материала осуществлялся, исходя из принципов достоверности и всесторонности освещения событий.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ клинико-морфологических параметров первичного н вторичного хронического гломерулонефрита

При проведении синдромальной диагностики и сравнительной оценки клинических вариантов течения первичных и вторичных гломерулонефритов - при первичном процессе достоверно чаще встречаются нефротический и нефритический синдромы (43,7% и 50,3% соответственно, р<0,05). При вторичных ХГН преобладает мочевой синдром (58,2% против 6,3%, р<0,05), который, в свою очередь, может быть использован в качестве потенциального неспецифического маркера дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН.

У пациентов с первичными гломерулонефритами заболевание протекало клинически и лабораторно более выражено, чем у пациентов с поражениями почек при вторичных ХГН. Частота обострений первичных ХГН была достоверно выше, чем при вторичных ХГН. При вторичных ХГН обострений практически не возникало, рак почки протекал малосимптомно. Отёчный синдром также встречался чаще в первой группе и связан был в основном с потерей белка и синдромом задержки жидкости вследствие активации ренин-ангиотензин-апьдостероновой системы (РААС) и нарушением фильтрационной способности почек. Артериальная гипертензия встречалась чаще при первичных ХГН, чем при вторичных (68,1% против 11,4%, р<0,05) и манифестировала выраженными головными болями, головокружениями, тошнотой, носила рефрактерный характер (в 52% случаев) при этом средний уровень САД составил160+9,5, а ДАД 102,5±3,7 мм. рт. ст. соответственно. При поражении почек при РП у пациентов артериальная гипертензия носила клинически невыраженный характер (САД составил 143,0±8,7, а ДАД 94,8±4,2 мм. рт. ст. соответственно) и поддавалась терапии стандартными дозировками антигипертензивных средств. Сахарный диабет и другие хронические заболевания встречались в 4,2% случаев. Это подтверждается анамнестическими сведениями, предъявляемыми жалобами пациентов, а также результатами анализов мочи, крови и уровня скорости клубочковой фильтрации.

У пациентов в группе первичными ХГН функция почек была нарушена достоверно чаще, чем у пациентов в группе с поражениями почек при РП и сопровождалась более выраженным снижением СКФ (61,4±4,5 против 87,7±5,8) при высоком уровне азотистых оснований (креатинин 201,9±32,1

Каждая молекула белка в функциональной группе взаимодействует с другими молекулами белков, реализуя межмолекулярные взаимодействия. В качестве примера на рисунке 3 представлены межмолекулярные взаимодействия эритропоэтина, объясняющие механизмы развития анемии, иммуновоспалительного процесса, гипоксии и ангиогенеза в почечной паренхиме, которые являются основой клинического фенотипа ХГН. Так, плотность рецепторов к эритропоэтину при ХГН значительно уменьшается, что приводит к развитию анемии. Эритропоэтин также взаимодействует с белками GATAI и GATA2, которые совместно стимулируют синтез гемоглобина и дифференцировку эритроцитов. Уменьшение передачи сигнала от эритропоэтина к транскрипционным факторам GATAI и GATA2 при ХГН также является важным патогенетическим обоснованием развития анемии. На рис.3 приведен пример межмолекулярных взаимодействий эритропоэтина.

¿г

-NPTN

tr.......-..................../-М

жкг '

s У-—

.......IPPx^ fi

H1F1A

[SETDî Jj

MPL

m?

YEGFA

ЩЛ0

Рисунок 3 Схема межмолекулярных взаимодействий эритропоэтина

При идентификации белковых молекул в моче пациентов различных морфологических вариантов ХГН - у пациентов с ^А-нефропатией выявлены рецепторы VI почечных канальцев к вазопрессину, ответственные за регуляцию артериального давления, повышенный риск развития несахарного диабета и артериальной гипертензии, также был обнаружен белок То11о1с1-Пке-2 (Т1ЬЬ2), обладающий металлопротеазной активностью, приводящей к вазоконстрикции, являющийся фактором риска развития артериальной гипертензии. Белок Т1ЬЬ2 был также найден в биообразцах пациентов с МПГН и МГН. На масс-спектрограмме 5 пациентов (3-е ЛН и 2 с МПГН) с высокой достоверностью определялся антионкоген - ТАСС1 (белок, связанный с центросомами и микротрубочками), повышенное содержание его в моче является фактором риска развития онкопатологии. В биообразцах встречались и другие онкогены, свидетельствующие о высоком

риске онкопатологии. Наличие клинической симптоматики, соответствующей паранеопластическим проявлениям, тяжелое течение и рефрактерность к патогенетической терапии диктовали необходимость проведения дальнейшего обследования, направленного на онкопоиск.

Идентифицировались и более редкие протеомы, характерные для пациентов с МГН и МПГН. Так, найден интегрин альфа-7, который указывает на повышенный риск развития рака или повышенный риск рецидива рака, в частности, предстательной железы, глиобластомы мультиформной, леймиосаркомы или гепатоцеллюлярной карциномы. У пациента с IgA-нефропатией выявлен достоверно высокий уровень профилин-2, отражающего работу мембран клеток и являющегося регулятором мембранного поглощения. Гиперэкспрессия профилин-2 в клетках препятствует поглощению мембран. Нужно отметить, что профилин-2 также участвует в перестройке актинового цитоскелета и имеет важное значение для таких процессов, как развитие органа, заживление ран. Филамин-А, обнаруженный у пациентов с МПГН, также принимает участие в построении цитоскелета и процессах, регулирующих ангиогенез и тромбообразование.

У нескольких пациентов (МГН, п=2 и МПГН, п=4) определялся белок ß-дефензин-1, относящийся к семейству дефензинов. Он обладает бактерицидной и цитотоксической активностью и вырабатывается нейтрофилами. Повышенная экспрессия Р-дефензина-1 у этих пациентов свидетельствует о наличии положительного прогноза течения заболевания в связи блокадой этим белком активации иммуновоспалительного процесса в ткани почек. Снижение экспрессии р-дефензина-1 у оставшейся части пациентов позволяет верифицировать ХГН как быстро прогрессирующий вариант течения заболевания. У пациентов с ХГН увеличение экспрессии ß-дефензина-1 может сопровождаться повышенной экспрессией белка CCR6, который, в свою очередь, способствует формированию нодулярных воспалительных инфильтратов в почечной ткани и ухудшает прогноз.

При исследовании протеомного спектра мочи пациентов с ХГН на различных стадиях ХБП, нами были выявлены несколько вариантов экспрессии представленных белков от первой стадии к пятой.

Так, нами обнаружены белки, экспрессия которых нарастала по мере прогрессирования ХБП: белок, связанный с центросомами и микротрубочками, белок переменного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, поликистин 2, вазопрессиновые Via рецепторы.

Также найдены достоверные различия в уменьшении экспрессии белков соответственно снижению почечной функции: дигидролипоамид S-сукцинилтрансфераза, транскрипционный фактор Oct-1.

Интерес представляют совокупность белков, экспрессия которых сначала убывала к 3-й стадии ХБП, а затем достигала своего максимума к 5-й стадии: белки сигнальной трансдукции (парис-1, ТВС1), предшественник антигена Е48, мембранный эритроцитарный белок 4.1N.

Выявлен также ряд белков, экспрессия которых нарастала к 3-й стадии ХБП, а к 5-й - убывала или отсутствовала: комплемент С4, метил СрО связывающий беок-2 изоформа В, Т-клеточный рецептор дельта цепей \Ч11, ядерные орфанные рецепторы ТГ14, связанные с белком Т11А16.

Таким образом, нами были выявлены протеины, ответственные за процессы воспаления, иммунного ответа, которые характерны для разных фаз течения патологического процесса. Мы определили, что каждой форме хронического гломерулонефрита характерно специфическое протеомное зеркало. Определяемые маркеры - мочевые факторы риска позволяют обновить знания о патогенезе хронических гломерулопатий и прогнозировать эффективность терапии, исход заболевания и темпы прогрессирования ХПН.

С расшифровкой масс-спектрограмм мочи пациентов с ХГН удалось выделить группы молекул белков, которые могут являться потенциальными чувствительными и специфическими маркерами возникновения и прогрессирования заболевания.

Анализ межмолекулярных взаимодействий иммунных белков почечной ткани и белков-участников иммунновоспалительных процессов, позволил обнаружить потенциальные маркеры, которые могут определять как положительную динамику в развитии аутоиммунного процесса, так и его прогрессирование.

Среди полученных белков были найдены протеомы, которые еще предстоит идентифицировать и выяснить их место и роль в формировании патологического процесса.

Особенности иротеомного спектра мочи пациентов со вторичным (паранеопластическим) ХГН

В ходе протеомного анализа нами были выделены около 500 различных белков. Представленные ниже функциональные группы новых белков, составивших молекулярные профили мочи у пациентов с ХГН при раке почки, отражают универсальные пути возникновения и прогрессирования онкопроцесса в почечной ткани, а также процессы метастазирования опухоли:

1. Белки, регулирующие тонус сосудов и активность свертывающей и противосвертывающей систем крови, процессы кроветворения (эритропоэтин, аннексии 5, фибронектин).

2. Белки, регулирующие свободнорадикальное окисление (СРО), а также участвующие в деятельности антиоксидантных систем (АОС) на уровне почечной ткани, участники систем детоксикации и элиминации (глицин -амидинотрансфераза, глутатион-8-трансфераза, пероксиредоксин 1).

3. Сократительные белки нефротелия, эндотелия почечных сосудов (кальбиндин 1).

4. Белки-участники метаболизма в нефроцитах (бетаин-гомоцистеин Б -метилтрансфераза, глицин - амидинотрансфераза, аргининосукцинат-

синтетаза, агматиназа, ЛДГ А, энолаза 2, альдолаза С, пируват-киназа, мышечная форма).

5. Белки, регулирующие клеточный рост, опухолевый рост клетки, реакции протеолиза в клетке, процессинг нейрогормональных факторов, процессы ангиогенеза и адгезии клеток (матриксная металлопротеиназа 2, матриксная металлопротеиназа 9, эритропоэтин, кадгерин 1, глутатион-8-трансфераза, опухоль-ассоциированный ингибитор трипсина, пероксиредоксин 1, аннексии 4, аннексии 5, цистатин В, кальпаин 11).

6. Белки, регулирующие активность рецепторных структур нефроцитов, сосудов почек (рецептор к эпидермальному фактору роста).

7. Структурные белки почечной ткани (уромодуллин, фибронектин).

8. Белки - транскрипционные факторы, регулирующие активность ядра клетки (метил - Срв - связывающий белок 2, изоформа В).

9. Иммунные белки почечной ткани и белки-участники иммунновоспалительных процессов (бета2-микроглобулин, комплемент С4В, пероксиредоксин 1, р-дефензин-1).

10. Транспортные белки (трансферрин, РСБ).

При классифицировании полученных белков в результате масс-спектрометрии мочи пациентов с раком почки, были выявлены белки, которые позволили сформировать новые группы: белки, регулирующие тонус сосудов и активность свертывающей и противосвертывающей систем крови, процессы кроветворения (эритропоэтин, аннексии 5, фибронектин) и сократительные белки нефротелия, эндотелия почечных сосудов (кальбиндин !)•

С целью определения повышения или снижения экспрессии белков в зависимости от наличия онкопроцесса, забор мочи для масс-спектрометрии в основной группе осуществлялся до операции и через 10 дней после оперативного вмешательства.

Обнаружена высокая экспрессия белков в моче пациентов с раком почки до операции, которые не идентифицировались в моче здоровых лиц контрольной группы: бетаин-гомоцистеин метилтрансфераза 2, матриксная металлопротеиназа 2, матриксная металлопротеиназа 9, |32-микроглобулин, кадгерин 1, аргининосукцинат-синтетаза, кальбиндин 1, глутатион-8-трансфераза, опухоль-ассоциированный ингибитор трипсина, пероксиредоксин 1, аннексии А5, кальпаин 11, энолаза 2, аннексии А4, цистатин В, альдолаза С, фибронектин.

Изменения в молекулярном спектре белков мочи пациентов с раком почки после проведения оперативного вмешательства показали его эффективность в отношении снижения экспрессии белков, регулирующих тонус сосудов и активность свертывающей и противосвертывающей систем крови, процессы кроветворения, в отношении системы СРО-АОС на уровне почечной ткани, участников систем детоксикации и элиминации, сократительных белков нефротелия, эндотелия почечных сосудов, участников метаболизма в нефроцитах, белков, регулирующих клеточный и

опухолевый рост клетки, реакции протеолиза в клетке, процессинг нейрогормональных факторов, процессы ангиогенеза и адгезии клеток, белков, регулирующих активность рецепторных структур нефроцитов, сосудов почек, структурных белков почечной ткани, транскрипционных факторов, иммунных белков почечной ткани и транспортных белков по сравнению с контрольной группой здоровых лиц.

Интерес представляет молекула комплемента С4В, уровень экспрессии которой не претерпевал изменений в группе пациентов с раком почки после операции и оставался таким же высоким, как и в группе пациентов с раком почки до операции. Этот факт свидетельствует о необходимости проведения дальнейших исследований молекулярных путей, отражающих активность компонентов системы комплемента в условиях возникновения и прогрессирования онкопроцесса в почечной ткани на ранних стадиях.

Смоделированные нами схемы межмолекулярных взаимодействий обнаруженных белков позволяют определить их роль в формировании патологического процесса. Пример такого взаимодействия представлен на рисунке 4. Аннексии А5 - это белок, который относится к семейству аннексинов - кальций-зависимых фосфолипид-связывающих белков. Принимает участие в мембранно-связанных экзоцитотоксических и эндоцитотоксических патологических путях при раке почки. Аннексии А5 -это фосфолипаза А2 и ингибитор белка протеиназы С с активностью в отношении кальциевых каналов и потенциальной ролью в активации сигнальной трансдукции в молекулярных путях при иммунном воспалении, росте и дифференцировке опухолевых клеток при раке почки. Аннексии А5 также является непрямым ингибитором тромбопластин-специфического комплекса, который вовлечен в коагуляционный каскад (фактор III свертывания крови) (рис.4).

......

,США1

Щ

Рисунок 4 Схема межмолекулярных взаимодействий аннексина А5

Примечания. ANXA5 - аннексии А5; F3 - фактор свертывания крови III (тромбопластин, тканевой фактор); COL2AI - коллаген, тип II, альфа 1; PRB1 - пролин-содержащий белок, подсемейство I; SERPINH1 - ингибитор серпиновой пептидазы, класс H (белок теплового шока 47), член 1; ACTG1 - актин, гамма 1; S100A1 - S100 кальций-связывающий белок Al; CD63 -кластер дифференцировки 63; EGF - эпидермальный фактор роста (бета-урогастрон); BCL2 -белок В- клеточной лимфомы; HRH4 - гистаминовый рецептор Н4.

Экспрессия аниексииа А5 увеличивается в группе пациентов с раком почки, вероятно, в связи с активацией тромбопластин-специфического коагуляционного комплекса. Увеличение экспрессии аннексина А5 может приводить к повышению синтеза альфа 1 - цепи коллагена II типа, которая усиливает процессы клеточной адгезии при метастазировании опухолевых клеток. Сопряженное увеличение экспрессии белков PRB1 и аннексина А5 может быть связано с контролем со стороны PRB1 синтеза антител в отношении опухолевых клеток.

Несмотря на достигнутые успехи в диагностике, инструментально-лабораторное выявление и клиническая манифестация РП проходила достаточно поздно и лишь в 33,3% случаев - это случалось на ранних стадиях. В 56,7% случаев опухоль была найдена на стадии ТЗа, когда она уже прорастала надпочечник или паранефральную клетчатку в пределах фасции Герота, что ухудшало прогноз.

Мы оценили белковый спектр мочи пациентов с ХГН при РП на разных стадиях процесса.

В подгруппе пациентов с ХГН при раке почки стадии Т1а достоверных изменений в белковом спектре мочи до и после операции не наблюдалось. Вместе с тем, некоторые протеомы, встречающиеся при других стадиях, на стадии Т1а полностью отсутствовали: аргининосукцинат-синтетаза, кальбиндин 1, комплемент С4В, лактатдегидрогеназа А, кальпаин 11, энолаза 2, цистатин В, альдолаза С, ретинол-связывающий белок, пируват-киназа, мышечная форма.

Отмечено снижение белков после нефрэктомии у пациентов данной подгруппы: матриксная металлопротеиназа 9, рецептор к эпидермальному фактору роста, опухоль-ассоциированный ингибитор трипсина, Р-дефензин-1, аннексии A4, фибронектин, трансферрин, уромодуллин.

Также наблюдалось не достоверное увеличение экспрессии следующих белков после операции: глицин - амидинотрансфераза, бета-гомоцистеин метилтрансфераза, агматиназа, метилСрО-связывающий белок 2 (изоформа В).

В подгруппе пациентов с ХГН при раке почки на стадии Т1в отмечаются достоверные различия между качественным спектром белка до и после операции по поводу рака почки. Так, экспрессия некоторых белков снижается после нефрэктомии: матриксная металлопротеиназа 9, матриксная металлопротеиназа 2, рецептор к эпидермальному фактору роста, эритропоэтин, пероксиредоксин 1, глутатион-8-трансфераза, опухоль-ассоциированный ингибитор трипсина, р-дефензин-1, уромодуллин.

С другой стороны, удаление опухоли приводит к увеличению синтеза других белков: глицин - амидинотрансфераза, бета-гомоцистеин метилтрансфераза, метилСрО-связывающий белок 2 (изоформа В).

В подгруппе с ХГН при раке почки на стадии За, наблюдаются достоверные различия в белковых спектрах мочи пациентов до и после нефрэктомии. В частности, качественный протеомный состав мочи изменился в сторону усиления экспрессии следующих белков: уромодуллин, лактатдегидрогеназа А, р-дефензин-1, энолаза 2, аннексии А4, фибронектин, ретинол-связывающий белок, трансферрин, кальбиндин 1.

Встречаемость белка МетилСрО-связывающий белок 2 (изоформа В) в представленных биообразцах возрасла.

Полученные данные позволяют сделать вывод об имеющихся взаимосвязях в экспрессии белка с мочой и стадии заболевания, что, в свою очередь, является предпосылками для определения некоторых белков в качестве канцерспецифичных. Последующие исследования позволят с большей вероятностью устанавливать такие белки в качестве потенциальных маркеров ХГН и РП, а также ХГН при РП.

Обнаруженная динамика экспрессии белков мочи в условиях возникновения и прогрессирования рака почки позволяет сформировать современную молекулярную схему патогенеза поражения почечной ткани у данного контингента пациентов. Зарегистрированные молекулярные профили мочи при раке почки разных стадий могут быть рекомендованы для молекулярной диагностики интенсивности поражения почечной ткани на качественном уровне. Необходимым является развитие количественного протеомного анализа мочи при раке почки. Гены-кандидаты, которые обеспечивают экспрессию обнаруженных нами белков, могут быть рекомендованы для выявления генетической предрасположенности к возникновению и прогрессированию поражения почечной ткани у пациентов с раком почки. Полученные нами данные о протеомных профилях мочи у пациентов с раком почки разных стадий являются источником знаний для разработки новых лекарственных препаратов, относящихся к биотаргетным нефропротекторам и противоопухолевым препаратам.

Заключение

В структуре болезней есть заболевания, которые могут протекать с наличием изменений в моче, характерных для гломерулонефритов. Это могут быть как собственно гломерулярные болезни, так и экстраренальные причины. Особую группу составляют паранеопластические проявления, в том числе и рак почки, который на определенном этапе может протекать с признаками гломерулонефрита. В этом случае поражения почек могут быть обусловлены действием самой опухоли, выделяемыми ею продуктами метаболизма и активных веществ, но также в ответ на наличие чужеродных опухолевых клеток активацией иммунной системы и вовлечением последней в процесс посредствам отложения иммунных комплексов в структурах почки.

Это представляет как научный интерес, так и сложность в аспекте дифференциальной диагностики первичных и вторичных форм.

Маркеры повреждения почек в моче (эритроцитурия, протеинурия) и крови (азотемия)

Есть

Нет

гт~

Снижение СКФ

Есть Т~

<60 мл/ми и/1,73 м 2

Есть

4

Биопсия ПОЧКИ (гистологическое исследоаание)

>60 мл/мин/1,73 м2

4- -

Проведение дифференциальной диагностики (ANA, ANCA, МАУ)

У -

Есть

Проведение дифференциальной диагностики {ANA, ANCA, МАУ)

Дополнительные методы обследования (масс-спектрометрия)

Ф

Дополнительные методы обследования (масс-спектрометрия)

Поиск дополнительных биомаркеров повреждения почек

(простациклин-стимулирующий фактор, белок переменного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, поликистин 2, вазопрессиновые Via рецепторы, белок, связанный с центросомами и микротрубочками (ТАСС-содержащий протеин 2)

Поиск потенциальных онкомаркеров вторичныхХГН (уромодуллин ретинол-связывающий белок, аннексии А5, кальбиндин 1,0-дефензин-1}

Нет

Проведение УЗ-диагностки

Есть

Нет

Заболевания почек нет

Нет

Рисунок 5 Оптимизированный алгоритм дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН

Проведенное исследование является оригинальным, так как в нем нами впервые изучены протеомные особенности мочи при ГН, РП и у относительно здоровых людей. Нами установлены особенности протеома при разных формах ГН и РП, а также проведен анализ возможного участия найденных беков в развитии этих заболеваний. В частности, нами был установлен тот факт, что каждой клинико-морфологической форме ГН и морфологическому варианту РП соответствует определенный белковый паттерн. Последующая расшифровка этих белковых спектров позволила нам уточнить их функции и роль. Предложенный оптимизированный алгоритм дифференциальной диагностики первичных и вторичных гломерулонефритов минимизирует риск ошибочной диагностики, особенно в сложных клинических ситуациях, при наличии противопоказаний для проведения пункционной нефробиопсии.

выводы

1. При первичном ХГН достоверно чаще, чем при вторичном встречаются нефротический и нефритический синдромы, преобладает эритроцитурия в мочевом осадке, выше частота обострений заболевания, активность патологического процесса, а также эффективность проводимой патогенетической иммуносупрессивной терапии.

2. Установлено, что конкретному морфологическому варианту первичного ХГН соответствуют специфичные белки в протеомном профиле мочи, являющиеся кандидатами в маркеры заболевания. При IgA-нефропатии было выявлено 2 таких белка-кандидата (То11-подобный рецептор 2, рецептор к вазопрессину Via), при БМИ - 1 (белок, связанный с центросомами и микротрубочками), при МГН - 2 (То11-подобный рецептор 2, Т-клеточный рецептор дельта цепей Vdl). Потенциальными маркерами прогрессирования нефрита являлись: простациклин-стимулирующий фактор, белок переменного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, поликистин 2, вазопрессиновые Via рецепторы, белок, связанный с центросомами и микротрубочками.

3. Обнаружены белки-кандидаты, ассоциирующиеся только с первичным (6 белков) или только с вторичным ХГН (7 белков), регистрация которых позволила оптимизировать дифференциальную диагностику ХГН по этиологии. Выявлены белки, сохраняющиеся в моче после удаления опухоли и маркирующие вторичный (паранеопластический) ХГН (уромодуллин, 0-дефензин-1).

4. Выявлены потенциальные маркеры активности трех контуров патогенеза первичного и вторичного ХГН: белки, разрушающие внеклеточный матрикс (металлопротеаза 2 и 9); белки, участвующие в неспецифическом иммунитете, в регуляции воспаления, свертывании крови (Р-дефензин-1, белок переменного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов, простациклин стимулирующий фактор, интерлейкин-16); белки цитоскелета и межклеточной адгезии (профилин-2, белок, связанный с центросомами и микротрубочками, поликистин-2, эритроцитарный мембранный белок 4.1N).

5. Предложены дополнительные методы оценки прогрессирования первичного ХГН и неинвазивной диагностики морфологических вариантов ХГН. Оптимизированы алгоритмы дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН целесообразно использование масс-спектрометрии мочи для выявления специфических белковых маркеров патологического процесса.

2. Целесообразно использование белковых маркеров-кандидатов в оценке прогрессирования первичного ХГН, прогнозирования морфологического варианта нефрита и выборе персонифицированного подхода к лечению.

3. При невозможности проведения пункционной нефробиопсии и отсутствии традиционных дифференциально-диагностических критериев, прежде всего в сложных диагностических ситуациях, использовать оригинальный алгоритм в качестве дополнительного инструмента дифференциальной диагностики первичных и вторичных ХГН.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гасанов М.З., Гончарова И.И., Лазарева Е.С., Батюшин М.М. Паранеопластнческий синдрому больных с онкологической патологией: распространенность, характер и формы. - // Сб. материалов IV научно-практической конференции молодых учёных с международным участием «Завадские чтения». Ростов- на-Дону, 2009. - С. 31-33.

2. Терентьев В.П., Батюшин М.М., Дерижанова И.С., Гасанов М.З. Паранеопластический синдром. - / Монография. Второе издание переработанное и исправленное. - Ростов-на-Дону, 2010.- 157 с.

3. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Терентьев В.П., Антипова Н.В., Галушкин A.A., Литвинов A.C. Поиск новых биомаркеров при хронических гломерулопатиях. - // Всероссийский конгресс нефрологов: Сб. тезисов. - М., 2010.-С. 21-23.

4. Гасанов М.З., Лазарева Е.С., Батюшин М.М. Особенности клинической картины и терапии хронического гломерулонефрита при некоторых морфологических вариантах. - // III съезд нефрологов Юга России: Сб. материалов. - Ростов-на-Дону, 2010. - С. 70-72.

5. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Терентьев В.П. Применение инновационных методов в диагностике хронического гломерулонефрита. - // III съезд нефрологов Юга России: Сб. материалов. - Ростов-на-Дону, 2010. -С. 69-70.

6. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Терентьев В.П. Распространенность факторов риска онкопатологии у пациентов с хроническими гломерулопатиями. - // Сб. материалов Пленума «Инновационные технологии и прогресс терапевтической клиники» Российского научного медицинского общества терапевтов и межрегиональной конференции, посвященной 80-летию Ростовского областного научно-медицинского общества терапевтов.-Ростов-на-Дону, 2010.-С. 34-35.

7. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Антипова Н.В. Роль масс-спектрометрии в диагностике внутренней патологии на примере пациентов с хроническим гломерулонефритом. - // Сб. материалов V научной сессии Ростовского государственного медицинского университета, посвященной 95 -летию высшего медицинского образования на Дону и 80 —летию РостГМУ. Ростов-на-Дону, 2010. - С. 452-453.

8. Гасанов З.М., Батюшин М.М., Антипова Н.В. - // Пути оптимизации дифференциальной диагностики первичного и вторичного (паранеопластического) гломерулонефритов Сб. материалов V Национального конгресса терапевтов. М., 2010. - С. 57-58.

9. Гасанов М.З., Галушкин A.A., Ковалевская H.A., Лазарева Е.С., Ионова М.С. Хронический гломерулонефрит как диагноз исключения. - // Сб. материалов V научно-практической конференции молодых учёных с

международным участием «Завадские чтения». Ростов- на-Дону, 2010 год. -С. 115-116.

10. Гасанов М.З., Цветков Д.С., Батюшин М.М. Роль биомедицинских технологий в диагностике социально-значимых заболеваний. - // Сб. материалов II Ростовского молодежного научно-практического форума «Молодежная инициатива - 2011». Ростов-на-Дону, 2011. - С. 76-77.

11. Батюшин М.М., Галушкин А.А., Гасанов М.З., Кашина М.А., Александрова Е.М. Случай ранней диагностики фокально-сегментарного гломерулосклероза. - // Сб. материалов VI научно-практической конференции молодых учёных с международным участием, посвященной 95-летию кафедры внутренних болезней №1«3авадские чтения». Ростов- на-Дону, 2011.-С. 181-183.

12. Gasanov M.Z., Batyushin М.М., Sadovnichaya N.A., Pasechnik D.G. Proteomic urinalysis in nephrology. From researches to differential diagnostics. Abstracts of 7th bilateral German-Russian symposium «Improving Research for a Common Future». Cologne, Germany, 2012. - P. 35.

13. Гасанов M.3., Батюшин M.M., Терентьев В.П. Протеомная нефрология в РостГМУ. Реалии и перспективы. - // Материалы VII Национального конгресса терапевтов. М., 2012. - С. 60-61.

14. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Терентьев В.П., Садовничая Н.А. Протеомный спектр мочи пациентов с хроническим гломерулонефритом. - // Клиническая нефрология. - 2012. - 5/6. - С. 2832.

15. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Терентьев В.П., Цветков Д.С., Пасечник Д.Г. Молекулярные аспекты патогенеза рака почки. - // Электронный журнал «Фундаментальные исследования». - 2013. - № 12 (часть 2). - С. 244-249.

16. Гасанов М.З., Батюшин М.М., Терентьев В.П., Садовничая Н.А. Особенности протеомного зеркала мочи пациентов с гломерулонефропатнями различного генеза. - // Кубанский научный медицинский вестник №4 (133) - 2013. С. 37-42

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АОС - антиоксидантная система Да - дальтон

ЛДГ -лактатдегидрогеназа

МГН - мембранозный гломерулонефрит

МПГН — мембрано-пролиферативный гломерулонефрит

МС - масс-спектрограмма

РСБ-ретинол-связывающий белок

РП - рак почки

ПКР - почечно-клеточный рак СРО - свободно-радикальное окисление США - Соединенные Штаты Америки ТФУ - трифторуксусная кислота ХГН - хронический гломерулонефрит ХБП - хроническая болезнь почек 2,5-ОНВ - 2,5-дигидроксибензойная кислота АЫР - атриальный натрийуретический пептид ЄРСЯ - Є-белок, связанный с рецептором НССА - а-циано-4-гидроксикоричная кислота

МЛЬОТ-ТОР-ТОР-МЭ - время-пролетный масс-спектрометр с лазерной десорбцией и ионизацией Мг - молекулярная масса

Подписано в печать 08.04.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 2983. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88