Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Оптимизация дифференциальной диагностики опухолей из зрелых В- и Т-клеток методом проточной цитометрии

11-1

3917

На правах рукописи

ВЕРШИНИНА Марина Германовна

ОПТИМИЗАЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ ИЗ ЗРЕЛЫХ В- И Т-КЛЕТОК МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор БЕЛЕВИТИН Александр Борисович доктор медицинских наук НИКИТИН Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор ВАСИЛЬЕВ Андрей Глебович доктор медицинских наук профессор МОСКАЛЕВ Александр Витальевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится 1 марта 2011 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО рф (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «_» января 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор МИТИН Юрий Алексеевич

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аюуальность исследования.

В настоящее время диагностика лейкозов основывается на сопоставлении результатов морфологических, проточно-цитометрических и молекулярно-генетических исследований.

Иммунофенотипирование злокачественных клеток периферической крови и костного мозга с помощью метода проточной цитометрии остается необходимым инструментом для постановки диагноза, классификации, определения стадии и мониторинга гематологических опухолей. За последние 10-15 лет проточная цитометрия интенсивно развивалась, был расширен диапазон моноклональных антител (МКА) и флюорохромов, что позволило повысить качество идентификации субпопуляций нормальных клеток и распознавание редких аберрантных иммунофенотипов даже при анализе небольшого количества клеток (Craig F.E., 2008). Определение варианта лимфопролиферативного заболевания (ЛПЗ) методом проточной цитометрии основывается на установлении иммунофенотипа опухолевых клеток периферической крови или костного мозга. В большинстве случаев опухолевые лимфоидные клетки имеют нормальные клеточные аналоги, т.е. соотносятся с определенным этапом дифференцировки лимфоцитов. Воздействие различных этиологических факторов приводит к развитию мутаций онкогенов в клетке, блоку в дифференцировке и накоплению опухолевого клона, сохраняющего набор антигенов нормальной лимфоидной клетки (Луговская С.А. и др., 2005; Van Dongen J.J.M. et al., 2002). Это определяет многообразие лимфопролиферативных заболеваний (4,h Edition WHO Classification 2008). В то же время при хронических ЛПЗ не всегда возможно установить стадию дифференцировки, на уровне которой наступила онкогенная трансформация.

Важным при изучении опухолей иммунной системы является формирование панели диагностических МКА (Луговская С.А. и др., 2005; Van Dongen J.J.M. et al., 2006). Набор используемых МКА может различаться в зависимости от целей исследования. Британским комитетом по стандартам в гематологии (BCSH) разработаны рекомендации по иммунофенотипированию ЛПЗ и предложена, так же как и для фенотипирования острых лейкозов (ОЛ), двухлинейная панель МКА (General Haematology Task Force of BCSH, 1994). На первом этапе проводится дифференциальная диагностика В-клеточных от Т- или NK-клеточных ЛПЗ и в группе В-клеточных опухолей выделяется ХЛЛ или другие варианты неходжкинских злокачественных лимфом. В зависимости от результатов первого этапа исследования и морфологии клеточных элементов проводится второй этап типирования, в ходе которого уточняется иммунофенотип ЛПЗ. Подходы к выбору панели моноклональных антител, алгоритмам иммунофенотипирования и оценке

полученных результатов были предложены и обобщены сравнительно недавно (Ван Донген Ж. и др., 2002; Catovsky D., 1997; Braylan R.C. et al, 2001). Несмотря на существование основных принципов, выбор набора МКА остается прерогативой исследователя, а единые алгоритмы иммунофенотнпирования методом проточной цитометрии отсутствуют.

Классическая многоцветная проточная цитометрия в основном использует определение позитивных и негативных по экспрессии анализируемого маркера клеток. Оценка положительной экспрессии антигена в зависимости от интенсивности флюоресценции для выделения популяций клеток dim, moderate и bright применяется редко. Анализ интенсивности флюоресценции маркеров позволяет значительно расширить возможности диагностики онкогематологических заболеваний с помощью метода проточной цитометрии. В последнее время анализу яркости флюоресценции антигенов стали уделять особое внимание и внедрять в рутинную практику, поскольку для этого не требуется дополнительных финансовых вложений (Куртова A.B. и др., 2008).

В связи с вышеизложенным, усовершенствование дифференциальной диагностики хронических лимфопролиферативных заболеваний с использованием проточно-цитометрического метода продолжает оставаться важной медицинской проблемой.

Цель исследования.

Оптимизация дифференциальной диагностики опухолей из зрелых В- и Т-клеток на основании изучения аберрантной экспрессии антигенов методом проточной цитометрии.

Задачи исследования:

1. Исследовать антигенный профиль опухолевых клеток и интенсивность экспрессии В- и Т-клеточных антигенов в периферической крови или костном мозге при различных хронических лимфопролиферативных заболеваниях.

2. Установить иммунофенотипический диагноз лимфопролиферативного заболевания.

3. Сопоставить результаты иммунофенотипирования с клинической картиной и данными морфологических и цитогенетических методов исследования для постановки окончательного диагноза.

4. Для I этапа иммунофенотипирования создать панель наиболее информативных трехцветных комбинаций моноклональных антител и разработать алгоритм предварительной дифференциальной диагностики хронических лимфопролиферативных заболеваний.

5. На основании результатов I этапа иммунофенотипирования создать панель трехцветных комбинаций антител для II этапа и разработать алгоритм дифференциальной диагностики вариантов хронических В- и Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

Научная новизна исследования.

Выявлены редкие иммунологические варианты В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) - С05+С023~В-ХЛЛ, С05"СВ2313-ХЛЛ, лимфомы из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) - СБ5+С023+ЛКМЗ и изучены их иммунофенотипические особенности. Впервые установлено, что для дифференциации В-клеточного хронического лимфолейкоза, включая редкие иммунофенотипические варианты СБ5-негативного В-ХЛЛ и С023-негативного В-ХЛЛ, от других хронических В-клеточных ЛПЗ диагностически наиболее значимым является характер экспрессии антигенов БМС7, СБ79Ь, СВ22.

Получены новые данные о том, что иммунологический вариант С05+СВ23~В-ХЛЛ, в отличие от классического С05+С023+В-ХЛЛ, характеризуется умеренной интенсивностью экспрессии антигенов СБ20, Зт^к и более высокой интенсивностью флюоресценции общелейкоцитарного антигена СБ45.

Впервые обнаружено, что редкий иммунофенотипический вариант С023-позитивного ЖМЗ характеризуется более высокой степенью экспрессии антигена С019, в отличие от типичного С05+СВ23~ЖМЗ.

Получены новые данные, позволяющие использовать в качестве дифференцирующих признаков интенсивность флюоресценции антигенов СЭ45, СБ 19, СВ20 для дискриминации опухолей из зрелых В-клеток.

Практическая значимость работы.

Предложенная панель трехцветных комбинаций антител и разработанный алгоритм предварительной дифференциальной диагностики для первого этапа иммунофенотипирования хронических В- и Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний позволяют предположить вариант опухоли из зрелых Т- или В-клеток по характеру экспрессии антигенов и распределения клеток на гистограммах по сигналам ББСД^С и 88С/С045.

Модифицированные панель трехцветных комбинаций антител и алгоритм дифференциальной диагностики вариантов хронических В- и Т-лимфопролиферативных заболеваний на втором этапе иммунофенотипирования уточняют вариант опухоли из зрелых В- или Т-клеток.

Применение трехцветной панели МКА позволяет получить стабильную максимальную чувствительность анализа и достоверные результаты для исследований на однолазериых и двухлазерных проточных цитометрах и является наиболее надежным в диагностическом и выгодным в экономическом аспектах. Проведение иммунофенотипирования на начальных этапах обследования пациента, в соответствии с предложенными алгоритмами, позволяет поставить точный диагноз, что приводит к уменьшению времени пребывания пациентов в стационаре и своевременному назначению адекватного лечения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распределение клеток на гистограммах по сигналам светорассеяния БвС/РЯС, 88С/СБ45 и средняя интенсивность флюоресценции антигенов С045, С019, СБ20 имеют диагностическое значение для дифференциации хронических В-клеточных ЛПЗ.

2. Основными дифференциально-диагностическими признаками классического (С05+С023"ь) и неклассических вариантов (С05+СВ23~ и СОЗТШЗ*) В-ХЛЛ являются отсутствие экспрессии или слабая интенсивность экспрессии антигенов РМС7, СБ79Ь, СБ22. Иммунофенотипическими особенностями неклассических форм В-ХЛЛ и ЛКМЗ являются: более высокая интенсивность экспрессии антигенов С020, Бт^к, СБ45 для С05+С023~В-ХЛЛ, и более выраженная степень экспрессии антигена СБ 19 для СБ5+С023+ЛКМЗ.

3. Модифицированные панели трехцветных комбинаций диагностических антител, алгоритмы I и II этапов иммунофенотипирования с учетом интенсивности флюоресценции антигенов позволяют сократить время проведения анализа и количество используемых антител, не снижая точности диагностики варианта ЛПЗ.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Материалы настоящей работы нашли практическое применение в учебном процессе и научно-практической деятельности кафедры факультетской терапии и НИО нанобиотехнологий НИЦ ВМедА им С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования.

Основные положения' работы обобщены и доложены на XVII Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2009), на 1 Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), на научной конференции с международным участием «Наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее», посвященной 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова. Секция 11 «Клиническая лабораторная диагностика: настоящее и будущее».

По материалам исследования опубликовано б печатных работ, в том числе 3 научные статьи, в журналах реферируемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 11 таблиц и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 18 отечественных, 119 зарубежных публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена в 2003-2010 гг. на кафедре факультетской терапии (начальник кафедры - доктор медицинских наук профессор В.В. Тыренко) и НИЛ общей иммунологии и иммуногенетики НИО нанобиотехнологий НИЦ (начальник НИО доктор медицинских наук профессор A.M. Иванов) Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург).

Материалом исследования служили образцы костного мозга или периферической крови (стабилизированные гепарином 50 ед/мл) 79 пациентов, находившихся на лечении в клинике факультетской терапии ВМедА в связи с подозрением на хронический лейкоз/лимфому в фазе лейкемизации. Возраст больных находился в пределах от 41 до 55 лет, медиана возраста составила 46 лет. Подавляющее большинство обследованных являлись лицами мужского пола 59 человек (75%), женщины составили 20 человек (25%).

При обследовании больных проводили общеклинический анализ крови, биохимическое исследование крови, стернальную пункцию костного мозга с цитологическим и цитог,енетическими исследованиями, трепанобиопсию. Окончательный диагноз устанавливали после сопоставления результатов клинико-морфологических, цитогенетических и иммунофенотипических исследований.

Иммунофенотипирование выполняли на проточных цитометрах FACScan фирмы «Becton Dickinson» США и Cytomics FC500 фирмы «Beckman Coulter» США. Для процедуры анализа использовали ядросодержащие клетки периферической крови и костного мозга в концентрации 5,0 8,0 х 109/л. Выделение клеток осуществляли с помощью стандартной методики лизиса эритроцитов с последующим центрифугированием (Луговская С.А., 2005). Для иммуиофенотипирования использовали панель диагностических МКА (табл. 1), применяемую в отделе иммунологии университета Эразмус (Нидерланды), одного из мировых лидеров в области онкогематологических исследований (Ван Донген Ж., 2002). Диагностическая панель состояла из трехцветных комбинаций мышиных моноклональных антител («Becton Diskinson» США и «Becman Coulter» США), конъюгированиых с одним из красителей флюоресцеинизотиоцинат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (зеленый спектр), фикоэритрин (РЕ) FL-2-детектором (оранжевая флюоресценция), белок хлорофилла - перидинхлорофилл протеин (РегСр) или тандем фикоэритрин/цианин-5 (РС5) - FL-3 детектором (глубокая красная флюоресценция).

б

В результате работы используемая диагностическая панель была модифицирована и стала более экономичной.

Таблица 1

Панель трехцветных моноклональных антител для иммунофенотипирования хронических лимфопролиферативных

заболеваний

1 этап иммунофенотипирования (определение линейной принадлежности) II этап иммунофенотипирования для В-кпеточных ХЛЛ/НХЛ (классификация) II этап иммунофенотипирования для Т- клеточных ХЛЛ/НХЛ (классификация)

1. SmIgK/SmIgX/CD19 (моноклональные В-кпетки) 2. CD4/CD8/CD3 (реактивные клетки/хронические Т-клеточные ХЛЛ/НХЛ) 3. CD38/CD16.56/CD3 (ММ/ЛБГЛ) 4. CD3/CD19/CD45 (дифференцировка) 5. CD5/CD23/CD19 (В-ХЛЛ/ЛКМЗ) 6. CD 103/CD11 c/CD 19 (ВКЛ) 7. FMC7/CD10/CD20 (ФЛ) 8. IgM/IgD/CD19 (IgH экспрессия) 9. IgGflgA/CD19 (IgH экспрессия) 10. CD103/CD25/CD19 (ВКЛ) 11. CD22/CD79b/CD24 (зрелые В-клетки) 5. С02/СБ7/СВЗ (пан Т-клетки) 6. С057/С016/С03 (Т-/НК-ЛБГЛ) 7. С02/НЬА-0К/С025 (реактивные клеткн/ПСЛ/ЛВ 8. С01а/С05/С07 (ПЛ/Т-ОЛЛ) 9. ТСИсф/ТСИуб/СОЗ (ТСИ-комплекс) 10. суС03/С05б/С03 (Т-ЛБГЛ/НК-клетки) 11.суТсЛ7С05/С019 (незрелые Т-/В-клеткн) 12. СОв/НЬА-ОК/СБЗ (реактивные клсткн/ЛБГЛ)

Для определения негативной или позитивной экспрессии антигена клетками в каждом случае использовался негативный контроль с изотопическими мышиными антителами IgGl/IgG2/CD45. Учет результатов осуществляли на основании анализа 10 ООО событий. Экспрессию маркера считали позитивной, если его экспрессировали не менее 20% опухолевых клеток.

В настоящем исследовании помимо определения процента клеток, экспрессиругащих тот или иной антиген, также проводили оценку степени (интенсивности) экспрессии антигена в зависимости от яркости флюоресценции с выделением популяций клеток dim, moderate и bright (Куртова A.B. и др., 2008; Dunphy С.Н. et al., 2007). Для оценки интенсивности положительной экспрессии при описании иммунофенотипа использовали следующую градацию: интенсивность экспрессии считали «слабой» (dim), если область распространения клеток на графиках была >10' < 102; «умеренной» (moderate, mod ) - если >102 <103, «яркой» (bright) - если > 103. Для антигенов CD45, CD 19, CD20, CD5, CD23 проводили количественную оценку средней интенсивности флюоресценции (MFI -mean fluorescence intensity).

Исходные данные были получены при использовании версий программного обеспечения RXP 1.0. (Cytomics FC-500) и CellQuest (FACSscan) и подвергались статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statistica 8.0 для Windows. Применяли следующие математико-статистические методы: 1) описательная статистика количественных данных в группах; 2) сравнение групп с помощью рангового непараметрического метода U-критерия Манна-Уитни; 3) корреляционный анализ (коэффициент корреляции - г) двух признаков непараметрическим методом Спирмена.

Результаты исследования

На основании иммунофенотипического анализа клеток костного мозга/периферической крови сопоставленного с данными клинических, морфологических и цитогенетических исследований у 79 пациентов с подозрением на хронический лейкоз/лимфому в фазе лейкемизации были установлены окончательные диагнозы следующих вариантов лимфопролиферативных заболеваний (табл. 2).

Таблица 2

Результаты обследования пациентов с хроническими лимфопролиферативными заболеваниями

№ Установленный вариант ЛПЗ Количество пациентов п

В-клеточные ЛПЗ (88%)

1 Волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) б

2 В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) 49

3 В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (В-ПЛЛ) 1

4 Лимфома селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами (ЛСВЛ) 5

5 Лимфома из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) 3

6 Лимфома Беркитта 2

7 Острый плазмобластиый (плазмоклеточный) лейкоз 1

Т-клеточные ЛПЗ (12%)

8 Т-клеточный пролимфоцитарный лейкоз (Т-ПЛЛ) 1

9 Т-клеточная лимфома кожи (ТКЛК) (грибовидный микоз/синдром Сезари) 1

10 Т-клеточиый лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов (Т-ЛБГЛ) 7

11 Злокачественная природа клеток не подтвердилась 3

Всего 79

Полное совпадение результатов диагностики методом проточной цитометрии с клинической картиной и данными морфологических методов обследования на основе REAL и ВОЗ классификаций составило 91% (72 из 79 случаев). В результате проточно-цитометрического исследования у 67 (88% ЛПЗ) пациентов была установлена В-клеточная природа лимфоидных опухолевых клеток (CD19+CD45+), а в 9 (12% ЛПЗ) случаях лейкозные клетки имели Т-клеточное происхождение (CD3+CD45).

Злокачественную природу В-лимфоцитов у пациентов со зрелыми В-клеточными опухолями определяли по наличию поверхностной экспрессии только одной из легких цепей иммуноглобулинов и аберрантной экспрессии CD-маркеров.

В нашем исследовании позитивная экспрессия легких каппа-цепей иммуноглобулинов была обнаружена в 78% случаев, а лямбда-цепей - в 22% случаев В-клеточных ЛПЗ. В 3 случаях (4% обследованных) иммунофенотип анализируемой популяции клеток соответствовал нормальным лимфоцитам. Они не были моноклональными, у них не наблюдалось аберрантной экспрессии или утраты антигенов, что опровергало злокачественную природу исследуемых клеток. У этих пациентов метод проточной цитометрии не подтвердил предварительный клинико-морфологический диагноз лимфопролиферативного заболевания.

Следует отметить, что при анализе иммунофенотигшческих особенностей опухолевых клеток диагностическое значение имела картина распределения лимфоцитов на гистограмме по сигналам бокового (SSC) и прямого (FSC) светорассеяния. Так, у больных ВКЛ при выделении лимфоцитов по сигналам SSC и FSC, в отличие от В-ХЛЛ, В-ПЛЛ, ЛКМЗ и ЛСВЛ, было обнаружено разделение на две и даже три субпопуляции, одна из которых характеризовалась нормальной для данного типа клеток картиной светорассеяния (субпопуляция R1), а другие - несколько более высокими показателями SSC (субпопуляции R2 и R3) (рис. 1 - а, Ь, с).

Рис. 1. Точечные гистограммы распределения лимфоцитов по сигналам ЗБС/РБС: а - при В-ХЛЛ, В-ПЛЛ; ЛКМЗ, ЛСВЛ; Ь, с - при ВКЛ. В гейте Rl расположены нормальные лимфоциты, в гейтах R2 и R3 -злокачественные клетки.

В этих случаях требовалось доказать злокачественность клеток каждой из выделенных субпопуляций. Доказательства были получены при анализе клеточного состава этих субпопуляций и последующем исследовании характера экспрессии легких цепей lg.

Субпопуляция R1 содержала нормальные Т- (CD3+CD45+) и В-(CD19+CD45+) лимфоциты в соотношении 6:1 (характерное распределение нормальных лимфоцитов). Субпопуляции R2 и R3 были представлены практически только В-клетками (CD19+CD45+) и экспрессировали исключительно поверхностные легкие к-цепи или только Х.-цепи Ig, что доказывало моноклональное происхождение этих клеток. Последующие исследования выявили иммунофенотип CD25+CD103+CD1 lc+CD24~, который позволил поставить диагноз ВКЛ (De Totero D. et al., 1993, General Haematology Task Force of BCSH, 1994).

Нетипичную картину распределения клеток на гистограмме SSC/CD45 по сравнению с другими ЛПЗ имели образцы костного мозга при лимфоме Беркитта и остром плазмоклеточном лейкозе, что также имело диагностическое значение. На графике (рис. 2 - а, Ь, с) были обнаружены 2 популяции клеток одна из которых занимала область расположения нормальных лимфоцитов и имела низкие значения SSC и была яркой rio CD45 (субпопуляция R1), а другая (субпопуляция R2) -более высокие показатели SSC и более низкие CD45 (dim). Дальнейшие исследования показали, что субпопуляция R1 содержала нормальные Т-(CD3+CD45+) и В- (CD19+CD45+) лимфоциты. Субпопуляция R2 была представлена в основном только В-клетками.

CD4SPCS

Рис. 2. Точечные гистограммы распределения лимфоцитов по сигналам 88С/СЭ45: а - при В-ХЛЛ, В-Г1ЛЛ, ЛКМЗ, ЛСВЛ; Ь - при ЛБ; с -при ОПЛ. В гейте Rl расположены нормальные лимфоциты, в гейте 112 -злокачественные клетки.

В 2-х случаях с лимфомой Беркитта В-лимфоциты субпопуляции 112 экспрессировали у одного больного исключительно поверхностные легкие к-цепи а у другого - что явилось доказательством

моноклонального происхождения этих клеток. Последующие

исследования выявили иммунофенотип злокачественных В-лимфоцитов при лимфоме Беркитта CD19+CD10+CD20+

В случае с ОПЛ трансформированные В-клетки не экспрессировали Т-, В-клеточные и миелоидные антигены, а были позитивны по CD38+, CD16+56+, HLA-DR+, что характерно для плазмобластов.

Анализ иммунофенотипических особенностей опухолевых клеток при хроническом В-лимфолейкозе показал, что в 98% случаев наблюдалась слабая (dim) интенсивность экспрессии CD20 и поверхностных легких цепей иммуноглобулинов Smlg. По данным литературы также отмечается относительно низкая интенсивность экспрессии этих антигенов у больных хроническим В-лимфолейкозом (Кау N.E. et al, 2002; Sara Monaghan et. al., 2003). Такая плотность экспрессии наблюдается исключительно при В-ХЛЛ, что свидетельствует о высокой диагностической значимости характера экспрессии CD20 при В-клеточных хронических пролиферациях. Экспрессия антигенов CD5 (96% случаев В-ХЛЛ) и CD23 (98% случаев В-ХЛЛ) наблюдалась у 46 и 48 пациентов соответственно. Типичный В-ХЛЛ также характеризовался отсутствием экспрессии FMC7, негативной или слабопозитивной экспрессией CD22, CD79b.

Дифференциация между В-ХЛЛ и ЛСВЛ с типичным иммунофенотипом характеризовалась следующими признаками: степенью экспрессии CD20 (moderate, MFI =293,3 при ЛСВЛ против dim, MFI = 23,8 при В-ХЛЛ), CD22 (moderate при ЛСВЛ против -/dim при В-ХЛЛ); отсутствием экспрессии CD5 и CD23 при ЛСВЛ за редким исключением; положительной экспрессией FMC7, CD79b при ЛСВЛ и, как правило, ее отсутствием при В-ХЛЛ.

Анализ иммунофенотипических особенностей классического иммунологического варианта ЛКМЗ показал, что основными отличительными признаками этой лимфомы в стадии лсйкемизации от классического В-ХЛЛ являются: степень экспрессии антигена CD20 (moderate, MFI =201,2 при ЛКМЗ против dim, MFI = 23,8 при В-ХЛЛ), позитивность по FMC7, CD79b и CD22, отсутствие экспрессии по CD23.

Иммунофенотип опухолевых клеток при ЛСВЛ отличался от типичного ЛКМЗ по интенсивности экспрессии CD 19 (MFI =142,7 при ЛСВЛ против MFI = 75,7 при ЛКМЗ) и отсутствию экспрессии CD5 антигена.

Были обнаружены 3 редких для В-ХЛЛ фенотипа опухолевых В-лимфоцитов CD 19+CD23+CD5", CD19+CD23~CD5+, CD19+CD20". В 94% случаев В-ХЛЛ лейкозные лимфоциты экспрессировали антиген CD20 и в 6% случаев были негативны по его экспрессии. Три CD20- и два CD5-негативных случая В-ХЛЛ, тем не менее, сохраняли другие иммунофенотипические черты присущие В-ХЛЛ - позитивную экспрессию CD23 антигена, слабую интенсивность экспрессии CD20,

SmlgK и были негативны по FMC7, CD79b, CD22, что отличает B-XJIJT от других В-клеточных ЛПЗ.

Сложную диагностическую задачу представлял собой единственный случай CD5+CD23"B-XJ1JI. Его было необходимо дифференцировать с классическим CD5+CD23~JIKM3. Лейкозные клетки при этом иммунофенотипическом варианте В-ХЛЛ характеризовались умеренной (moderate) степенью экспрессии антигена CD20 (MFI = 161) и легкой к-цепи иммуноглобулина. Трансформированные лимфоциты в этом случае также показывали более высокую интенсивность экспрессии CD45 антигена (MFI = 89,6), чем у С023-позитивных В-ХЛЛ (MFI = 63,8±4,9). По другим признакам этот иммунофенотипический вариант соответствовал В-ХЛЛ, опухолевые клетки были негативны по FMC7, CD22 и слабопозитивны по CD79b, что отличало его от ЛКМЗ. Для окончательного установления диагноза были проведены цитогенетические исследования. У пациента была обнаружена трисомия 12 хромосомы, часто встречающаяся при В-ХЛЛ, а специфическая для ЛКМЗ транслокация t (И; 14) не была выявлена, что подтвердило предварительный иммунофенотипический диагноз С023-негативный В-ХЛЛ.

Также довольно трудно было дифференцировать нетипичный вариант CD5+CD23^KM3 от классического СБ5+С023+В-ХЛЛ. В этом случае основными отличиями явились: интенсивность экспрессии CD20 (moderate, MFI =449,0 при ЛКМЗ против dim, MFI = 23,8 при В-ХЛЛ), положительная экспрессия FMC7, CD79b, CD22 при ЛКМЗ. Интенсивность экспрессии CD23 при этом редком варианте ЛКМЗ соответствовала максимальным значениям этого антигена при В-ХЛЛ. Решающим фактором стало обнаружение специфичной для ЛКМЗ транслокации t (11;14). Найденная транслокация и нетипичный для ЛКМЗ нммунофенотип CD5+CD23+ позволили поставить окончательный иммунофенотипический диагноз ЛКМФ (лимфома из клеток мантии фолликулов).

Определенные трудности представляла собой дискриминация редкого варианта С05~С023+ЛСВЛ с двумя иммунологически нетипичными вариантами СВ5"СТ)23+В-ХЛЛ. Иммуиофенотипически друг от друга эти варианты отличались по интенсивности флюоресценции антигенов CD20 (moderate, MFI =323,2 при СЭ23+ЛСВЛ против dim, MFI = 22,0-87,8 при С05~В-ХЛЛ), CD 19 (moderate, MFI =180,4 при С023+ЛСВЛ против dim, MFI 22,2-46,2 при С05~В-ХЛЛ) и положительной экспрессией FMC7, CD79b, CD22 при С023+ЛСВЛ (при С05"В-ХЛЛ негативная).

Особенностью иммуиофенотипа единственного случая В-клеточного пролимфоцитарного лейкоза была позитивность по CD5 антигену, тогда

з*

как обычно В-ПЛЛ по экспрессии этого антигена негативен. Главными дифференциальными признаками между В-ПЛЛ и В-ХЛЛ, ЛКМЗ, ЛСВЛ являлись яркая (bright) степень экспрессии поверхностных легких цепей Ig (в данном случае Igte) и содержание в костном мозге более 55% пролимфоцитов. Было установлено, что иммунологический вариант CD5+CD23 "В-ПЛЛ отличался от CD5+CD23 "В-ХЛЛ по положительной экспрессии FMC7, CD22, CD79b при В-ПЛЛ, а от классического варианта CD5+CD23VIKM3 - по степени экспрессии CD20 на опухолевых клетках, которая была значительно ниже при В-ПЛЛ (CD5+CD23~B-RJLJ] MFI = 76,3 против CD5+CD23"\TIKM3 MFI = 201,2).

Исследование иммунофенотипических особенностей опухолевых клеток при различных формах ЛПЗ подтвердило диагностическую важность не только определения антигенного профиля, но и оценки интенсивности экспрессии антигенов трансформированными лимфоцитами. На основании проведенных исследований была уточнена интенсивность экспрессии маркеров важных для дифференциальной диагностики хронических ЛПЗ. Результаты сравнительного анализа показали, что наиболее высокие значения интенсивности флюоресценции CD45, CD 19, CD20 характерны для ВКЛ-клеток (MFI = 119,2 ± 12,9; 255,1 ± 54,5; 350,5 ± 55,0 - соответственно), выраженные - для ЛСВЛ (MFI = 91,9 ± 8,3; 142,7 ± 48,9; 293,3 ± 47,6 - соответственно) и самые низкие -для В-ХЛЛ (MFI = 63,8 ± 4,9; 55,9 ± 4,4; 23,8 ± 3,2 - соответственно), что согласуется с имеющимися данными литературы (CaruHi G. et al., 2008). Наряду с В-ХЛЛ низкие значения интенсивности флюоресценции CD 19 демонстрировал классический вариант ЛКМЗ (MFI = 75,7 ± 8,6). Интенсивность экспрессии CD 19, CD20, CD23, CD5 на опухолевых клетках при С023+ЛКМЭ оказалась значительно выше, чем па популяции лейкозиых лимфоцитов при типичном В-ХЛЛ.

В результате корреляционного анализа было обнаружено, что общей закономерностью для хронических В-ЛПЗ оказалась прямая взаимозависимость яркости экспрессии CD 19 и CD45. В группе высокодифференцироваиных малигнизаций (В-ПЛЛ, ВКЛ, ЛСВЛ, ЛКМЗ), была обнаружена прямая корреляционная связь между интенсивностью экспрессии антигена CD19 (г=0,64; п=12; р=0,024), относительным количеством CD20* лимфоцитов (г=0,57; п=13; р=0,04) с одной стороны и относительным количеством РМС7-позитнвпых клеток с другой, тогда как у больных В-ХЛЛ такая закономерность отсутствовала. Эти данные подтверждают высокую диагностическую значимость антигена FMC7 для дифференциации В-ХЛЛ от других В-клеточиых ЛПЗ.

Для дифференциальной диагностики хронических Т-клеточпых пролиферации важную роль играет наличие или отсутствие экспрессии антигенов CD8, CD4, CD57, CD16, CD56 (Zambello R., 1998; Ahmad Е.,

2005; Sandberg Y., 2006). Моноклональность образования Т-клеточного происхождения косвенно определяли по преобладанию CD4 или CD8 субпопуляций Т-лимфоцитов, аберрантному соотношению CD4/CD8 и TcRap/TcRyS.

Диагностированный единственный случай Т-ПЛЛ по иммунофенотипической характеристике соответствовал классическому типу данного лейкоза. Лейкозные клетки экспрессировали антигены CD3, CD4 и CD7 (bright), CD5, CD2. Интенсивность экспрессии TcRa/p была умеренной (moderate). Экспрессия антигенов CD25 и HLA-DR отсутствовала.

Клетки опухолевого клона при диагностике единственного случая ГМ/синдрома Сезари были позитивны по CD3, CD4, CD5, CD2 антигенам и негативны по CD25, основным В-лимфоцитарным и NK-клеточным антигенам. Следует отметить, что интенсивность флюоресценции TcRa/p была слабой (dim). В диагностируемом нами случае ГМ/синдрома Сезари на трансформированных Т-лимфоцитах отсутствовала экспрессия антигенов CD7 и HLA-DR.

Характерными иммунофенотипическими чертами случаев диагностированных как Т-ЛБГЛ была умеренная интенсивность экспрессии Т-клеточиых антигенов CD3, TcRa(3\ CD8, CD2, CD7 и низкая интенсивность экспрессии антигена CD5 (dim). На опухолевых лимфоцитах наблюдалась коэкспрессия маркера натуральных киллеров CD57 и активационного антигена HLA-DR. Экспрессия CD16 и CD56 отсутствовала.

На основании проведенных нами исследований была оптимизирована трехцветная панель диагностических MICA (табл. I) для иммунофенотипирования различных форм хронических

лимфопролиферативных заболеваний и разработаны алгоритмы их дифференциальной диагностики.

Применение трехцветных комбинаций антител имеет определенное преимущество по сравнению с окрашиванием клеток 4-мя и более флюорохромами, в последнее время активно внедряющихся в диагностическую практику. Во-первых, легче подобрать правильное наложение компенсаций необходимое для максимальной чувствительности анализа, неверная установка которого может исказить результаты и снизить надежность диагностики. Во-вторых, трехцветную панель можно использовать в медицинских учреждениях, имеющих проточный цитометр как с одним, так и с двумя лазерами, тогда как для применения большего количества окрашенных антител требуется более дорогой двухлазерный проточный цитометр.

Для составления оптимальной панели с учетом выявленных иммунофенотипических особенностей опухолевых клеток при проведении проточно-цитометрического анализа были выбраны антитела наиболее

значимые для диагностики хронических ЛПЗ. В оптимизированной панели МКА, также как и в ранее используемой, первый этап иммунофенотипирования является общим для всех хронических ЛПЗ и позволяет определить Т- или В-клеточнуга природу опухоли. Кроме того, этот этап с предлагаемой комбинацией антител достаточно информативен и позволяет предварительно предположить вариант выявленной линии зрелого новообразования по характеру экспрессии антигенов в соответствии с алгоритмом, представленном на рис. 3.

Если установлено, что трансформированные клетки имеют В-клеточное происхождение, то по интенсивности экспрессии С020 можно предполагать наличие В-ХЛЛ (если С020а1т) или другого варианта В-клеточной опухоли (если С020то£1). По специфической картине распределения клеток на гистограмме ЗБС/РБС (рис. 1) и выраженной интенсивности экспрессии всех трех антигенов С045, СБ 19, С020 можно предполагать наличие ВКЛ. По специфической картине распределения клеток на графике 88С/С045 (рис. 2) и положительной экспрессии СОЮ можно предполагать наличие лимфомы Беркитта, а при положительной экспрессии СО 19, СО 16, С056 и отсутствии экспрессии других В-клеточных маркеров - ММ или ОПЛ. Если опухоль Т-клеточная, то по фенотипу С03+С04"С08+ и отсутствию экспрессии маркеров ЫК-клеток (С016 и С056) можно предположить Т-ЛБГЛ, а по фенотипу С03+С04+С08" - Т-ПЛЛ или ГМ/СС.

В оптимизированной панели сокращается время проведения первого этапа за счет того, что комбинация 8т1§к/8т1§Х/С019 используется па втором этапе (если установлена В-1слеточная природа опухоли), так как для анализа Бт^с/Х требуется четырехкратная отмывка пробы, что занимает немало времени. Отмывка легких цепей иммуноглобулинов проводится параллельно с пробоподготовкой первого этапа иммупофенотипирования.

Панель диагностических МКА (I этап)

1. CD3 FITC / CD19 РЕ / CD45 РегСР или РС5

2.CD10FITC / CD20PE / CD45 РегСР или РС5

3.CD4FITC / CD8PE / CD3 РегСР или РС5

4. CD 16 FITC / CD56PE / CD3 РегСР или РС5

CD19+»CD3+ (В-клеточные ЛПЗ)

Лимфоциты на графике SSC/FSC и SSC/CD45 располагаются гомогенно

CD19-CD3-

MFI MFI ш\

CD4SO) CD45(t) CD45CTT)

MFI МП MFI

CDI9CT) CD19(t) CD19(TT)

CD20 dim/- CD20 mod CD20 mod

CDI0- CDI0- CD10-

CD4-CD8- CD4-.CD8- CD4-.CD8-

CDI6- CDI6-, CD16-,

CD56- CD56- CD56-

1 1 \

В-ХЛЛ? лкле? ЛСВЛ?

В-ПЛЛ?

V 1.

CD20 mod CD 10 dim CD4-CD8-CD16-CD56-

Лимфоциты на графике SSC/FSC или SSC/CD45 располагаются гетерогенно

I

CD3+»CD19+ (T-клеточные ЛПЗ)

MFI CDA5 dim CD45 dim CD20- CD20-

CD45(iTT) CD20+ CD20- CD10- CDI0-

MFI CDI0+ CDI0- CD4+ CD4-

CDI9(m) CD4- CD4- CD8- CD8+

CD20 mod CD8- CD8- CD16- CD16-/+

CDIO- CDI6- CDI6+ CD56- CD56-/+

CD4-, CD8- CD56- CD56+

CD16-

CDS6-

1 i 1 1 \

f X Г > f л

ВКЛ ? ЛБ ? MM? ОПЛ ? CD4+ Т-ЛПЗ Т-ЛБГЛ t

V. ^ k. )

Рис. 3. Алгоритм I этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых В- и Т-клеток (первичный скрининг и определение линейной принадлежности): В-ХЛЛ хронический В-лимфолейкоз; В-ПЛЛ - В-клеточный пролимфощггарныП лейкоз; ВКЛ - волосатоклеточнын лейкоз; ЛСВЛ - лимфома маргинальной зоны селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами; ЛКМЗ - лимфома га клеток мантийной зоны; ФЛ - фолликулярная лимфома; ЛБ - лимфома Берюпта; ОПЛ - острый плазмобластный лейкоз; Т-ЛБГЛ - Т-лейкоз из больших гранулярных лимфоцитов. (-) - негативная экспрессия; (+) - позитивная экспрессия; (dim) - слабая степень экспрессии; (mod) -умеренная степень экспрессии; MFI - средняя интенсивность флюоресценции: (Т) - наименее выраженная, (ТТ) - выраженная, (Iff) - наиболее

выпаженная.

Второй этап иммунофенотипирования мы проводили в соответствии с установленной на первом этапе линией ЛПЗ - В- или Т-клеточной. Если было выявлено В-клеточное происхождение трансформированных клеток в зависимости от информации, полученной после проведения первого этапа, составляли трехцветную панель диагностически значимых МКА согласно предполагаемой форме В-клеточного ЛПЗ в соответствии с рис. 4.

Антиген CD24 рационально включать в диагностическую панель второго этапа только для подтверждения волосатоклеточного лейкоза, потому что этот антиген всегда экспрессируется при других формах В-ЛПЗ и для их дифференциации малоинформативен. Комбинация с поверхностными легкими цепями иммуноглобулинов SmlgK/SmJgX/CDl 9 обязательна для подтверждения клональности трансформированных клеток большинства форм В-клеточных ЛПЗ, за исключением множественной миеломы и острого плазмобластного лейкоза, для которых целесообразно определять легкие цепи Ig в цитоплазме. Экспрессия cylgic- или cyIgX-цепей обнаруживается при ММ, но отсутствует при ОПЛ. Диагностическая панель 2-го этапа иммунофенотипирования для дифференцирования ЛБ, ММ и ОПЛ не требует большого количество МКА ввиду их уникального иммунофенотипа. Для диагностики В-ХЛЛ на втором этапе, помимо положительной экспрессии CD5+CD23+, наиболее значимыми маркерами являются FMC7~/dim, CD79b'/dim и CD22~/dim, которые надежно отличают В-ХЛЛ от других типов В-клеточных ЛПЗ, даже при отсутствии экспрессии CD5 или CD23 при В-ХЛЛ. Поэтому в предлагаемую нами диагностическую панель для дифференциации классического В-ХЛЛ на 2 этапе иммунофенотипирования мы рекомендуем включать меньшее количество МКА, чем для дифференциации других форм опухолей из зрелых В-клеток. При отсутствии экспрессии CD23 антигена и повышении интенсивности флюоресценции CD20 и легких цепей Ig важным признаком для диагностики В-ХЛЛ служит обнаружение трисомии 12, а для CD23+JIKM3 - циклина D1 и t (11; 14).

Для дифференциальной диагностики опухолей из зрелых Т-клеток панель второго этапа, по сравнению с ранее используемой, была сокращена с 8 до 6 проб и стала более экономичной. Диагностическая надежность при этом не снизилась. В эту панель вошли маркеры наиболее значимые для классификации Т-клеточных ЛПЗ. Разработанный алгоритм 2-го этапа иммунофенотипирования представлен на рис. 5. Комбинация с поверхностными Т-клеточными рецепторами TcRap/TcRy5/CD3 обязательна для косвенного подтверждения клональности трансформированных Т-клеток. Отсутствие экспрессии TcR, CD3 и положительная экспрессия таких Т-клеточных маркеров как CD2, CD7 и CD57 предполагает наличие варианта NK-клеточного хронического лейкоза. Т-ЛБГЛ от других вариантов Т-клеточных ЛПЗ отличает положительная экспрессия антигенов CD57 и HLA-DR на поверхности

лейкозных Т-клеток. Яркость экспрессии антигена CD7 позволяет дифференцировать Т-ПЛЛ от других Т-ЛПЗ. При неясной картине первого этапа иммунофенотипирования необходимо расширить набор МКА для получения дополнительной информации.

Таким образом, в соответствии с поставленной целью и объемом решаемых задач исследования проведено иммунофенотипирование клеток образцов периферической крови/костного мозга 79 пациентов. В каждом случае определен характер экспрессии основных дифференциальных антигенов и поставлен иммунофенотипический диагноз. Проведено сравнение полученных результатов с клиническими проявлениями и данными морфологических и цитогенетических методов исследования. Частота совпадения диагнозов составила 91% (72 из 79 случаев), причем в 4% случаев проточно-цитометрический анализ не подтвердил предварительный клинико-морфологический диагноз хронического ЛПЗ, а у 4 пациентов (5% обследованных) с неясной морфологической картиной был установлен диагноз Т-ЛБГЛ только с помощью иммунофенотипирования. В настоящей работе была оценена диагностическая значимость интенсивности флюоресценции маркеров CD45, CD 19, CD20, CD23 и CD5. Выявлен и охарактеризован «аномальный» иммунофенотип CD19+CD5+CD23+ ЛКМЗ. Были обнаружены и охарактеризованы 3 нетипичных для В-ХЛЛ иммунофенотипических варианта опухолевых В-лимфоцитов CD19+CD23+CD5~, CD19+CD23~CD5+ CD19+CD20" На основании оценки антигенного профиля и интенсивности флюоресценции маркеров, расширяющей характеристику опухолевого клона, была оптимизирована панель диагностических MICA и разработаны алгоритмы дифференциальной диагностики опухолей из зрелых В- и Т-клеток. Полученные данные подтверждают высокую значимость проточной цитометрии в диагностике выделенных в REAL (1994) и ВОЗ (1997 - 2008) классификациях вариантов хронических лейкозов и неходжкипскпх лимфом в фазе лейкемизации. Проведение иммунофенотипирования на ранних этапах обследования пациента позволяет поставить точный диагноз, что приводит к уменьшению времени пребывания пациентов в стационаре и своевременному назначению адекватного лечения.

Предварительный диагноз I этапа нммунофенотшшроваыня

Панель диагностических МКЛ

(II этап) XIя дифференциации В-ХЛЛ

5. SmlgK/ Smlg)./ CDI9

6. CD5/CD23/CD19

7. CD22/CD79b/ CD19

8. FMC7/CD38/CD19

• r

Smlg dim - " CD5+ ~- ■ '-'•.. CD23+ CD22 dim/-CD38+/-* \ " FMC7-/dim • . CD79Wdim Smlg dim CD5- CD23+- CD22 dim/- . CD38+/-* FMC7-/dim CD79b-/dim

1

В-ХЛЛ r ^ CD5-В-ХЛЛ

Панель диагностических МКА(Нтгап) для дифференциации В-ХЛЛ, ЛСВЛ, ЛКМЗ, ВКЛ, ФЛ

5. SmlgK/ Smlg)./CD 19

6. CD5/ CD23/CDI9

7. CD22/ CD79b/ CD 19

8. FMC7/CD38/CD19

9. CD 103/ CD24 / CD 19

10. CD25/ CD1 \cl CD19

Панель диагностических МКЛ (II лап) для дифференциации ЛБ от В-ОЛЛ

5. SmIgK/SmIgA/CD19

6. HLADRj'cyTdT/CD 19

^ / 1 T ■

Smlg mod CD5+ CD23-CD22 dim/-CD38+/-* FMC7-'dim CD79b dim/-CDI lc mod Трисомия 12 Smlg ^ CD5+ CD23- CD22+ CD19dim FMC7+ CD"9b+ Цикяин Dh t <11;I4) Smlg + CD5+ CD23+ CD22+ CD19 mod FMC7- CD79b+ Цнклин D1+ 1(11:14) Smlg + CD5- CD23- CD22+ CDllci-+ FMC7+ CD79b+ CD25- Smlg bright CD5-/+ CD23-/+ CD22+ FV1C7+ CD79b+ > 55% пролимфо 1ХИТОВ Smlg mod CD5- CD23- CD22+ FMC7+ CD79b+/~ CDllc* CD25+ CD 103+ CD24- CD5-/+ CD23-/+ CD22+ FMC7+ cyBCL2 I(I4;I8)

CD23-В-ХЛЛ

ЛКМЗ

CD23+ ЛКМЗ

/ - - ——ч (----

ЛСВЛ В-ПЛЛ ВКЛ ФЛ** ЛБ

/ I 1

Рис. 4. Алгоритм П этапа иммунофенотнпирования опухолей из зрелых В-клеток (классификация): В-ХЛЛ - хронический В-лнмфолейкоз; В-ПЛЛ - В-клеточный пролимфошггарный лейкоз; ВКЛ волосатоклеточный лейкоз; ЛСВЛ - лимфо.ма маргинальной зоны селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами; ЛКМЗ - лимфома го клеток мантийной зоны; ФЛ - фолликулярная лимфома; ЛБ - лимфома Берюгтта; В-ОЛЛ-острый В-лимфобластный лейкоз; ММ множественная миелома; ОПЛ - острый плазмобластный лейкоз; (-) - негативная экспрессия; (+) - позитивная экспрессия; (dim) - слабая степень экспрессии; (mod) - умеренная степень экспрессии; (bright) - яркая степень экспрессии; * - прогностический фактор.** -только по данным литературы.

Рис. 5. Алгоритм II этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых Т-клеток (классификация):

Т-ПЛЛ - T-клеточный пролимфошггарныП лейкоз; ТКЛ/ЛВ - T-клеточная лнмфома/леПкоз взрослых; ГМ/СС - грибовидный микоз/синдром Сезари; Т-ЛБГЛ лейкоз ia больших гранулярных лимфоцитов; NK-ХЛПЗ - хроническое лнпфопролифератнвное заболевание in NK-клеток. (-) - негативная экспрессия; (dim) слабая интенсивность экспрессии; (mod) - умеренная интенсивность экспрессии; (bright) - яркая интенсивность экспрессии; * - только по данным литературы.

ВЫВОДЫ

1. Методом проточно-цитометрического исследования у 67 (88% ЛПЗ) пациентов была установлена В-клеточная природа лимфоидных опухолевых клеток (CD19 CD45 ), а в 9 (12% ЛПЗ) случаях лейкозные клетки имели Т-клеточное происхождение (CD3+CD45+). В 3 случаях (4% обследованных) иммунофенотип анализируемой популяции клеток соответствовал нормальным лимфоцитам. Полное совпадение результатов диагностики методом проточной цитометрии с клинической картиной и данными морфологических методов обследования на основе REAL и ВОЗ классификаций составило 91% (72 из 79 случаев).

2. Определение интенсивности экспрессии антигена является обязательным иммунофенотипическим критерием при диагностике опухолей из зрелых В- и Т-клеток.

3. При анализе иммунофенотипических особенностей опухолевых клеток диагностическое значение имеет картина распределения лимфоцитов на гистограммах по сигналам бокового (SSC) и прямого (FSC) светорассеяния - для волосатоклеточного лейкоза, а также по SSC и интенсивности экспрессии CD45 - для лимфомы Беркитта.

4. Диагностическое значение для дифференциации В-ЛПЗ имеет интенсивность флюоресценции антигенов CD45, CD 19, CD20. Наиболее выраженные значения интенсивности флюоресценции CD45, CD 19 характерны для ВКЛ-клеток, выраженные для ЛСВЛ и наименее выраженные - для типичных форм В-ХЛЛ и ЛКМЗ. Лимфома Беркитта характеризуется слабой экспрессией антигена CD45 (dim). Для классического варианта В-ХЛЛ характерна слабая интенсивность экспрессии антигена CD20, для других форм хронических В-ЛПЗ умеренная.

5. Обнаруженные редкие иммунологические варианты В-ХЛЛ, не экспрессирующие антиген CD5 (2 случая) и CD23 (1 случай), как и классический вариант В-ХЛЛ отличаются от ЛКМЗ, ЛСВЛ и В-ПЛЛ отсутствием экспрессии или слабой интенсивностью экспрессии антигенов FMC7, CD79b, CD22.

6. Идентифицирован редкий иммунофенотипический вариант CD5+CD23"В-ХЛЛ, в отличие от классического С05+С023+В-ХЛЛ, характеризующийся умеренной интенсивностью экспрессии антигенов CD20, SmlgK. Интенсивность флюоресценции CD45 у CD5+CD23"B-XJUI была выше, чем у С05+С023+В-ХЛЛ. Лейкозные клетки CD5+CD23"B-ХЛЛ имели следующий иммунофенотип:

CD 19mod/CD5+/CD237SmIgKmod/CD20moil/FMC77CD79bdim/CD22~

7. Установлен иммунофенотип редкого варианта С05+С023+ЛКМЗ, который характеризовался более высокой степенью экспрессии антигена CD 19 (mod), чем типичный CD5+CD23~.IIKM3 - CD 19

(dim). Лейкозные клетки СВ5+СБ23+ЛКМЗ имели следующий иммунофенотип:

CD19mod/CD5+/CD23+/SmIgK+/CD20mod/FMC7+/CD79b+/CD22mod/CD25dim.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для иммунофенотипического исследования клеток костного мозга или периферической крови у пациентов с подозрением на хроническое ЛПЗ предложен «Алгоритм I этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых В- и Т-клеток (первичный скрининг и определение линейной принадлежности)», требующий меньше времени на пробоподготовку, позволяющий определить не только линию опухолевого клона, но и предварительно предположить вариант зрелого новообразования по характеру экспрессии антигенов и распределения клеток на гистограммах по сигналам SSOFSC и SSC/CD45.

2. В целях дифференциальной диагностики хронических В-клеточных ЛПЗ рекомендуется использовать разработанный «Алгоритм II этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых В-клеток (классификация)», который позволяет, согласно полученной на I этапе иммунофенотипирования информации, выбрать необходимую панель МКА для дальнейшей дифференциальной диагностики, что делает метод проточной цитометрии более экономичным, не снижая диагностической надежности.

3. В целях дифференциальной диагностики Т-клеточных хронических ЛПЗ рекомендуется использовать разработанный «Алгоритм II этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых Т-клеток (классификация)», включающий панель МКА с наиболее значимыми для классификации хронических Т-клеточных ЛПЗ маркерами.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов A.M. Полиморфизм рецепторов врожденного иммунитета / A.M. Иванов, A.B. Апчел, Т.А. Камнловя, В.Ю. Никитин, М.В. Ссрдюцкая, О.В. Протасов, М.Г. Вершинина // Вести. Рос. Восн.-мед. акад. - 2009. - №1 (25). - С.172-184.

2. Никитин В.Ю. Иммунофенотипические особенности различных B-клеточных лимфоидных опухолей / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, В.Н. Цыган, М.Г. Вершинина // Нейроиммунология. - 2009. - №1 (7). - С.113.

3. Никитин В.Ю. Иммунофснотнпичсскаи и цитогснстическая характеристика М4 и М5 вариантов острого лейкоза / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, С.Н. Колюбаева, A.M. Иванов, В.Н. Цыган, И.С. Зюзгнн, М.Г. Вершинина // Вести. Рос. Воеп.-мсд. акад. - 2009. - №4 (28). -С.121-130.

4. Никитин В.Ю. Иммунофенотипические черты редких форм острых миелоидных лейкозов / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, A.B. Новицкий, A.M. Иванов, И.В. Ширина, М.Г. Вершинина // Клинико-лабораторный консилиум. - 2010. - №2-3 (33-34). - С. 163.

5. Никитин В.Ю. Иммунофенотипический анализ в дифференциальной диагностике хронических В-лимфоцитарных лейкозов / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, A.M. Иванов, A.B. Новицкий, М.Г. Вершинина // Клиническая патофизиология. - 2010. - №1-2. - С.28-45.

6. Ннкнтин В.Ю. Проточная цнтомстрня в дифференциальной диагностике зрелых Т- и NK-клеточных опухолей / В.Ю. Никитин, И.А. Сухина, A.B. Новицкий, A.M. Иванов, М.Г. Вершинина // Вести. Рос. Воен.-мед. акад. - 2011. -№1 (33). - С.220-225.

Подписано в печать 26.01,11 Формат 60x84/16

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 70

Типография ВМА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.

2010176491

Г. Актуальность исследования

Последнее десятилетие, принципиально. изменило подход к изучению лимфоидных\ опухолей:.Многими?■.■авторами; была признана; недостаточная1 информативность морфологических методов исследования- при. ряде хронических лейкозов и. склонных к лейкемизации лимфом (Новик А.А.,. 2000;: Волкова МА. и др., 2007; Hanson С.А. 1999;Chieng D.C. et al., 2000);, Для. некоторых неходжкинских. лимфом (НХЛ) характерна; тенденция к диссеминации злокачественных клеток в кровь и костный мозг. В этих , случаях клиницисты встречаются с трудной задачей дифференциальной диагностики между формами НХЛ и хронических лейкозов Т- и В-клеточного происхождения в связи с, однотипной картиной абсолютного лимфоцитоза периферической крови: Это связано; с. высоким сходством мелких ШШ; среднего размеров лимфоцитов. Частота установления,точного диагноза согласно REAL-классификации по, данным клинических проявлений и морфологических методов составляет лишь 33% (Mourad W.A. et ah, 2003). В; настоящее время- диагностика зрелых новообразований: основывается на сопоставлении результатов морфологических, проточно-цитометрических и молекулярно-генетичёских исследований.

Иммунофенотипирование злокачественных клеток, периферической: кровши костного мозга с помощью метода проточной цитометрии остается необходимым инструментом для постановки, диагноза, . классификации, определения стадии и мониторинга гематологических опухолей; За последние 10-15 лет проточная цитометрия интенсивно развивалась, был расширен диапазон моноклональных антител (МКА) и флюорохромов, что позволило; повысить качество идентификации субпопуляций нормальных клеток и распознавание редких аберрантных иммунофенотипов даже при анализе небольшого количества клеток (Craig F.E., 2008). Определение варианта лимфопролиферативного заболевания (ЛПЗ) методом проточной цитометрии основывается на установлении иммунофенотипа опухолевых клеток периферической крови или костного мозга. Это возможно благодаря сохранению малигнизированными лимфоцитами основных дифференцировочных антигенов клетки-предшественника, хотя встречается и аберрантная их экспрессия (Волкова М.А. и др., 2001). Особенностью лимфопоэза является способность клеток к опухолевой трансформации в процессе их дифференцировки. Это определяет многообразие лимфопролиферативных заболеваний. В большинстве случаев опухолевые лимфоидные клетки имеют нормальные клеточные аналоги, т.е. соотносятся с определенным этапом дифференцировки лимфоцитов. Воздействие различных этиологических факторов приводит к развитию мутаций онкогенов в клетке, блоку в дифференцировке и накоплению опухолевого клона, сохраняющего набор антигенов нормальной лимфоидной клетки (Луговская С.А. и др., 2005; Van Dongen J.J.M. et al., 2002).

Изучая особенности иммунофенотипа клеток, можно установить стадию дифференцировки, на уровне которой наступила онкогенная трансформация. В то же время при хронических ЛПЗ такую строгую параллель не всегда удается провести. Так, для волосатоклеточного (ВКЛ) и пролимфоцитарного (В-ПЛЛ) лейкозов пока не найдены нормальные клеточные аналоги, а при ряде зрелых В- и Т-клеточных опухолей могут наблюдаться утрата типичных антигенов, появление активационных маркеров либо коэкспрессия антигенов, несвойственных данной стадии дифференцировки лимфоцитов.

Фенотипически аномальные популяции обнаружены при многих гематологических опухолях - лимфомах, хронических лимфоидных лейкозах, миелопролифератпвных заболеваниях, острых лейкозах и т. д. Эти иммунофенотипические критерии, использовавшиеся для идентификации различных форм онкогематологических заболеваний, были применены в классификации ВОЗ (Muller-Hemerlink Н.К. et al., 2001). В соответствии с критериями, предложенными ВОЗ, при установлении диагноза обязательным является определение линейной принадлежности опухолевых лимфоидных клеток (Т или В) и степени их дифференцировки (предшественники или зрелые клетки).

Важным при изучении опухолей иммунной системы является формирование панели диагностических МКА (Луговская С.А. и др., 2005; Van Dongen J.J.M. et al., 2006). Набор используемых МКА может различаться' в зависимости от целей исследования. Британским комитетом по стандартам в гематологии (BCSH) разработаны рекомендации по ■ иммунофенотипированию ЛПЗ и предложена, так же как и для фенотипирования острых лейкозов (ОЛ), двухлинейная панель МКА. На первом этапе проводится дифференциальная диагностика В-клеточных от Тили NK-клеточных ЛПЗ и в группе В-клеточных опухолей выделяется ХЛЛ или другие варианты неходжкинских злокачественных лимфом (НХЛ). В зависимости от результатов первого этапа исследования и морфологии клеточных элементов проводится второй этап типирования, в ходе которого уточняется иммунофенотип ЛПЗ. Подходы к выбору панели моноклональных антител, алгоритмам иммунофенотипирования и оценке полученных результатов были предложены и обобщены сравнительно недавно (Ван Донген Ж. и др., 2002; Catovsky D., 1997; Braylan R.C. et al, 2001).

Классическая многоцветная проточная цитометрия в основном использует определение позитивных и негативных по экспрессии анализируемого маркера клеток. Оценка положительной экспрессии антигена в зависимости от интенсивности флюоресценции для выделения популяций клеток dim и bright применяется редко. Анализ интенсивности флюоресценции позволяет значительно расширить возможности диагностики онкогематологических заболеваний с помощью метода проточной цитометрии. В последнее время анализу яркости флюоресценции маркеров стали уделять особое внимание и внедрять в рутинную практику, поскольку для этого не требуется дополнительных финансовых вложений (Куртова А.В. и др., 2008).

В связи с вышеизложенным, усовершенствование дифференциальной диагностики хронических лимфопролиферативных заболеваний с использованием проточно-цитометрического метода продолжает оставаться важной медицинской проблемой.

Цель работы

Оптимизация дифференциальной диагностики опухолей из зрелых В- и Т-клеток на основании изучения аберрантной экспрессии антигенов методом проточной цитометрии.

Задачи исследования:

1. Исследовать антигенный профиль опухолевых клеток и интенсивность экспрессии В- и Т-клеточных антигенов в периферической крови или костном мозге при различных хронических лимфопролиферативных заболеваниях.

2. Установить иммунофенотипический диагноз лимфопролиферативного заболевания.

3. Сопоставить результаты иммунофенотипирования с клинической картиной и данными морфологических и цитогенетических методов исследования для постановки окончательного диагноза.

4. Для I этапа иммунофенотипирования создать панель наиболее информативных трехцветных комбинаций моноклональных антител и разработать алгоритм предварительной дифференциальной диагностики хронических лимфопролиферативных заболеваний.

5. На основании результатов I этапа иммунофенотипирования создать панель трехцветных комбинаций антител для II этапа и разработать алгоритм дифференциальной диагностики вариантов хронических В- и Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний.

Научная новизна исследования

Выявлены редкие иммунологические варианты В-клеточного хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) - СВ5+СБ23~В-ХЛЛ, СБ5"С023+В-ХЛЛ, лимфомы из клеток мантийной зоны (ЛКМЗ) - С05+С023+ЛКМЗ и изучены их иммунофенотипические особенности. Впервые установлено, что для дифференциации В-клеточного хронического лимфолейкоза, включая редкие иммунофенотипические варианты СБ5-негативного В-ХЛЛ и С023-негативного В-ХЛЛ, от других хронических В-клеточных ЛПЗ диагностически наиболее значимым является характер экспрессии антигенов ¥МС7, СБ79Ь, С022.

Получены новые данные о том, что иммунологический вариант СБ5+С023"В-ХЛЛ, в отличие от классического С05+СЭ23+В-ХЛЛ, характеризуется умеренной интенсивностью экспрессии антигенов СЭ20, Бт^к и более высокой интенсивностью флюоресценции общелейкоцитарного антигена С045.

Впервые обнаружено, что редкий иммунофенотипический вариант СЭ23-позитивного ЛКМЗ характеризуется более высокой степенью экспрессии антигена СБ 19,-в отличие от типичного С05+С023~ЛКМЗ.

Получены новые данные, позволяющие использовать в качестве дифференцирующих признаков интенсивность флюоресценции антигенов СБ45, С019, СБ20 для дискриминации опухолей из зрелых В-клеток.

Практическая значимость

Предложенная панель трехцветных комбинаций антител и разработанный алгоритм предварительной дифференциальной диагностики для первого этапа иммунофенотипирования хронических В и Т-клеточных лимфопролиферативных заболеваний позволяют предположить вариант опухоли из зрелых Т- или В-клеток по характеру экспрессии антигенов и распределения клеток на гистограммах по 88С/Р8С и 88С/С045.

Модифицированные панель трехцветных комбинаций антител и алгоритм дифференциальной диагностики вариантов хронических В- и Т-лимфопролиферативных заболеваний на втором этапе иммунофенотипирования уточняют вариант опухоли из зрелых В- или Т-клеток.

Применение трехцветной панели МКА позволяет получить стабильную максимальную чувствительность анализа и достоверные результаты для исследований на однолазерных и двухлазерных проточных цитометрах и является наиболее надежным в диагностическом и выгодном в экономическом аспектах. Проведение иммунофенотипирования на начальных этапах обследования пациента, в соответствии с предложенными алгоритмами, позволяет поставить точный диагноз, что приводит к уменьшению времени пребывания пациентов в стационаре и своевременному назначению адекватного лечения.

Личное участие автора в получении результатов

Автором научно обосновано проведение исследования больных лимфопролиферативаными заболеваниями с помощью проточной цитометрии, проанализированы клинико-лабораторные и иммунофенотипические особенности опухолевых клеток периферической крови или костного мозга, созданы панели диагностических антител и алгоритмы диагностики ЛПЗ на первом и втором этапах иммунофенотипирования.

Автор лично планировала исследования, принимала непосредственное участие в клиническом обследовании больных, организовывала и участвовала в проведении всех лабораторно-инструментальных, проточно-цитометрических исследованиях. Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распределение клеток на гистограммах по сигналам светорассеяния 88С/Р8С, 88С/СБ45 и средняя интенсивность флюоресценции антигенов СБ45, СБ 19, СВ20 имеют диагностическое значение для дифференциации хронических В-клеточных ЛПЗ.

2. Основными дифференциально-диагностическими признаками классического (СБ5+СБ23+) и неклассических вариантов (СБ5+С023~ и СБ5~С023+) В-ХЛЛ являются отсутствие экспрессии или слабая интенсивность экспрессии антигенов РМС7, СБ79Ь, СБ22. Иммунофенотиппческими особенностями неклассических форм В-ХЛЛ и ЛКМЗ являются: более высокая интенсивность экспрессии антигенов СБ20, 8ш^к, С045 для СБ5+С023~В-ХЛЛ, и более выраженная степень экспрессии антигена СБ 19 для СБ5+СБ23+ЛКМЗ.

3. Модифицированные панели трехцветных комбинаций диагностических антител, алгоритмы I и II этапов иммунофенотипирования с учетом интенсивности флюоресценции антигенов позволяют сократить время проведения анализа и количество используемых антител, не снижая точности диагностики варианта ЛПЗ.

Реализация и внедрение результатов исследования

Материалы настоящей работы нашли практическое применение в учебном процессе и научно-практической деятельности кафедры факультетской терапии и НПО нанобиотехнологий НИЦ ВМедА им С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования

Основные положения работы обобщены и доложены на XVII Всероссийской научно-практической конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург, 2009), на 1 Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), на научной конференции с международным участием «наследие Пирогова: прошлое, настоящее, будущее», посвященное 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова. Секция 11 «Клиническая лабораторная диагностика: настоящее и будущее».

По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 научных статьи, в журналах реферируемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 11 таблиц и 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 18 отечественных, 119 зарубежных публикаций.

122 ВЫВОДЫ

1. Методом проточно-цитометрического исследования у 67 (88% ЛПЗ) пациентов была установлена В-клеточная природа лимфоидных опухолевых клеток (CD19+CD45+), а в 9 (12% ЛПЗ) случаях лейкозные клетки имели Т-клеточное происхождение (CD3+CD45+). В 3 случаях (4% обследованных) иммунофенотип анализируемой популяции клеток соответствовал нормальным лимфоцитам. Полное совпадение результатов диагностики методом проточной цитометрии с клинической картиной и данными морфологических методов обследования на основе REAL и ВОЗ классификаций составило 91% (72 из 79 случаев).

2. Определение интенсивности экспрессии антигена является обязательным иммунофенотипическим критерием при диагностике опухолей из зрелых В- и Т-клеток.

3. При анализе иммунофенотипических особенностей опухолевых клеток диагностическое значение имеет картина распределения лимфоцитов на гистограммах по сигналам бокового (SSC) и прямого (FSC) светорассеяния - для волосатоклеточного лейкоза, а также по SSC и интенсивности экспрессии CD45 - для лимфомы Беркитта.

4. Диагностическое значение для дифференциации В-ЛПЗ имеет интенсивность флюоресценции антигенов CD45, CD 19, CD20. Наиболее выраженные значения интенсивности флюоресценции CD45, CD 19 характерны для ВКЛ-клеток, выраженные - для ЛСВЛ и наименее выраженные - для типичных форм В-ХЛЛ и ЛКМЗ. Лимфома Беркитта характеризуется слабой экспрессией антигена CD45 (dim). Для классического варианта В-ХЛЛ характерна слабая интенсивность экспрессии антигена CD20, для других форм хронических В-ЛПЗ — умеренная.

5. Обнаруженные редкие иммунологические варианты В-ХЛЛ, не экспрессирующие антиген CD5 (2 случая) и CD23 (1 случай), как и классический вариант В-ХЛЛ отличались от ЛКМЗ, ЛСВЛ и В-ПЛЛ отсутствием экспрессии или слабой интенсивностью экспрессии антигенов FMC7, CD79b, CD22.

6. Идентифицирован редкий иммунофенотипический вариант CD5+CD23~B-XJIJI, в отличие от классического CD5+CD23+B-XJIJI, характеризующийся умеренной интенсивностью экспрессии антигенов CD20, SmlgK. Интенсивность флюоресценции CD45 у CD5 CD23 B-XJIJT была выше, чем у CD5+CD23 B-XJm. Лейкозные клетки СБ5+СВ23"В-ХЛЛ имели следующий иммунофенотип:

CD19mod/CD5+/CD237SmIgKmod/CD20mod/FMC77CD79bdim/CD22".

7. Установлен иммунофенотип редкого варианта CD5+CD23^KM3, который характеризовался более высокой степенью экспрессии антигена CD19 (mod), чем типичный CD5+CD237TKM3 - CD19 (dim). Лейкозные клетки CD5+CD23+.nKM3 имели следующий иммунофенотип: CD19mod/CD5+/CD23+/SmIgK7CD20mod/FMC7+/CD79b+/CD22mod/CD25dim.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для иммунофенотипического исследования клеток костного мозга или периферической крови у пациентов с подозрением на хроническое ЛПЗ предложен «Алгоритм I этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых В- и Т-клеток (первичный скрининг и определение линейной принадлежности)», требующий меньше времени на пробоподготовку, позволяющий определить не только линию опухолевого клона, но и предварительно предположить вариант зрелого новообразования по характеру экспрессии антигенов и распределения клеток на гистограммах по сигналам 88С/Р8С и 88С/СБ45.

2. В целях дифференциальной диагностики хронических В-клеточных ЛПЗ рекомендуется использовать разработанный «Алгоритм II этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых В-клеток (классификация)», который позволяет, согласно полученной на I этапе иммунофенотипирования информации, выбрать необходимую панель МКА для дальнейшей дифференциальной диагностики, что делает метод проточной цитометрии более экономичным, не снижая диагностической надежности.

3. В целях дифференциальной диагностики Т-клеточных хронических ЛПЗ рекомендуется использовать разработанный «Алгоритм II этапа иммунофенотипирования опухолей из зрелых Т-клеток (классификация)», включающий панель МКА с наиболее значимыми для классификации хронических Т-клеточных ЛПЗ маркерами.