Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Оптимизация методов обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы

На правах рукописи

Богомолова Оксана Андреевна

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ОБНАРУЖЕНИЯ ДИССЕМИНИРОВАННЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В КОСТНОМ МОЗГЕ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.03.02 - патологическая анатомия 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук •

005559283

1 9 ФЕВ 2015

Ульяновск - 2015

005559283

Работа выполнена на кафедре онкологии и лучевой диагностики в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Научные руководители: доктор медицинских наук,

Родионов Валерий Витальевич кандидат медицинских наук, Вишневская Яна Владимировна

Официальные оппоненты:

Петров Семен Венедиктович - доктор медицинских наук, профессор, ПЮУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры патологии

Гатауллин Ильгиз Габдуллович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры онкологии и хирургии

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 04 » марта 2015г. в « 11.00 » часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.06 при ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: Набережная реки Свияги, 106, корпус 1, аудитория 703.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке УлГУ, с авторефератом — на сайте ВУЗа - http://www.ulsu.ru и на сайте ВАК: http://vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат можно присылать по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, УлГУ, Управление научных исследований.

Автореферат разослан « » ** 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Заболеваемость раком молочной железы (далее РМЖ) в России, как и во многих странах, продолжает расти. Прирост стандартизованного показателя заболеваемости РМЖ в России за последние 10 лет составил 19,94%. В структуре онкологической заболеваемости женщин РМЖ устойчиво занимает 1 ранговое место, при этом у трети впервые заболевших женщин диагностируется Ш или IV стадии заболевания. В итоге, результаты лечения больных РМЖ остаются неудовлетворительными - прирост грубого показателя смертности за последние 10 лет составил 4,89% (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2014; Каприн А.Д., Старинский В.В., 2014).

Основной причиной смерти больных РМЖ являются отдаленные метастазы, поэтому неслучайно диагностика гематогенного распространения эпителиальных опухолей на ранних стадиях является одной из главных проблем онкологии. Развитие современных технологий сделало возможным определение единичных опухолевых клеток в биоптатах костного мозга и в периферической крови. Как показали результаты известных крупных, мета-анализов, микрометастазы в костном мозге при раннем РМЖ являются фактором независимого прогноза (Braun S., 2005; Janni W., 2011). Присутствие микрометастазов в костном мозге у больных РМЖ после проведения химиотерапии ассоциируется с низкой выживаемостью. Накапливаются данные о том, что количественное определение и характеристика диссеминированных и циркулирующих опухолевых клеток (ДОК и ЦОК) позволяет получить важную прогностическую информацию и проводить мониторинг эффективности терапии (Родионов В.В., Петров С.В., 2007; Тупицын H.H., 2014; Тюляндин С.А., 2014; Pantel К., Alix-Panabieres С., 2012).

Единичные разрозненные опухолевые клетки выявить с помощью рутинных патоморфологических методов крайне сложно, поэтому для их диагностики требуется применение высокочувствительных иммунологических

методов. К ним в настоящее время относятся иммуноцитологические (иммуноцитохимический, проточная цитометрия) и молекулярно-биологические (полимеразная цепная реакция) методы. Однако, в мировой онкологической практике пока не найден оптимальный метод обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге с целью оценки индивидуального прогноза больных. По мере того, как методы исследования станут стандартизированными, с приемлемой чувствительностью и специфичностью, это позволит сделать еще один шаг к индивидуализации антиметастатической терапии.

Таким образом, представляется актуальным изучение степени диссеминации РМЖ и, в частности, обнаружение диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге иммуноцитологическим методом, сопоставление данных результатов с другими клинико-морфологическими показателями распространенности процесса, которые могут быть учтены при оценке степени распространенности и прогноза заболевания. Весьма интересным представляется также изучение реакции костного мозга на присутствие в нем опухолевых клеток. Изучение состояния пораженного костного мозга с помощью морфоцитохимических методов может дать ценную информацию о влиянии опухолевых клеток на метаболизм клеток гемопоэза. Работы, посвященные анализу реакции костного мозга на диссеминированные опухолевые клетки, в настоящее время практически отсутствуют.

Работа поддержана гос. заданием Минобрнссуки РФ. Шифр гос. задания 4. 1219. 201.

Цель исследования:

Установить оптимальный метод обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы для оценки степени распространенности опухолевого процесса и прогноза заболевания.

Задачи исследования:

1. Оценить информативность метода проточной цитометрии для выявления диссеминированных клеток рака молочной железы в костном мозге в сравнении с морфологическими методами диагностики.

2. Определить сопряженность обнаружения диссеминированных клеток рака молочной железы в костном мозге с морфологическими . и иммуногистохимическими параметрами первичной опухоли, статусом регионарных лимфатических узлов и клинико-лабораторными показателями распространенности процесса.

3. Выявить особенности костномозгового кроветворения у больных раком молочной железы в зависимости от наличия в нем диссеминированных опухолевых клеток.

4. Установить корреляцию наличия диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы с прогнозом заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Метод проточной цитометрии является более информативным методом в обнаружении диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы по сравнению с традиционными морфологическими методами.

2. Рак молочной железы уже на ранних стадиях является гематогенно диссеминированным заболеванием. С увеличением стадии растет вероятность выявления микрометастазов и диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге.

3. Существует достоверная корреляция между выявлением диссеминированных клеток рака молочной железы в костном мозге с биологическими характеристиками первичной опухоли.

4. Микрометастазы и диссеминированные опухолевые клетки рака молочной железы в костном мозге не влияют на функциональную активность

миелокариоцитов по данным цитохимических исследований и не вызывают изменения показателей в миелограммах и трепанобиоптатах.

5. Наличие диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге приводит к снижению общей выживаемости у больных раком молочной железы.

Научная новизна

Впервые на статистически репрезентативном материале (150 биоптатов костного мозга у пациенток РМЖ) произведено обнаружение диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге с помощью метода проточной цитометрии с предварительным иммуномагнитным обогащением опухолевых клеток, связывающих антитела к молекуле адгезии эпителиальных клеток ЕрСАМ (CD326). При этом обнаружена высокая чувствительность данного метода в диагностике микрометастазов и диссеминированных клеток РМЖ в костном мозге. Анализируя влияние клинико-морфологических факторов на вероятность выявления диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге было получено, что только интегральный морфологический прогностический индекс (суммарный балл злокачественности) является независимым прогностическим фактором микрометастатического поражения костного мозга у больных РМЖ. Даны рекомендации по дополнению и усовершенствованию патоморфологической диагностики и клинического стадирования РМЖ с использованием метода проточной цитометрии.

Практическая и теоретическая значимость работы

Результаты исследования костного мозга на предмет обнаружения диссеминированных опухолевых клеток с помощью различных методов диагностики показали эффективность использования для этой цели метода проточной цитометрии. Полученные данные доказывают необходимость дальнейшего совершенствования методов диагностики микрометастазов в костном мозге у онкологических больных и поиска косвенных признаков присутствия в нем диссеминированных опухолевых клеток. Разработанный автором протокол исследования костного мозга у больных РМЖ может быть

использован для уточнения степени распространенности опухолевого процесса с целью индивидуализации лечения.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г. Ульяновска, ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» РАМН, в учебный процесс кафедры морфологии, кафедры анатомии человека, кафедры онкологии и лучевой диагностики ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Минобрнауки РФ.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены, доложены и обсуждены на всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологическая физиология и медицина: наука, образование, здоровье человека» (Ульяновск, 14 сентября 2012г.); X международной конференции «Иммунология гемопоэза» «Возможности эрадикации минимальной остаточной болезни при раке и гемобластозах» (Москва, ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, 6-7 июня 2013г.); IX Российской научно-практической конференции «Модниковские чтения» «Актуальные вопросы онкологии» (Ульяновск, 18 октября 2013 г.)»; 9th International Simposium on Minimal Residual Cancer (Франция, Париж, 25-27 сентября 2013 г.); 9th European Breast Cancer Conference (Великобритания, Глазго, 19-21 марта 2014г.); XI международной конференции «Иммунология гемопоэза» «Костный мозг у онкологических больных» (Венгрия, Будапешт, 67 июня 2014г.; Москва, ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, 9-10 июня 2014г.); расширенном межкафедральном совещании ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» Минобрнауки РФ (Ульяновск, 2014).

Публикацин по теме диссертации

По результатам диссертационного исследования опубликовано 22 научные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ для

опубликования результатов диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук, 3 публикации в зарубежных изданиях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из 173 источников, в том числе - 44 отечественных и 129 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 28 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужили 50 биоптатов опухолевой ткани молочной железы, 150 биоптатов костного мозга пациенток с РМЖ в возрасте 56,7±10,5 лет, находившихся на лечении в ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер г.Ульяновска с 2011 по 2013 гг. В анализ также были включены анамнестические, клинические, лабораторные показатели и другие материалы медицинских карт указанных выше больных.

В медицинских картах пациенток анализировались продолжительность времени до прогрессирования после установления диагноза, а также продолжительность жизни до даты смерти. Медиана наблюдения составила 24,5 месяца (минимум - 16 месяцев, максимум - 36 месяцев).

По стадиям заболевания в соответствие с данными медицинских карт больные были распределены следующим образом: наибольшее число больных относилось к ПА стадии (22%), на 2-м месте по частоте были больные со IIB и IIIC стадиями (по 18%). ШВ стадия установлена в 14,0% случаев, 1ПА и IV стадия - у 10% больных в каждой подгруппе. Наименьшее число больных взято в исследование с I стадией (8%).

Были проанализированы микроскопические препараты инвазивного РМЖ в соответствии с его гистологическим вариантом. Все биоптаты были получены в процессе соге-биопсии или оперативного лечения опухоли.

Макроскопически проводилась оценка локализации опухоли в молочной железе, границы опухолевого узла, длины и ширины узла в мм. Микроскопические препараты исследовали методом обзорной микроскопии с оценкой следующих качественных патоморфологических параметров опухолевой ткани: гистологический вариант рака, степень злокачественности, ядерный полиморфизм клеток, наличие типичных и атипичных митозов, число митозов с градациями, наличие и степень выраженности раковых структур, наличие и степень выраженности склероза стромы, наличие микрокальцинатов, определение степени и наличие преимущественной локализации круглоклеточной инфильтрации, определение наличия инвазии в кровеносные сосудах стромы, определение наличия опухолевых эмболов в лимфатических сосудах.

На основании перечисленных выше микроскопических морфологических параметров опухоли произведено определение суммарного балла злокачественности опухоли (СБЗ). СБЗ - это интегральный морфологический прогностический индекс для оценки прогноза эпителиальных злокачественных опухолей. Индекс оценивается в баллах и складывается из следующих показателей: степень дифференцировки опухоли (1-3 балла); полиморфизм опухолевых клеток (1-3 балла); митотическая активность опухолевых клеток (1-3 балла); инфильтративный компонент (1-5 баллов); лимфоидная инфильтрация стромы опухолевого узла (0-3 баллов); опухолевые эмболы в сосудах стромы (0-3 баллов). СБЗ колеблется в пределах значений от б до 20 баллов. В зависимости от СБЗ все опухоли можно разделить на 4 группы с различным прогнозом заболевания: 6-10 баллов = отличный прогноз; 11-13 баллов = хороший прогноз; 14-16 баллов = умеренный прогноз; 17-20 баллов = плохой прогноз (Занкин В.В., Родионов В.В., Хайруллин P.M., Кометова В.В., Лазаревский М.М., 2009).

Определение рецепторов стероидных гормонов, НЕЯ2-статуса и индекса пролиферации Ki-67 первичной опухоли осуществлялось иммуногистохимическим методом исследования. Производилась

полуколичественная оценка уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в баллах интенсивности по D.C. Allred (Петров C.B., Райхлин Н.Т., 2012, с. 123). Распределение случаев по вышеперечисленным параметрам представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение случаев РМЖ__

Характеристика опухоли Абсолютное Относительно

число е число

наблюдений наблюдений

! Вариант инвазивного РМЖ

Инвазивный неспецифический рак 18 36, 0%

(протоковый вариант) 10 20 0%

Инвазивный дольковый рак

Инвазивный неспецифический рак 15 30,0%

(смешанный протоково-дольковый вариант) 7 1 A fl%

Особые формы рака

Степень злокачественности

I 4 8,5%

II 36 76,6%

III 7 14,9%

Суммарный балл злокачественности

Отличный прогноз 3 6,7%

Хороший прогноз 19 42,2%

Умеренный прогноз 22 48,9%

Плохой прогноз 1 2.2%

Лимфоидная инфильтрация

! Отсутствует 10 21,3%

Слабая 13 27,6%

Умеренная 18 38,3%

Выраженная 3 6,4%

Сосудистая инвазия

Присутствует 46 93,9%

Отсутствует 3 6,1%

Гормональный рецепторный статус

Рецептор-позитивный 32 65,3%

Рецептор-негативный 17 34,7%

Экспрессия НЕЯ2

НЕ112- позитивный 10 20,8%

НЕЯ2- негативный 38 79,2%

Экспрессия ¥Л-61

Высокая пролиферативная активность (> 20%) 25 65,4%

Низкая пролиферативная активность ( < 20%) 11 30,6%

Всем больным до начала лечения проводилось морфологическое и иммунологическое исследование биоптатов костного мозга. Морфологическое исследование включало в себя цитологический и гистологический методы. Материал для цитологического исследования и проточной цитометрии получали с помощью стернальной пункции. Объем костномозгового пунктата не превышал 0,5 мл, так как при большем объеме возможно разбавление образца периферической кровью. Материал для гистологического исследования получали с помощью трепанбиопсии костного мозга задне-верхней ости подвздошной кости с двух сторон.

Цитологическое и иммунологическое исследования материала проводились в лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина» РАМН (руководитель -д.м.н., профессор H.H. Тупицын). Иммунологическое исследование включало в себя иммуноцитофлуориметрическое определение количества опухолевых клеток в костномозговых пунктатах методом проточной цитометрии. На первом этапе проводилось выделение клеток методом лизиса эритроцитов. Далее было проведено иммуномагнитное обогащение клеток, связывающих антитела к CD326, что позволило оценивать до 50 млн. миелокариоцитов у одного больного. При подсчете количества опухолевых клеток использовались двойная флуоресцентная метка. При этом клетки одномоментно окрашивали моноклональными антителами к общелейкоцитарному антигену CD45, меченными флуоресцеинизотиационатом (FITC) и моноклональными антителами к эпителиальному антигену ЕрСАМ (CD326), меченными фикоэритрином (РЕ). Уровни неспецифического связывания оценивались по изотопическим контролям с соответствующей флуорохромной меткой (рис. 1).

За пороговый диагностический уровень было принято считать обнаружение 1 опухолевой клетки среди 1 миллиона миелокариоцитов.

FL3-Height FLl-Height

Рис. 1. Выявление клеток РМЖ в образце костного мозга методом проточной цитофлуориметрии. Двойная флуоресцентная метка.

Кроме того, всем больным было проведено исследование препаратов костного мозга с помощью следующих цитохимических реакций: определение активности миелопероксидазы, кислой фосфатазы, щелочной фосфатазы, содержание гликогена. В каждом мазке подсчитывали 100 клеток, среди которых определяли процент клеток, содержащих отложения соответствующего субстрата и подсчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Полученные данные обрабатывались на персональном компьютере «PC IBM Pentium IV» с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2003 и Statistics for Windows 8.0. (Stat Soft Inc., USA). Для анализа статистической значимости групп наблюдений числом более двух использовали следующие методы математической статистики: методы непараметрической статистики (критерии Манна-Уитни, Бонферрони), метод вычисления различий качественных признаков по таблицам сопряженности 2x2 с использованием критерия %2 с поправкой Йетса, а также точного теста Фишера при малых выборках. Достоверными считались различия с вероятностью не менее 95% (р<0,05).

Результаты собственных исследований

При стандартных цитологическом и гистологическом исследованиях метастазы в костном мозге выявлены в 1 (2%) и 2 (4%) из 50 случаев соответственно (рис. 2-4). В обоих случаях метастазы в костном мозге подтверждены методом проточной цитометрии. Кроме того, в 5 (10%) из 50 миелограмм обнаружены «единичные недифференцированные клетки неясного происхождения, возможно, негемопоэтической природы». Эти клетки были расценены как подозрительные на метастатические. В 2 из 5 случаев микрометастазы в костном мозге подтверждены методом проточной цитометрии. В 11 (22%) из 50 случаев в трепанобиоптатах обнаружено микроочаговое скопление или повышенное содержание плазматических клеток в костном мозге. Это служит косвенным признаком поражения костного мозга. При проточной цитометрии в 2 из этих 11 биоптатов обнаружены микрометастазы.

Рис. 2. Микрофото цитологического мазка пунктата костного мозга пациентки М., 53 лет. Окр. по Романовскому-Гимзе, х400. Выявлены скопления клеток микрометастатического поражения.

Рис. 3. Микрофото метастаза инфильтративного РМЖ в костном мозге подвздошной кости больной М.,53 лет. Окр. гематоксилином и эозином, х 400. Опухолевые клетки инфильтрируют кроветворную ткань костного мозга подвздошной кости.

Рис. 4. Микрофото метастаза инфильтративного РМЖ в костном мозге подвздошной кости пациентки Д., 58 лет. Окр. гематоксилином и эозином, х200. Тотальное замещение костного мозга опухолевыми комплексами, инвазия в костные балки.

Использование моноклональных антител позволило повысить частоту обнаружения опухолевых клеток при иммуноморфологическом исследовании. Так. применяя проточную цитометрию, единичные эпителиальные (опухолевые) клетки - 1 клетка и более в 1 млн. миелокариоцитов костного мозга - были выявлены в 8 (16%) из 50 наблюдений. Важным является тот факт, что количество опухолевых клеток, определяемых иммунологическим методом, было очень небольшим - от 1 до 10 клеток среди 1 млн. нормальных клеток костного мозга. Лишь в 1 случае обнаружено 44 клетки на 1 млн. .лиелокариоцитов. Четкий кластер опухолевых клеток - микрометастаз - при проточной цитометрии обнаружен в 4 (8%) из 50 случаев (рис. 5). При этом в 3 случаях число клеток было менее 1 клетки на 1 млн. миелокариоцитов.

Таким образом, иммуноцитофлоуметрический метод обнаружения микрометастазов РМЖ в костном мозге обладает более высокой чувствительностью, чем стандартные цитологический (22% против 2%) и гистологический (22% против 4%) методы, выявляя единичные опухолевые клетки и кластеры клеток.

о

Рис. 5. Цитограмма больной Б., 74 лет с РМЖ ИВ стадии с микрометастазом в костном мозге, выявленным методом проточной цитометрии. Ш - «кластер» из 20 СВ45-негативных клеток (ось абсцисс), положительных в реакции с антителами к ЕрСАМ (СБ326) (ось ординат). По оси абсцисс - уровни экспрессии лейкоцитарного антигена С045. По оси ординат - уровни экспрессии эпителиального антигена ЕрСАМ.

Среднее количество опухолевых клеток в группе наблюдений с 1 и более злокачественными клетками (п=8) в 1 млн. миелокариоцитов составило 8,5 (минимум 1 клетка, максимум - 44 клетки).

В нашей работе метод проточной цитометрии позволил обнаружить микрометастазы в костном мозге у 20,8% больных с локальными стадиями РМЖ (1-НВ стадии), у 7,7% больных с местно-распространенным процессом (ША-ШС стадии) и у 80% больных с метастатическим РМЖ (IV стадия). Различия в частоте обнаружения микрометастазов в костном мозге в зависимости от стадии РМЖ оказались статистически недостоверными (р=0,32). Наибольшая частота обнаружения метастазов в костном мозге (80%) и наибольшее среднее значение количества опухолевых клеток (11,4 клеток в 1 млн. миелокариоцитов) отмечается при IV стадии РМЖ.

При "Г1 и Т2 отдельные опухолевые клетки в костном мозге обнаружены иммуноцитологическим методом с одинаковой частотой - в 18,2% случаев; при

ТЗ - у 0%, что, видимо, объясняется присутствием лишь одного случая в данной группе; при Т4 - в 31,2% случаев РМЖ. Данные различия оказались незначимыми (р=0,36). Морфологические варианты РМЖ не влияли на диагностику микрометастазов в костном мозге: частота выявления ДОК при инвазивном дольковом раке составила 40%, при инвазивном неспецифическом раке (протоковом варианте) - 27,8%, при инвазивном неспецифическом раке (смешанном протоково-дольковом варианте) - 13,3%, при особых формах рака ДОК не были выявлены (р=0,99), В биоптатах костного мозга опухолевые клетки обнаруживались почти в два раза чаще при РМЖ с III степенью злокачественности (42,9%), чем при опухолях со II степенью злокачественности (22,2%). Микрометастазы в костном мозге не диагностированы при I степени злокачественности РМЖ. Но выявленные различия оказались статистически незначимыми (р=0,37).

Наше исследование не обнаружило значимой взаимосвязи между статусом опухоли по рецепторам эстрогенов и прогестерона и выявлением в костном мозге микрометастазов РМЖ (р=0,25). Хотя для обоих рецепторов в отдельности было показано, что частота выявления ДОК в костном мозге выше б группе рецептор-позитивных опухолей (28,1% и 11,8% - для рецепторов эстрогенов; 26,9% и 17,4% - для рецепторов прогестерона соответственно). Не обнаружена взаимосвязь между статусом экспрессии НЕ112, уровнем пролиферативной активности опухоли (Ю-67) и выявлением в костном мозге микрометастазов РМЖ (р=0,81 и 0,31 соответственно).

В нашем исследовании обнаружена статистически высокозначимая связь между выявлением ДОК в костном мозге и СБЗ опухоли (р=0,009). Метастатические клетки в костном мозге обнаружены в 3,5 раза чаще при РМЖ с умеренным прогнозом заболевания (36,4%) по сравнению с биоптатами первичной опухоли с хорошим прогнозом заболевания (10,5%). Если разделить все случаи на 2 группы: с отличным и хорошим прогнозом (СБЗ 1-2) и умеренным и плохим прогнозом (СБЗ 3-4), то различие в частоте диагностики

ДОК в костном мозге еще более выражено (9% при СБЗ 1-2 против 39% при СБЗ 3-4, соответственно) (рис. 6).

В нашей работе было выявлено, что наличие и степень выраженности круглоклеточной инфильтрации не влияет на частоту обнаружения ДОК в костном мозге (р=0,6). Также не было обнаружено значимой взаимосвязи между метастазированием опухоли в костный мозг и определением раковых эмболов в лимфатических сосудах (р=0,35).

сбз 1-2 сбз 3-4 _|

Рис. 6. Распределение случаев РМЖ в зависимости от СБЗ первичной опухоли и выявления ДОК в костном мозге.

Не выявлено взаимосвязи между метастазированием РМЖ в костный мозг и в регионарные лимфатические узлы (р=0,58). Хотя опухолевые клетки в препаратах костного мозга в случаях без поражения лимфатических узлов (N0) встречались реже, чем в случаях с метастазами в лимфоузлы (М+) - 15,4% и 24,3% соответственно (р=0,5). Не выявлено взаимосвязи между детекцией злокачественных клеток в костном мозге и средним количеством метастатических лимфоузлов (р=0,87). На наш взгляд, полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что лимфогенный и гематогенный пути метастазирования являются независимыми и равноценными, а опухолевые клетки могут попадать в кровоток, минуя аксиллярные лимфатические узлы.

Мы не выявили значимой взаимосвязи между метастазированием опухоли в костный мозг и уровнем сывороточных опухолевых маркеров РЭА, са 15-3, mca, са 19-9 (р>0,05).

Таким образом, в нашем исследовании было обнаружено, что интегральный морфологический прогностический индекс (суммарный балл злокачественности) является единственным независимым прогностическим фактором микрометастатического поражения костного мозга у больных РМЖ (р=0,009). Анализ корреляции обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге с факторами прогноза представлен в таблице 2.

Таблица 2

Анализ корреляции обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в

костном мозге с факторами прогноза

Факторы прогноза р

Размер первичной опухоли р=0,43

Гистологический вариант р=0,99

Степень злокачественности р=0,46

Рецепторный статус р=0,43

Уровень экспрессии не112 р=0,86

Индекс пролиферации кл-67 р=0,56

Лимфоидная инфильтрация р=0,61

Лимфоваскулярная инвазия р=0,8

Суммарный балл злокачественности р=0,009

Статус регионарных лимфатических узлов р=0,57

Уровень сывороточных опухолевых маркеров р>0,05

Несмотря на выявленные отклонения в миелограммах как в случаях с наличием, так и в случаях с отсутствием микрометастазов в костном мозге, при сравнении средних значений показателей миелограмм в обеих группах, статистически значимых различий ни по одному показателю не обнаружено.

При гистологическом исследования препаратов костного мозга были выявлены такие патологические изменения, как: гипоплазия ростков

кроветворения, раздражение миелоидного и/или эритроидного ростков кроветворения, повышенное содержание плазматических клеток, а также их микроочаговое скопление, что является подозрительным признаком в отношении поражения костного мозга (рис. 7). Но различия в частоте этих признаков в случаях с наличием и отсутствием диссеминированных опухолевых клеток оказались статистически незначимыми.

Рис. 7. Микрофото препарата костного мозга подвздошной кости пациентки А., 62 лет, с РМЖ ШВ стадии; выявлены ДОК в костном мозге. Окр. гематоксилином и эозином, х200. Соотношение жирового и клеточного костного мозга 1:1, раздражен миелоидный росток, обнаружены микроскопления плазматических клеток.

Цитохимическое исследование костного мозга не обнаружило значимых различий средних значений СЦК активности миелопероксидазы, шелочной и кислой фосфатаз, а также содержания гликогена в клетках костного мозга у больных РМЖ в зависимости от наличия и отсутствия микрометастазов (р>0,05) (рис. 8).

Таким образом, на основании анализа миелограмм, гистологических препаратов костного мозга и цитохимических методов исследования, нам не удалось выявить косвенные признаки присутствия единичных опухолевых клеток в костном мозге у больных РМЖ.

Рис, 8. Реакция на миелопероксидазу в клетках костного мозга у больной К., с РМЖ IIB стадии; ДОК в костном мозге не выявлены. В центре и вверху справа — нейтрофилы с ярко-положительной реакцией (+++) в виде гранул коричневого цвета, занимающих всю цитоплазму. Ядра окрашены метиленовым синим.

В связи с недостаточной длительностью исследования нам не удалось оценить общую и безрецидивную 3-летнюю выживаемость. Однако, на момент окончания исследования (01.11.2014г.) мы обнаружили, что общая выживаемость у больных без микрометастазов в костном мозге (п=39) выше, чем у больных с наличием микрометастазов (п=9), но данные различия оказались статистически незначимыми (log-rank test, р=0,1) (рис. 9). Имеется преимущество в общей выживаемости у группы больных без микрометастазов (п=39) перед группой больных с метастазами, доказанными цитологическим и/или гистологическим методами (n=2) (log-rank test, р=0,015). На рисунке 10 представлены кривые выживаемости без прогрессирования больных с наличием (п=9) и отсутствием диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге (п=39). Такой результат, на наш взгляд, связан с тем, что все больные в группе с микрометастазами в костном мозге получали адъювантную химиотерапию.

1,00

■I . „ , s, 11.. ■ i 0,80

Кумулятивная доля выживших (метод Каплана-Майера)

Продолжительность жизни, годы

: ^ 1Й {

Н: g- 5

• * v а-,8

5 ' « .... Г

aii

' "

■ Больные без ДОК в костном мозге — Больные с ДОК в костном мозге

Рис. 9. Общая выживаемость больных РМЖ с наличием и отсутствием диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге (метод Каплана-Майера, log-rank test, р=0,1).

Кумулятивная доля выживших, метод Каплана-Майера

0,95: ..............................................

8 ......-.

а ■ :

1 0,90- ........

'I --:

03 ,

. I о,ее ■■ .............................................г!;.................................

§

о I

| I! Ч........................:

>■ _:_

0,75 ............ ; ..........

0,70' 1 . .-------:—*--

0 1 2 3

- ■ • Больные без ДОК в костном мозге — Больные с ДОК в костном мозге

Рис. 10. Выживаемость без прогрессирования больных с наличием и отсутствием диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге (метод Каплана-Майера, log-rank test, р=0,77).

Несомненно, наиболее полная прогностическая оценка значимости обнаружения микрометастазов в костном мозге будет возможна после анализа результатов общей и безрецидивной 3-х и 5-летней выживаемости всех больных, включенных в исследование.

ВЫВОДЫ

1. Иммуноцитофлуориметрический метод ' обладает большей информативностью в обнаружении диссеминированных клеток рака молочной железы в костном мозге в сравнении со стандартными цитологическим и гистологическим методами (16% против 2% и 4% соответственно). С учетом обнаружения кластеров опухолевых клеток (микрометастазов) частота иммуноцитологического выявления микрометастазов возрастает до 22%.

2. Не обнаружены косвенные признаки присутствия диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге по данным анализа миелограмм, трепанобиоптатов и цитохимических исследований (р>0,05).

3. Интегральный морфологический прогностический индекс (суммарный балл злокачественности) является единственным независимым прогностическим фактором микрометастатического поражения костного мозга у больных раком молочной железы (р=0,009).

4. Диссеминированные опухолевые клетки в костном мозге обнаружены при всех стадиях рака молочной железы. Наибольшая частота обнаружения микрометастазов в костном мозге (80%) и самое высокое среднее количество опухолевых клеток (11,4 клеток в 1 млн. миелокариоцитов) отмечается при IV стадии заболевания. Больные раком молочной железы с микрометастазами в костном мозге имеют тенденцию к снижению общей выживаемости по сравнению с больными без микрометастазов (р=0,1).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод проточной цитометрии для исследования костного мозга у больных раком молочной железы может быть рекомендован к внедрению в клиническую практику, особенно у пациенток с ранними стадиями дЛя уточнения степени распространенности опухолевого процесса, оценки прогноза и индивидуализации лечения.

2. Для иммуноцитофлуориметрического определения клеток рака молочной железы в костном мозге целесообразно использовать моноклональные антитела к ЕрСАМ (СБ 326).

3. С целью оценки максимального количества клеток предварительно следует проводить иммуномагнитное обогащение клеток, связывающих антитела к СЭ 326.

4. С целью уточнения прогноза заболевания и выработки тактики адъювантной терапии у больных раком молочной железы целесообразно определять интегральный морфологический индекс (суммарный балл злокачественности) первичной опухоли, который является суррогатным маркером присутствия диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Богомолова, O.A. Диагностика диссеминированных опухолевых клеток рака молочной железы в костном мозге с помощью метода проточной цитометрии / В.В. Родионов, H.H. Тупицын, O.A. Богомолова, М.В. Родионова // Фундаментальные исследования. - 2013. - №3. - С. 147151.

2. Богомолова, O.A. Иммуиоцитологический метод обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы / O.A. БогомолЬва, В.В. Родионов, H.H. Тупицын, В.В. Кометова, М.В. Родионова // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. - 2014. - №1-2. - С. 47-51.

3. Bogomolova, О. Clinical symptoms of bone marrow metastases in breast cancer patients / Valéry Rodionov, Oksana Bogomolova, Maria Rodionova // The Breast. - October 2011. - Vol. 20. - Suppl. 4. - S41.

4. Bogomolova, O. Bone Marrow Micrometastases in Breast Cancer. Changes in Hematologic Parameters / M. Rodionova, V. Rodionov, O. Bogomolova, A. Bayramov // European Journal of Cancer. - March 2012. - Vol. 48. - Suppl. 1. - S112-S113.

5. Bogomolova, O.A. Detection of disseminated breast cancer cells in bone marrow using Flow cytometry / V. Rodionov, N. Tupitsyn, O. Bogomolova, V. Kometova, M. Rodionova // European Journal of Cancer. - March 2014. -Vol.50.-Suppl. 2.-S118.

6. Богомолова, O.A. Проблема канцеромиеломатоза у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, O.A. Богомолова // «История, современность и перспективы развития медицинской помощи в условиях модернизации здравоохранения» : материалы 4б-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции (Ульяновск, 19-20 мая 2011г.). - Ульяновск, 2011. - С. 424-427.

7. Богомолова, O.A. Проблемы костномозгового метастазирования у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, O.A. Богомолова // Ульяновский медико-биологический журнал. - Ульяновск, 2011. - №1. - С.7-17.

8. Богомолова, O.A. Гематологические изменения при микрометастазах рака молочной железы в костный мозг /В.В. Родионов, O.A. Богомолова // Онкология сегодня: пациент, государство, медицинское сообщество: материалы VII Российской научно-практической онкологической конференции «Модниковские чтения» (Ульяновск, 20-21 октября 2011г.). -Ульяновск, 2011. - С. 264-268.

9. Богомолова, O.A. Методы диагностики метастазов рака молочной железы в костный мозг/ В.В. Родионов, O.A. Богомолова // Онкология сегодня:

пациент, государство, медицинское сообщество: материалы VII Рос. научно-практической онкологической конференции «Модниковские чтения» (Ульяновск, 20-21 октября 2011г.). - Ульяновск, 2011. - С.268-272.

10. Богомолова, O.A. Современные возможности диагностики диссеминированных опухолевых клеток у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, O.A. Богомолова // Экологическая физиология и медицина: наука, образование, здоровье населения : материалы всерос. конф. (Ульяновск, 12-14 сентября 2012 г.). - Ульяновск, 2012. - С. 176-178.

П.Богомолова, O.A. Анализ гематологических показателей при микрометастазах рака молочной железы в костный мозг / В.В. Родионов, O.A. Богомолова // Материалы VII Общероссийского медицинского форума в Приволжском федеральном округе совместно с VIII Российской научно-практической онкологической конференции «Модниковские чтения» «Развитие радиотерапевтической службы в России. Высокие технологии консервативного лечения» (Ульяновск, 25-26 октября 2012 г.). - Ульяновск, 2012.-С. 130-132.

12. Богомолова, O.A. Диагностика микрометастазов в костном мозге у больных раком молочной железы с помощью метода проточной цитометрии / В.В. Родионов, O.A. Богомолова, М.М. Лазаревский // Материалы VII Общероссийского медицинского форума в Приволжском федеральном округе совместно с VIII Российской научно-практической онкологической конференции «Модниковские чтения» «Развитие радиотерапевтической службы в России. Высокие технологии консервативного лечения» (Ульяновск, 25-26 октября 2012 г.). - Ульяновск, 2012. - С. 134-136.

13. Богомолова, O.A. Клинико-гематологические аспекты костномозгового метастазирования у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, O.A. Богомолова, М.В. Родионова // Материалы II конференции с международным участием «Общества специалистов онкологов по опухолям органов репродуктивной системы» (Москва, 29-30 октября 2012 г.). - М., 2012. - С. 68-69.

14. Богомолова, O.A. Метод проточной цитометрии в диагностике диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, H.H. Тупицын, O.A. Богомолова, М.В. Родионова // Успехи современного естествознания. - М., 2013. -№.5. - С. 149-151.

15. Богомолова, O.A. Диагностика диссеминированных опухолевых клеток рака молочной железы в костном мозге с помощью проточной цитометрии / В.В. Родионов, O.A. Богомолова, В.В. Кометова И Наука и медицина 21 века: традиции, инновации, приоритеты : материалы 48-й

межрегиональной научно-практической медицинской конференции (Ульяновск, 23-24 мая 2013г.). - Ульяновск, 2013. - С. 373-376.

16. Bogomolova, О.A. Towards the study of bone marrow DTC in breast and ovarian cancer / N.N. Tupitsyn, O.V. Krokhina, O.A. Bzhadug, K.I. Zhordania, V.N.Blindar, E.V. Artamonova, O.A. Bogomolova, V.V. Rodionov, T. Grigorieva, V.Yu. Selchuk D.A. Burov, I.K. Vorotnikov // Materials of 9th International Symposium on Minimal Residual Cancer (Paris, September 25-27, 2013). - Paris. - 2013. - Abstracts - P. 35.

17. Bogomolova, O.A. Diagnosis of disseminated breast cancer cells in tumor in bone marrow using Flow cytometry / Valery V. Rodionov, Nikolai N. Tupitsyn, Oksana A. Bogomolova, Maria V. Rodionova // Materials of 9th International Symposium on Minimal Residual Cancer (Paris, September 25-27, 2013). -Paris. - 2013. - Posters. - P. 147.

18. Богомолова, О.А. Диагностика диссеминированных клеток рака молочной железы в костном мозге с помощью метода проточной цитометрии / О.А. Богомолова // Иммунология гемопоэза. - 2013. - №1-2. - Том 11. — С.176-179.

19. Богомолова, О.А. Метод проточной цитометрии в диагностике диссеминированных клеток рака молочной железы в костном мозге / В.В. Родионов, О.А. Богомолова, В.В. Кометова // Ульяновский медико-биологический журнал. - Ульяновск, 2013. - № .1 - С. 77-82.

20. Богомолова, О.А. Иммуноцитологическая диагностика диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, О.А. Богомолова, В.В. Кометова // Медицина и современность. Теория, практика, перспективы : материалы 49-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции (Ульяновск, 22-23 мая 2014г.). - Ульяновск, 2014. - С. 368-370.

21. Bogomolova, О.А. Detection of bone marrow DTC in breast cancer using flow cytometry / V.V. Rodionov, N.N. Tupitsyn, O.A. Bogomolova, V.V. Kometova, M.V. Rodionova // Haematopoiesis Immunology. - 2014. - Vol. 12. - №1-2. - P. 100-101.

22. Богомолова, O.A. Гемопоэз у больных раком молочной железы / В.В. Родионов, Н.Н.Тупицын, О.А. Богомолова // Иммунология гемопоэза. -2014.-Т. 12.-№1-2.-С. 109-111.

Спнсок сокращений

РМЖ - рак молочной железы

ДОК - диссеминированные опухолевые клетки

СБЗ - суммарный балл злокачественности

Подписано в печать 26.12.2014. Формат 60 х 84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ № 140 &&0

Отпечатано с оригинал-макета в Издательском центре Ульяновского государственного университета 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42