Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Исследование минимальной остаточной болезни у детей с острым лимфобластным лейкозом из в-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-BABY, методом проточной цитометри



Попов Александр Михайлович

ИССЛЕДОВАНИЕ МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ У ДЕТЕЙ С ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ ИЗ B-ЛИНЕЙНЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ПОЛУЧАЮЩИХ ТЕРАПИЮ ПО ПРОТОКОЛАМ ALL-MB 2008 И MLL-BABY, МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

14.01.21 - Гематология и переливание крови 14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2011

2 4 ФЕВ 2011

4856080

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Фечнна Лариса Геннадьевна Цвиренко Сергей Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Мякова Наталья Валерьевна Луговская Светлана Алексеевна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт детской онкологии и гематологии ГУ «Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина» РАМН.

совета по защите докторских диссертаций Д 208.050.01, созданного при Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, Ленинский проспект, 117/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, Ленинский проспект, 117/2, а с авторефератом на сайте ueirrpa www.niidg.ru

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Защита диссертации состоится «_»

2011 г. в « » часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чернов В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении острого лимфобластного лейкоза (OJIJI) у детей, данное заболевание по-прежнему является самой частой причиной смерти детей от онкологических заболеваний (Pui С.Н. 2003). Дштьнейшее повышение интенсивности химиотерапии не приводит к увеличению выживаемости детей с OJIJI, а во многих случаях повышает риск токсических осложнений (Pui С.Н. 2009). Поэтому крайне актуальным является вопрос выявления среди всех больных тех пациентов, у которых опухоль высокочувствительна к проводимой химиотерапии и для которых возможно снизить интенсивность лечения.

С другой стороны, традиционный перечень факторов риска развития рецидива OJLJI нуждается в расширении, чтобы максимально точно выявлять пациентов с высокой вероятностью рецидивирования опухоли, и, следовательно, интенсифицировать терапию только этой группе пациентов, избегая повышения токсичности для остальных. В последние годы в большинстве протоколов инициальные факторы риска дополняются показателями, характеризующими ответ опухоли на терапию (Bruggcmann М. et al 2010).

Ответ на терапию OJIJI уже в течение длительного времени используется как один из важнейших факторов прогноза и стратификации пациентов по группам риска (Riehm Н. et al 1983). Даже в том случае, если в образцах костного мозга, взятых во время терапии, количество опухолевых клеток ниже чувствительности обычных цитологических методов (менее 1%), они могут вносить существенный вклад в неблагоприятный исход заболевания (Moppet J. et al 2003). Совокупность этих клеток, не выявляемых цитологически, но обнаруживаемых другими

более чувствительными методами диагностики, получила название минимальной остаточной болезни (МОБ). Для оценки и мониторинга МОБ чаще всего используются два метода: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и многоцветная проточная цитометрия (Бгсгерапяк! Т. 2007; Вп^етапп М. й а1 2010). Основным направлением применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ является определение лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа, т.е. специфического для опухоли сочетания экспрессии антигенов (Сатрапа Б. 2010). Клиническая значимость определения МОБ методом проточной цитометрии показана различными исследовательскими группами.

Чаще всего разные исследовательские группы используют различные подходы к определению остаточных опухолевых клеток (Воготекг М. е1 а1 2008; Биадгак М. й а1 2008; 1пмгщ I. й а1 2009; Сатрапа Б. 2010). Поэтому, несмотря на определенный опыт применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ, накопленный к настоящему времени, крайне редки публикации, в которых бы описывался четкий алгоритм анализа данных цитометрического исследования. Кроме того, постоянно появляются новые маркеры, потенциальное применение которых для определения МОБ представляется перспективным. Одним из таких антигенов, например, является N02, экспрессия которого специфична для ОЛЛ, ассоциированных с перестройками гена МЫ (Zangrando А. й а1 2008). В то же время, некоторыми исследователями предлагаются упрощенные подходы для мониторинга МОБ методом проточной цитометрии (Соиз1ап-8гшЛ Е. й а! 2006). Применимость таких методов остается недостаточно изученной.

Кроме того, конкретные методики мониторинга МОБ могут применяться только в рамках конкретного протокола лечения. Методология определения МОБ во время терапии по одному протоколу может не удовлетворять условиям другого протокола. Это может быть

обусловлено различиями в изменения иммунофснотипа опухолевых клеток под воздействием различных препаратов, разным временем заселения КМ нормальными клетками-предшественниками, а также другими факторами, напрямую связанными с терапевтическим режимом.

Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии ОЛЛ у детей разных возрастных групп (Fechina L. et al 2008; Karachunskiy A. et al 2008; Румянцева Ю.В. и соавт. 2009) диктует необходимость разработки собственных алгоритмов мониторинга МОБ. Однако в настоящее время попытки применения проточной цитометрии для оценки минимальной остаточной болезни в рамках российских протоколов единичны (Савва H.H. и соавт. 2009, 2010). Таким образом, возможности применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ в рамках российских протоколов лечения ОЛЛ, таких как ALL-MB 2008 и MLL-Baby, остаются неизученными.

Цель исследования - изучить количество остаточных опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом из В-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby, методом проточной цитометрии.

Задачи исследования

1. Определить аберрации иммунофенотипа опухолевых клеток, применимые для определения минимальной остаточной болезни при ОЛЛ из B-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ).

2. Оценить изменения экспрессии антигенов, применяемых для мониторинга минимальной остаточной болезни, в процессе терапии по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby.

3. Оценить возможность применения антигена MLL-ассоциированного антигена NG2 для мониторинга минимальной остаточной болезни при B-линейном ОЛЛ с перестройками гена MLL.

4. Оценить возможности применения трехцветного «упрощенного» метода для определения минимальной остаточной болезни.

5. Разработать и внедрить алгоритм определения минимальной остаточной болезни при OJIJ1 из B-линейных предшественников.

6. Сравнить результаты определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и экспрессии химерных генов в ПЦР.

7. Провести определение минимальной остаточной болезни на 15-й, 36-й и 85-й дни лечения у пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008.

Научная новизна

Показаны отличия опухолевых бластов при ВП-ОЛЛ и нормальных B-клеток по экспрессии CD10, CD20, CD45, CD20 и CD58. Выявлена неоднородность опухолевой популяции по интенсивности экспрессии антигенов, использующихся для определения МОБ. Установлены особенности изменений иммунофенотипа бластов, происходящих во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB 2008. Показано существенное снижение экспрессии ^¿¿-ассоциированного антигена NG2 во время терапии ВП-ОЛЛ, ассоциированного с перестройками гена MLL. Установлено появление в костном мозге у некоторых пациентов с ВП-ОЛЛ, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008, нормальных В-линейных предшественников (ВП) уже на мо.мент окончания индукционной терапии, что может существенно осложнять определение МОБ в данной точке наблюдения. В результате детального сравнительного анализа показана хорошая сопоставимость результатов определения МОБ методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР на различных этапах терапии ОЛЛ. В результате определения МОБ в 168 образцах костного мозга пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008, выявлена положительная корреляционная связь

показателей раннего ответа на терапию с наличием МОБ на момент окончания индукционной терапии.

Практическая значимость

Определены наиболее применимые для мониторинга МОБ аберрации иммунофенотипа опухолевых бластов при ВП-ОЛЛ. Разработаны алгоритмы анализа данных проточной цитометрии при определении МОБ у пациентов с различными иммунологическими вариантами ВП-ОЛЛ с учетом гетерогенности экспрессии антигенов опухолевыми клетками и изменений иммунофенотипа во время терапии. Установлена ограниченная применимость антигена NG2 для мониторинга МОБ при ВП-ОЛЛ, ассоциированном с перестройками гена MLL. Показана ограниченная применимость «упрощенного» трехцветного метода определения МОБ по Е. Coustan-Smith et al. На основании хорошей качественной сопоставимости результатов определения МОБ методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР, предложено одновременное применение двух данных методов для мониторинга МОБ у детей с ВП-ОЛЛ с наличием химерных генов. Рекомендовано применять проточную цитометрию на ранних этапах терапии, когда важно определение количества МОБ, а ПЦР - в более поздних точках наблюдения, когда прогностически значимо качественное определение МОБ.

Внедрение в практику

Разработанный по результатам исследования алгоритм мониторинга МОБ методом проточной цитометрии у детей с ВП-ОЛЛ успешно внедрен в работу Лаборатории иммунофенотипирования гемобласгозов Отдела детской онкогематологии Областной детской клинической больницы №1 (г. Екатеринбург). Данный алгоритм успешно применяется для мониторинга МОБ методом проточной цитометрии в рамках кооперативной группы по изучению острого лимфобластного лейкоза

«Москва-Берлин». Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной и микробиологической диагностики ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России. Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской конференции «Лабораторная наука - практике: первое десятилетие XXI века» (Москва, 2010), Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2009), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург,

2008), XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007), Съезде детских онкологов России (Москва, 2008), конгрессах Европейского гематологического общества (Берлин, 2009; Барселона, 2010), Международного общества детских онкологов (Берлин, 2008; Сан-Паулу,

2009), Американского общества гематологов (Новый Орлеан, 2009; Орландо, 2010), Американского общества клинической химии (Анахайм,

2010). По материалам исследования опубликовано 53 печатные работы, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста. Состоит из введения, трех глав, заключения и выводов. Библиография включает 178 источников, из них 17 отечественных и 161 иностранный. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками. Положения, выносимые на защиту

1. Наиболее применимыми для мониторинга минимальной остаточной болезни при ВП-ОЛЛ аберрациями иммунофенотипа опухолевых клеток являются снижение экспрессии CD45, CD20, CD38 и повышение экспрессии CD10, CD34, CD58.

2. Во время индукционной терапии происходят существенные изменения экспрессии антигенов, используемых для определения минимальной остаточной болезни, что обусловливает необходимость применения для мониторинга МОБ многоцветной проточной цитометрии.

3. Разработанный по результатом исследования алгоритм применения проточной цитометрии позволяет адекватно мониторировать минимальную остаточную болезнь у детей с OJIJI из В-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Пациенты и методы исследования

В исследуемую группу были включены 199 детей, больных ВП-ОЛЛ (107 мальчиков и 92 девочки) в возрасте от 1 месяца до 16 лет, проходившие обследование в Лаборатории иммунофенотипирования гемобластозов Областной детской клинической больницы №1 (г. Екатеринбург) с октября 2005 г по июль 2010 г.

Наличие МОБ и присутствие нормальных В-линейных предшественников в костном мозге определяли в предусмотренные протоколом точках наблюдения. Для протокола ALL-MB 2008 это были 15-й, 36-й и 85-й дни лечения. МОБ на 15-й и 36-й дни терапии определяли у всех пациентов. На 85-й день МОБ оценивали только у пациентов групп стандартного и промежуточного риска. В рамках протокола MLL-Baby МОБ определяли на 15-й, 36-й дни терапии и далее после каждого курса полностью транс-ретиноевой кислоты (Fcchína L. et al 2008).

Иммунофенотипирование опухолевых клеток в костном мозге производилось методом 4-8-цветной проточной цитометрии на приборах

"FACS Canto", "FACS Canto II" и "FACS Aria" (Becton & Dickinson (BD), США).

Для иммунофенотипирования применялись первичномеченные моноклональные антитела. Результаты иммунофенотипирования оценивались при помощи программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (BD). Популяцию считали позитивной по тому или иному маркеру, если 20% и более клеток экспрессировали исследуемый антиген. Результат определения МОБ рассчитывали в виде процентного содержания опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток костного мозга.

Для сравнений уровней экспрессии применялись следующие моноклональные антитела: CD58 (AICD58-FITC, Beckman Coulter (ВС), США), CD34 (581 -PE-TexasRed, ВС), CD38 (HIT2-PerCP-Cy5.5, BD), CD10 (HI10a-PE-Cy7, BD), CD20 (L27-APC-Cy7, BD), CD45 (2Dl-AmCyan, BD). Для этого использовали значения средней интенсивности флюоресценции (Mean Fluorescence Intensity, MFI). Для сравнения данных экспрессии, полученных на разных приборах, MFI пересчитывали в количество молекул эквивалентного растворимого флюорохрома (MESF) при помощи калибровочных частиц "Quanti Brite" (BD), содержащих известное количество молекул РЕ. Гетерогенность распределения клеток по экспрессии исследованных маркеров оценивали качественно и количественно (при помощи коэффициента вариации (CV)). Также в опухолевой популяции определяли процентное содержание клеток позитивных по конкретному антигену.

Экспрессия химерных генов выявлялась по ранее описанным протоколам (van Dongen J.J.M. et al 1999) с рядом модификаций. Результат количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) рассчитывали как процентное отношение числа копий химерного и нормального генов в конкретной точке наблюдения и в момент установления диагноза, согласно рекомендациям «Европа против рака» (Gabert J. et al 2003).

Чувствительность ПЦР оценивали методом лимитирующих разведений. При этом РНК из клеточных линий REH и RS411, разводили смесью РНК, выделенной из костного мозга 5 пациентов без острого лейкоза в соотношениях 1:10, 1:100, 1:1000, 1:5000, 1:10000, 1:50000, 1:100000, 1:500000. Чувствительность гнездной обратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) составила 5х 10"5, ПЦР-РВ - 1 х Ю"4.

Для статистической обработки результатов применяли программы «Statistica 6.0», «Analyse-it» и «SPSS 17.0».

Для сравнения количественных показателей в двух группах применялся критерий Манна-Уитни, для парных количественных сравнений в двух группах - критерий Уилкоксона. Для сравнения качественных показателей использовались точный критерий Фишера и критерий х2- Зависимости оценивали при помощи коэффициента корреляции Пирсона (г). Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

При определении связи наличия МОБ на 36-й день терапии с другими факторами риска ОЛЛ анализировали характеристические кривые (receiver operator characteristic, ROC-кривые). Затем при помощи множественной логистической регрессии с пошаговым включением значимых факторов рассчитывались отношения шансов с 95% доверительными интервалами. Также для каждого теста рассчитывали диагностическую чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результатов, а также общую диагностическую эффективность теста.

Результаты исследования и их обсуждение

Для сравнения интенсивности экспрессии CD 10, CD34, CD20, CD45, CD58 и CD38 опухолевыми клетками, зрелыми В-лимфоцитами и нормальными ВП анализировали образцы 30 пациентов с CD10(+) ВП-

ОЛЛ, 7 пациентов с СОЮ(-) ВП-ОЛЛ, а также 15 пациентов без онкогематологических заболеваний. Результаты сравнения представлены на рис. 1.

О В-лф СОЮ(-) О ВП С010(+)

а о

В-лф СОЮ(-) В-лф СОЮ(-)

ВП СОЮ(+) ВП СШО(+)

Рисунок 1. Сравнение экспрессии СОЮ, СЭ34, СЭ20, СБ45, СП58 и С038 нормальными В-лимфоцитами (В-лф), В-линейными предшественниками (ВП), а также опухолевыми клетками при СОЮ(+) и СЭ10(-) иммунологических вариантах ВП-ОЛЛ. На графиках для каждого типа клеток показаны медиана (■), межквартильный интервал (§§), а также 1-й (-Ц и 99-й (-у) процентили.

При СОЮ(+) ВП-ОЛЛ бласты экспрессировали СОЮ более интенсивно, чем нормальные ВП (р=0,0002). По экспрессии С034

опухолевые клетки при СП10(+) и СЭ10(-) ВГ1-ОЛЛ не отличались от нормальных ВП (р=0,2894 и р=0,7309 соответственно). МП СОЮ и СЭ34 зрелых В-лимфоцитов находилась на уровне аутофлюоресценции. Экспрессия С020 опухолевыми клетками при СБ10(+) и СЭЮ(-) ВП-ОЛЛ была статистически значимо ниже, чем зрелыми В-лимфоцитами (р<0,0001 в обоих случаях) и нормальными ВП (р=0,0024 и р<0,0001 соответственно). Экспрессия С1345 опухолевыми клетками СОЮ(+) ВП-ОЛЛ была статистически значимо ниже, чем нормальными ВП (р=0,0001) и В-лимфоцитами (р<0,0001). Данный антиген экспрессировался бластами при СОЮ(-) ВП-ОЛЛ более ярко, чем нормальными ВП (р=0,0038), но менее ярко, чем зрелыми лимфоцитами (р<0,0001). Экспрессия Сй58 опухолевыми клетками при СОЮ(+) ВП-ОЛЛ была достоверно выше, чем В-лимфоцитами (р<0,0001) и нормальными ВП (р<0,0001). Такие же результаты были получены и для СОЮ(-) варианта (р<0,0001 и р=0,0001 соответственно). МИ СЭ38 опухолевых клеток при СБ10(+) ВП-ОЛЛ была достоверно ниже, чем МР1 нормальных ВП (р<0,0001), однако выше, чем МР1 В-лимфоцитов (р<0,0001). Такие же результаты были получены и для СОЮ(-) варианта (р<0,0001 и р=0,0008 соответственно).

Несмотря на выявленные количественные отличия в экспрессии антигенов опухолевыми и нормальными клетками, зачастую маркеры экспрессировались далеко не всеми бластами. Так в 16,8% случаев наблюдалась гетерогенная экспрессия СЭ10 - маркера, на котором чаще всего основывается определение МОБ при СБ10(+) ВП-ОЛЛ. Гетерогенная экспрессия С1334, еще одного антигена, часто используемого для мониторинга МОБ, наблюдалась в 30,6% случаев. Кроме того, у 11,6% пациентов бласты оказались С034-негативными. У большинства пациентов (особенно при СОЮ(-) варианте ВП-ОЛЛ) выделение опухолевых клеток только по экспрессии СЭ45 может оказаться проблематичным, так как у них бласты отличаются от нормальных клеток

по экспрессии пан-лейкоцитарного антигена только количественно. Разные варианты экспрессии CD20 и CD38, а также выявление случаев с наличием С058-негативных бластов свидетельствуют в пользу того, что и эти маркеры не всегда применимы для мониторинга МОБ.

По результатам исследования были сформулированы алгоритмы анализа данных для выявления остаточных опухолевых клеток при CD 10-позитивном и CDlO-негативном вариантах ВП-ОЛЛ (рис. 2). Для CD10(+) ВП-ОЛЛ после выделения С019-позитивных клеток анализ точечных графиков основывается на определении экспрессии CD 10 и маркеров, по которым можно отличить опухолевые клетки от нормальных ВП (например, CD45 при CD45(-) ВП-ОЛЛ, или CD58). В случае гетерогенной экспрессии CD 10 необходимо оценивать также экспрессию всех остальных используемых маркеров, прежде всего, CD34. Для CDIO(-) ВП-ОЛЛ при анализе данных наиболее значимым является определение экспрессии CD10 и CD20. При этом из анализа исключаются CDlO-позитивные и С020-позитивные клетки. Среди оставшихся CD19(+)CD10(-)CD20(-) клеток необходимо отличать МОБ от плазмоцитов и продуктов неспецифического связывания антител. Для этого необходимо использовать CD38, CD34, CD45, а также антигены, ассоциированные с перестройками гена MIL (CD15, CD65, CD133, NG2), если эти перестройки были обнаружены на момент диагностики.

Изменения экспрессии антигенов опухолевыми клетками в результате лечения были отмечены для всех исследованных маркеров (табл. 1). Изменения иммунофенотипа коснулись не только опухолевых клеток, но и зрелых В-лимфоцитов (табл. 1). Несмотря на изменения экспрессии антигенов, численные различия в MFI между бластами и лимфоцитами в основном сохранились и на 15-й день терапии.

Рисунок 2. Алгоритм анализа данных проточной цитометрии для мониторинга МОБ при С010(+) и СОЮ(-) вариантах ВП-ОЛЛ.

Во время терапии изменилось также распределение клеток по экспрессии маркеров. Распределение опухолевых клеток по экспрессии СОЮ и С034 изменилось в сторону более гетерогенного, а по экспрессии СБ45 - в сторону более гомогенного (табл. 2). К 15-му дню терапии доля клеток, экспрессирующих СБ20 и С045, статистически значимо увеличилась, в то время как содержание СВ34-позитивных бластов снизилось (табл. 3). Выявленные тенденции изменения экспрессии антигенов опухолевыми клетками к 15-му дню терапии сохранялись и на момент окончания индукционной терапии (36-му дню).

Таблица 1

Экспрессия СОЮ, С019, СБ20, СТО4, СЕ>45 и С058 опухолевыми клетками и зрелыми В-лимфоцитами на момент диагностики и на 15-й

день терапии по протоколу ALL-MB 2008 у пациентов с ВП-ОЛЛ (п=22)

День 0 День 15 Р*

медиана MFI | диапазон MF1 медианаМИ | диапазон MFI

Опухолевые клетки

CD10 70482,5 11126-189833 37192 244-104985 0,0030

CD34 5144,5 341-25887 772,5 119-18781 0,0007

CD20 879 77-5753 2652 65-7811 0,0273

CD19 13245 2068-30787 20824 1587-34505 0,0033

CD45 181 19-2161 1500 47-7965 0,0001

CD58 2571 1648-4337 1587 764-4263 0,0017

Зрелые В-лимфоциты

CD20 21276 5968-40445 9353 2551-19367 0,0013

CD19 19604 2473-26203 15823 811-30882 0,1060

CD45 7840 4282-11374 6316 3976-9784 0,0130

CD58 1016 193-1646 525 364-1387 0,0067

* Достоверность различий оценивалась при помощи критерия Уилкоксона

Таблица 2

Распределение опухолевых клеток по экспрессии СОЮ, С020, С034, С045 и С058 на момент диагностики и на 15-й день терапии по протоколу

ALL-MB 2008 у пациентов с ВП-ОЛЛ (п=22)

День 0 День 15 Р*

медиана CV, % диапазон CV, % медиана CV, % диапазон CV, %

CDI0 52,10 37,20-75,60 59,00 45,90-96,10 0,0364

CD34 68,75 42,80-177,20 132,25 53,90-304,90 0,0008

CD20 202,95 97,90-714,50 136,70 71,40-621,40 0,1913

CD45 165,40 57,50-284,10 84,70 35,50-187,50 0,0003

CD58 46,10 29,70-73,90 51,60 27,80-85,00 0.3443

* Достоверность различий оценивалась при помощи критерия Уилкоксона

Несмотря на то, что численная разница в экспрессии СОЮ, С034, С020 и С045 сохраняется, анализ точечных графиков на 15-й день терапии осложняется тем, что опухолевые клетки и зрелые лимфоциты на графиках сближаются. В результате этого во время лечения бласты на

точечных графиках бывает сложнее отличить от нормальных клеток, чем на момент диагностики.

Таблица 3

Доля опухолевых клеток, экспрессирующих CD20, CD34 и CD45 на момент диагностики и на 15-й день терапии по протоколу ALL-MB 2008 у

пациентов с ВП-ОЛЛ (п=22)

День 0 День 15

медиана доли диапазон доли медиана доли диапазон доли Р*

позитивных ПОЗИТИВНЫХ позитивных позитивных

клеток, % клеток, % клеток, % клеток, %

CD34 92,60 0,00-99,00 20,90 0,00-99,60 0,0003

CD20 34,90 6,60-90,30 83,10 27,20-99,90 0,0015

CD45 21,10 0,00-100,00 86,00 2.30-99,90 0,0002

* Достоверность различий оценивалась при помощи критерия Уилкоксона

Несмотря на то, что N02 является специфическим маркером, ассоциированным с перестройками гена МП, экспрессия N02 и доля N02-положительных клеток существенно снижалось во время лечения, особенно после окончания индукционной терапии, а при рецидиве у части пациентов опухолевые клетки были NG2-нeгaтивны (рис. 3).

Количество СВ19(+)Ы02(+)-клеток в образцах, в которых осуществлялся мониторинг МОБ, оказалось достоверно ниже (р<0,0001) количества остаточных опухолевых бластов в тех же образцах, определенного при помощи 6-8-цветной проточной итометрии. Несмотря на то, что во время индукционной терапии экспрессия N02 не отличалась от инициальной, даже на 15-й и Зб-й дни терапии количество остаточных бластов, определенное только при помощи N02 оказалось также достоверно ниже (р=0,0010).

Таким образом, N02 нельзя использовать как основной маркер для выделения опухолевых клеток на точечных графиках при мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Тем не менее, в комбинации с другими антигенами N02 может использоваться для мониторинга МОБ, но

не для выделения популяции опухолевых клеток, а для дополнительной характеристики популяций, выделенных по другим маркерам.

Рисунок 3. Экспрессия NG2 (а) и доля К02-позитивных клеток (б) в образцах костного мозга у пациентов исследуемой группы (п=15), взятых на момент диагностики (Д) (п=12), во время индукционной терапии (ИТ)

(п=15), во время консолидации/интенсификации (К/И) (п=18), при рецидиве (Р) (п=6) и во время терапии рецидива (TP) (п=14). На графиках для каждого этапа терапии показаны медиана (■), межквартильный интервал (Щ), а также 1-й (-1-) и 99-й (у) процентили.

Ни в одном образце, взятом на 15-й день терапии, нормальные ВП не были обнаружены вне зависимости от того, выявлялись ли в этих образцах остаточные опухолевые бласты. При этом в 6,9% образцов, взятых на момент окончания индукционной терапии, и в 87,2% образцов, взятых на 85-й день терапии, были выявлены нормальные ВП в различных количествах. Таким образом, даже на момент окончания индукционной терапии но протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby в костном мозге могут обнаруживаться нормальные ВП, а на 85-й день терапии нормальные клетки-предшественники выявляются у подавляющего большинства пациентов.

Отсутствие единственного применимого для определения МОБ маркера, изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии и колонизация костного мозга нормальными клетками-предшественниками даже на момент окончания индукционной терапии приводят к тому, что для адекватного определения остаточных опухолевых клеток предпочтительно применять многоцветные комбинации антител. Попытки упростить методологию определения МОБ путем сокращения панелей моноклональных антител (Coustan-Smith Е. et al 2006) уменьшают число пациентов, у которых возможно определение МОБ методом проточной цитометрии, а также ведут к качественно и количественно некорректным результатам анализа, количество которых возрастает с каждой дальнейшей точкой наблюдения. Так при сравнении результатов 6-8-цветной проточной цитометрии и «упрощенного» трехцветного метода в 201 образце костного мозга, были обнаружены расхождения в 16,0%, 27,4% и 81,8% образцов на 15, 36 и 85 день терапии OJ1J1 соответственно.

Качественная сходимость результатов проточной цитометрии и ОТ-ПЦР в 132 образцах костного мозга, взятых от 35 пациентов с ВП-ОЛЛ, составила 93,9%. Сходимость результатов незначительно варьировала между образцами МХ-позитивных и ETV6-RUNX1-позитивных пациентов (94,0% и 96,3% соответственно, р=0,9910). Несмотря на то, что во время индукционной терапии определение МОБ методом проточной цитометрии не осложняется наличием в костном мозге нормальных лимфоидных предшественников, расхождения в результатах несколько чаще встречались при мониторинге МОБ во время индукции, нежели после достижения первой ремиссии (сходимость результатов 88,9% и 96,6% соответственно, р=0,1725). Также достоверно не отличалась сходимость результатов в образцах, в которых присутствовали (п=65) и отсутствовали (п=67) нормальные ВП (96,9% и 91,0% соответственно, р=0,4160).

Несмотря на то, что прямое количественное сопоставление результатов определения МОБ двумя данными методами невозможно, кинетика величины МОБ во время терапии сходна для проточной цитометрии и ПЦР-РВ. Вследствие этого, одновременное применение данных методов может с успехом использоваться у пациентов, у которых определяется ХТр. У таких больных, с нашей точки зрения, во время индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать данные проточной цитометрии. В то же время, в последующих ТН достаточно только качественного определения МОБ, поэтому предпочтительнее использовать результаты определения ХТр методом ОТ-ПЦР вследствие более высокой чувствительности метода.

В рамках протокола ALL-MB 2008 определение МОБ было проведено у 61 пациента в 168 образцах костного мозга, в том числе 60, взятых на 15-й день терапии, 61- на 36 день, 47- на 85 день. На 15-й, 36-й и 85-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2008 остаточные опухолевые клетки были выявлены у 73,7%, 42,6% и 12,8% пациентов соответственно. При этом среди МОБ-позитивных пациентов на 15-й день преобладали пациенты с относительно высокими величинами МОБ (более 0,1%), а на более поздних этапах лечения - пациенты с относительно низким содержанием опухолевых клеток (менее 0,1%).

Связь наличия МОБ на момент окончания индукционной терапии (36-й день) с другими факторами риска ОЛЛ оценивали у 60 пациентов с ВП-ОЛЛ (34 мальчика и 26 девочек), получавших индукционную терапию по протоколу ALL-MB-2008. Среди инициальных показателей значимые отличия МОБ-позитивных от МОБ-негативных пациентов были выявлены только для возраста. Дети старше 3 лет имели статистически значимо больший шанс быть МОБ-позитивными. Среди параметров раннего ответа, величина МОБ на 15-й день терапии позволила наиболее точно разделить МОБ-позитивных и МОБ-

негативных на 36-й день пациентов (диагностическая эффективность теста -79,31%)- Пороговым уровнем для МОБ на 15-й день была величина в 0,160%. Данный параметр оказался единственной независимой переменной при проведении многофакторного анализа. Наиболее распространенные показатели раннего ответа на терапию, такие как определенные цитологически количество бластов в периферической крови на 8-й день терапии и процентное содержание бластов в костном мозге на 15-й день, также влияли на МОБ-статус по окончании индукционной терапии (пороговые уровни 38/мкл и 0,8% соответственно), но при многофакторном анализе они оказались зависимыми переменными (р=0,131 и р=0,677 соответственно), как и возраст (р=0,113). Какой-либо связи остальных исследованных показателей с наличием МОБ на момент окончания индукционной терапии выявлено не было.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее применимыми для определения минимальной остаточной болезни аберрациями иммунофенотипа при ВП-ОЛЛ являются различия в экспрессии CD 10, CD34, CD20, CD45, CD58 и CD38 между опухолевыми и нормальными клетками.

2. Для ВП-ОЛЛ характерна неоднородность опухолевой популяции по интенсивности экспрессии антигенов, применяемых для определения МОБ.

3. Во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB 2008 происходят изменения иммунофенотипа опухолевых клеток: снижается экспрессия CD10, CD34 и CD58, в то время как экспрессия CD19, CD20 и CD45 повышается.

4. Опухолевая популяция неоднородна по количеству NG2 на поверхности клеток, а экспрессия данного антигена существенно снижается во время терапии, поэтому NG2 может применяться для

мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при ВГ1-ОЛЛ с перестройками гена MLL только в качестве вспомогательного антигена для дополнительной характеристики популяций, выделенных по другим маркерам.

5. Гетерогенная экспрессия антигенов опухолевыми клетками и изменения иммунофенотипа во время терапии делают необходимым применение для определения минимальной остаточной болезни широкой панели моноклональных антител, включающей в себя CD19, CD10, CD34, CD45, CD20, CD38 и CD58, а также, в некоторых случаях, дополнительные лейкоз-ассоциированные антигены.

6. Методологические упрощения приводят к ограниченной применимости проточной цитометрии для мониторинга МОБ. При сравнении результатов 6-8-цветной проточной цитометрии и «упрощенного» трехцветного метода, были обнаружены качественные и количественные расхождения результатов в 16,0%, 27,4% и 81,8% образцов, взятых на 15, 36 и 85 день терапии OJ1JI соответственно.

7. Результаты определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления наличия химерного транскрипта методом ОТ-ПЦР у детей с ВП-OJIJI имеют хорошую сопоставимость.

8. На 15-й, 36-й и 85-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2008 остаточные опухолевые клетки были выявлены у 73,7%, 42,6% и 12,8% пациентов соответственно.

9. Количество остаточных опухолевых клеток, определенное методом проточной цитометрии на 15-й день терапии по протоколу ALL-MB 2008 выше 0,160% является наиболее значимым фактором прогнозирования наличия МОБ на 36-й день терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ, ВХОДЯЩИХ В ПЕРЕЧЕНЬ ИЗДАНИЙ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК

1. Попов, A.M. Изучение минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии с целью своевременного планирования стратегии лечения с трансплантацией гемопоэтических клеток / A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур, [и др.] // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2006. - №2. - С. 32-38.

2. Попов, A.M. Особенности мониторинга минимальной остаточной болезни при В-линейных острых лимфобластных лейкозах методом проточной цитометрии у детей первого года жизни / A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур [и др.] // Детская онкология. - 2008. - №2. -С. 32-35.

3. Попов, А.М. Возможности применения NG2 для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом, ассоциированным с реарранжировками гена MLL / А.М. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур [и др.] // Гематология и трансфузиология. - 2009. - №б. - С. 19-22.

4. Цаур, Г.А. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом / Г.А. Цаур, Т.В. Наседкина, A.M. Попов [и др.] // Онкогематология. - 2010. -№2. - С. 46-54.

5. Попов, A.M. Изменения иммунофенотипа опухолевых бластов при CDlO-позитивном остром лимфобластном лейкозе у детей к 15-му дню индукционной терапии по протоколу ALL-MB-2008 / A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур [и др.] // Иммунология. - 2010. - №2. - С. 60-64.

6. Попов, A.M. Сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и

выявления химерного транскрипта полимеразной цепной реакцией у детей, больных В-линейным острым лимфобластным лейкозом / A.M. Попов, Г.А. Цаур, Т.Ю. Вержбицкая [и др.] // Гематология и трансфузиология. -2010.-№2,-С. 3-9.

7. Попов, A.M. Мониторинг минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии у детей с острым лимфобластным лейкозом / A.M. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур [и др.] // Клин. Лаб. диагностика. - 2010. - №8. - С. 36-41.

8. Попов, A.M. Аберрации иммунофенотипа, применимые для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при CDlO-позитивном остром лимфобластном лейкозе из В-линейных предшественников / А.М. Попов, Т.Ю. Вержбицкая, Г.А. Цаур [и др.] // Иммунология. - 2010. - №6. - С. 299-304.

вп

ВП-ОЛЛ

МкАТ

МОБ

ОЛ

ОЛЛ

ОТ-ПЦР

ПЦР ПЦР-РВ

тн

ХТр

сэ

СУ

Р8С

МЕ8Р

МР1 ББС

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В-линейные предшественники

острый лимфобластный лейкоз из В-линейных

предшественников

моноклональные антитела

минимальная остаточная болезнь

острый лейкоз

острый лимфобластный лейкоз

полимеразная цепная реакция с предшествующей обратной

транскрипцией

полимеразная цепная реакция

полимеразная цепная реакция в режиме «реального

времени»

точка наблюдения

химерный транскрипт

кластер дифференцировки

коэффициент вариации

параметр прямого светорассеяния

количество молекул эквивалентного растворенного

флюорохрома

средняя интенсивность флюоресценции параметр бокового светорассеяния

Подписано в печать 10.11.2010 г. Формат 60x84 Мм Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 62/2011. Отпечатано в типографии ГОУ ВПО УГМА Росздрава, г. Екатеринбург, ул. Репина, 3.

Актуальность проблемы

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в лечении острого лимфобластного лейкоза (OJIJI) у детей, данное заболевание по-прежнему является самой частой причиной смерти детей от онкологических заболеваний [3, 8, 100, 137]. Дальнейшее повышение интенсивности химиотерапии не приводит к увеличению выживаемости детей с OJIJI, а во многих случаях повышает риск токсических осложнений [137, 138]. Поэтому крайне актуальным является вопрос выявления среди всех больных тех пациентов, у которых опухоль высокочувствительна к проводимой химиотерапии, и для которых возможно снизить интенсивность лечения.

С другой стороны, традиционный перечень факторов риска развития рецидива OJIJI нуждается в расширении, чтобы максимально точно выявлять пациентов с высокой вероятностью рецидивирования опухоли, и, следовательно, интенсифицировать терапию только этой группе пациентов, избегая повышения токсичности для остальных. В последние годы в большинстве протоколов инициальные факторы риска дополняются показателями, характеризующими ответ опухоли на терапию [54, 55, 85, 93, 105, 118, 122, 124, 143, 147, 148, 149, 153, 157, 158, 164, 165].

Ответ на терапию OJIJI уже в течение длительного времени используется как один из важнейших факторов прогноза и стратификации пациентов по группам риска [143]. Даже в том случае, если в образцах костного мозга (КМ), взятых во время терапии, количество опухолевых клеток ниже чувствительности обычных цитологических методов (менее 1%), они могут вносить существенный вклад в неблагоприятный исход заболевания [47, 80, 123, 171]. Совокупность этих клеток, не выявляемых цитологически, но обнаруживаемых другими более чувствительными методами диагностики, получила название минимальной остаточной болезни (МОБ). Для оценки и мониторинга МОБ чаще всего используются два метода: полимеразная цепная реакция (ГЩР) и многоцветная проточная цитометрия [39, 44, 46, 47, 48, 80, 123, 160]. Основным направлением применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ является определение лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа, т.е. специфичного для опухоли сочетания экспрессии антигенов [2, 11, 39, 43, 44, 47, 75, 109]. Клиническая значимость определения МОБ методом проточной цитометрии показана различными исследовательскими группами [10, 23, 30, 37, 57, 58, 79, 172].

Чаще всего разные исследовательские группы используют различные подходы к определению остаточных опухолевых клеток [38, 39, 43, 81, 109]. Поэтому, несмотря на определенный опыт применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ, накопленный к настоящему времени, крайне редки публикации, в которых бы описывался четкий алгоритм анализа данных цитометрического исследования. Кроме того, постоянно появляются новые маркеры, потенциальное применение которых для определения МОБ представляется перспективным. Одним из таких антигенов, например, является NG2, экспрессия которого специфична для ОЛЛ, ассоциированных с перестройками гена MLL [176]. В то же время, некоторыми исследователями предлагаются упрощенные подходы для мониторинга МОБ методом проточной цитометрии [7, 61]. Применимость таких методов остается недостаточно изученной.

Кроме того, конкретные подходы к мониторингу МОБ могут применяться только в рамках конкретного протокола лечения. Методология определения МОБ во время терапии по одному протоколу может не удовлетворять условиям другого протокола. Это может быть обусловлено различиями в изменениях иммунофенотипа опухолевых клеток под воздействием различных препаратов, разным временем заселения КМ нормальными клетками-предшественниками, а также другими факторами, напрямую связанными с терапевтическим режимом.

Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии OJ1JI у детей разных возрастных групп [12, 13, 14, 86, 106] диктует необходимость разработки собственных алгоритмов мониторинга МОБ. Однако в настоящее время попытки применения проточной цитометрии для оценки минимальной остаточной болезни в рамках российских протоколов единичны [2, 7, 10, 11]. Таким образом, возможности применения проточной цитометрии для мониторинга МОБ в рамках российских протоколов лечения OJIJI, таких как ALL-MB 2008 и MLL-Baby, остаются неизученными.

Все вышесказанное определило цель исследования - изучить количество остаточных опухолевых клеток у детей с острым лимфобластным лейкозом из B-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby, методом проточной цитометрии.

Задачи исследования

1. Определить аберрации иммунофенотипа опухолевых клеток, применимые для определения минимальной остаточной болезни при OJIJI из В-линейных предшественников (ВП-OJIJI).

2. Оценить изменения экспрессии антигенов, применяемых для мониторинга минимальной остаточной болезни, в процессе терапии по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby.

3. Оценить возможность применения MZX-ассоциированного антигена NG2 для мониторинга минимальной остаточной болезни при B-линейном ОЛЛ с перестройками гена MLL.

4. Оценить возможности применения трехцветного «упрощенного» метода для определения минимальной остаточной болезни.

5. Разработать и внедрить алгоритм определения минимальной остаточной болезни при ОЛЛ из B-линейных предшественников.

6. Сравнить результаты определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и экспрессии химерных генов в ПЦР.

7. Провести определение минимальной остаточной болезни на 15-й, 36-й и 85-й дни лечения у пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008.

Научная новизна

Показаны отличия опухолевых бластов при B-линейных OJIJI от нормальных B-клеток по экспрессии CD10, CD20, CD45, CD20 и CD58. Выявлена неоднородность опухолевой популяции по интенсивности экспрессии антигенов, использующихся для определения МОБ. Установлены особенности изменений иммунофенотипа бластов, происходящих во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB 2008. Показано существенное снижение экспрессии MLZ-ассоциированного антигена NG2 во время терапии OJIJI, ассоциированного с перестройками гена MLL. Установлено появление в костном мозге у некоторых пациентов с OJIJI, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008, нормальных B-линейных предшественников уже на момент окончания индукционной терапии, что может существенно осложнять определение МОБ в данной точке наблюдения. В результате детального сравнительного анализа показана хорошая сопоставимость результатов определения МОБ методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПНР на различных этапах терапии OJIJI. В результате определения МОБ в 168 образцах КМ пациентов, получавших терапию по протоколу ALL-MB 2008, выявлена положительная корреляционная связь показателей раннего ответа на терапию с наличием МОБ на момент окончания индукционной терапии.

Практическая значимость

Определены наиболее применимые для мониторинга МОБ аберрации иммунофенотипа опухолевых бластов при ВП-OJIJI. Разработаны алгоритмы анализа данных проточной цитометрии при определении МОБ у пациентов с различными иммунологическими вариантами ВП-ОЛЛ с учетом гетерогенности экспрессии антигенов опухолевыми клетками и изменений иммунофенотипа во время терапии. Установлена ограниченная применимость антигена N02 для мониторинга МОБ при ВП-ОЛЛ, ассоциированных с перестройками гена МЬЬ. Показана ограниченная применимость «упрощенного» трехцветного метода определения МОБ по Е. Со^ап-ЗгшА е! а1. На основании хорошей качественной сопоставимости результатов определения МОБ методом проточной цитометрии и выявления химерного транскрипта в ходе ПЦР, предложено одновременное применение двух данных методов для мониторинга МОБ у детей с ВП-ОЛЛ с наличием химерных генов. Рекомендовано применять проточную цитометрию на ранних этапах терапию, когда важно определение уровня МОБ, а ПЦР - в более поздних точках наблюдения, когда прогностически значимо качественное определение МОБ.

Внедрение в практику

Разработанный по результатам исследования алгоритм мониторинга МОБ методом проточной цитометрии у детей с ВП-ОЛЛ успешно внедрен в работу Лаборатории иммунофенотипирования гемобластозов Отдела детской онкогематологии Областной детской клинической больницы №1 (г. Екатеринбург). Данный алгоритм успешно применяется для мониторинга МОБ методом проточной цитометрии в рамках кооперативной группы по изучению ОЛЛ «Москва-Берлин». Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре клинической лабораторной и микробиологической диагностики ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на Всероссийской конференции «Лабораторная наука - практике: первое десятилетие XXI века»

Москва, 2010), Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2009), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007), Съезде детских онкологов России (Москва, 2008), конгрессах Европейского гематологического общества (Берлин, 2009; Барселона, 2010), Международного общества детских онкологов (Берлин, 2008; Сан-Паулу, 2009), Американского общества гематологов (Новый Орлеан, 2009; Орландо, 2010), Американского общества клинической химии (Анахайм, 2010). По материалам исследования опубликовано 53 печатные работы, в том числе 8 статей в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК.

Положения, выносимые на защиту

1. Наиболее применимыми для мониторинга минимальной остаточной болезни при ВП-ОЛЛ аберрациями иммунофенотипа опухолевых клеток являются снижение экспрессии CD45, CD20, CD38 и повышение экспрессии CD 10, CD34, CD58.

2. Во время индукционной терапии происходят существенные изменения экспрессии антигенов, используемых для определения минимальной остаточной болезни, что обусловливает необходимость применения для мониторинга МОБ многоцветной проточной цитометрии.

3. Разработанный по результатом исследования алгоритм применения проточной цитометрии позволяет адекватно мониторировать минимальную остаточную болезнь у детей с ОЛЛ из B-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby.

выводы

1. Наиболее применимыми для определения минимальной остаточной болезни аберрациями иммунофенотипа при ВП-OJIJI являются различия в экспрессии CD 10, CD34, CD20, CD45, CD58 и CD38 между опухолевыми и нормальными клетками.

2. Для ВП-ОЛЛ характерна неоднородность опухолевой популяции по интенсивности экспрессии антигенов, применяемых для определения МОБ.

3. Во время индукционной терапии по протоколу ALL-MB 2008 происходят изменения иммунофенотипа опухолевых клеток: снижается экспрессия CD10, CD34 и CD58, в то время как экспрессия CD 19, CD20 и CD45 повышается.

4. Опухолевая популяция неоднородна по количеству NG2 на поверхности клеток, а экспрессия данного антигена существенно снижается во время терапии, поэтому NG2 может применяться для мониторинга минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии при ВП-ОЛЛ с перестройками гена MLL только в качестве вспомогательного антигена для дополнительной характеристики популяций, выделенных по другим маркерам.

5. Гетерогенная экспрессия антигенов опухолевыми клетками и изменения иммунофенотипа во время терапии делают необходимым применение для определения минимальной остаточной болезни широкой панели моноклональных антител, включающей в себя CD 19, CD 10, CD34, CD45, CD20, CD38 и CD58, а также, в некоторых случаях, дополнительные лейкоз-ассоциированные антигены.

6. Методологические упрощения приводят к ограниченной применимости проточной цитометрии для мониторинга МОБ. При сравнении результатов б-8-цветной проточной цитометрии и «упрощенного» трехцветного метода, были обнаружены качественные и количественные расхождения результатов в 16,0%, 27,4% и 81,8% образцов, взятых на 15, 36 и 85 день терапии OJIJI соответственно.

7. Результаты определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии и выявления наличия химерного транскрипта методом ОТ-ПЦР у детей с ВП-ОЛЛ имеют хорошую сопоставимость.

8. На 15-й, 36-й и 85-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2008 остаточные опухолевые клетки были выявлены у 73,7%, 42,6% и 12,8% пациентов соответственно.

9. Количество остаточных опухолевых клеток, определенное методом проточной цитометрии на 15-й день терапии по протоколу ALL-MB 2008 выше 0,160% является наиболее значимым фактором прогнозирования наличия МОБ на 36-й день терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время накоплен определенный опыт в мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Вместе с тем многие методические аспекты описаны в литературе крайне обще. Кроме того, алгоритмы применения проточной цитометрии для выявления МОБ различаются в рамках разных протоколов терапии ОЛЛ. Наличие в Российской Федерации и Республике Беларусь оригинальных протоколов терапии ОЛЛ у детей разных возрастных групп диктует необходимость разработки собственных подходов к мониторингу МОБ. Это и определило цель и задачи данного исследования.

В результате исследования образцов костного мозга взятых на момент диагностики и на разных этапах терапии у 199 детей с ВП-ОЛЛ, нами были разработаны алгоритмы применения проточной цитометрии для определения МОБ при разных иммунологических вариантах ВП-ОЛЛ. Созданный алгоритм позволяет адекватно мониторировать минимальную остаточную болезнь у детей с ОЛЛ из B-линейных предшественников, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby. В рамках протокола ALL-MB 2008 определение МОБ было проведено у 61 пациента.

При сравнении экспрессии различных антигенов нормальными и опухолевыми клетками, нами были выявлены существенные отличия бластов при ВП-ОЛЛ как от зрелых B-лимфоцитов, так и от нормальных ВП по уровню экспрессии CD 10, CD45, CD20, CD58 и CD38. В то же время экспрессия CD34 опухолевыми клетками достоверно не отличалась от экспрессии данного антигена ВП. Все исследованные маркеры применимы для мониторинга МОБ как во время индукционной терапии, так и на более поздних этапах лечения. Даже CD34, применение которого не всегда позволяет отличить опухолевые клетки от нормальных ВП, достаточно ценен при CDIO(-) ВП-ОЛЛ, так как нормальные ВП, в отличие от опухолевых клеток, экспрессируют CD 10, и, соответственно С010(-)С034(+)-клетки расцениваются при анализе данных как опухолевые. Кроме того, отсутствие CD34 при высокой экспрессии CD 10 также является аберрацией иммуиофенотипа, применимой для мониторинга МОБ. Несмотря на четкие отличия между опухолевыми и нормальными клетками в экспрессии различных антигенов, в настоящее время не существует единственного маркера, который был бы применим для мониторинга МОБ во всех случаях ВП-ОЛЛ. Причин этого несколько.

Несмотря на выявленные количественные отличия в экспрессии антигенов опухолевыми и нормальными клетками, зачастую маркеры экспрессируются далеко не всеми бластами. Так в 16,8% случаев наблюдалась гетерогенная экспрессия CD 10 - маркера, на котором чаще всего основывается определение МОБ при CD10(+) ВП-ОЛЛ. Гетерогенная экспрессия CD34, еще одного антигена, часто используемого для мониторинга МОБ, наблюдалась в 30,6% случаев. Кроме того, у 11,6% пациентов бласты оказались CD34-негативными. В итоге, менее чем у половины больных (45,08%) все бласты коэкспрессировали CD 10 и CD34. У 4,1% пациентов обнаруживались также опухолевые клетки, не экспрессировавшие ни CD 10, ни CD34. Анализ экспрессии CD34 опухолевыми клетками пациентов с различной экспрессией CD 10 показал, что чаще всего хотя бы один из этих двух антигенов клеток-предшественников гомогенно экспрессируется всеми бластами. Сходные результаты определения экспрессии CD34 были получены и в группе пациентов с CDIO(-) ВП-ОЛЛ. У большинства пациентов (особенно при CDIO(-) варианте ВП-ОЛЛ) выделение опухолевых клеток только по экспрессии CD45 может оказаться проблематичным, так как у них бласты отличаются от нормальных клеток по экспрессии пан-лейкоцитарного антигена только количественно. Разные варианты экспрессии CD20 и CD38, а также выявление случаев с наличием С058-негативных бластов свидетельствуют в пользу того, что и эти маркеры не всегда применимы для мониторинга МОБ.

Кроме того, фенотип опухолевых клеток изменяется под действием химиопрепаратов. Экспрессия таких антигенов, как CD 19, CD20 и CD45 повышается, в то время как экспрессия CD10, CD34 и CD58 во время индукционной терапии снижается. В результате этого во время лечения бласты на точечных графиках бывает сложнее отличить от нормальных клеток, чем на момент диагностики. Несмотря на то, что численная разница в экспрессии CD 10, CD34, CD58, CD20 и CD45 сохраняется, анализ точечных графиков на 15-й день терапии осложняется тем, что опухолевые клетки и зрелые лимфоциты на графиках сближаются. В результате этого во время лечения бласты на точечных графиках бывает сложнее отличить от нормальных клеток, чем на момент диагностики.

Таким образом, несмотря на четкие отличия между опухолевыми и нормальными клетками в экспрессии различных антигенов, в настоящее время не существует единственного маркера, который был бы применим для мониторинга МОБ во всех случаях ВП-OJIJI. Гетерогенность экспрессии антигенов опухолевыми клетками, выявленная для всех исследованных маркеров при обоих вариантах ВП-ОЛЛ, приводит к тому, что у некоторых пациентов приходится мониторировать одновременно несколько субпопуляций бластов, а изменения иммунофенотипа ограничивают применение каждого маркера по отдельности.

По результатам исследования нами были сформулированы алгоритмы анализа данных для выявления остаточных опухолевых клеток при CD 10-позитивном и CDlO-негативном вариантах ВП-ОЛЛ. Для CD10(+) ВП-ОЛЛ после выделения С019-позитивных клеток анализ точечных графиков основывается на определении экспрессии CD 10 и маркеров, по которым можно отличить опухолевые клетки от нормальных ВП (например, CD45 при CD45(-) ВП-ОЛЛ, или CD58). В случае гетерогенной экспрессии CD 10 необходимо оценивать также экспрессию всех остальных используемых маркеров, прежде всего, CD34. Для CDIO(-) ВП-ОЛЛ при анализе данных наиболее значимым является определение экспрессии CD 10 и CD20. При этом из анализа исключаются CDlO-позитивные и С020-позитивные клетки. Среди оставшихся

CD19(+)CD10(-)CD20(-) клеток необходимо отличать МОБ от плазмоцитов и продуктов неспецифического связывания антител. Для этого необходимо использовать CD38, CD34, CD45, а также антигены, ассоциированные с перестройками гена MLL (CD15, CD65, CD133, NG2), если эти перестройки были обнаружены на момент диагностики.

Несмотря на то, что NG2 является специфическим маркером, ассоциированным с перестройками гена MLL, данный антиген экспрессируется в большинстве случаев лишь частью опухолевой популяции (медиана доли позитивных клеток — 63,75%). Кроме того, экспрессия NG2 и доля NG2-положительных клеток существенно снижаются во время лечения, особенно после окончания индукционной терапии, а при рецидиве у части пациентов опухолевые клетки КС2-негативны. Таким образом, даже NG2 нельзя использовать как основной маркер для выделения опухолевых клеток на точечных графиках при мониторинге МОБ методом проточной цитометрии. Тем не менее, в комбинации с другими антигенами NG2 может использоваться для мониторинга МОБ, но не для выделения опухолевых клеток, а как дополнительная характеристика популяций, выделенных по другим маркерам. Особенно применение дополнительных лейкоз-специфических маркеров важно в тех случаях, когда количество остаточных опухолевых клеток крайне невелико. Так как алгоритм анализа данных при мониторинге МОБ при CDIO(-) ВП-ОЛЛ основан на выделении CD10(-)CD20(-)-KneTOK, могут возникнуть трудности с отличием бластов от плазмоцитов и результатов неспецифического связывания антител. Дополнительные антигены, такие как CD38, CD34, CD45, CD58, не всегда применимы в таких случаях. Именно поэтому NG2 может оказать существенную помощь в определении, являются ли выделенные клетки опухолевыми, или нет.

Ни в одном образце, взятом на 15-й день терапии, нормальные ВП не были обнаружены вне зависимости от того, выявлялись ли в этих образцах остаточные опухолевые бласты. При этом в 6,9% образцов, взятых на момент окончания индукционной терапии, и в 87,2% образцов, взятых на 85-й день терапии, были выявлены нормальные ВП в различных количествах. Таким образом, даже на момент окончания индукционной терапии в костном мозге могут обнаруживаться нормальные ВП, а на 85-й день терапии нормальные клетки-предшественники обнаруживаются у подавляющего большинства пациентов.

Отсутствие единственного применимого для определения МОБ маркера, изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии и колонизация костного мозга нормальными клетками-предшественниками уже на момент окончания индукционной терапии приводят к тому, что для адекватного определения остаточных опухолевых клеток предпочтительно применять многоцветные комбинации антител, включающие в себя, кроме CD 19, такие маркеры как CD10, CD20, CD34, CD45, CD58 и CD38. Попытки упростить подходы к определению МОБ путем сокращения панелей МкАТ уменьшают число пациентов, у которых возможно определение МОБ методом проточной цитометрии, а также ведут к качественно и количественно некорректным результатам анализа, количество которых возрастает с каждой дальнейшей точкой наблюдения. Так при сравнении результатов 6-8-цветной проточной цитометрии и «упрощенного» трехцветного подхода, были обнаружены расхождения в 16,0%, 27,4% и 81,8% образцов на 15, 36 и 85 день терапии OJIJ1 соответственно.

Крайне интересным показалось нам сопоставление результатов проточной цитометрии и другого метода, часто применяемого для мониторинга МОБ — ПЦР химерного транскрипта. Качественная сходимость составила 93,9%. Сходимость результатов не зависела от этапа терапии, типа молекулярной перестройки, варианта ВП-OJIJI, наличия в образце нормальных ВП. Несмотря на хорошую качественную сходимость, прямое количественное сопоставление результатов определения МОБ двумя данными методами невозможно по нескольким причинам. Во-первых, экспрессия химерного гена может заметно меняться в процессе терапии вне зависимости от изменения количества опухолевых клеток. Во-вторых, существуют значительные различия при расчете величины МОБ при иммунофенотипировании и ПЦР-РВ. Так при проведении проточной цитометрии определяется процентное содержание опухолевых клеток среди всех ядросодержащих клеток костного мозга, в то же время при ПЦР-РВ величина МОБ определяется как процентное отношение нормализованного числа копий ХТр в остаточных опухолевых клетках к аналогичной величине на момент диагностики. Тем не менее, кинетика уровня МОБ во время терапии сходна для проточной цитометрии и ПЦР-РВ. Вследствие этого, одновременное применение данных методов может с успехом использоваться у пациентов, у которых определяется ХТр. Особенно это важно для детей с OJIJI, имеющих высокий риск развития рецидива: пациентов с наличием химерного гена BCR-ABL р190, перестройками гена MLL, а также пациентов, у которых в костном мозге в течение длительного времени обнаруживаются опухолевые клетки или ХТр. У таких больных, с нашей точки зрения, необходим продолжительный мониторинг МОБ, в том числе во время консолидации/интенсификации и (при сохранении МОБ) в ходе поддерживающей терапии. При этом во время индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать данные проточной цитометрии. В то же время, в последующих ТН достаточно только качественного определения МОБ, поэтому предпочтительнее использовать результаты определения ХТр методом ОТ-ПЦР, вследствие более высокой чувствительности метода.

На 15-й, 36-й и 85-й дни терапии по протоколу ALL-MB 2008 остаточные опухолевые клетки выявляются у 73,7%, 42,6% и 12,8% пациентов соответственно. При этом среди МОБ-позитивных пациентов на 15-й день преобладали пациенты с относительно высокими величинами МОБ (более 0,1%), а на более поздних этапах лечения - пациенты с относительно низким содержанием опухолевых клеток (менее 0,1%). Наличие пациентов с величинами МОБ в диапазоне от 0,001% до 0,01% не позволяет ограничивать чувствительность проточной цитометрии уровнем более или равным 1х10~4. Особенно это важно на 36-й день терапии, когда пациентов со столь низким уровнем МОБ больше всего (14,7%).

Мы исследовали влияние на наличие МОБ у детей с ОЛЛ на момент окончания индукционной терапии протокола А1Х-МВ-2008 различных инициальных клинических и лабораторных показателей, а также параметров, характеризующих ранний ответ на терапию. Среди инициальных показателей значимые отличия МОБ-позитивных от МОБ-негативных пациентов были выявлены только для возраста. Дети старше 3 лет имели статистически значимо больший шанс быть МОБ-позитивными. Среди параметров раннего ответа, величина МОБ на 15-й день терапии позволяет наиболее точно разделить МОБ-позитивных и МОБ-негативных на 36-й день пациентов (диагностическая эффективность теста - 79,31%). Пороговым уровнем для МОБ на 15-й день является 0,160%. Данный параметр оказался единственной независимой переменной при проведении многофакторного анализа. Наиболее распространенные показатели раннего ответа на терапию, такие как определенные цитологически количество бластов в периферической крови на 8-й день терапии и процентное содержание бластов в костном мозге на 15-й день, также могут влиять на МОБ-статус по окончании индукционной терапии (пороговые уровни 38/мкл и 0,8% соответственно), но при многофакторном анализе они оказались зависимыми переменными (р=0,131 и рЮ,677 соответственно), как и возраст (р=0,113). Какой-либо связи остальных исследованных показателей с наличием МОБ на момент окончания индукционной терапии выявлено не было.

Прогностическая значимость мониторинга МОБ методом проточной цитометрии в рамках данных протоколов нуждается в дальнейшем исследовании.

Таким образом, если учитывать различия в экспрессии маркеров нормальными и опухолевыми клетками, гетерогенность экспрессии антигенов, изменения иммунофенотипа опухолевых клеток во время терапии и заселение костного мозга нормальными клетками-предшественниками, определение МОБ методом проточной цитометрии возможно практически у всех пациентов с ВП-OJIJI, получающих терапию по протоколам ALL-MB 2008 и MLL-Baby. При этом для адекватной оценки МОБ во всех точках наблюдения, предусмотренных протоколами, необходимо использовать широкую панель МкАТ включающую в себя, кроме CD 19, такие маркеры как CD 10, CD20, CD34, CD45, CD58 и CD38. В ряде случаев может оказаться полезным также применение дополнительных лейкоз-ассоциированных маркеров, таких как NG2. У части пациентов возможно комбинирование определения МОБ проточной цитометрией и выявления ХТр в ходе ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ.