Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов при иммунокорригирующей терапии рака молочной железы

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов при иммунокорригирующей терапии рака молочной железы

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.12 онкология

ШАМИЛОВ ФАРХАД АЗЕРОВИЧ

9 ОКТ 2014

Москва 2014

005553312

005553312

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет МГМСУ имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени H.H. Блохина» Российской академии медицинских наук.

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук, профессор Сельчук Владимир Юрьевич

Доктор медицинских наук, профессор Тупицын Николай Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор кафедры онкологии ГБОУ ВПО «1 МГМУ им. И.М.Сеченова»

Минздрава России Высоцкая Ирина В икторовна

Доктор медицинских наук, заведующий отделением онкологии и реконструктивно-пластической хирургии молочной железы и кожи ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт им. П. А. Герцена» Минздрава России Зикиряходжаев Азиз Дилыподович

Ведущее учреждение:

ФГБУ «Государственный научный центр (ГНЦ) институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации (ФМБА РФ).

диссертационного совета (Д.001.017.02) при ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru

Защита диссертации состоится

года в_часов на заседании

Автореферат разослан «/Jj» Q $ 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В структуре онкологических заболеваний женского населения в России, как и в большинстве развитых стран мира, рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место, причем отмечается рост как показателей заболеваемости, так и смертности. В России в 2007 году его доля составила 20%. 1 млн. новых случаев рака молочной железы ежегодно регистрируется в мире по данным Всемирной организации здравоохранения. В Москве и Санкт-Петербурге 5-летняя выживаемость при РМЖ составляет 59,3-59,6%. У вновь выявленных больных около 35% случаев составляют III—IV стадии. Отдаленные метастазы возникают у 50% больных раком молочной железы, медиана выживаемости больных с метастатическим раком молочной железы составляет 24-36 месяцев, и только 15% живут более 5 лет (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009).

У больных злокачественными опухолями отмечаются значительные нарушения различных звеньев иммунного ответа организма. Проведенные исследования у онкологических больных указывают на снижение количества естественных киллеров, Т-хелперов, функциональной активности Т-лимфоцитов, увеличение количества Т-супрессоров и их функциональной активности.

Снижение уровня Т-клеточной инфильтрации опухоли имеет определенную связь с регионарным метастазированием или наличием микрометастазов (Паниченко A.B., 2002; Крохина О.В., 2003). Доказано, что увеличение количества интратуморальных Т-киллеров является фактором благоприятного прогноза у больных раком молочной железы, преимущественно без регионарных метастазов (Артамонова Е.В., ТупицынН.Н., 2005). Наибольшее значение имеет инфильтрация опухоли CD8+ лимфоцитами. Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе неоадъювантной химиотерапии РМЖ взаимосвязана с прогнозом заболевания (Субботина A.A., Тупицын H.H., 2009).

Доказано, что инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы цитотоксическими лимфоцитами (CD 8+) является фактором благоприятного прогноза, а выраженная инфильтрация CD4+ лимфоцитами и макрофагами, напротив, ухудшает прогноз (DeNardo D.G. et al., 2011; Ruffel В. et al., 2012).

Прогностическая роль субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы также достаточно хорошо известна. При

однофакторном анализе главенствующая прогностическая роль принадлежит СБ8+ лимфоцитам (Артамонова Е.В., 2009). В отсутствие выраженной инфильтрации рака молочной железы С08+ клетками СБ4+ лимфоциты способствуют опухолевой инвазии и развитию отдаленных метастазов рака молочной железы путем влияния на протуморальную активность опухолеассоциированных макрофагов феКап!о Б.й. е1 а1., 2009). Совокупность этих данных позволила предположить, что три клеточных типа — СБ4+ и СБ8+ лимфоциты, а также СИ68+ макрофаги могут играть главную роль в прогнозе рака молочной железы. Предложена трехмаркерная иммунная сигнатура для более точной оценки прогноза у больных раком молочной железы (БеЫагс1о О-в. й а1„ 2011). Иммунный профиль СВ681ля'СВ41ли'СВ8н'еЬ характерен для первичного рака молочной железы, который даже в случаях только хирургического лечения, характеризуется высокими показателями общей и безрецидивной выживаемости. Напротив, иммунные ответы С068ш6ьС04твьС1)81Л« соответствуют группе больных с риском развития отдаленных метастазов и низкими показателями выживаемости.

Таким образом, установлены прогностически благоприятные иммунологические характеристики интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Актуальной является задача по поиску путей иммунотерапевтического воздействия на субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов с целью его коррекции и улучшения прогноза у больных. Решению данной актуальной задачи и посвящена наша работа.

Цель исследования

Изучение количественного состава интратуморальных лимфоцитов, динамики их субпопуляций при проведении иммунокорригирующей терапии рака молочной железы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить количественный субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы (на материале хирургически удаленной опухоли) методом многопараметровой проточной цитометрии.

2. На материале опухолевой ткани, полученном при кор-биопсии, определить уровень субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по следующим показателям:

2.1 общий уровень лимфоидной инфильтрации — количество СБ45+

лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при

проточной цитометрии;

2.2 процент зрелых Т-лимфоцитов (СОЗ+) среди лимфоцитов (СБ45+);

2.3 процент зрелых С04+СБЗ+ Т-лимфоцитов;

2.4 процент зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов СШ+СВ8+;

2.5 соотношение СБ8/СВ4;

2.6 процент активированных (регуляторных) СВ4+СБ25+ клеток;

2.7 процент Ж-клеток — СБЗ-С05б+;

2.8 процент ТЫК клеток — СВЗ+С05б+.

3. Провести лечение препаратом «Полиоксидоний» больных раком молочной железы с оценкой клинических показателей и морфологических признаков его эффективности (индукция патоморфоза).

4. Изучить динамику показателей интратуморальных лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием.

5. Сопоставить иммунологические изменения в ходе иммунотерапии с клиническими характеристиками, морфологическими признаками и рецепторным статусом опухоли.

6. Определить показания для проведения иммунокорригирующей терапии у больных операбельным раком молочной железы.

Научная новизна

Впервые на достаточном клиническом материале проведен анализ субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы. Уровень общей лимфоидной инфильтрации рака молочной железы определяется, в первую очередь, Т-цитотоксическими клетками (СБ8+). Установлено, что в материале опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (СБЗ+), количество которых достигало 95,2% числа лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%. Количество С04-лимфоцитов незначительно

преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (СБ8+) — в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение СБ8:СВ4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (СБ45+СБЗ-СВ56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Количество Т-регуляторных клеток находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем — 4,2±0,5%. Новым является факт, что в процессе иммунотерапии полиоксидонием большинство субпопуляций интратуморальных лимфоцитов не изменяются, вместе с тем, достоверно снижается количество интратуморальных естественных киллеров, а выраженность эффекта полиоксидония (индукция патоморфоза) определяется, в первую очередь, нарастанием пропорции интратуморальных СБ4+ лимфоцитов.

Практическая значимость

Научно-практическое значение проведенной работы определяется двумя основными аспектами — диагностическим и лечебным.

В диагностическом плане убедительно доказана возможность проведения полноценного изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по материалу кор-биопсии методом многоцветной проточной цигометрии. Это дает основание для формирования групп больных, которым показана иммунотерапия в неоадъювантном режиме, т.е. до проведения хирургического лечения.

Лечебный аспект выполняемого диссертационного исследования заключается в том, что применение полиоксидония у больных раком молочной железы вело к развитию иммуно-опосредованного патоморфоза. Данный феномен наблюдался у 30% больных. Также научно-практическим значением данной работы являются полученные сведения по целесообразности включения полиоксидония в арсенал препаратов, применяемых в неоадъювантном режиме у больных операбельным раком молочной железы.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 30 октября 2013 года на совместной научной конференции подразделений: кафедры онкологии факультета последипломного образования ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» и кафедры онкологии ГБОУ ВПО « I ММУ им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, а также отделений опухолей молочных желез, опухолей женской репродуктивной системы, радиохирургии и лаборатории

иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН.

Личный вклад автора: автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Разработан дизайн исследования, статистическая обработка материала, полученного в ходе исследования. Под руководством и при непосредственном участии автора проведено внедрение новых форм диагностики и лечения рака молочной железы.

Автором осуществлен анализ, интерпретация собранных материалов, сформулированы выводы и практические рекомендации, оформлена диссертационная работа.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения соответствуют паспорту специальности 14.01.12 _

«онкология», конкретно пункту 6.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в т.ч. 3 в журналах, рекомендованных ВАК России

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы, включающего 38 источников отечественной и 169 источников зарубежной литературы. Иллюстрирована 34 таблицами и 10 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пациенты, характеристика клинического и биопсийного материала

Материалом для настоящего исследования послужили результаты исследований 57 образцов опухолевой ткани от 37 больных раком молочной железы T1-2N1-3M0 стадий. Установление диагноза рака молочной железы и лечение пациенток проведено в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН в 20102012 годах.

Все пациентки, включенные в исследование, проходили лечение в хирургическом отделении опухолей молочных желез (зав. отделением профессор И.К.Воротников) НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН.

Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза (зав. лабораторией д.м.н. профессор Н.Н.Тупицын) централизованного клинико-лабораторного отдела (зав. доктор медицинских наук, профессор Кадашдзе З.Г.) НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОЩ им. Н.Н.Блохина» РАМН (директор — академик РАН и РАМН профессор М.И.Давыдов).

Морфологическая часть исследования проводилась в отделе патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (зав. отделом доктор медицинских наук, профессор Карселадзе А.И.).

Критерием для отбора больных в исследовании служи гистологический верифицированный диагноз рака молочной железы.

В нашу работу вошли женщины в возрасте от 32 до 78 лет. Средний возраст больных составил 55 лет. Менструальная функция была сохранена у 9 больных (24,3%), в периоде менопаузы — 28 женщин (75,7%).

Клинический диагноз рака молочной железы у всех больных подтвержден данными гистологического исследования опухоли. Стандартный объем предоперационного обследования у пациенток РМЖ включал ультразвуковое исследование и рентгеновскую маммографию обеих молочных желез в двух проекциях, ультразвуковое исследование подмышечных, надключичных и подключичных лимфатических узлов, органов малого таза и печени, рентгенографию органов грудной клетки, сканирование скелета.

Распространенность опухоли оценивалась согласно Международной классификации злокачественных опухолей по системе TNM 7-ой редакции. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, наибольшее число больных относилось к На, lib и Ша стадиям (по 27,0%). До проведения настоящей работы больным специфического лечения не проводили.

20 больным в возрасте от 32 до 78 лет (медиана — 52,5 года) проводили кор-биопсию опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальную операцию. Полиоксидоний применяли внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й дни (1-й день — день кор-биопсии). Препарат был предоставлен для выполнения протокола совместных исследований ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН и НПО «Петровакс». Протокол был утвержден этическим комитетом ГБОУ ВПО

«МГМСУ им А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Все больные подписывали информированное согласие. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония.

Таблица 1

Распределение больных РМЖпо стадиям в соответствии с классификациейрШМ

Стадия Число больных абс. Частота %

I стадия: T1N0M0 6 16,2

Па стадия: T1N1M0 T2NOMO 10 1 9 27,0 2,7 24,3

116 стадия: T2N1M0 10 10 27,0 27,0

Illa стадия: T1N2M0 T2N2M0 10 1 9 27,0 2,7 14,3

Шс стадия: T2N3M0 1 1 2,7 2,7

Всего 37 100

По данным гистологического исследования хирургически удаленных опухолей, обнаружено, что наиболее часто встречался инфильтративный протоковый рак — 29 наблюдений (78,4%), инфильтративный дольковый рак — 6 случаев (16,2%), тубулярный и медуллярный раки — по одному наблюдению.

У 15 (40,5%) пациенток не обнаружено метастазов в лимфатических узлах (критерий N0) у 11 (29,7%) — имелись метастазы в 1-4 лимфоузлах (N1), в 10 (27,0%) случаях определялись конгломераты увеличенных плотных лимфатических узлов в подмышечной области или поражение от 5 до 9 лимфоузлов (N2). Мы наблюдали 1 (3,7%) случай, соответствующий индексу N3 поражения регионарных лимфатических узлов при раке молочной железы.

Степень злокачественности опухоли была определена у 34 больных исследуемой группы. В большинстве случаев — 29 (85,3%) обнаружена II степень злокачественности, реже — 1П степень — у 5 (14,7%) больных.

Хирургическое вмешательство различного объема выполнено всем больным изучаемой группы. Радикальная резекция выполнена 8 больным, остальным

хирургическое лечение проведено в объеме радикальной мастэктомии с сохранением грудных мышц.

Помимо клинико-морфологических критериев прогноза (размер опухолевого узла, гистологический тип опухоли, количество пораженных лимфатических узлов), у больных оценивали рецепторный статус опухоли, пролиферативный индекс (Ki-67), экспрессию рецептора Her2/neu.

Исследование рецепторов эстрогенов было проведено у 32 больных раком молочной железы, из которых у 27 (84,4%) больных опухоль была рецептор-положительной по рецепторам эстрогенов, у 5 .(15,6%) — рецептор-отрицательной.

Уровень рецепторов прогестерона в первичной опухоли определен также у 32 больных. В 25 (78,1%) случаев опухоль содержала рецепторы к прогестерону, у 7 (21,9%) больных опухоль была рецептор отрицательной.

Распределение больных в зависимости от рецепторного статуса опухоли было следующим: у большинства больных опухоли содержали рецепторы эстрогенов и прогестерона (РЭ+РП+) 25 (78,1%). В 5 (15,6%) клинических случаях не обнаружены оба вида рецепторов (РЭ-РП-). Случаев отрицательного рецепторного статуса по рецепторам эстрогенов и положительного по рецептору прогестерона (РЭ-РП+) не было. Опухоль, положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по прогестерону (РЭ+РП-) обнаружена у 2 (6,3%) больных.

Уровень рецептора Her2/neu в первичной опухоли также определен у 32 больных. В 17 (53,1%) случаях опухоль не содержала рецепторы к Нег2/ neu (-), у 10 (31,3%) больных уровни рецепторов к Her2/neu (1+) были крайне низкие, у 3 (9,4%) больных — Her2/neu (2+) (в одном из этих случаев методом FISH подтвержден положительный рецепторный статус), у 2 (6,3%) больных — Her2/neu (3+).

Реактивы и методы исследования

Характеристика специфичности использованных в работе моноклональных антител представлена в таблице 2.

и

Таблица 2

Специфичность использованных моноклональных антител

№ Кластер дифференцировки, название Специфичность

1 CD45 Все лейкоциты

2 CD 8 Т-киллеры

3 CD4 Т-хелперы

4 CD3 Т-клетки

5 CD56 NK-клетки

6 CD25 Рецептор ИЛ-2; активированные лимфоциты, Трег

Примечание: Использованы прямые конъюгаты представленных антител с флуорохромами — FITC, РЕ, РЕ-Су5, ECD — производства фирмы Becton Dickinson (США) или Весктап Coulter (США).

Проточная цитометрия

Иммунологическое исследование материала кор-биопсии и удаленной опухолевой ткани проводили методом 4-цветной проточной цитометрии с использованием следующих комбинаций антител: 1-ая проба — CD4/CD3/CD25/CD45, 2-ая проба — CD8/CD3/CD56/CD45. Анализ данных проводили с использованием программы WinMDI или программы FCS, версия 3.

Нами оценены следующие иммунологические показатели интратуморальных лимфоцитов:

1. Общий уровень лимфоидной инфильтрации — количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии.

2. Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+).

3. Процент зрелых CD4+CD3+ Т-лимфоцитов.

4. Процент зрелых Т-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+.

5. Соотношение CD8/CD4.

6. Процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток.

7. Процент NK-клеток — CD3-CD56+.

8. Процент TNK клеток — CD3+CD56+.

Для статистической обработки данных использовался пакет программ SPSS, версия 13. Использовали тест Колмогорова—Смирнова для проверки гипотезы о принадлежности выборок к нормальным совокупностям. В случае значимого подтверждения этой гипотезы использовались: тест Стьюдента (при сравнении

двух выборок) или дисперсионный анализ (при сравнении большего числа выборок). В противном случае применялись непараметрические тесты: Манна-Ушни (две выборки) или Краскела-Уоллеса (больше двух выборок). Для установления связи между двумя дискретными величинами, в зависимости от их типа и получаемых таблиц сопряженности использовались точный тест Фишера или тест х2 по Пирсону. Для количественной оценки связи между двумя случайными величинами, в зависимости от их типа и нормальности распределения использовали коэффициенты корреляции по Пирсону или Спирману.

Результаты исследований

Характеристика субпопуляиий интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы методом проточной иитометрии

Исследование материала хирургически удаленных опухолей

Мы изучили субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у 17 больных на материале опухоли, удаленной в ходе радикальной операции.

В материале удаленной опухоли у больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (СБЗ+), количество которых достигало 95,2% числа лимфоцитов, в среднем 84,02±2,0%. Количество цитотоксических лимфоцитов (С08+) незначительно преобладало над количеством СБ4+ лимфоцитов — в среднем 47,1±3,1% и 46,4%±3,9% соответственно. Соотношение СБ8:СВ4 в целом по группе составило 1,24. Уровень клеток естественных киллеров (СБ45+СВЗ-СБ56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Количество Т-регуляторных клеток находилось в диапазоне от 1,48 до 9,09%, в среднем — 4,4±0,8%.

По результатам исследования операционного материала уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1,0% лимфоцитов от общего числа клеток) — 12 из 17 больных (70,6%) и умеренные/высокие (более 1%) — 5/17 (29,4%).

Только уровни №С-клеток были взаимосвязаны с общим уровнем лимфоидной инфильтрации опухоли и были более выраженными при незначительной инфильтрации: 2,54±0,52% и 0,61±0,15%, р=0,03. В случаях с умеренной/выраженной инфильтрацией процент Т-цитотоксических клеток был

несколько выше (55,02±7,28), чем при незначительной инфильтрации (43,56±2,71), р=0,09.

Исследование субпопуляиий интратуморальных лимфоцитов методом проточной иитометрии на материале кор-биопсии опухоли v больных раком молочной железы.

Исследование субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы на материале кор-биопсии проведено у 20 больных операбельным раком молочной железы, у которых в процессе комплексного обследования с целью верификации диагноза проводилась данная процедура. Для иммунологических исследований клетки опухоли дезагрегировали с использованием аппарата "Medimashin" (Becton Dickinson, США), специально разработанного для выделения лимфоцитов из опухолевой ткани.

Окраску клеток проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител, меченых флуорохромами. Количество проб, изучаемых иммунологически, было ограничено двумя, учитывая крайне малое количество материала кор-биопсии: 1. CD4-FITC/CD25-PE/CD3-ECD/CD45-РЕ.Су5. 2. CD8/FITC/CD56-PE/CD3-ECD/CD45-Pe.Cy5. Эти комбинации антител позволяли оценить общий уровень инфильтрации опухоли лимфоцитами, пропорцию Т-клеток среди лимфоцитов, субпопуляции CD4 и CD8 клеток, акгивационные маркеры (CD25), и, в частности, CD4+CD25+ Т-регуляторные клетки, TNK-лимфоциты (CD3+CD56+) и естественные киллеры (CD3-CD56+).

Сбор клеток проводили на проточном цитометре EPICS XL MCL, общее количество набираемых событий — от 75 ООО до 500 ООО.

Уровень лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани колебался от незначительного до выраженного. На рисунке 1 представлена умеренная лимфоидная инфильтрация ткани рака молочной железы лимфоцитами. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили в гейте R1.

Количественная характеристика субпопуляций лимфоцитов по материалу кор-биопсии представлена в таблице 3.

Рис. 1. Умеренная инфильтрация рака молочной железы лимфоцитами (клетками с яркой экспрессией СБ45 /ось X/ и низкими уровнями бокового светорассеяния Э8С /ось У/). В представленном случае общее количество накопленных при цитометрии событий — 75 453, из них лимфоцитов (СВ45++ 1216(1,61%).

Таблица 3

Субпопуляции лимфоцитов ткани рака молочной железы __(кор-биопсийный материал)_

Субпопуляция (СО) Число больных П роцент клеток Стд. ошибка

тш тах среднее

СБЗ 19 72,90 95,00 88,02 1,50

СБ8 19 25,38 57,38 40,87 1,97

СБ4 19 24,49 60,82 45,18 2,24

СБ8/СБ4 19 0,43 1,43 0,96 0,07

СБ4+СБ25+ 15 0,58 9,13 4,03 0,72

СБЗ+СБ56+ 18 0,59 28,00 4,36 1,48

СБЗ-С Б56+ 18 0,00 4,12 1,59 0,32

Процент С045++88Си™ 20 0,10 9,54 2,05 0,65

В материале кор-биопсии рака молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (СБЗ+), количество которых достигало 95% числа лимфоцитов, в среднем 88,0±1,5%. Количество СБ4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (СБ8+) — в среднем, 45,2% и 40,9%, соответственно. Соотношение СБ8:СБ4 в целом по группе составило 0,96. Уровень клеток естественных киллеров (СБ45+СБЗ-СБ56+) был, как правило, незначительным и не превышал 4,12%. Количество Т-регуляторных клеток находилось в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем — 4,0±0,7%.

Таким образом, материала кор-биопсии, в большинстве случаев достаточно для оценки субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов. Для минимизации количества необходимого для исследования материала необходимо использовать многопараметровую (четырехцветную) проточную цитометрию, позволяющую количественно оценить как уровни инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами, так и субпопуляции наиболее значимых эффекторных клеток противоопухолевого иммунитета. На материале кор-биопсии уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1% лимфоцитов от общего числа клеток) — 7 из 20 больных (35,0%) и умеренные/высокие (более 1%)— 13/20 (65,0%).

Из числа проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов только Т-цитотоксические (CD8+) клетки и TNK-клегки имели взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно более высоким: 44,2% и 35,2%, р=0,022. Взаимоотношения общего уровня лимфоидной инфильтрации (CD45++ SSCLow) с процентом TNK-клеток были иными: более высокое содержание TNK-клеток отмечено при низкой лимфоидной инфильтрации опухоли (8,65±4,05 и 2,21±0,31, р=0,03).

При сопоставлении состава лимфоцитов в материале кор-биопсии и в материале удаленной опухоли ни по одной из субпопуляций (CD3, CD4, CD8, индекс CD8/CD4, CD4+CD25+, CD3+CD56+, CD3-CD56+) не выявлено достоверных различий (р>0,05). Полученные результаты свидетельствуют о сходстве субпопуляционного состава лимфоцитов при проведении исследования по материалу кор-биопсии и при изучении удаленной опухоли.

Следовательно, материал кор-биопсии является адекватными для изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов.

Это позволило нам представить результаты исследования субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов в целом по группе 37 больных раком молочной железы, таблица 4.

В материале опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% всех лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%. Количество С04-лимфоцитов незначительно преобладало над

количеством цитотоксических лимфоцитов (СБ8+) — в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение СБ8:СБ4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (СБ45+С03-С056+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем — 4,2±0,5%.

Таблица 4

Субпопуляции лимфоцитов ткани рака молочной железы

Субпопуляция (СБ) Число больных Процент клеток Стд. ошибка

тт тах среднее

СБЗ 36 70,95 95,20 86,54 1,19

СБ 8 35 25,38 81,80 43,74 1,83

СБ4 35 23,25 67,80 45,74 2,11

С08/СБ4 35 0,43 3,52 1,09 0,10

СБ4+С025+ 24 0,58 9,13 4,15 0,53

СБЗ+СБ56+ 34 0,39 28,00 4,24 1,02

СБЗ-СБ56+ 34 0,00 5,29 1,75 0,26

Процент С045++88Си"' 37 0,08 27,90 2,17 0,80

Уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами были чаще низкими (менее 1% лимфоцитов от общего числа событий) — 21 из 37 больных (56,8%), чем умеренными/высокими (более 1%) — 16/37 (43,2%).

Лишь одна из проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов имела достоверную взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно выше, чем при низких уровнях инфильтрации: 48,1% и 40,5%, р=0,039.

Сравнительный_анализ состава интратуморальных лимфоиитов.

клинических характеристик и морфологических признаков у больных раком молочной железы

У 37 больных мы сопоставили иммунологические параметры интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками опухоли, такими как стадия заболевания, размер опухоли (рТ), вовлеченность регионарных лимфатических узлов (индекс Ы).

Взаимосвязи с клинической стадией мы не обнаружили, вместе с тем, при ранних (1-Па) стадиях процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов (СБЗ+) было

достоверно ниже, чем при более поздних стадиях (Ilb-IIIc): 83,9±1,9 и 89,3±1,2%, р=0,016. Эти различия, в основном, обусловлены нарастанием уровней CD3+ интратуморальных лимфоцитов при стадии IIb. Различия между стадиями Па и IIb высоко достоверны, р=0,013.

Различия, установленные нами при различных стадиях опухолевого процесса, нашли отражение и во взаимосвязях с размером опухоли (Т) и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах. При опухолях большего размера (сравнение рТ1 и рТ2) отмечены более высокие уровни CD3 лимфоцитов (недостоверно) и более низкий процент интратуморальных TNK-клеток (CD3+CD56+) — 9,8±4,2% и 2,8±0,44%, р=0,004.

Уровни интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3+) были выше при наличии метастатического поражения лимфатических узлов (N+), однако, различия не достоверны (р=0,07).

Уровни Т-клеток резко возрастали при наличии регионарных метастазов, т.е. при индексе N1 в сравнении с N0 (Р=0,005): 90,9±1,0% и 83,8±1,99%.

При дальнейшем распространении процесса (N2) различия с начальными стадиями были не столь достоверными и на первый план выходило достоверное повышение уровней интратуморальных киллеров (CD8+) — 49,9±4,1% и 38,3±2,1%, р=0,019. Подобное достоверное нарастание уровней интратуморальных Т-киллеров при наличии регионарных метастазов (N2), возможно, свидетельствует о том, что ингратуморальная иммунная система реагирует на опухоль достаточно поздно — при наличии обширного регионарного метастазирования.

При сопоставлении с гистологическим типом опухоли установлено, что уровни CD8+ Т-киллеров достоверно более высокие при инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком — 45,6±2,1% и 36,0±3,1%, р=0,027. Различий в субпопуляционном составе интратуморальных лимфоцитов в зависимости от рецепторного статуса нами не установлено, как в отношении рецепторов эстрогенов, так и в отношении рецептора прогестерона, р>0,05. Аналогичным образом, степень злокачественности опухоли не была связана ни с одной из субпопуляций иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих рак молочной железы, р>0,05.

Для сопоставлений с экспрессией Her2/neu мы не располагали достаточным материалом, так как в изучаемой группе было всего 3 рецептор-позитивных случая.

Влияние поликсидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы

Оценено влияние иммуномодулятора полиоксидония на уровни интратуморальных лимфоцитов у 20 женщин, больных раком молочной железы. Диагноз во всех случаях был установлен на основании морфологического исследования опухолевой ткани. Возраст больных — от 32 до 78 лет ( медиана — 53,5). Проводилась кор-биопсия опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальная операция и исследование послеоперационного материала. Полиоксидоний применяли внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2-й, 3-й, 5-й, 7-й дни. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония. Инфильтративный протоковый рак установлен у 14 пациенток (70,0%), инфильтративный дольковый — у 4 (20%), тубулярный — у 1 (5%), медуллярный — у 1 (5%). Рецепторы эстрогенов были положительны в 16 случаях из 20 (80%), рецепторы прогестерона — в 14 из 20 (70%). Статус по Her2/neu: 0 — 9 (45%), 1+ — 7 (35,0%), 2+ — 3 (15,0%), 3+ — 1 (5,0%). В одном из 3 случаев, расцененных как 2+, экспрессия рецептора расценена как положительная на основании результатов FISH-реакции. Таким образом, положительный статус по Her2/neu имел место у 2 больных (20%). Пролиферативный индекс (Ki-67) находился в диапазоне от 7 до 75% (среднее — 33,9±17,4%). У 12 больных установлена 2-ая степень злокачественности (70,6%), у 5 — 3-я (29,4%).

Размеры опухоли в основном (95,0%, 19 больных) соответствовали индексу рТ2, лишь в одном случае (5,0%) — рТ1. Метастазы в регионарных лимфатических узлах установлены у 14 (70,0%) больных (N1—7 /35%/, N2 — 7 /35%/), у 6 больных (30%) метастазы отсутствовали. В соответствии с клиническими стадиями заболевания больные распределились следующим образом: I стадия — 1 (5%), IIa — 5 (25%), IIb — 7 (35%), Illa — 7 (35%).

Все больные хорошо переносили введение полиоксидония. Осложнений нами не отмечено. Ни у кого из больных во время проведения иммуномодулирующей терапии и в послеоперационном периоде не было инфекционных заболеваний.

Интересно отметить, что по результатам морфологического исследования хирургически удаленной опухоли у 6 из 20 больных (30%), получавших в неоадъювантном режиме только полиоксидоний, отмечен лечебный патоморфоз: у 3 больных — 1-й степени, у двух — второй, у 1 больной — патоморфоз 4-й степени.

Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов до назначения полиоксидония по материалу исследования кор-биопсии рака молочной железы представлен в предыдущем разделе (табл. 3).

Сравнительная оценка субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов, выделенных из удаленной опухоли, проведена в 2 группах больных: у 20 больных исследование проводилось после применения полиоксидония, у 17 — полиоксидоний в неоадъювантном режиме не применяли.

Ни по одному из изученных нами показателей не установлено различий между группами больных, получавших полиоксидоний и не получавших данный препарат.

При расширении группы сравнения, при объединении всех первичных больных раком молочной железы (37 пациенток, не получавших полиоксидоний) достоверных различий с группой пациенток, у которых исследование проведено после применения полиоксидония, также не получено.

Наиболее убедительные данные относительно влияния полиоксидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов получены при непосредственном (попарном) сравнении данных материала кор-биопсии (до применения полиоксидония) и удаленной опухоли (после применения полиоксидония) тех лее самых больных.

После лечения полиоксидонием у больных не отмечено по большинству изученных показателей достоверного увеличения или снижения процента интратуморальных лимфоцитов в опухолевой ткани (р>0,05). Исключение составили уровни МТС-клеток, которые были достоверно более низкими после лечения полиоксидонием (1,68±0,33 и 1,16±0,26, р=0,029).

Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе применения полиоксидония у больных раком молочной железы

Помимо оценки средних значений процентного содержания антигенпозитивных клеток в пуле тумор-инфильтрирующих лимфоцитов у больных раком молочной железы мы сопоставили динамику различных субпопуляций лимфоцитов. Если разница процента антиген-позитивных лимфоцитов в материале удаленной опухоли и материале кор-биопсии не превышала 5%, то это расценивали как отсутствие изменений в уровнях экспрессии маркера. Если разница в процентах антиген-позитивных клеток в материале кор-биопсии и удаленной опухоли превышала 5%, то это расценивали как снижение уровней соответствующих антиген-позитивных клеток (более высокий процент в кор-биоптате) или их повышение (более высокий процент в материале удаленной опухоли).

При анализе динамики СБ8-позитивных клеток у 19 больных отсутствие изменений в проценте CD8+ лимфоцитов установлено в 3 случаях (15,8%), снижение — в 7 случаях (36,8%) и повышение — в 9 случаях (47,4%). При этом уровни снижения процента CD8+ лимфоцитов были, как правило, незначительными — от 5,9% до 10,79%. Уровни повышения CD8+ клеток были более высокими — от 6,1% до 22,28%. В двух случаях отмечено повышение CD8+ клеток на 19,93 и 22,28%. Взаимосвязи изменений CD8 в зависимости от исходного цитотоксического индекса не установлено, р=0,11. Повышение процента CD8+ клеток отмечено в 55,6% случаев при низком исходном цитотоксическом индексе (менее 1) и в 44,4% случаев с индексом более 1.

Аналогичным образом оценили динамику содержания CD4+ лимфоцитов. Изменения также были разнонаправленными: снижение процента CD4+ клеток отмечено в 5 случаях (26,3%), в 8 случаях (42,1%). процент CD4 клеток практически не изменялся, в 6 наблюдениях отмечено повышение процентного содержания CD4+ лимфоцитов (31,6%). В случаях снижения процента CD4 клеток диапазон изменений был от 10,37% до 20,57%, причем в 2 случаях отмечены высокие проценты отличий — 19,85% и 20,57%.

Характеристика клинико-иммунологических особенностей больных раком молочной железы, у которых применение полиоксидония вело к индукции апоптоза опухолевых клеток

Одним из важных свойств полиоксидония явилась индукция патоморфоза

клеток рака молочной железы. Этот феномен наблюдали у 6 из 20 пациенток (30%).

Преобладали больные IIb и Illa стадий. Каких-либо взаимосвязей с размером

опухоли, гистологическим типом и вовлеченностью регионарных лимфатических

узлов не отмечено. Больная, у которой наблюдалась 4-ая степень патоморфоза

опухолевой ткани, имела стадию ПЪ и очень высокий уровень пролифератавного индекса (75%).

У всех 6 больных, у которых отмечен лечебный патоморфоз опухоли, иммунологическое исследование интратуморальных лимфоцитов проводились дважды — до назначения полиоксидония (по материалу кор-биопсии) и после лечения полиоксидонием (по материалу удаленной опухоли).

Сравнили исходное процентное содержание различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы, у которых после введения полиоксидония наблюдался лечебный патоморфоз или таковой отсутствовал.

К сожалению, на основании исходного содержания клеток той или иной субпопуляции было невозможно прогнозировать результат действия полиоксидония. Достоверных различий между субпопуляциями лимфоцитов больных, у которых был получен лечебный патоморфоз, и субпопуляциями больных, у которых подобного эффекта не наблюдалось, не выявлено.

Мы провели сравнительный анализ субпопуляционного состава лимфоцитов удаленной опухоли в группах больных с наличием и отсутствием патоморфоза, таблица 5.

Как видно из представленных данных, только два показателя интратуморальных лимфоцитов имеют связь с патоморфозом опухоли после терапии полиоксидонием — уровень интратуморальных Т-хелперов (CD3+CD4+) и соотношение CD8/CD4 в опухолевой ткани. Средний процент CD4+ лимфоцитов в случаях наличия патоморфоза был достоверно более высоким, чем в группе с отсутствием патоморфоза. Именно это, также как и более низкое (не достоверно) количество CD8+ лимфоцитов в опухолевой ткани при наличии патоморфоза отражается на соотношении CD8/CD4 интратуморальных лимфоцитов, которое значимо снижается.

Таблица 5

Сравнение процентного содержания различных субпопуляций

интратуморальных лимфоцитов после лечения полиоксидонием больных раком молочной железы при наличии и отсутствии лечебного патоморфоза (по материалу __удаленной опухоли)_

Популяция клеток, CD Патоморфоз N Среднее Стд. ошибка среднего Р

CD3 нет 10 88,49 2,003 0,48

есть 6 86,51 1,11

CD8 нет 10 45,97 3,41 0,21

есть б 39,46 2,91

CD4 нет 10 40,89 2,26 0,006

есть 6 50,91 2,05

CD8/CD4 нет 10 1Д7 0,13 0,03

есть 6 0,79 0,09

CD4+CD25+ нет 10 3,89 0,68 0,4

есть б 3,13 0,56

CD3+CD56+ нет 9 2,82 0,90 0,33

есть 6 4,18 0,94

CD3-CD56+ нет 9 1,46 0,43 0,7

есть 6 1Д9 0,48

Процент лимфоцитов нет 11 2,90 0,95 0,44

есть 6 1,76 0,82

Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что стратегия иммунотерапии и иммунокоррекции при раке молочной не может быть основана на стремлении повысить или понизить относительное содержание того или иного типа интратуморальных Т-клеток. По-видимому, для реализации полноценного противоопухолевого иммунного ответа необходимо взаимодействие нескольких субпопуляций иммунокомпетентных клеток, также как это реализуется в ходе нормальных иммунных ответов, например, на вирусные антигены. Конечным результатом действия препарата должно быть усиление цитотоксического действия лимфоцитов на опухолевые клетки. Именно эти случаи могут служить основой для изучения эффективной композиции интратуморальных лимфоцитов.

Критерии эффективности неоадъювантной гшмуномодулируюшей терапии полиоксидонием у больных раком молочной железы

Мы оценили взаимосвязь динамики С08+ интратуморальных лимфоцитов под действием полиоксидония с исходными уровнями С08+ клеток в материале кор-биопсии, таблица 6.

Таблица 6

Связь динамики СБ8+ лимфоцитов с исходными уровнями этих клеток в

опухоли при иммунотерапии полиоксидонием

Маркер Исходный уровень Динамика CD 8

снижение без изменений повышение

CD8 > медианы 6 (67%)* 1(11%) 2 (22%)

<= медианы 1 (10%) 2 (20%) 7 (70%)

*Процент в строке

видно, препарат, действительно, характеризовался

иммуномодулирующим действием. Полиоксидоний снижал уровни (процент) CD8+ клеток в 67% случаев при исходных значениях выше медианы (медиана — 40,78%) и лишь в 10% случаев — при исходных значениях ниже или равняющихся медиане. Напротив, повышение процента CD8+ лимфоцитов отмечено в 70% случаев при их исходном значении не более медианы и лишь в 22% (2 из 9) при исходном значении выше медианы (р=0,036). Достоверной связи динамики интратуморальных CD8+ лимфоцитов с индукцией патоморфоза опухолевой ткани под действием полиоксидония не наблюдалось, р=0,68. Более того, у половины больных с наличием патоморфоза (3 из 6) данный феномен наблюдался на фоне снижения уровней интратуморальных CD8+ лимфоцитов.

Аналогичным образом оценили взаимосвязь динамики CD4+ интратуморальных лимфоцитов под действием полиоксидония с исходными уровнями CD4+ клеток в материале кор-биопсии, таблица 7.

Таблица 7

Связь динамики CD8+ лимфоцитов с исходными уровнями этих клеток в

опухоли в процессе иммунотерапии полиоксидонием

Маркер Исходный уровень Динамика CD4

снижение без изменений повышение

CD4 > медианы 4 (44%)* 5 (56%) 0 (0%)

<= медианы 1 (10%) 3 (30%) 6 (60%)

*Процент в строке

Как видно, препарат, действительно, характеризовался иммуномодулирующим действием на уровни интратуморальных CD4+ клеток. Полиоксидоний снижал уровни (процент) CD4+ клеток в 40% случаев при исходных значениях выше медианы (медиана — 47,06%) и лишь в 25% случаев — при исходных значениях ниже или равняющихся медиане. Напротив, повышение процента CD4+ лимфоцитов отмечено в 60% случаев при их исходном значении ниже медианы и не наблюдалось при исходном значении выше медианы (р=0,016). Достоверной связи динамики интратуморальных CD4+ лимфоцитов с индукцией патоморфоза опухолевой ткани под действием полиоксидония не выявлено, р=0,17. Более того, ни у одной из больных с наличием патоморфоза данный феномен не наблюдался на фоне снижения уровней интратуморальных CD4+ лимфоцитов в процессе иммунотерапии.

Выводы

1. Интратуморальные лимфоциты рака молочной железы представлены в основном (86,5±1,2) зрелыми Т-лимфоцитами, с примерно равным содержанием Т-хелперов (CD4+) и Т-цитотоксических клеток (CD8+) — 45,7±2,1 и 43,7±1,8, соответственно, соотношение CD8/CD4 составляет 1,1.

2. NK-клетки и Т-регуляторные клетки (CD4+CD25+ лимфоциты) представляют незначительную фракцию среди интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы: NK-клетки — 1,8±0,3%, CD4+CD25+ клетки — 4,2±0,5%.

3. Исследования субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы методом многопараметровой проточной цитометрии может проводиться по материалу кор-биопсии: результаты не отличаются от таковых, полученных при изучении хирургически удаленной опухоли.

4. Существуют определенные взаимосвязи между субпопуляционным составом интратуморальных лимфоцитов и клиническими характеристиками опухолевого процесса. Содержание CD3+ зрелых Т-клеток в опухоли достоверно более высокое при стадиях Ilb-IIIc в сравнении со стадиями I-IIa (89,3±1,2% и 83,8±1,9%, р=0,016). Это обусловлено, в первую очередь, нарастанием CD3+ клеток при стадии IIb в сравнении со стадией IIa (91,3±0,8% и 84,2±2,6%, р=0,013).

5. Увеличение размера опухоли (Т2 в сравнении с Т1) сопровождается достоверным снижением (р=0,004) уровней интратуморальных TNK (CD3+CD56+) лимфоцитов. Возникновение регионарных метастазов (N1 в сравнении с N0) ассоциируется с достоверным возрастанием интратуморальных CD3+ лимфоцитов, а нарастание метастатического процесса (N2) характеризуется более высокими уровнями интратуморальных Т-киллеров (CD8) в сравнении с группой больных с индексом N1 (р=0,019).

6. Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов взаимосвязан с морфологическим вариантом опухоли: уровни Т-киллеров достоверно более высокие при инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком: 45,6±2,1 и 35,9±3,1; р=0,027.

7. Полиоксидоний в неоадъювантном режиме хорошо переносится больными, не имеет побочных эффектов и в 30% случаев приводит к патоморфозу опухолевых клеток. Степень выраженности патоморфоза — от 1-й до 4-й.

8. Использование полиоксидония в неоадъювантном режиме не ведет к изменению субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы по большинству субпопуляций. Достоверные различия отмечены для NK-клеток (р = 0,029 ), уровни которых после применения полиоксидония были более низкими.

9. Больные, у которых применение полиоксидония сопровождалось патоморфозом опухолевых клеток, не имели особенностей субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов до применения иммуномодулятора (материал кор-биопсии), но характеризовались достоверно более высокой пропорцией интратуморальных CD4+ Т-клеток (р = 0,006) и более низким соотношением CD8/CD4 после иммунотерапии (р = 0,03).

10. Полиоксидоний обладает иммуномодулирующим действием на субпопуляции интратуморальных CD4 (р=0,016) и СБв-лимфоцитов (р=0,036), что характеризуется достоверным повышением уровней этих клеток при их исходно низких значениях и снижением ■— при исходно высоких значениях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Шамилов Ф.А. Влияние полиоксидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы / Шамилов Ф.А., Ельшина Г.А., Буров Д.А., Вишневская Я.В., Чхиквадзе Н.В., Зернов Д.И., Тимошенко В.В., Сельчук В.Ю. , Тупицын Н.Н // Иммунология — 2013 №4. — с.209-213.

2. Шамилов Ф.А.,. Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы / Шамилов Ф.А, Вишневская Я.В., Сельчук В.Ю., Погодина Е.М., Зернов Д.И., Чхиквадзе Н.В., Тимошенко В.В., Тупицын H.H. // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2012 г. — №3-4. — с. 29-33

3. Шамилов Ф.А. Особенности Т-клеточного иммунитета при раке молочной железы / Скотаренко JI.B., Воротников И.К., Кадагидзе З.Г., Шамилов Ф.А. // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2011 г. — №4. — с. 24-27

Другие публикации по теме диссертации:

4. Шамилов Ф.А., Вишневская Я.В., Сельчук В.Ю., Погодина Е.М., Зернов Д.И., Чхиквадзе Н.В., Тимошенко В.В., Тупицын H.H.. Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы. // Материалы VII общероссийского медицинского форума в Приволжском федеральном округе — 2012 г. С.180.

5. Шамилов Ф.А. Субпопуляции интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы / Шамилов Ф.А // РМЖ онкология — 2012 №2. — с.60-64.

Подписано в печать 17. о э. 14 Формат 60x84/16. Бумага офисная «ЗуеЬСору». Тираж 100 экз. Заказ №484 Отпечатано на участке множительной техники ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» 115478, г. Москва, Каширское ш., 24