Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Клеточный цикл кроветворных клеток при гематологических заболеваниях до и после воздействия цитостатических факторов

Р Г О О Д На правах рукописи

ШМАРОВ Дмитрий Александрович

КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ДО II ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЦШОСТАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1997

мчплто т>г тплпчапо г» I л»»п"глгтаптал»'л * ж гт«-»* гпг»т/>»« патттпл »У и (\/I Ы 1 иии>и ион шли^ии 1> I П1ШШ Ц^шр^ & * 11»11 »

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Г.И.Козинец

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Ковалева, доктор медицинских наук, профессор И.А.Быкова, доктор биологических наук, профессор Р.В.Ленская.

Ведущее учреждение: Онкологический научный центр РАМН

Защита состоится «_»_1997 г. в _час.

На заседании диссертационного Совета Д 001.45.01 в Гематологическом научном центре РАМН (Москва, 125167, Новозыковский проезд, д.4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН

Автореферат разослан «__»__1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

В.Д.Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Анализ клеточного цикла кроветворных клеток в норме, при гематологических заболеваниях, в условиях воздействия ионизирующей радиации и цитостатических препаратов длительное время находится в сфере внимания ученых, работающих в этой области в нашей стране и за рубежом. Параметры пролиферации исследовали различными методами, включая морфологический, радионуклидный (авторадиография и сцингилляционный счет), цитохимические, иммунологические способы и их комбинации.

Показатели клеточного цикла нормальных и злокачественных клеток могут иметь решающее значение в оценке прогноза и в выборе метода лечения ряда гематологических и онкологических заболеваний. Эта параметры в определенных случаях позволяют контролировать эффективность терапии и существенно помогают в диагностике. Действие лучевой и химиотерапии приводит к нарушениям кинетики «критических» тканей, к которым относится в первую очередь гемопоэтическая ткань, что дает возможность использовать показатели пролиферации для оценки степени воздействия цитотоксических агентов на Организм по конечному биологическому эффекту. До настоящего времени применение этих подходов было недостаточно эффективным, на наш взгляд, из-за высокой трудоемкости классических методов анализа клеточного цикла, что требовало больших затрат времени и позволяло проводить только ретроспективную оценку.

В последние годы большие успехи были достигнуты благодаря использованию проточной цитометрии, которая возникнув как метод автоматизации в цитологии выделилась в самостоятельное направление. Однако, при больших возможностях этого методического подхода (высокая точность и быстрота анализа), полученные научные результаты имеют фрагментарный характер и в большинстве работ посвящены решению частных проблем. Много нерешенных вопросов имеется в методических подходах к изучению пролиферации клеток при помощи проточной цитометрии.

Целью работы явилась оценка параметров клеточного цикла кроветворных клеток при помощи проточной цитометрии у гематологических больных, в экспериментах на животных и на культурах клеток до и после воздействия цитостатических факторов, а также анализ возможности применения полученных данных в клинико-лабораторной диагностике.

Основные задачи исследования

1. Разработать подход к изучению пролиферации гемопоэтических клеток на базе современных методов проточной цитометрии.

2. При помощи ДНК-цитометрии получить параметры клеточного цикла клеток костного мозга здоровых людей и оценить их взаимосвязь с показателями миелограммы.

3. Исследовать кинетику гемоиоэтических клеток у больных острыми лейкозами и анемиями различной этиологии (железодефицитные, пернициозные, аутоиммунные гемолитические и апласгаческие анемии).

4. Изучить в экспериментах на животных изменения клеточного цикла миелокариоцитов при действии цитостатических факторов (ионизирующей радиации и 5-фторурацила).

5. Оценить в клинических наблюдениях параметры пролиферации клеток костного мозга после радиационного облучения организма и разработать критерии для индикации лучевого поражения.

6. Провести анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином в норме и при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями иммунного статуса.

Научная новизна. В работе использован новый комплексный подход для изучения клеточного цикла кроветворных клеток на основе современных проточно-цитометрических методов. Показано, что метод дает воспроизводимые и достоверные оценки.

Изучены костномозговые пунктаты практически здоровых людей, пациентов, получавших химиотерапию и больных острыми лейкозами в состоянии гематологической ремиссии для характеристики распределения гемоиоэтических клеток по стадиям клеточного цикла в норме. Проведена оценка степени влияния на точность и устойчивость цитометрических показателей клеточного состава аспиратов при сопоставлении результатов ДНК-цитометрии с данными гемоцигологического анализа (миелограмма). Впервые установлено, что параметры клеточного цикла клеток костного мозга в норме характеризуются стабильностью, что отражает постоянство гемопоэза. При острых лейкозах и, в меньшей степени, при анемиях наблюдается неустойчивость показателей пролиферации, что связано с нестабильностью кроветворения и неэффективным кроветворением. Высокая вариабельность параметров клеточного цикла лейкозных клеток свидетельствует об их гетерогенности в пределах определенных нозологических групп.

Установлены закономерности нарушешы клеточного цикла миелокариоцитов при облучении организма. Выявлено, что эффекты ионизирующей радиации проявляются в снижении доли клеток в Б-фазе и в блоке на стадии С2+М. Получено, что зависимость содержания клеток, синтезирующих ДНК от дозы излучения у экспериментальных животных имеет логарифмический характер в диапазоне 0,5 - 6 Гр через 1 сутки после воздействия. Действие цитостатического агента 5-фторурацила приводило к снижению пролиферативного пула клеток и не сопровождалось блоком в стадии Ог+М. Период восстановления пролиферации клеток после действия цитостатика и в следствии облучения имел сходную динамику, которая характеризовалась повышением содержания миелокариоцитов в стадиях Б и вг+М.

Исследованы параметры распределения клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла после облучения организма человека и проведено сопоставление показателей миелограммы с данными проточной цитометрии. Для этого была использована разработанная нами компьютерная программа на основе рекуррентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана. При проведении такого анализа в отношении пациентов, получавших лучевую терапию органов средостенья, получено, что наибольшей информативностью обладают два цитометрических показателя - доля клеток в стадии синтеза ДНК и отношение 8/(С2+М). В пространстве этих двух признаков можно проводить разделение со 100% достоверностью. Также получено логическое правило, позволяющее отделять лиц, получивших облучение при аварии от здоровых людей, то есть диагностировать факт облучения организма низкими дозами радиации (0,2 - 0,4 Гр).

Показано, что анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином по параметрам клеточного цикла оптимизирует оценку бластной трансформации (РБТЛ). Применение субоптамальных доз митогена (доза, при которой ответ ниже максимального на 37%) повышает информативность метода и делает его значимым лабораторным тестом, отражающим состояние клеточного иммунитета.

Теоретическое и практическое значение работы. Установленные клинические и экспериментальные данные значительно расширяют современные представления о клеточном цикле гемопоэтаческих клеток в норме, при гематологических заболеваниях и при воздействии на организм цитостатических факторов. Получетгые сведения можно использовать для оценки состояния гемопоэза при различных заболеваниях и токсико-радиационных поражениях организма, решения вопросов патогенеза, классификации и разработки схем химиотерапии острых лейкозов.

Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

1. Разработанные автором методики применяются при проведешш клинико-лабораторных и научных исследований в Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, Главном военном клиническом госпитале им. Н.Н.Бурденко и в Гематологическом научном центре РАМН.

2. В процессе выполнения данной работы был разработан метод изучения биологически-акгавных факторов на культурах клеток, который апробирован и защищен авторским свидетельством на изобретение № 289321.

3. Результаты опубликованы в 34 печатных работах, докладывались на научных и научно-практических конференциях.

4. Полученный подход для оценки облучения организма по параметрам клеточного цикла в сочетании с показателями миелограммы при помощи логических правил, на основе реккурентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана можно рекомендовать для разработки методик биологической дозиметрии.

5. Результаты работы используются при обучении аспирантов и научных сотрудников на рабочих местах методам анализа параметров пролиферации клеток.

Положения, выносимые на защиту.

1. Параметры клеточного цикла клеток костного мозга характеризуются стабильностью, что отражает постоянство кроветворения.

2. При острых лейкозах и при анемиях отмечается высокая вариабельность показателей пролиферации клеток костного мозга, что связано с гетерогенностью лейкозных клеток, нестабильностью кроветворения и неэффективным гемопоэзом.

3. Эффекты. ионизирующего облучения организма проявляются главным образом в снижении доли миелокариоцитов в S-фазе и в блоке в стадии G2+M. Оценка степени лучевого воздействия по этим цитометрическим показателям в сочетании с данными миелограммы при помощи логических правил на основе рекуррентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана информативна и может использоваться для разработки методик биологической дозиметрии.

4. Изучение пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с субоптимальными дозами фитогемагглютинина по параметрам клеточного цикла объективизирует оценку бластной трансформации (РБТЛ), повышает достоверность метода и делает его информативным клинико-лабораторным тестом, отражающим состояние иммунитета.

Апробация диссертациа Материалы работы докладывались и обсуждались на: Симпозиуме «Цитофотометрия гемопоэтических клеток» (Москва, 1983); YII Научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск» (Москва, 1985); Научной конференции «Проблемы интенсивной терапии в клинике» (Москва, 1985); Ш Всесоюзном совещании но проточной цитометрии и сортировке клеток (Гатчина, 1986); Научной конференции «Специализированная медицинская помощь и современные проблемы ее интеграции» (Москва, 1986); IY Всесоюзном симпозиуме по проточной цитометрии (Пущино-на-Оке, 1988; П Всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991); Международном симпозиуме «Новые направления в развитии гематологии (Гамбург - Санкт-Петербург, 1992, 1994); Y Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995); Гематологической секции Московского научного общества терапевтов (Москва, 1996); Научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы»(Санкт-Петербург, 1996); Семинаре пользователей «Roche» (Санкт-Петербург - Валаам, 1996); I Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы» (Москва, 1996); Конференции «Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и

будущее» (Москва, 1996); Симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 1997).

Выступления с лекциями и подготовка специалистов лечебных и научных учреждений гематологического профиля на рабочих местах. Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 научных работы. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложения. Изложена на 234 страницах, содержит 10 таблиц, иллюстрирована 60 рисунками. Список литературы включает 230 наименований. В приложении приведены 10 таблиц статистической обработки данных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В основу настоящей работы были включены результаты исследования клеток костного мозга 26 доноров (контрольная группа), 39 гематологически здоровых людей, получавших химиотерапию по поводу онкологических заболеваний, 34 - больных лимфосаркомами без лейкемизации (ЛСА), 6 -лимфогранулематозом (ЛГМ), 107 - острыми лейкозами (ОЛ), 18 -лимфосаркомами с лейкемизацией (ЛСЛ), 12 - бластным кризом хронического миелолейкоза (БКХМЛ), 42 - анемиями различной этиологии.

Клинические исследования проводились совместно с сотрудником гематологического центра Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н.Бурденко Ю.М.Кучмой (начальник центра Н.М.Щербаков), сотрудником отделения химиотерапии гемобластозов Онкологического научного центра РАМН кандидатом мед. наук С.В.Лепковым (руководитель отделения кандидат мед. наук Ю.В.Червонобаб).

Также обследовано 25 пациентов, подвергавшихся лучевой терапии п области средостенья по поводу ЛГМ, 13 человек, получивших переоблучение при аварии и 6 больных острой лучевой болезнью. Эти исследования проводились совместно с доктором мед. наук Е.В.Кижаевым и Г.А.Сергеевым на базе радиологического центра Главного военного клинического госпиталя им. Н.Н.Бурденко, а также старшим научным сотрудником Государствешюго научного центра МЗ РФ - Института биофизики (руководитель клинического отдела доктор мед. наук Г.Д.Селидовкин) кандидатом мед. наук М.В.Кончаловским.

В экспериментальной части работы по изучению действия ионизирующей радиации и 5-фторурацила на клеточный цикл клеток костного мозга использовались белые беспородные мыши, всего 403 особи, а также 346 белых крыс.

При изучении пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином использовали лимфоциты, которые выделяли из периферической крови 45 здоровых доноров. Также обследовано 206 больных с заболеваниями легких, сопровождающимися развитием вторичного иммунодефицита: 150 пациентов с острыми пневмониями различной степени

тяжести, 22 - с хроническими пневмониями и бронхиальной астмой, 34 - с активным туберкулезом легких. Эту часть работы выполняли совместно с кандидатом мед. наук Б.А.Никулиным. Кроме того, проводились экспериментальные исследования на краткосрочных культурах лимфоцитов с ФГА и на перевиваемой культуре 1игка1.

В работе использовали главным образом метод проточной цитометрии, позволяющий оценивать параметры распределение гемопоэтаческих клеток по стадиям митотического цикла (Б, Сг+М, Ош, 8/(02+М), Б+Ог+М), который подробно описан ниже. Кроме того, анализировали клеточный состав костного мозга (миелограмму) на препаратах, окрашенных по Романовскому. Для оценки пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином применяли проточную ДНК-цитометрию (клинические наблюдения) и изучали включение 3Н-тимидина методом сциншлляционного счета. Также для исследования клеточного цикла применяли флуоресцентную метку с антителами Кд-67 и тест с использованием моноклональных антител (МКА) к бромдезоксиуридину. В работе использовали методы анализа хромосомных аберраций, комплекс методик для оценки состояния гуморального и клеточного иммунитета.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клетки костного мозга у людей получали при помощи пункции по методу М.И.Аринкина. При проведении пункции после того, как игла со шприцем вынута из кости и содержимое помещено на предметное стекло, в опорожненный шприц набирали 0,5 мл раствора, содержащего цитрат натрия в концентрации 1г/л и флуоресцентный краситель бромистый этидий (0,05 г/л). Получившийся смыв клеток со стенок иглы и шприца помещали в пробирку. Измерения обычно проводили не позднее 6-8 ч после взятия материала.

Суспензию пропускали через нейлоновую сетку с размером ячеек 70 мкм для удаления конгломератов клеток и добавляли равный объем раствора хромомицина Аз (0,05 г/л красителя в 0,1 моль/л трис-буфере, содержащем 0,1 моль/л хлорида натрия, 7,5 ммоль/л хлорида магния, рН 7,4). Непосредственно перед измерением полученную взвесь инкубировали с рибонуклеазой в конечной концентрации 0,05 г/л в течении 20 мин при комнатной температуре.

Одновременное использование двух флуоресцентных зондов (бромистого этидия и хромомицина Аз) значительно улучшало стехиометричность окраски ДНК, что повышало точность измерений. При совместном использовании этих красителей значительно возрастает специфичность и интенсивность реакции, что Объясняется переносом энергии возбуждения флуоресценции с хромомицина Аз (максимум возбуждения люминесценции составляет 405 нм) на бромистый этидий. При работе на проточном цитометре ЕР1СБ-С для возбуждения применяли длину волны 457,9 нм, что достигалось благодаря использованию аргонового лазера с перестраиваемой длиной волны.

Клетки костного мозга у экспериментальных животных (белые беспородные мыши и крысы) получали из бедренных костей. Животных

забивали при помощи этилового эфира, извлекали бедренные косточки и извлекали костный мозг из диафиза в пробирку с 0,5 мл бромистого этидия. Пробирку энергично встряхивали до получения гомогенной суспензии. При работе на крысах костный мозг предварительно разводили в 0,5 мл физиологического раствора. К 0,05 мл этой суспензии добавляли 0,5 мл раствора бромистого этидия. Методика окраски клеток костного в дальнейшем ничем не отличалась от описанной выше. При работе с культурами клеток основным требованием было получение конечной концентрации клеток в окрашенной суспензии не менее 1 млн. кл./мл.

Измерения проводили на проточном цитофлуориметре - анализаторе и сортировщике клеток EPICS-C (Coulter Electronics, США) и на лабораторной модели проточного цитометра, сконструированного в соавторстве с В.Н.Першиным. При этом в большей части исследования, включая получение клинического материала по изучению клеток костного мозга при гематологических заболеваниях, использовался коммерческий прибор. На лабораторном цитометре выполнена часть экспериментальных исследований, которая связана с опытами на животных, а также раздел работы, посвященный анализу бластной трансформации лимфоцитов в культуре с фитогемагглютишшом.

EPICS-C - лазерный проточный цитофлуориметр, анализатор и сортировщик клеток, имеет ортогональную оптическую систему, при которой поток суспензии клеток проходит в вертикальном направлен™ и перпендикулярно оси возбужден™ флуоресценции. В приборе применялся аргоновый лазер «Argon-Innova 90-6» ( «Coherent», США) с выходной мощностью 6 Вт (в режиме «Oil lines») и перестраиваемой длиной волны.

Лабораторная установка для проточной цитофлуориметрии сконструирована на базе люминесцентного микроскопа серии ШОМАМ и состояла из проточной системы, оптической части и электронных узлов. В приборе применялась вертикальная проточная камера закрытого типа с гидродинамической фокусировкой потока. Направление потока суспензии окрашенных клеток совпадало с оптической осью объектива (аксиальная система), что значительно облетало настройку системы и юстировку оптики по сравнению с аппаратурой, сконструированной по ортогональной системе.

Измерения производили в режиме реального времени, что позволяло следить за процессом накопления информации и при необходимости его корректировать. В одном образце анализировали, как правило, 30 тысяч клеток. В это число не включали регистрацию низкоамплитудных сигналов (<2С) и агрегатов.

Для анализа ДНК-гистограмм с получением оценок распределения клеток по стадиям клеточного цикла (S, G2+M, Gi/o) нами была разработана и использовалась специальная программа для компьютерной обработки данных. В основу был положен алгоритм, разработанный Dean (1980) для асинхронных пролиферирующих клеточных популяций (SFIT-метод).

Анализ гистограмм, получаемых на лазерном проточном цитометре, проводили при помощи IBM-совместимого компьютера, сопряженного с процессором самого прибора. При этом использовался стандартный пакет программ «Cytology» (Coulter, США). Программы рассчитаны на работу в интерактивном режиме с графическим выводом.

При сопоставлении данных, получаемых при помощи этих программ и модифицированного нами метода, была получена очень высокая степень корреляции. Коэффициенты корреляции (п = 10) составляли: 0,998 - для доли клеток в S-фазе, 0,996 - для Gi/o, 0,924 - для G^+M. Данные не только хорошо коррелировали, но и достаточно строго соответствовали друг другу по абсолютным значениям.

Для контроля правильности проведения анализа его результаты обычно сопоставляют с данными, полученными при помощи других методов. Поэтому нами было предприняты параллельные исследования пролиферативной активности гемопоэтических клеток при помощи МКА к бромдезоксиуридину, МКА Ki-67 и метки 3Н-тимидином.

Было получено, что как в случае исследования миелокариоцитов, так и при изучении культуры Jurkat, доля клеток в S-стадии, получаемая при помощи однопараметровой ДНК-цитометрии достаточно, строго соответствовала паттерну, регистрируемому по двум параметрам (метка с бромдезоксиуридином). Число клеточных элементов, имевших содержание ДНК от 2С до 4С, и не включавших метку (предположительно, не синтезирующих ДНК) составляло величины менее 3%. Интенсивность включения метки была приблизительно одинаковой во всех измеренных образцах. Также была установлена положительная корреляция между количеством клеток в S-фазе и долей клеток, меченых Ki-67. Коэффициент корреляции составил г=0,803 (п=22, р<0,001), при этом зависимость имела линейный характер.

При сопоставлении данных радиоизотопного исследования (количества импульсов, регистрируемых по включению 3Н-тимидина) и ДНК-цитометрии (доли клеток в S-стадии) на клетках культуры лимфоцитов была установлена достаточно высокая положительная корреляция. Коэффициент корреляции составил 0,85 (п^=9), что также подтверждает достоверность данных, получаемых при помощи проточной цитометрии.

Таким образом, разработанный метод изучения параметров клеточного цикла при помощи проточной цитометрии дает достаточно воспроизводимые и устойчивые оценки. Результаты проточной ДНК-цитометрии хорошо коррелировали с данными, получаемыми при помощи других методов, в частности метки с МКА (антитела к бромдезоксиуридину и Ki-67) и радиоизотопного анализа (включение 3Н-тимидина). Параметры клеточного цикла ( S, G2+M, Gi/o, S/(G2+M), S+G2+M ) отражают интегральное состояние пролиферативной активности гемопоэтических клеток и могут служить информативными показателями в проведении клинических и экспериментальных исследований.

В настоящей работе статистическую обработку данных проводили с привлечением параметрических методов. Достоверность различия средних определяли по критерию Стъюдента. Под стабильностью параметров клеточного цикла и других показателей понимали вариабельность результатов, полученных в однородной выборке, которую оценивали по коэффициентам вариации. Статистическую значимость их различия рассчитывали по критерию Стъюдента для коэффициентов вариации.

Для сравнения двух выборок по параметрам клеточного цикла и показателям миелограммы нами в соавторстве Б.В.Крехновым была разработана компьютерная программа на основе рекуррентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана. Программа работает в диалоговом режиме и служит для выделения наиболее информативных признаков среди множества исходных. В результате формулируется правило выбора решений или «древовидный классификатор», позволяющее с достаточной достоверностью проводить разделение между двумя группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

В НОРМЕ

Обследование 26 здоровых людей (17 мужчин и 9 женщин) в возрасте от 18 до 59 лет показало, что в норме показатели клеточного цикла клеток костного мозга варьируют в сравнительно узких пределах и характеризуются достаточно высокой стабильностью. Доля клеток в стадии синтеза ДНК составляла 12,3+0,3%, относительное число клеток в стадиях Ош - 83,9+0,4%, -

3,8+0,17%, Б+вг+М - 16,2+0,4%, отношение Б/^+М) - 3,34+0,15. Коэффициенты вариации этих параметров клеточного цикла соответственно составили 13,1%, 2,5%, 23,1%, 13,1% и 22,8%.

Стабильность изучаемых параметров не зависела от пола и возраста обследуемых лиц. При фактически одинаковых показателях средних величин у мужчин и женщин коэффициенты вариации доли клеток, находящихся в определенных стадиях клеточного цикла, составляли приблизительно одинаковые значения, которые статистически не различались.

Эти данные свидетельствуют о устойчивости цигометрических данных у здоровых людей, что связано не только с высокой степенью стандартизации методики и точностью разработанного метода. Низкая вариабельность параметров клеточного цикла клеток костного мозга в норме обусловлена стабильностью кроветворения, которая поддерживается системой гомеостазиса на определенном уровне и регулируется в зависимости от потребностей организма [Козинец Г.И. и соавт., 1988].

При исследовании клеточного цикла такой гетерогенной клеточной системы, как популяция клеток костного мозга, возникает вопрос об адекватности применения проточной цитометрии в качестве аналитического метода. Необходимо оценить степень влияния на точность и устойчивость

цитометрических показателей клеточного состава гемопоэтической ткани, что можно реализовать при сопоставлении результатов ДНК-цитометрии с данными гемоцитологического анализа пунктатов.

Нами были исследованы параметры клеточного цикла клеток костного мозга и миелограммы у 39 гематологически здоровых людей, получавших химиотерапию по поводу онкологических заболеваний, 34 - пациентов с ЛСА, 6 - ЛГМ. Также обследовано 130 пунктатов, полученных от 79 больных ОЛ в стадии полной гематологической ремиссии (ОЛ-р). Полученные данные представлены в таблице 1.

Установлено, что основные показатели клеточного цикла миелокариоцитов у гематологически здоровых людей, получавших химиотерапию, а также у больных ЛСА и ЛГМ практически не отличались от нормы, хотя и имели более высокую вариабельность. Достоверно более высокий уровень по сравнению с контрольной группой отмечался только у отношения Э/ССг+М) у пациентов с ЛСА (р<0,05 по критерию Стьюдента, обозначено звездочкой).

Табл.1.

Показатели клеточного цикла у гематологически здоровых пациентов, получавших химиотерапию, больных ЛСА, ЛГМ и ОЛ-р (М+шх, %; СУ, %).

Показатели Гемат.здоровые, получ. ХТ ЛСА ЛГМ ОЛ-ремиссия

Б-фаза 12,9+0,39 13,42+0,52 14,8+2,25 14,97+0,52

18,9 22,6 37,3 39,7

в2+М 3,60+0,21 3,76+0,28 3,86+0,54 4,32+0,22

36,5 42,8 34,4 57,4

83,3+0,48 82,8+0,71 81,34+2,62 80,64+0,65

3,6 5,0 7,9 9,18

Б+02+М 16,52+0,51 17,17+0,71 18,68+2,61 19,36+0,66

19,3 24,1 34,3 38,5

8/(02+М) 3,95+0,21 4,04±0,24* 4,01+0,46 3,94+0,14

33,2 34,8 27,9 39,3

Данные, полученные при обследовании больных с острыми лейкозами в стадии ремиссии, характеризовались изменениями, которые свидетельствовали о повышении пролиферативной активности миелокариоцитов, что было связано, вероятно, с процессами регенерации костного мозга после курса химиотерапии.

Кроме того, нами был проведен корреляционный анализ цитометрических показателей и данных миелограммы, в результате которого было получено, что коэффициенты вариации пика Суо , которые отражают точность цитометрического анализа, не зависят от клеточного состава суспензии и основных показателей миелограммы во всех обследованных группах.

По большинству признаков не получено значимой корреляции между параметрами клеточного цикла и данными миелограммы, хотя достаточно

выраженные корреляционные зависимости прослеживались внутри этих двух групп показателей. Установлена формально достоверная корреляция только между долей клеток в стадиях вш ,02+М, Э и содержанием клеток эритроидного ряда, особенно у гематологически здоровых пациентов, получавших химиотерапию и у больных ОЛ в стадии ремиссии. По-видимому, это обусловлено тем, что эритрокариоциты обладают более высокой пролиферативной активностью по сравнению с другими клетками костного мозга. В таком случае при регенерации костного мозга после химиотерапевтических воздействий эритроидный росток восстанавливается быстрее, чему соответствует возрастание доли клеток пролиферирующего пула (Б и вг+М) и снижение содержания миелокариоцитов в фазе Ош-

При обследовании практически здоровых людей (контрольная группа) никаких зависимостей между показателями клеточного цикла и данными миелограммы не было обнаружено. Отсутствие значимой отрицательной корреляции между долей миелокариоцитов в стадии в^о и клеточностью пункгата, а также положительной корреляционной зависимости между Ош и содержанием лимфоцитов позволяет исключить контаминацию материала лейкоцитами периферической крови.

ПАРАМЕТРЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

Изучали распределение клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла с помощью проточной цитометрии у 95 ОЛ. Контрольную группу составили 26 практически здоровых людей (доноры). Возраст обследованных варьировал от 18 до 78 лет. У пациентов с лейкозами исследование проводили и период ремиссии (109 наблюдений), а также в острый период (дебют и рецидив заболевания (95 наблюдений). В эту группу вошли 34 больных острыми миелобластными лейкозами и 31 - острыми лимфобластными лейкозами (ОЛЛ), 18 - ЛСЛ и 12 - БКХМЛ. В выборку включали результаты обследования пациентов с лейкозами только с диплоидным содержанием ДНК в клетках. Данные, полученные при анализе больных с ДНК-анеуплоидней приведены ниже в отдельном разделе.

Больные ОМЛ и БКХМЛ получали цитозар, рубомицин и тиогуанин по программам полихимиотерапии «7+3», «5+2» и «ТАО-9», а пациенты с ОЛЛ и ЛСЛ - винкристин, преднизолон, циклофосфан, 6-меркаптопурин, цитозар, адриабластин и 1-аспарагиназу по Берлинскому протоколу, а также применялись программы полихимиотерапии: СНОР, Ь-АОР и СОАР. В острый период обследование проводили, как правило, до начала химиотерапии. В ремиссии больных пункгарование не ранее, чем через 3 недели после завершения курса химиотерапии. В исследовании рассматривали только те варианты ремиссии заболевания, при которых содержание бластных клеток в путпетате снижалось до 5% и менее (полная ремиссия).

У пациентов с ОЛЛ в острый период заболевания наблюдалось достоверное возрастание средних значений доли клеток в стадиях Б (р<0,05),

отношения Б/^+М) (р<0,01) (см, табл.2). Однако, в данном случае усредненные величины не в полной мере отражают реальную картину. В действительности содержание клеток в Б-фазе варьировало в очень широких пределах от 4,5 до 37,0%. При превышении средней доли клеток в стадии синтеза ДНК на 28% коэффициент вариации (рис.1) почти в 4 раза был больше нормы (1=5,66, р<0,001).

Лейкозы (дебют и рецидив)

- острый лимфобластный лейкоз

- острый миелобластый лейкоз

- лимфосаркома с лейкемизацией

- властный криз хронического мивлолейкоза

Рис.1. Коэффициенты вариации показателей клеточного цикла клеток костного мозга при острых лейкозах, ЛСЛ и БКХМЛ в период обострения (дебют и рецидив).

Обозначения: столбиками представлены значения коэффициентов вариации параметров в процентах относительно контроля (за 100% приняты нормативные показатели); значения, достоверно отличающиеся от контроля, обозначены прямым крестиком (р<0,05), косым крестиком (р<0,01) и звездочкой (р<0,001).

Как видно на рис.1 коэффициенты вариации других параметров клеточного цикла при ОЛЛ в 3-5 раз превышали норму и достоверность их отличия была такой же высокой.

Не было получено достоверных различий между долей клеток в Б-фазе у первичных больных ОЛЛ до начала лечения и у пациентов в период первого рецидива, хотя отмечалась тенденция к увеличению этого показателя по мере развития заболевания. Усредненные значения составляли соответственно 13,3+2,85% и 17,2+4,65%.

Таблица 2.

Параметры клеточного цикла миелокариоцитов в норме и при острых лейкозах (%, М+мх)._

Группа обследованных S G2+M G1/0 S+G2+M S/(G2+M)

Здоровые лица 12,3+0,3 3,8+0,17 83,9+0,4 16,2+0,4 3,34+0,15

Лейкозы, дебют и рецидив: ОЛЛ 15,7+1,5 4,0+0,46 80,3+1,8 19,7+1,8 4,73+0,45

ОМЛ 10,6+0,7 2,55+0,40 85,2+1,4 14,5+1,46 4,45+0,41

ЛСЛ 14,9+1,44 2,89+0,35 82,4±1,5 17,8+1,6 6,62+1,15

БКХМЛ 14,7+1,54 3,28±0,38 81,8+1,63 18,0+1,58 5,0+0,81

Лейкозы, ремиссия: ОЛЛ 15,2+0,95 4,83+0,53 79,8+1,22 20,2+1,25 3,88±0,27

ОМЛ 15,6+1,06 4,20+0,36 80,0+1,32 19,8 + 1,38 4,0+0,25

ЛСЛ 14,5+1,15 5,24+1,52 80,1+2,0 19,8+2,0 4,0+0,51

БКХМЛ 12,4+1,38 3,72+0,64 83,8+1,86 16,2+1,86 3,71+0,59

При ОМЛ доля клеток в S-стадии варьировала от 4,4 до 13,0% (среднее 10,6+0,7%, р<0,05). Коэффициент вариации при этом составлял 38,2%, что практически в 3 раза выше нормативных значений (р<0,01). У больных ОМЛ, также, как и у пациентов с ЛСЛ коэффициенты вариации почта всех изучаемых показателей клеточного цикла миелокариоцитов достоверно превышали норму (р<0,001). При БКХМЛ выраженность этих изменений была несколько ниже.

Установлено, что у обследованных пациентов наблюдалось достоверное увеличение средних значений соотношения S/(G2+M), что может быть связано с наличием U-клеток (от англ. «unrecognizable»). Эти клетки по содержанию ДНК соответствуют S-фазе, но не включают 3Н-тимидин и, вероятно, не синтезируют ДНК, что впервые это было показано при сочетании цитофотометрии с авторадиографией [Котельников В.М., 1991]. В нормальном костном мозге U-

клетки встречаются крайне редко (менее 1%), но при острых лейкозах их содержание может достигать 28%.

При лейкозах в ремиссии отмечалось достоверное возрастание пролиферативной активности миелокариоцитов, которое сопровождалось менее значительным увеличением 8/(Сг+М) (табл.2). Это связано, вероятно, с регенерацией костного мозга после курсов химиотерапии. Более высокое соотношение Б^г+М) по сравнению с нормой может быть вызвано остаточным действием цитостатиков, блокирующих клеточный цикл в стадии синтеза ДНК, а также частичным повреждением клеточного микроокружения гемопоэтической ткани. О нарушениях стабильности кроветворения при ремиссии ОЛ свидетельствует более высокая вариабельность параметров клеточного цикла по сравнению с нормой.

КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ АНЕМИЯХ

Обследовано 42 пациента с анемиями, из которых 17 составили больные ЖДА, 8 - ПА, 9 - АИГА, 8 - АА, у которых костный мозг обследовали в период постановки диагноза заболевания до начала лечения.

При анемиях часто наблюдались более значимые изменения абсолютных значений показателей клеточного цикла по сравнению с другими гематологическими заболеваниями (табл.3). Также наблюдалось увеличение вариабельности этих параметров, которое было выражено в меньшей степени, чем при острых лейкозах. При ЖДА средние величины параметров пролиферации миелокариоцитов оставались в пределах нормы, тогда как их вариабельность значительно возрастала.

Таблица 3.

Параметры клеточного цикла миелокариоцитов в норме и при анемиях различной этнологии (%, М+мх).________

Группа обслсдовашшх Б а+м С1/0 Б+02+М Б/(02+М)

Здоровые лица 12,3+0,3 3,8+0,17 83,9+0,4 16,2+0,4 3,34+0,15

Анемии: ЖДА 12,7+0,6 3,76+0,29 83,6+0,9 16,4+0,7 3,37+0,50

ПА 36,1±3,0 6,28+0,94 57,6+2,6 42,3+2,6 7,40+1,73

АИГА 20,4+1,4 5,95+0,49 73,7+1,87 26,3+1,9 3,50+0,20

АА 7,63+1,2 1,98+0,36 90,4+1,4 9,6+1,4 4,22+0,56

У больных ПА отмечалось резкое увеличение доли клеток в Б-стадии, менее значительное возрастание 02+М при достоверном повышении соотношения 8/(С2+М). При этом часто фиксировались изменения распределения клеток на гистограммах в пределах Б-фазы, которые могли свидетельствовать о нарушениях синтеза ДНК в клетках в результате дефицита витамина В12 и

фолиевой кислоты (рис.2). Изменчивость параметров клеточного цикла была выше нормы.

О 10 20 30 40

Содержание ДНК (усл.ед.)

Рис.2. Гистограммы распределения клеток костного мозга но содержанию ДНК у здорового человека (норма) и пациентов с анемиями: першщиозной (ПА), аутоиммунной гемолитической (ЛИГА) и апластической (АА).

Обозначения: по оси абсцисс - содержание ДНК а отдельной клетке (условные единицы); но оси ординат - число клеток с данным содержанием ДНК (условные единицы, масштаб логарифмический).

У пациентов с АИГА отмечалось значительное возрастание пролиферативной активности миелокариоцитов. При этом доля клеток пролиферирующего пула (Б, СЬ+М, Б+вг+М) как в среднем, так и у каждого конкретного больного увеличивалась приблизительно одинаково (примерно на 80%). Соотношение 8/((}2+М) не отличалось от нормы, а его вариабельность даже имела выраженную тенденцию к снижению. Различия с контролем были недостоверны 0=0,64, р>0,05), но статистически значимы по сравнению с ЖДА

(1=3,96, р<0,001) и ПА (р=2,12, р<0,05). Высокая стабильность показателя Б/(02+М) свидетельствует о компенсаторном характере изменений клеточного цикла, связанных с повышением продукции эритроидных костномозговых клеток.

При АА отмечалось снижение пролиферативной активности, при котором доля клеток в стадии Ог+М уменьшалась в большей степени по сравнению с содержанием миелокариоцитов в стадии синтеза ДНК. Это приводило к возрастанию соотношения Б/^+М), как при ПА и при лейкозах, что может свидетельствовать о нарушениях клеточного цикла в Б-стадии. В динамике лечения заболевания нормализации гематологических параметров обычно соответствовало возрастание доли клеток, синтезирующих ДНК и уменьшение соотношения Б/(С2+М). Вариабельность основных параметров пролиферации миелокариоцитов при АА значительно выше, чем при других анемиях.

Таким образом, при анемиях наблюдается снижение стабильности показателей пролиферации, которое выражается в увеличении значений коэффициентов вариации в менее значительной степени, чем при лейкозах. У пациентов с анемиями разной этиологии отмечаются характерные для каждой нозологической формы изменения клеточного цикла клеток костного мозга, что можно использовать при дифференциальной диагностике этих заболеваний.

При гематологических заболеваниях часто отмечается повышение соотношения Б/(С2+М). Мы полагаем, что это связано с нарушением процессов синтеза ДНК в клетках и остановкой в прохождении Б-фазы в результате действия эндогенных (дефицит В)2 и фолиевой кислоты, действие ингибиторов пролиферации) и экзогенных (цитостатические агенты) факторов. Очевидно, что действие этих агентов на организм приводит к нарушению эффективности гемопоэза [Козинец Г.И. и соавт., 1988]. Предлагаемый нами цитометрический парамеф Б/(Ог+М), характеризующий клеточный цикл клеток костного мозга, можно рассматривать в качестве одного из тестов, позволяющих выявлять неэффективный гемопоэз.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ДНК-АНЕУПЛОИДИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ.

С целью выявления ДНК-анеуплоидии исследовано распределение клеток костного мозга по содержанию ДНК у 107 взрослых больных с различными формами острого лейкоза в острый период (дебют и рецидив). Взятие материала, окраску клеток и проведение проточно-цитометрических измерений проводили по методам, подробно описанным ранее. В качестве внутреннего стандарта (репера) использовали суспензию лимфоцитов человека, фиксированных 20% этиловым спиртом. Для каждой субпопуляции (анеуплоидного клона) определяли индекс ДНК (иДНК), который рассчитывали как отношение содержания ДНК в фазе вш лейкозных клеток к значению соответствующего показателя для нормальных клеток, у которых иДНК=1.

ДНК- анеуплоидия была нами выявлена у 28 из 107 больных с лейкемиями (26%): у 12 из 43 пациентов (28%) с ОЛЛ и у 16 из 64 пациентов (25%) с ОНЛЛ.

Среди выявленных аномальных по содержанию ДНК популяций лейкозных клеток преобладали гипердиплоидные клоны с околодиплоидными значениями иДНК. Степень анеуплоидии была несколько ниже при ОНЛЛ (иДНК составлял 1,17+0,06), чем при ОЛП (иДНК=1,21+0,05). В двух случаях обнаружены тетраплоидные клоны лейкозных клеток.

У 18 из 28 больных с ДНК-анеуплоидией костный мозг исследовали в динамике на протяжении от 2 до 36 месяцев. В одних случаях наблюдали полное исчезновение анеуплоидного клона при достижении гематологической ремиссии заболевания, в других - анеуплоидные клетки оставались в костном мозге в период гематологической ремиссии. Продолжительность ремиссии в последнем случае была короче и рецидив заболевания наступал раньше. В динамике лечения больного анеуплоидные клетки часто приобретали нормальный фенотип и их нельзя было идентифицировать как лейкозные на основании морфологических критериев.

Значимость использования ДНК-анеуплоидии в качестве маркера лейкозных клеток можно продемонстрировать на следующем примере.

Больной Ч., 19 лет, диагноз ОЛЛ, полная гематологическая ремиссия. Наличие ремиссии заболевания подтверждено трепанобиопсией костного мозга из гребня подвздошной кости. При ДНК-цитометрии костного мозга из грудины зарегистрирован гипердиплоидный клон клеток, составляющий 4,37%, иДНК 1,15. В пунктате костного мозга из подвздошной кости содержалось 1,50% клеток этого же клона.

Ремиссия заболевания сохранялась 6 месяцев. На протяжении этого периода в костном мозге анеуплоидный клон постепенно увеличивался до 12,9%. Морфологические исследования крови и пунктатов костного мозга не выявляли рецидива заболевания и соответствовали критериям полной ремиссии. В периферической крови среди лимфоцитов, выделенных на фиколлс, анеуплоидный клон составлял 38,5%. В момент диагностики рецидива пунктат костного мозга содержал 29,2% бластов, 18% лимфоцитов. В крови выявлялась лейкопения, бласты не обнаруживались. Гипердиплоидный клон в костном мозге составлял уже 58,6%. При цитогенетическом исследовании костного мозга, выполненном в последующем, все клетки, проанализированные в 21 метафазе были гипердиплоидными и содержали от 57 до 90 хромосом.

Следовательно, при сохраняющейся по данным морфологического исследования крови и костного мозга полной ремиссии ОЛЛ удалось проследить за динамикой опухолевого клона вплоть до развития рецидива заболевания.

АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПРИ ДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

Нами были исследованы костномозговые пунктаты от 44 человек, из которых 25 составили пациенты, у которых при лучевой терапии были облучены органы средостенья, 13 - лица, подвергавшиеся облучению при аварии на Чернобыльской АЭС, 6 - больные острой лучевой болезнью.

Для анализа влияния ионизирующей радиации в различных дозах на гемопоэтическую ткань человека были проведены исследования клеточного цикла и морфологического состава костного мозга у больных при терапевтическом однократном локальном облучении. Пациентов, облучавшихся по поводу лимфогранулематоза (локальные формы заболевания - 1-Н стадии), пунктировали через 22+1 и 46+1 ч после у-облучения Со60 в дозах 1, 2, 4 Гр. Больные не получали химиопрепаратов до начала лучевой терапии. Основные гематологические показатели у них находились в пределах нормы. Результаты представлены в табл.4.

Табл.4.

Параметры распределения клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла у лиц, подвергавшихся облучению (%, М+тх).

Группа обследованных Параметры клеточного цикла

Б 02+М С1/0 Б+в2+м Б/(02+М)

Пациенты, получавшие лучевую терапию (25) 6,18+0,36 10,1+0,81 83,8+0,86 16,30+0,87 0,69+0,06

1 Гр, 22 ч(4) 7,83+0,84 10,13+1,48 82,04+2,15 17,96+2,16 0,67+0,07

2Гр, 22 ч(9) 7,08+0,37 9,07+0,93 83,84+1,12 16,16+1,12 0,84+0,10

4 Гр, 22 ч (5) 5,70+0,58 8,93+1,10 85,56+1,49 14,63+1,64 0,65±0,04

1 Гр, 46 ч (3) 4,59+1,00 11,78+3,84 83,62+3,76 16,37+3,78 0,52+0,20

2 Гр, 46 ч (3) 5,64+0,61 9,80+1,63 84,55+1,27 15,45+1,28 0,67+0,02

4 Гр, 46 ч (1) 3,67 15,23 81,10 18,90 0,24

Лица, подвергавшиеся облучению при аварии (13) 14,48+0,74 4,95+0,33 80,65+0,77 19,43+0,75 3,07+0,22

Пострадавшие от ОЛБ, 47-69 с (6) 11,3+1,24 2,36+0,39 86,3+1,6 13,7+1,6 5,06+0,39

Контрольная группа (26) 12,31 ±0,32 3,84+0,17 83,88+0,42 16,15+0,42 3,34+0,15

При локальном облучении отмечалось уменьшение доли клеток в стадии синтеза ДНК и выраженный блок в фазе Ог+М. При этом снижение содержания миелокариоцитов в Б-фазе имело зависимый от дозы характер и нарастало на вторые супси. Относительное число клеток в Ог+М было достоверно повышено по сравнению с контролем, но имело приблизительно одинаковые значения при разных дозах и в разные сроки. Доля клеток в вш и пролиферативный пул (Б+йг+М) во всех случаях не отличались от контрольных значений. Также отмечалось выраженное снижение соотношения 8/(С2+М).

Значительные изменения отмечались со стороны миелограммы: снижение содержания эритроидных клеток, особенно оксифильных нормоцитов, относительное увеличение миелоидных клеток, повышение лейко-эритробластического соотношения, уменьшение элементов делящегося-созревающего пулов, бластов. В эти сроки после облучения: снижение содержания ядерных клеток в пунктате отмечалось при дозах радиации выше 2 Гр и было выражено в незначительной степени.

Для изучения возможности отделения здоровых людей от получивших облучение по параметрам клеточного цикла и миелограммы была использована компьютерная программа на основе рекуррентного алгоритма классификации Дж.Х.Фридмана. В результате было установлено, что именно цитометрические показатели - доля клеток в стадии Б и соотношение Б/(С12+М) - обладают самой высокой информативностью (рис.3).

б -|

О

о

сч 4 -О

О

со <0 5! X

си

3

Ро

О

О 2

I-

О

++

&

о

о

4

8

Доля клеток в Б-фазе, %

12

16

Рис.3. Параметры клеточного цикла клеток костного мозга у пациентов после локального облучения (обозначены крестиком) и у здоровых людей (обозначены кружком).

Обозначения: прерывистыми линиями нанесены значения показателей, по которым можно провести разделение.

При сравнении цитологических параметров у больных, получавших лучевую терапию, с данными обследования 26 здоровых доноров установлено, что в пространстве этих двух признаков можно проводить разделение со 100%-ой достоверностью (рис.4). Это свидетельствует о возможности использования показателей клеточного цикла клеток костного мозга для ранней диагностики факта облучения организма ионизирующей радиацией в дозе 1 Гр и более.

25,26

1 > 1

Б-фаза < 8,69 Б/(С2+М) < 1,38 1

1 25,0 1 0,26

1 « 1 1 з |

Рис.4. Логическое правило для отделения пациентов после локального облучения органов средостенья от здоровых людей.

Обозначения: в рамках - номера вершин, цифры над рамками - число объектов первого и второго образа (пациенты после облучения и здоровые люди соответственно), причем слева - число пациентов, а справа - число здоровых; под рамками - условия деления данной вершины (левая ветвь - «да», правая - «нет»).

Нами была также обследована группа лиц, подвергшихся внешнему облучению при аварш1 в суммарной дозе от 0,20 до 0,42 Гр (по данным индивидуальной дозиметрии) в течение 8-30 дней. Пункцию проводили в первую неделю после госпитализации. Результаты проведенного нами исследования хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у этих лиц подтвердили соответствие биологической дозы, полученной при облучении, показаниям физической дозиметрии.

Были выявлены достоверные изменения со стороны параметров клеточного цикла у обследуемой группы лиц, которые характеризовались повышением доли клеток в стадиях Б, С2+М, пролиферативного пула - Б+вг+М и снижением вш (табл.4). Соотношение Б/^+М) имело тенденцию к уменьшению, но от нормы отличалось не достоверно. Эти сдвиги могут свидетельствовать о повышении пролиферативной активности миелокариоцитов.

Большая часть гематологических показателей у всех обследованных участников ликвидации аварии находилась в пределах физиологических колебаний. Со стороны миелограммы отмечалось достоверное уменьшение содержания промиелоцитов, сегментоядерных нейгрофилов, оксифильных нормоцитов, лимфохоггов, а также увеличение доли палочкоядерных нейгрофилов и метамиелоцитов, базофильных и полихроматофильных нормоцитов. Обнаруженные сдвиги можно, вероятно, рассматривать как динамические изменения, связанные с активацией гемопоэза и повышением пролиферативной активности клеток а также с нарушением «барьерной» функции костного мозга, о чем свидетельствовало снижение содержания оксифильных нормоцитов и сегменгоядерных нейгрофилов.

При помощи компьютерной программы на основе рекуррентного алгоритма классификации было получено логическое правило в виде «бинарного дерева», позволяющее отделять лиц, получивших облучение в малых дозах (0,2-0,4 Гр) при аварии, от практически здоровых людей (рис.5).

26,13

1 ' 1

Б+вг < 17,29 1

1 1 21, 1 5,12

1 « 1 1 з 1

НОКС < 3,6 1

1 1 0,10 5, 2

1 « 1 1 7 1

ПМЦ < 0,5 1

1 0,2 ~~1 5,0

1 »4 | 1 * 1

Рис.5. Логическое правило для отделения участников ликвидации аварии на АЭС от здоровых людей.

Обозначения: в рамках - номера вершин; цифры над рамками - число объектов первого и второго образа (здоровые люди и участники ликвидации аварии соответственно), причем слева - число здоровых, а справа - число участников ликвидации аварии; под рамками - условия деления данной вершины (левая ветвь -«да», правая - «нет»); конечная вершина целиком относится к тому образу, объектов которого в ней больше; НОКС - нормоциты оксифильные; ПМЦ - промиелоциты.

Правило позволяет проводить тестирование для индикации облучения на основе трех признаков (пролиферативного пула клеток - Б+Ог+М, числа оксифильных нормоцитов и промиелоцитов) с высокой степенью достоверности.

Нами было обследовано 6 пациентов с острой лучевой болезнью 2-3 степени (облучение в дозах от 3,5 до 9 Гр) на 47-68 сут после воздействия. Доля клеток в стадии синтеза ДНК составляла 11,3+1,24%, в йг+М - 2,36+0,39%, в С,/о - 86,3+1,6%, соотношение Б/^+М) - 5,06+0,39% (табл.4). Статистически значимые изменения относительно нормы отмечались со стороны долевого содержания клеток в стадии Ог+М и соотношения Б/^+М). Выявленные нарушения клеточного цикла миелокариоцитов связаны, вероятно, со снижением эффективности гемопоэза в результате радиационного поражения костного мозга. Показатели пролиферации у пациентов с лучевой болезнью весьма сходны с параметрами клеточного цикла при апластических анемиях (табл.3) и могут рассматриваться как вариант апластического состояния клеток костного мозга, вызванного действием высоких доз радиации.

В экспериментах с изучением действия ионизирующей радиации использовали белых беспородных мышей-самцов (430 особей) массой 20-26 г. Часть опытов была проведена на белых беспородных крысах-самцах (60 животных) массой 200-220 г.

При исследовании клеток костного мозга у интактных лабораторных мышей (контрольная группа - 11 животных) было получено, что содержание миелокариоцитов в Б-фазе варьировало в относительно узких пределах от 13,5% до 21,3%, среднее значение - 17,04+0,84%, коэффициент вариации 16,0%. Доля клеток в стадии 02+М изменялась от 5,2 до 11,1%, среднее - 7,66+0,52%, коэффициент вариации 22%. Число клеток в фазе вш составило 75,3+0,90% при коэффициенте вариации 3,6%.

Живо тных подвергали общему равномерному рентгеновскому облучению на установке РУМ-11 при мощности дозы 0,5 Гр/мин. Режимы облучения: напряжение 200 кВ, сила тока 15 мА, фильтр медный - 0,5 мм, алюминиевый -1 мм. Доза облучения составляла от 0,1 до 13 Гр.

Установлено, что при действии радиации на организм в дозах 0,5-8 Гр происходят выраженные изменения в распределении клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла. Эти изменения максимально проявляются через 1 сут после воздействия. Наблюдалось значительное уменьшение доли клеток в стадии синтеза ДНК, возрастание относительного количества миелокариоцитов в вш, а при дозах 0,5 и 6-8 Гр - увеличение Сг+М.

Зависимости типа доза-эффект для содержания клеток в Б-фазе через 1 и 2 сут после воздействия были весьма сходными. В диапазоне доз от 1 до 6 Гр они имели в полулогарифмическом масштабе линейный характер и адекватно отображались логарифмическими функциями (рис.6).

30 — £ о" 1 20~ 1 со а э« е о 5 ю-§ о п В I----- }

I 1 11 | 1 1 1 1 1 1 И | 1 1 1 1 1 1 II | 0.1 1.0 10.0 Доза радиации, Гр

Рис.6. Зависимость доли клеток костного мозга в Б-фазе клеточного никла от дозы ионизирующей радиации в первые 2 сут после облучения.

Обозначения: линия А - кривая доза-эффект через 1 сут после облучения; линия В -кривая доза-эффект через 2 сут после облучения; сплошной линией выделены участки кривых, которые описываются при помощи логарифмических функций; вертикальными линиями нанесены стандартные ошибки средних; пунктирная линия, идущая параллельно оси абсцисс обозначает долю клеток в Б-фазе в контрольной группе.

При аппроксимировании кривая доза-эффект для 24 ч после облучения выражалась уравнением:

Б = 13,0 -4,42 1пБ (6 >Б >0,5), (1)

где Б - число клеток, синтезирующих ДНК (в %), а О - доза радиации (в Гр).

Зависимость доза-эффект для 48 ч после облучения описывалась аналогичной функцией с другими коэффициентами:

Б = 23,0-9,1 кШ ( 6 > О > 1,0). (2)

Как указано в уравнениях (1) и (2), эти зависимости справедливы в диапазоне доз от 0,5 до 6 Гр при исследовании через 24 ч после облучения и в

диапазоне от 1 до 6 Гр через 48 ч. При более высоких и более низких дозах кривые приобретали пологий наклон относительно оси абсцисс.

Изучение действия малых доз радиации (0,1-0,5 Гр) показало, что если через 1 сут после облучения достоверного различия в содержании клеток в Б-стадии по отношению к контролю не наблюдалось, то на 2-е сутки их уровень был значительно выше нормы. Это явление можно рассматривать как элемент стимуляции гемопоэтических клеток малыми дозами ионизирующего излучения.

Снижение доли миелокариоцитов в стадии синтеза ДНК происходило главным образом за счет блока в фазе вш , а при высоких дозах (6-13 Гр) -задержке в Сг+М. Задержка в прохождении цикла к Б-фазе и к митозу дает возможность завершиться процессам энзиматической репарации ДНК и элиминировать клетки, имеющие повреждения, несовместимые с жизнью. Процессы пострадиационной гибели миелокариоцитов также оказывают влияние на соотношение клеток в разных стадиях клеточного цикла, так как гибнут в основном пролиферирующие клетки. Но, как нами было показано, эти процессы имели в определенной степени вторичный характер и, если их оценивать по снижению общего количества ядерных клеток костного мозга (в бедренной кости животного), развивались несколько позднее по времени.

На 3-7 сут после облучения изменения клеточного цикла связаны главным образом с процессами восстановления гемопоэза. При дозах радиации 2 и 4 Гр происходило значительное (в 1,5- 2 раза по сравнению с нормой) повышение пула пролиферирующих клеток (в стадиях Б и 02+М).

Нами также были исследованы закономерности изменений клеточного цикла клеток костного мозга лабораторных крыс при общем и локальном облучении. Установлено, что в норме показатели пролиферации у этих животных мало отличались от соответствующих параметров у лабораторных мышей. При обследовании 12 интакгных животных доля клеток, синтезирующих ДНК составила 19,23+0,56%, число миелокариоцитов, находящихся в стадии С2+М - 6,85+0,40%, а в вш- 73,92+0,76%. При этом разброс данных характеризовался коэффициентами вариации соответственно 10,1%, 20,2%, 4,6%.

Изучали параметры клеточного цикла гемопоэтических клеток крыс через 1 сут после облучения в дозах 0,1-6 Гр. С этой целью было поставлено 7 серий опытов на 42 животных. Получено, что наиболее выраженные изменения отмечались в количестве клеток в Б-фазе, причем преимущественно за счет увеличения их относительного содержания в О^о. Содержание клеток в С^ М не отличалось от контроля во всем исследованном диапазоне доз. Только при облучении в дозе 6 Гр доля клеток в постсшгтетической фазе достоверно возрастала (Р<0,01).

Зависимость типа доза-эффект для доли клеток в Б-фазе имела линейный характер в полулогарифмическом масштабе в диапазоне доз от 0,5 до 6 Гр и адекватно описывалась логарифмической функцией. При аппроксимировании зависимость отображалась уравнением:

S = 13,95 - 4,95 lnD (6>D>0,5), где S - количество клеток, синтезирующих ДНК (%), a D - доза радиации (Гр).

Такой тип функциональной зависимости, отражающей изменения клеточного цикла через 1 сут после облучения, вероятно, имеет универсальный характер, так как его удалось воспроизвести на разных видах животных. Очевидно, что полученная модель весьма удобна для оценки интенсивности воздействия на организм по конечному биологическому эффекту, что имеет прямое отношение к проблеме биологической дозиметрии. Установленные закономерности можно рассматривать в качестве тест-системы, позволяющей изучать влияние на пролиферацию гемопоэтических клеток различных агентов, в частности цитостатических препаратов и средств, модифицирующих радиочувствительность организма.

Представляет интерес выяснить, в какой степени связаны наблюдаемые изменения с непосредственным действием радиации на миелокариоциты и с опосредованными эффектами на организменном уровне через образование радиотоксинов, общую реакцию организма и др. Приблизиться к решению этих вопросов можно путем изучения влияния локального облучения на пролиферацию клеток костного мозга.

С этой целью была поставлена отдельная серия опытов, в которой облучению подвергали одну заднюю конечность животного. Крыс обездвиживали при помощи этилового эфира и фиксировали на специальном штативе. Все тело животного кроме правой задней конечности экранировали. Животных подвергали однократному локальному рентгеновскому облучению на установке РУМ-11 в дозе 4 Гр в стандартном режиме. Крыс контрольной группы (контроль 1) также обездвиживали, фиксировали на штативе и при облучении экранировали полностью.

Было получено, что через 1 сутки после локального облучения одной задней конечности в дозе 4 Гр долевое содержание клеток костного мозга в основных стадиях клеточного цикла практически не отличалось от этих показателей при общем облучении всего тела. Это убедительно свидетельствует, что наблюдаемые нарушения пролиферации миелокариоцитов в значительной степени связаны с прямым действием радиации на клетки.

В более поздние сроки после воздействия различия в эффектах общего и локального облучения могут, вероятно, проявиться. Но эти отличия будут обусловлены не особенностями первичного поражающего действия радиации, а условиями регенерации гемопоэтической ткани. В случае локального облучения будет происходить миграция стволовых клеток в поврежденные участки костного мозга, что ускорит восстановление гемопоэтической ткани (по сравнению с облучением всего тела) [Дыгай A.M. и соавт., 1983].

В интактном (экранированном) костном мозге, который получали из другой конечности подопытного животного, показатели доли клеток в стадиях S и G2+M статистически не отличались от контрольных значений. Однако, отмечалось достоверное (Р<0,05) возрастание относительного содержания

миелокариоцитов в фазе вш. Это может быть связано с радиационным блоком в стадии О] и, вероятно, с некоторым уменьшением пула пролиферирующих клеток. Из литературных источников известно, что гибель и исчезновение клеток костного мозга происходят не только в облученных участках костного мозга, но и в экранированных [Ярмоненко С.П., 1988]. Подавление клеточного деления и гибель наиболее радиочувствительных элементов наблюдаются при опосредованном действии радиации, в котором ключевую роль выполняют радиотоксины - аномальные метаболиты и вещества, образующиеся в облученном организме [Кузин А.М. и Копылов В.А., 1983]

ПРОЛИФЕРАЦИЯ МИЕЛОКАРИОЦИТОВ ПРИ ВВЕДЕНИИ 5-ФТОРУРАЦИЛА.

С целью изучения влияния цитостатического препарата 5-фторурацила на пролиферативную активность клеток костного мозга было поставлено 38 серий опытов на 286 животных (белые беспородные крысы).

На первом этапе исследовали действие препарата через 2, 4, 8, 16, 24 ч после введения. Было установлено, что 5-фторурацил в дозах 15 и 30 мг/кг вызывал эффект синхронизации клеток. При регистрации распределения миелокариоцитов по содержанию ДНК через 4 ч после воздействия наблюдалось накопление клеток в вш -стадии и на границе О^Б клеточного цикла. Через 8 ч после введения цитостатика синхронизированные в результате блока клетки достигали середины Б-фазы, а через 16 ч- стадии вг+М и конца Б-фазы.

Такой эффект отсутствовал при введении препарата в больших дозах (100 мг/кг и более), вероятно, в результате тотальной гибели клеток. В более поздние сроки (на 2-е и 3-е сутки происходила потеря синхронизации (десинхронизация). Причины этого могут быть обусловлены тем, что гемоиоэппсская ткань представляет собой достаточно гетерогенную систему, включающую популяции клеток с различной длительностью клеточного цикла.

Препарат в дозах от 1 до 15 мг/кг через 1 сут после введения не вызывал существенных изменений в количестве клеток, синтезирующих ДНК. Достоверно ниже нормы был уровень миелокариоцитов в стадии 02+М при дозах 10 и 15 мг/кг, что могло быть обусловлено частичной синхронизацией клеток. Введение 5-фторурацила в дозе 30 мг/кг и более вызывало резкое снижение пролиферативного пула клеток (в стадиях Б и 02+М). Наиболее четко это проявлялось в уменьшении доли миелокариоцитов, синтезирующих ДНК. Эффект был приблизительно одинаково выражен при дозах 30, 100, 300 мг/кг. Кривая доза-эффект для доли клеток в Б-фазе имела ступенчатую форму (рис.7).

На 2-3-и сутки после введения препарата в дозах 15 и 30 мг/кг отмечалось значительное возрастание пролвферативного пула клеток, особенно в Б-стадии клеточного цикла, что было связано, вероятно, с процессами регенерации костного мозга. Более высокие дозы препарата (100 мг/кг) вызывали дальнейшее снижение содержания пролиферирующих клеток на 2-е и 3-й сут после воздействия. Лишь через 5-6 суг отмечалась тенденция к восстановлению

пролиферативной активности миелокариоцитов. Достоверное возрастание доли клеток в фазе синтеза ДНК отмечалось только на 7-е сут эксперимента. На 9-е сут содержание клеток в Б-фазе уже значительно превышало нормативные показатели.

1 ю юо

Доза 5-фу, мг/кг

Рис.7. Зависимость доли клеток в стадии синтеза ДНК от дозы 5-фторурацила через 1 сут после воздействия.

Обозначения: по оси абсцисс - доза препарата (мг/кг) в логарифмическом масштабе; по оси ординат - доля клеток в Б-фазе (%); прерывистой горизонтальной линией обозначен уровень долевого содержания клеток в Б-фазе в контрольной группе.

Полученные данные свидетельствуют, что при действии на организм циготоксических факторов - облучения и цитостатического препарата 5-фторурацила - отмечаются нарушения параметров клеточного цикла гемопоэтических клеток, которые возникают в ранние сроки после воздействия и имеют дозозависимый характер. Наибольшие сдвиги наблюдались в долевом содержании клеток, синтезирующих ДНК.

Различия в эффектах ионизирующей радиации и 5-фторурацила касались главным образом содержания миелокариоцитов в премитотической стадии (вг+М). При облучении наблюдался выраженный блок пролиферации клеток в Ог+М, чего не отмечалось после введения цитостатика. Это свидетельствует о выраженных различиях в механизмах влияния исследованных агентов на процессы пролиферации. Вместе с тем, в поздние сроки после воздействия динамика развития нарушений имела сходный характер, так как определялась процессами гибели и регенерации клеточных элементов костного мозга.

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В КУЛЬТУРЕ С ФИТОГЕМАГГЛЮТИНИНОМ.

Для оценки нормативных показателей пролиферации лимфоцитов в культуре с ФГА использовали клетки, которые выделяли из периферической крови 45 здоровых доноров (лица мужского пола из организованных коллективов в возрасте 18-20 лег). Кровь брали из локтевой вены в стерильную пробирку с гепарином (25 ЕД/мл).

Лимфоциты выделяли в градиенте плотности верографина-фиколла (d=l,077 г/мл), дважды отмывали средой 199 и культивировали из расчета 200 тыс. клеток в 1 мл. Культуральная смесь состояла из среды 199 с добавлением 20% инактивированной сыворотки группы АВ (IV). Клетки термостатировали при 37°С в течение 72 ч.

Для анализа активности ФГА было исследовано 40 культур при 5 возрастающих концентрациях митогена (12,5, 25, 50, 100, 200 мкг/мл) с построением кривой доза-эффекг. Кровь для выделения лимфоцитов брали у 8 практически здоровых людей. В эксперименте использовали ФГА типа М фирмы «Serva». Властную трансформацию лимфоцитов оценивали по доле клеток, синтезирующих ДНК.

Получено, что пролиферация клеток в культуре возрастала в зависимости от дозы ФГА в диапазоне от 12,5 до 50 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации митогена не приводило к повышению доли клеток, синтезирующих ДНК. ФГА в концентрации 50, 100, 200 мкг/мл вызывал максимальную стимуляцию лимфоцитов, при которой доля клеток в стадии синтеза ДНК не зависела от концентрации митогена.

Полученные данные свидетельствуют, что при решении исследовательских задач, связанных с оценкой функциональной активности лимфоцитов, использовать ФГА в высоких концентрациях нецелесообразно. В таких условиях трудно регистрировать воздействие стимулирующих агентов, так как пролиферативная активность клеток уже достигла определенного предела. В этом случае факторы, вызывающие функциональную недостаточность лимфоцитов, также не могут в полной мере проявить своего действия ввиду того, что избыточные дозы ФГА, вероятно, будуг вызывать избыточную стимуляцию клеток со сниженной потенцией к бластной трансформации.

Исходя из сказанного выше, мы при проведении исследований выбрали концентрацию лекгана, при которой регистрировался ответ, ниже максимального на 27%. При использовании ФГА «Serva» типа М такая субоптимальная концентрация составляла 25 мкг/мл. Применение других митогенов требовало дополнительного тестирования.

Для анализа значимости полученного нами метода исследования функциональной активности лимфоцитов для характеристики

иммунологической резистентности организма мы ограничились использованием такого параметра, как пролиферирующий пул клеток -S+Gj+M. При обследовании 45 доноров (контроль) этот показатель составил 32,4+1,53%.

Было обследовано 206 пациентов с воспалительными заболеваниями легких, поскольку показано, что эта патология часто сопровождается нарушением иммунного статуса [Кноринг Б.Е. и соавт., 1994]. В работе использовали лимфоциты, которые выделяли из периферической крови 150 пациентов с острой пневмонией (ОП), то которых 30 составили больные с легкой формой пневмонии, 97 - средней тяжести, 27 - тяжелой. У 107 больных длительность течения заболевания не превышала 30 суток, у 43 - составляла более 30 дней (затяжная пневмония). Кроме того, обследовано 22 пациента с хронической пневмонией и бронхиальной астмой и 34 - с активным туберкулезом легких.

Было установлено, что показатели РБТЛ при ОП имели тенденцию к снижению. При легкой пневмонии параметры РБТЛ практически не отличались от нормы (31,2+0,65%), при средней тяжести заболевания были снижены на 17% по отношению к контролю (26,9+0,85%, Р<0,01). Тяжелая и затяжная формы характеризовались достаточно резким уменьшением значений РБТЛ (соответственно 18,5+1,22% и 17,2+2,10%, Р<0,001). Таким образом, показатели РБТЛ при ОП снижались в зависимости от тяжести процесса, что может иметь определенное значение для прогноза течения заболевания при обследовании пациентов на ранних стадиях.

Проведено обследование при помощи унифицированных методов уровня R-белка и гомореакганта в сыворотке крови, гуморальных факторов: сывороточных иммуноглобулинов, основных компонентов комплемента СЗ и Clq методом Манчини, активности комплемента по 100% гемолизу эритроцитов барана, уровня циркулирующих иммушшх комплексов (ЦИК), клеточных факторов иммунитета: относительного и абсолютного количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, В- и «активных» Т-лимфоцитов по тесту розеткообразования, фагоцитоза и окислительного метаболизма гранулоцитов.

Корреляционный анализ полученных нами данных показал наличие зависимости иммунореактивности организма и параметров пролиферации лимфоцитов в культуре. Корреляция показателей РБТЛ прослеживалась с R-белком, гомореактантом, СЗ компонентом комплемента и уровнем Т-лимфоцитов.

Наиболее выраженный характер имела отрицательная корреляция между параметрами РБТЛ и уровнем R-белка. Как известно, R-белки являются продуктами катаболитного распада клеточных рецепторов [Кульберг А.Я., 1986]. Их содержание резко возрастает при нарушениях метаболизма на уровне клетки и клеточной деструкции.

Непосредственно сами R-белки, видимо, не влияют на РБТЛ. Об этом свидетельствуют полученные данные по обследованию пациентов с хроническими неспецифическими заболеваниями легких и активным туберкулезом легких [Никулин Б.А. и соавт., 1989]. Оказалось, что при этих заболеваниях наиболее значимые изменения претерпевает уровень R-белка, который значительно выше, чем при ОП, особенно при активном туберкулезе легких. При неспецифических заболеваниях легких (хроническая пневмония и бронхиальная астма) РБТЛ была достоверно снижена (среднее 18,4+1,67%, Р<0,001), что примерно соответствует значениям показателя при тяжелой и затяжной ОП. У больных с активным туберкулезом легких выявлено резкое повышение РБТЛ не только по сравнению с этими параметрами при других заболеваниях легких, но и относительно нормы (41,5+1,57%, Р<0,001).

Полученные данные в совокупности свидетельствуют, что оценка РБТЛ по параметру «пролиферирующий пул клеток» делает этот метод значимым лабораторным тестом, отражающим состояние клеточного иммунитета.

ОБСУЖДЕНИЕ

Использование в работе адекватных методов составляет основу для получения достоверных научных результатов. Исходя из этого мы большое внимание уделяли решению методических вопросов. При этом учитывалось, что подходы, связанные с применением проточной ДНК-цитометрии для получения интегральных показателей распределения клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла нередко подвергаются критике по следующим соображениям:

1. Костный мозг имеет очень гетерогенный состав, включающий гранулоцитарный, эритроидный, лимфоцитарный, моноцнгарный и мегакарноцитарный ростки. Однако проточную цитометрию, по мнению некоторых исследователей, можно применять только для исследования гомогенных клеточных популяций.

2. При пунктировании происходит разбавление костного мозга кровью, что в большой степени искажает результаты и делает невозможной оценку распределения клеток по фазам клеточного цикла.

3. Показатели пролиферации клеток костного мозга даже в норме подвержены значительным колебаниям, воспроизводимость и устойчивость этих параметров настолько низкая, что применение их в качестве референтных клшшко-лабораторных тестов представляется проблематичным.

4. Компьютерный анализ гистограмм распределения клеток по содержанию ДНК, позволяющий получить оценки содержания клеток в стадиях клеточного цикла, основан на гипотетических «софистических» моделях и дает косвенные результаты.

5. Оценка распределения популяции клеток по стадиям клеточного цикла (S, G2+M, Gi/o) при помощи проточно-цитометрического анализа показывает содержание ядер с содержанием ДНК, соответствующим определенным

стадиям цикла, что не отражает состояние пролиферации в системе. В частности, этот способ не определяет скорости синтеза ДНК, что достигается с применением метода метай с моноклоналышми антителами к бромдезоксиуридину. Этот тезис основан на положении, что в клеточной системе (ткань, культура клеток) могут быть элементы, по содержанию ДНК соответствующие, например, Б-стадии, но не синтезирующие ДНК.

Костный мозг действительно является гетерогенной системой. Однако, как показано при помощи ряда методов включая и проточную цитометрию [АЬгаЬашзеп е1 а1., 1995], в норме пролиферативный пул миелокариоцитов включает главным образом гранулоцитарный и эритроидный ростки. Костномозговые лимфоциты пракгически не пролиферируют, клетки моноцигарного ряда в процентном отношении составляют такую незначительную часть (обычно менее 3%), которая при интегральной оценке может не учитываться. Что касается тромбоцитопоэза, то продукция тромбоцитов связана с мегакариоцитами, которые в зрелом состоянии являются полиплоидными клетками с содержанием ДНК >4С (8С, 16С и 32С), которые при проточно-цитометрическом анализе регистрируются вне основного пула клеток.

Таким образом, интегральная оценка распределения костномозговых клеток по стадиям клеточного цикла в норме отражает суммарное состояние пролиферации в гранулоцитарном и эритроидном ростках. Соотношение этих ростков, а также других элементов миелограммы на основе рекуррентного алгоритма классификации позволяет составить более детальное представление о пролиферации миелокариоцитов.

Разбавление пунктата кровью действительно может иметь место, особенно п тех случаях, когда при проведении пункции пытаются получить большое количество материала. Как известно, лейкоциты периферической кропи находятся в стадии во митотического цикла. Примесь крови в костномозговом пункгате наряду со снижением концентрации клеток вносит погрешность в цитометрическое измерение («фактор образца»). При этом доля клеток в стадиях 01+0о завышена за счет увеличения содержания зрелых лейкоцитов, а содержание элементов в Б- и Ог+М-стадиях относительно снижено. По-нашему мнению, в каждом конкретном случае необходимо учитывать содержание ядерных клеток в единице объема пунктата, миело!рамму (наличие более 30% лимфоцитов может свидетельствовать о разбавлении), объем полученного материала (не более 0,5 мл) и квалификацию персонала, производящего процедуру.

В нашей работе получено, что при сопоставлении параметров клеточного цикла с показателями миелограммы не выявляется значимых корреляционных связей ни с долевым содержанием лимфоцитов, ни с клеточностью пунктата. Кроме того, коэффициенты вариации, вычисляемые по ширине пика вш и отражающие точность измерений, тоже не зависели от данных миелограммы. Таким образом, получаемые с помощью метода проточной цитометрии результаты достаточно устойчивы, так как они не связаны с параметрами,

характеризующими качественный состав клеточных популяций костного мозга. Эти показатели имеют самостоятельное значение в оценке интегрального состояния клеток гемопоэтической ткани.

Анализ данных литературы показал, что в большинстве работ по изучению клеточного цикла миелокариоцитов исследования проводились на аспиратах костного мозга, объем которых при проведении пункции составлял от 2 до 5 мл [Dosik et al., 1980; Hiddemann etal., 1982; Sasaki et al., 1986; White a. Meistrich, 1986]. Такая техника взятия материала приводила к его разбавлению периферической кровью, что влекло за собой «занижение» значений фракции пролиферирующих клеток, нестабильность результатов и повышение их вариабельности.

Сравнительно недавно были опубликованы материалы по изучению влияния контаминации периферической кровью клеток костного мозга на показатели их пролиферативной активности [Abrahamsen et al., 1995; Abrahamsen, et al., 1996]. Среднее значение доли клеток в S-фазе у здоровых людей составляло 12,6+2,6%, что хорошо соответствует полученным нами данным. В этой же работе исследовали биопсийный материал, который был получен при проведении торакальных хирургических операций. Доля клеток в стадии синтеза ДНК в этом случае составила 15+1,5%. Методика обработки и окраски клеток из биопсийного материала включала выделение фракции мононуклеарных клеток в градиенте плотности (1,077+0,001 г/л). Исследование пунктатов после их выделения влияло на оценку доли клеток в S-фазе, которая в этом случае была несколько выше -14+3,45%. Авторы при проведении пункции ограничили объем аспирата (ОД мл), что привело к получению практически одинаковых результатов при исследовании клеток, взятых при пункции и при биопсии (различия статистически не значимы).

Стабильность показателей пролиферации зависит от метода анализа и складывается из влияния целого ряда факторов, среди которых можно выделить влшпше «фактора образца» и точности измерений («аппаратная точность»). В первую очередь вариабельность результатов определяется однородностью выборки, которую используют при проведении исследования.

Нами установлено, что в норме показатели клеточного цикла кроветворных клеток варьируют в достаточно. узких пределах, что свидетельствует об их стабильности. Коэффициенты вариации этих параметров составляли приблизительно одинаковые значения при исследовании костного мозга здоровых людей и экспериментальных животных. При взятии материала у животных вероятность разбавления кровью минимальная. Тем не менее, это не привело к снижению вариабельности результатов по сравнению с данными изучения пунктатов у людей. По-видимому, разработанный метод дает достаточно воспроизводимые и достоверные результаты, которые адекватно отражают пролиферативную активность клеток, а регистрируемая при этом неустойчивость параметров соответствует уровню стабильности кроветворения.

Параметры клеточного цикла, получаемые при помощи ДНК-цитометрии при их формальной оценке в некоторых случаях могут не соответствовать

уровню пролиферативной активности популяции клеток. Это отмечается достаточно редко и только в случае действия факторов, вызывающих нарушения метаболизма ДНК. В частности, при введении цигостатических препаратов - антиметаболитов, при дефиците витамина Вци фолиевой кислоты может наблюдаться блок клеточного цикла в стадии синтеза ДНК. Кроме того, наличие клеток, по содержанию ДНК соответствующих Б-фазе, но не синтезирующих ДНК, описано при лейкозах (Л-клетки) [Котельников В.М., 1991]. При этом меняется характер распределения клеток, имеющих промежуточное содержание ДНК (от 2С до 4С), что достаточно четко фиксируется на гистограммах и сопровождается возрастанием соотношения Б/(02+М).

Отношение Б/(С2+М) в норме довольно постоянно. Его увеличение свидетельствует о блоке клеточного цикла в 02+М, который: развивается в ранние сроки после действия ионизирующей радиации. При гематологических заболеваниях: пернициозной и апластической анемии, острых лейкозах, острой лучевой болезни 2-3 степени (в поздние сроки) отмечается увеличение Б/(С2+М), что свидетельствует о нарушениях клеточного цикла и, вероятно, снижении эффективности гемопоэза. Этот питометрический параметр можно рассматривать в качестве одного из дополнительных тестов, позволяющих выявлять неэффективный гемопоэз.

Нами было получено, что при острых лейкозах и, в гораздо меньшей степени, при анемиях отмечается неустойчивость параметров пролиферации клеток костного мозга. Хотя вариабельность показателей пролиферации при острых лейкозах была ранее показана другими исследователями [Котельников В.М., 1991], нам впервые удалось продемонстрировать это на большом клиническом материале и в сопоставлении с нормой, которая характеризовалась стабильностью. Установлено, что неустойчивость параметров клеточного цикла клеток костного мозга при гематологических заболеваниях связана не с методическими причинами, как это полагали ранее [№1№етапп с1 а1., 1982; АлёгееН, 1990], а с вариабельностью репродукции неопластических клеток (дебют и рецидив острых лейкозов), а также с нарушениями стабильности кроветворения и неэффективным гемопоэзом (анемии различной этиологии и лейкозы в ремиссии).

Уровень клеток, синтезирующих ДНК, рассматривается в качестве важного прогностического показателя [Ргаэкг е1 а1., 1984; И а/а е1 а1., 1987; Котельников В.М. и соавт., 1989]. Низкая стабильность показателей пролиферации также свидетельствует о необходимости выработки в каждом конкретном случае индивидуальной стратегии лечения больных.

ДНК-цитометрия клеток костного мозга дает возможность наряду с оценкой клеточного цикла выявлять анеуплоидные клеточные клоны при гемобластозах, что в ряде случаев позволяет дополнительно верифицировать заболевание и следить за динамикой опухолевого роста для определения минимальной остаточной болезни в период ремиссии заболевания. Хотя анеуплоидию удается выявлять менее чем в 30% случаев острых лейкозов

взрослых и приблизительно в 40% - у детей, с разработкой проточно-цитометрической техники, методов окраски клеток и появлением новых флуоресцентных зондов можно ожидать дальнейшего развития этого аналитического подхода.

Значительные нарушения клеточного цикла миелокариоцитов наблюдаются при действии на организм ионизирующей радиации. Исследование костномозговых пунктатов пациентов, облученных в области средостенья в дозах до 4 Гр и людей, подвергшихся облучению (0,2 - 0,4 Гр) при аварии, показало общие закономерности изменения клеточного цикла у человека и экспериментальных животных. При дозах более 1 Гр через 1-2 сут после воздействия отмечали значительное уменьшение доли клеток в стадии синтеза ДНК и выраженный блок в фазе G2+M. При этом эффект снижения содержания миелокариоцитов в S-фазе был более выражен при высоких дозах облучения. Относительное число клеток в G2+M достоверно возрастало по сравнению с нормой, но имело приблизительно одинаковые значения в диапазоне 1-4 Гр.

При сравнении данных проточной цитометрии и миелограммы на основе рекуррентного алгоритма классификации было установлено, что параметры клеточного цикла - доля клеток в S-фазе и соотношение S/(G2+M) - наиболее адекватно отображают факт радиационного воздействия в дозах 1 Гр и более.

При низких дозах воздействия (0,2 - 0,4 Гр) отмечали увеличение содержания миелокариоцитов в стадиях S и G2+M. Для этих пациентов также был разработан алгоритм, позволяющий проводить достаточно строгое разделение со здоровыми людьми (контрольная группа) по цитометрическим показателям (S+G2+M) в сочетании с данными миелограммы (содержание оксифилышх нормоцитов и промиелоцитов). Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования параметров клеточного цикла в сочетании с показателями миелограммы в качестве диагностических маркеров переоблучения организма.

В экспериментах на животных нами было установлено, что изменения клеточного цикла наиболее выражены в ранний период после воздействия (1-2 сут). Наблюдалось резкое уменьшение доли клеток в стадии синтеза ДНК, возрастание их содержания в Gi/o-фазе, а также увеличение содержания миелокариоцитов в G2+M.

Большинство исследователей считает, что основным эффектом ионизирующей радиации на клеточный цикл является блок пролиферации в премитотической стадии («арест» G2 ) [Окада, 1974; Roy, 1985]. В нашей работе получено, что блок в G2 развивается раньше снижения содержания клеток в S-стадии и максимально выражен через 8 ч после воздействия. Через 1 сут достоверное увеличение доли клеток в G2+M относительно контроля отмечалось при дозах радиации 0,5 Гр и более 6 Гр.

Более выраженный и устойчивый характер имело снижение относительного содержания миелокариоцитов в S-стадии, причем у лабораторных животных (белые мыши и крысы) это присходило главным образом за счет увеличения

доли клеток в Gi/o. При значительных дозах радиации (более 4 Гр) через 24 ч после облучения наблюдали более чем трехкратное снижение числа клеток, синтезирующих ДНК.

Полученные нами в экспериментах на животных кривые для 24 ч после облучения имели линейную форму в диапазоне 0,5-6 Гр и адекватно отображались логарифмическими функциями:

S = b - alnD (6 >D >0,5), (1)

где а и b - коэффициенты.

Зависимость доза-эффект для 48 ч после облучения описывалась аналогичной функцией в диапазоне от. 1 до 6 Гр (6 > D > 1,0).

Логарифмическая форма кривой «доза-эффекг», отражающей зависимость величины реагирования клеток от интенсивности воздействия, установлена для целого ряда биологических систем. Такой тип зависимости позволяет с высокой степенью точности оценивать биологические эффекты при действии агентов в низких дозах и вместе с тем обеспечивает анализ в достаточно большом диапазоне значений интенсивности. Установленная зависимость относится к гак называемым «функциям сжатия», в которых с возрастанием одной переменной (в данном случае дозы радиации) «шкала» другой (доли клеток в S-фазе) все более сжимается. Этот принцип давно известен в технике и широко применяется в измерительной аппаратуре.

Следует отметить, что в данном случае снижение относительного содержания клеток в фазе синтеза ДНК фактически отражает выраженность развития блока в стадиях G] и G2. Задержка в прохождении цикла к S-фазе и к митозу дает возможность завершиться процессам эгоиматической репарации ДНК и элиминировать клетки, имеющие несовместимые с жизнью макроорганизма повреждения генома [Murnane a. Schwartz, 1993; O'Connor et al., 1993]. Логарифмическая форма зависимости доза-эффект, по-нашему мнению, может свидетельствовать о наличии в аппарате регуляции клеточной пролиферации специальных механизмов, обеспечивающих такой тип реагирования.

Очевидно, что логарифмическая форма зависимости доза-эффекг весьма удобна для для оценки интенсивности воздейсшия но конечному эиологическому эффекту. Действительно, если преобразовать уравнешге (1), то г го можно представить в виде функциональной зависимости, обратной югарифмической - показательной (экспоненциальной) функции:

D = e(b-s)/a (6>D>05) (2)

Три помощи этой формулы, зная содержание клеток костного мозга в стадии :шгтеза ДНК, можно с определенной степенью достоверности рассчитать дозу эадиации, полученную организмом.

В настоящее время разработка тест-систем для биологической дозиметрии шляется весьма актуальной проблемой [Воробцова И.Е. и соавт., 1996; Viendelsohn, 1996]. Хорошо известно, что ионизирующее излучение повреждает диетические структуры. Поэтому, среди способов биодозиметрии наибольшее

значение приобрели цитогенетические методы анализа включая флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) с использованием специальных селекхивных ДНК-зондов, связанных с красителями [Moore а. Jensen, 1996]. Весьма перспективным направлением считается также гликофориновый тест [Anvinen et al., 1996], в основе которого лежит двойная метка эритроцитов МКА к гликофоринам М и N с выявлением аберрантных клеток (с фенотипом МО и N0). Этот подход реализуется исключительно благодаря возможностям проточной цитометрии, так как для его реализации необходим анализ исключительно большого числа клеток (порядка 107).

Установленные в результате настоящей работы функциональные зависимости типа доза-эффект можно рассматривать в качестве биологической тест-системы, позволяющей по доле клеток в S-фазе клеточного цикла устанавливать дозу радиационного воздействия (см. уравнение 2). Наблюдаемые изменения клеточного цикла имеют нестойкий характер, но они опережают по времени процессы постлучевой гибели миелокариоцитов, развиваются в ранние сроки после облучения и в этом смысле могут расцениваться в качестве «доклинических» лабораторных тестов.

Выявленные в настоящей работе закономерности нарушений клеточного цикла кроветворных клеток полагают наличие специальных регуляторных механизмов, обеспечивающих негативный контроль пролиферации клеток при воздействии цитотоксических факторов. При действии ионизирующего излучения пролиферирующие клетки в норме не приступают к синтезу ДНК и не переходят в митоз. Они блокируются в фазе Gi в R-точке или в фазе G2 в точке, которая подготавливает митоз к инициации [O'Connor a. Kohn, 1992]. Задержка в прохождении к S-фазе или к митозу в случае повреждений ДНК даст возможность репаративным ферментам восстановить структуру генома. Дефекты в любой из этих точек контроля приводят к повышению вероятности повреждения хромосом и могут быть причиной нестабильности генома, что имеег место в большинстве случаев раковых опухолей [Hartwell, 1992]. Блок в фазе Gi вызывается нормально функционирующим р53. Полагают, что белок р53 выполняет функцию «стража генома» [Kastan et al., 1991; Lane, 1992].

С точки зрешш гипотезы «стража генома» [Lane, 1992], роль белка р53 заключается в том, что он помогает клеткам до их вступления в S-фазу восстановить повреждения ДНК. Тем не менее нормальная функция р53 часто ассоциируется со скоростью пострадиационной гибели клеток [Kastan, 1993; Lee а. Bernstein, 1993; Murnane a. Schwartz, 1993]. Так, в исследовании эффектов радиации в отношении клеток лимфомы Беркитга большинство мутантных по р53 линий имело низкую радиочувствительность по сравнению с нормальными линиями [O'Connor et al., 1993]. Объяснение этого неожиданного феномена может заключаться в том, что белок р53 выполняет существенную роль в запрограммированной клеточной гибели или апоптозе [Kohn, 1994].

Опосредованный р53 ответ на повреждение ДНК зависит от типа клеток. Для гемопоэтических клеток характерна задержка в стадиях Gi и G2, которая приводит к снижению числа миелокариоцитов, синтезирующих ДНК, и

гострадиационной гибели клеточных элементов. Фибробласты более устойчивы с действию ионизирующей радиации и не в такой степени запрограммированы с алоптозу. Их реакция может ограничиваться блоком в стадии в) [К^ап, 1993]. Особенно склонны к гибели по типу апоптоза лимфоидные клетки. Тем те менее ассоциация между мутацией р53 и снижением радиочувствительности сарактерна для различных типов клеток.

В нашей работе при анализе действия на пролиферацию цитостатического цента 5-фторурацила были обнаружены различия в его эффектах по сравнению ; облучением организма ионизирующей радиацией. При ведении крысам этого щтостатика в дозах 30 мг/кг и более происходило резкое снижение пула тролиферирующих клеток (в стадиях Б и Ог+М). Кривая типа доза-эффект при этом имела ступенчатообразную форму. Период восстановления имел динамику, которая была весьма сходна с последствиями облучения животных и сарактеризовался повышением пролиферативной активности миелокариоцитов. Кроме того, нами было получено, что характер распределения клеток на ДНК-гистограммах в пределах Б-фазы позволяет выявлять эффект синхронизации тролиферирующих клеток костного мозга, который наблюдался при введении крысам 5-фторурацила в дозах, близких к терапевтическим (15 и 30 мг/кг).

Эти данные представляют интерес с точки зрения изучения подходов для эазработки режимов химиотерапии с использованием накопленных знаний о клеточном цикле нормальных и опухолевых клеток. Генеральная стратегия :водится к тому, чтобы обеспечить накопление злокачественных клеток в чувствительных к действию цитостатиков стадиях клеточного цикла при минимальном повреждении нормальных (главным образом гемопоэтических) клеток [Ко1ш, 1994].

Нами было получено, что анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином по параметрам клеточного цикла оптимизирует оценку реакции бластной трансформации (РБТЛ). Использование субоптимальных доз митогена в сочетании с применением ДНК-цитометрии дает возможность регистрировать как увеличение так и аптжение показателей пролиферации лимфоцитов, что повышает достоверность и информативность метода. Это делает его значимым лабораторным тестом, отражающим состояние клеточного иммунитета.

Хорошая воспроизводимость цитометрических параметров по сравнению с данными, получаемыми другими методами, в частности способом тамидиновой метки с жидкостным сцинтилляционным счетом, объясняется, вероятно, тем, что получаемые результаты имеют относительный характер и на их точность не влияют такие факторы, как исходное число клеток в культуре, удельная активность изотопа, эндогенный пул тимидина и тимидшприфосфата и т. д. [Котельников В.М., 1986, Рег1ш й а1., 1995]. Влияние этих факторов затрудняло до последнего времени введение каких-либо межлабораторных стандартов и нормативных показателей для РБТЛ.

Полученные в настоящей работе данные позволяют рекомендовать метод проточной ДНК-цитометрии к использованию в клинико-лабораторной

практике для оценки клеточного цикла кроветворных и опухолевых клеток при гематологических заболеваниях, химио- и радиотерапии, а также при различных поражениях организма, сопровождающихся нарушениями пролиферации.

ВЫВОДЫ

1. Параметры клеточного цикла ( Б, вг+М, Сш, БАХтг+М), Б+вг+М ) адекватно отражают интегральное состояние пролиферативной активности клеток костного мозга и в сочетании с миелограммой являются информативными показателями, характеризующими состояние гемопоэза. Цитометрический параметр Б/^г+М) рассматривается в качестве одного из важных тестов, позволяющих выявлять неэффективный гемопоэз.

2. Установлено, что показатели клеточного цикла миелокариоцитов у здоровых людей физиологически стабильны и отражают постоянство кроветворения. При лейкозах и при анемиях отмечается неустойчивость параметров пролиферации клеток, что приводит к нарушениям стабильности кроветворения и неэффективному гемопоэзу.

3. У пациентов с анемиями разной этиологии (пернициозная, аутоиммунная гемолитическая, апластическая анемии) отмечаются характерные для каждой нозологической формы особешюсти изменений клеточного цикла миелокариоцитов, что целесообразно использовать при дифференциальной диагностике этих заболеваний.

4. ДНК-цигометрия клеток костного мозга дает возможность наряду с оценкой клеточного цикла выявлять анеуплоидные клеточные клоны при гемобластозах, что, в ряде случаев, позволяет проследить за динамикой опухолевого роста и имеет важное значение для определения минимальной остаточной болезни в период ремиссии заболевания.

5. Эффекты ионизирующего облучения проявляются в снижении доли клеток в Б-стадии и в блоке Ог+М. С помощью проточно-цитометрического анализа клеточного цикла клеток костного мозга можно оценить степень радиационного воздействия как при общем, так и при локальном облучении.

6. Параметры, отражающие пролиферацию гемопоэтических клеток - доля миелокариоцитов в Б-стадии и Б/(С2+М), позволяют с высокой степенью достоверности устанавливать факт облучения в дозе от 1 до 4 Гр.

7. На основе реккурентного алгоритма классификации получены логические правила для оценки степени радиационного воздействия на организм по цитометрическим данным в сочетании с показателями миелограммы, которые информативны и являются перспективными для биологической дозиметрии.

8. Установлен логарифмический характер зависимости содержания клеток, синтезирующих ДНК, от дозы радиации в диапазоне 0,5 - 6 Гр через 1 сутки после облучения экспериментальных животных.

9. При введении крысам 5-фторурацила в дозах 30 мг/кг и более обнаружено резкое снижение пролиферирующего пула клеток костного мозга (в стадиях

S+G2+M). Кривая доза-эффекг имеет ступенчатообразную форму через сутки после воздействия.

10. Период восстановления костного мозга после действия радиации и 5-фторурацила имеет сходную динамику и характеризуется значительным (в 1,5 -2 раза по сравнению с нормой) повышением пула пролиферирующих клеток.

11. Проточно-цитометрический анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином в субоптамальных концентрациях объективизирует оценку реакции бластной трансформации, повышает достоверность метода и делает его значимым лабораторным тестом, отражающим состояние клеточного иммунитета (авторское свидетельство па изобретение № 289321).

12. Доказано, что метод проточной ДНК-цитометрии эффективен для использования в клипико-лабораторной практике для анализа пролиферативной активности гемопоэтических клеток и оценки опухолевого роста при гематологических заболеваниях, химио- и радиотерапии, а также токсико-радиационных поражениях организма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Исследование системы крови в клинической практике (под редакцией Г.И.Козшща и В.А.Макарова). М., «Триада-Х», 1997,480 с.

2. Ишков А.Г., Патрушев Л.М., Шмаров Д.А. Авторское свидетельство на изобретение № 289321. Госкомитет СССР по делам изобретений и открытий. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 1 февраля 1989 г.

3. Кобзев В.П., Тарабан В.И., Шмаров Д.А., Мельников П.П. Клиническая оценка метода проточно-цитофлуориметрического изучения клеток костного мозга. Тезисы докладов Y1I научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск». М., 1985, с.288-289.

4. Кравцова Т.Н., Шмаров Д.А. ДНК-цитометрия лимфоцитов периферической крови в краткосрочной культуре. Тезисы докладов II Всесоюзного симпозиума «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии». М„ 1991, с.106.

5. Никулин Б.А., Шмаров Д.А., Першин В.Н., Крехнов Б.В. Проточно-цитофлуориметрический анализ пролиферативной активности лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином. Лаб.дело, 1989, №4, с.34-38.

6. Першин В.Н., Шмаров Д А., Лапотников И.А. Юша А.Т. О проточной флуориметрии. Тезисы докладов научно-методической конференции врачей, посвященной юбилею Центрального военного госпиталя «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». М., 1983, с.93-94.

7. Шмаров Д.А., Кижаев Е.В., Козинец Г.И., Лапотников И.А., Сергеев Г.А., Першин В.Н., Забелин В.А. Проточная флуориметрия клеток костного мозга

при действии на организм ионизирующей радиации,- В кн.: Проблемы интенсивной терапии в клинике. М., 1985, с.268-269.

8. Шмаров Д.А., Першин В.Н., Лапотников И.А., Зубрихина Г.Н. Проточный цитофлуориметр на базе люминесцентного микроскопа. Лаб.дело, 1985, №9, с.562-565.

9. Шмаров Д.А., Лапотников И.А., Першин В.Н. Проточно-цитофлуориметрический анализ клеток костного мозга при цитотоксических воздействиях. Тезисы докладов YH научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы медицинского обеспечения войск». М., 1985, с.287-288.

10. Шмаров Д.А., Кижаев Е.В., Сергеев Г.А., Лапотников И.А. и др. Интегральная оценка пролиферативной активности клеток костного мозга после облучения и введения цитостатиков. Тезисы докладов научной конференции «Специализированная медицинская помощь и проблемы ее интеграции». М., 1986, с.365-367.

11. Шмаров Д.А., Сафронов В.В., Першин В.Н. Флуориметрическая приставка. Военно-мед. журнал, 1987, №11, с.66-67.

12. Шмаров Д.А., Сидоров В.И., Будник Е.В., Чичерина Т.А. Анализ хромосомных аберраций в лейкоцитах периферической крови у лиц, облученных ионизирующим излучением. Тез. докл. военно-научн. конф., посвящ. 70-летию Великого Октября «Актуальные вопросы человеческого фактора». М., 1988.

13. Шмаров Д.А., Крехнов Б.В., Попова О Н., Кучма Ю.М., Лепков C.B. Анализ распределения миелокариоцитов по содержанию ДНК и клеточный состав костного мозга. Тез. докл. II Всесоюзн. симп. «Теор. и прикл. аспекты молекулярной биологии». М., 1991. с.212.

14. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Попова О.Н., Белоусов Е.А., Щербаков Н.М. Проточная ДНК-цитометрия в диагностике острого лейкоза. Тез. докл. научн.-практ.конфер. «Возможн. и перспект. диагностики и лечения в клин, практике». М., 1992, с.300-308.

15. Шмаров ДА., Ламогкин И.А., Родионов А.Н., Розанов Ю.М., Попова О.Н. Проточная ДНК-цитометрия в диагностике и оценке динамики опухолевой прогрессии лимфом кожи. Тез. докл. научн.-практ.конфер. «Возможн. и перспект. диагностики и лечения в клин, практике». М., 1992, с.261-262.

16. Шмаров Д.А., Крехнов Б.В., Попова О.Н., Кучма Ю.М., Лепков C.B. Пролиферативная активность и клеточный состав костного мозга. Гематол. и трансфузиол., 1992, №7-8, с.6-9.

17. Шмаров Д.А., Кижаев Е.В., Крехнов Б.В. Показатели пролиферации клеток костного мозга в оценке состояния гемопоэза. В кн.: «Экология и кроветворение». М., 1992, с. 107-108.

18. Шмаров Д.А. Оценка пролиферативной активности клеток костного мозга методом проточной цитофлуориметрии. Клинич. лабораторная диагностика. 1993, №5, с.40-44.

19. Шмаров Д.Л., Першин В.Н. Параметры пролиферации клеток костного мозга при действии генотоксяческих агентов. Вестник РАМН, 1993, №3, с.8-12.

20. Шмаров Д.А., Кижаев Е.В., Сергеев Г.А., Крехнов Б.В. Параметры митотического цикла клеток костного мозга после облучения. Гематол. и трансфузиол., 1993, №5, с.21-24.

21. Шмаров Д А., Козинец Г.И. Закономерности клеточного цикла гемопоэтических клеток при действии ионизирующей радиации. Гематол. и трансфузиол., 1995, т.40, №6, с.25-29.

22. Шмаров Д.А., Кижаев Е.В., Крехнов Б.В. Пролиферативная активность и морфологический состав костного мозга человека после облучения. Медицинская радиология и радиационная безопасность, 1995, т.40, №6, с.3-7.

23. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Белоусов Е.А., Щербаков Н.М. Проточная цитометрия клеток костного мозга в определении ДНК-анеуплоидии при острых лейкозах. V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике. Тез.докл. М., 1995 с.318-319.

24. Шмаров Д.А., Магомедова А.У., Асцатуров И.А., Сарычева Т.Г. и др. Проточная цитометрия клеток костного мозга при миеломной болезни. Матер, научн.-практ. конф. «Клиническая лабораторная диагностика -состояние и перспективы». С,- Г1б., 1996, с. 161-162.

25. Шмаров Д.А., Туркина А.Г., Соколова М.А., Митерев Г.Ю. и др. Пролиферативная активность клеток костного мозга при хроническом миелолейкозе. Матер, научн.-практ. конф. «Клиническая лабораторная диагностика - состояние и перспективы». С - Г1б., 1996, с. 162-163.

26. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Митерев Г.Ю., Козинец Г.И. Проточная цитометрия в определении ДНК-анеуплоидии у больных острыми лейкозами, Терапевтический архив, 1996, т.68, №7, с.11-14.

27. Шмаров Д.А., Митерев Г.Ю., Балабуткин В.А., Козинец Г.И. Параметры клеточного цикла клеток костного мозга как показатель физиологического состояния кроветворения. Тез.докл. I Российского конгресса по патофизиологии. М., 1996, с. 101.

28. Шмаров Д.А., Никулин Б.А., Козинец Г.И. Пролиферативная активность лимфоцитов в культуре с фитогемагглютинином и показатели иммунитета при острых пневмониях. Клинич.лабораторная диагностика, 1997, №4, с. 3336.

29. Шмаров Д.А., Кучма ЮМ., Козинец Г.И. Изменения стабильности параметров клеточного цикла клеток костного мозга при гематологических заболеваниях. Терапевтический архив, 1997, №7, с.17-21.

30. Шмароп Д.А., Асцатуров ИА., Кучма Ю.М., Митерев Г.Ю., Козинец Г.И. Показатели клеточного цикла гемопоэтических клеток у больных хроническим лимфолейкозом. Клинич. лабораторная диагностика, 1997, №5, с.17-18.

31. Шмарои Д.А., Магомедова А.У., Сарычева Т.Г., Левина Т.Н., Козинец Г.И. Параметры клеточного цикла клеток костного мозга у больных