Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунологические лабораторные критерии в диагностике лимфаденопатий и гемобластозов у детей

На правах рукописи

ХАМАТДИНОВА ЗЕМФИРА РОБЕРТОВНА

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ КРИТЕРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ЛИМФАДЕНОПАТИЙ И ГЕМОБЛАСТОЗОВ

УДЕТЕЙ

14.03.09-Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 идр 2012

Уфа-2012

005014889

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Республиканская детская клиническая больница» Республики Башкортостан

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Хайруллина Раиса Масгутовна

доктор медицинских наук, профессор Зуева Екатерина Евгеньевна; доктор биологических наук, профессор Веселов Станислав Юрьевич; доктор биологических наук Шевчук Наталья Евгеньевна Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (г.С.-Петербург)

Защита состоится <о

2012 года в-^/^часов на заседа-

нии Объединенного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан « 012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Лукманова К.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Актуальность изучения иммунобиологических особенностей лимфопро-лиферативного синдрома у детей обусловлена, прежде всего, сложностью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных процессов на ранних стадиях. Этой проблеме посвящено немало отечественных и зарубежных работ [Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2007; Ковригина A.M., Пробатова H.A., 2007; Ioachim Н, Ratech Н., 2006]. В последнее десятилетие возросли возможности диагностики инфекционных заболеваний, стал более понятным спектр клинических проявлений таких инфекций как токсоплазмоз, ци-томегаловирусная инфекция, инфекционный мононуклеоз [Баранова И.П., 2002; Башмакова М.А., 2000].

Злокачественные процессы кроветворной и лимфоидной тканей являются одной из важнейших проблем современной медицины и методом, раскрывающим новые перспективы в понимании природы опухоли, ее возникновения, развития и прогрессирования является иммунофенотипирование [Луговская С.А., 2006]. Иммуновариант острого лейкоза, определяющий выбор тактики лечения больных, устанавливают на основании данных об экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов лимфоидных и миелоидных клеток [Дурнов Л.А., 2002; Луговская С.А., 2006]. Кроме того, необходимость оценки состояния функциональной активности и количественного содержания лимфоидных и миелоидных клеток разных типов обусловлена тем, что они избирательно подвергаются воздействию цитостатиков, что может влиять на результаты терапии. Сложно провести четкое разделение между острым лейкозом и лимфобластной лимфомой, так как по клинической картине эти заболевания довольно схожи, отсутствуют специфические лабораторные проявления и различия между ними иногда можно выявить только при изучении опухолевого субстрата. В связи с тем, что в настоящее время метод проточной цитометрии в клинической практике не является рутинным методом диагностики, возникает необходимость более подробного изучения лимфомы для выявления критериев

дифференциального диагноза [Воробьева А.И., 2002; Масчан А.А., 2006; Locks-ley R.M., 2001].

В основе процессов, протекающих как при доброкачественной лимфаде-нопатии так и при гемобластозах, лежит гиперплазия лимфоидной ткани, т.е. непосредственное вовлечение лимфоидных клеток в процесс пролиферации. Активно пролиферирующие клетки синтезируют ДНК и находятся в разных фазах (G1-, S-, G2- или М-фазе) клеточного цикла, т. е. представляют собой «фракцию роста» [Бычкова Н. В., 2004; Владимирская Е.Б., 1998]. При различных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке не всегда бывает диплоидным и может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения или увеличения. Последнее (гипердип-лоидия, триплоидия, тетраплоидия и т.д.) часто имеет место при злокачественном росте.

Проточная ДНК-цитометрия является одним из методов измерения плоид-ности бластных клеток позволяющим, кроме того, характеризовать кинетический профиль, что может варьировать в зависимости от интенсивности пролиферации [Muller H-J., 2000; Сатрапа D., 2002].

Прикладное значение ДНК-цитометрии при оценке пролиферативной активности лимфоидных клеток обусловлено быстротой исполнения, информативностью, точностью и надежностью метода. Он дает возможность выявлять патологические изменения на стадиях, когда число клеток, подвергшихся опухолевой трансформации, еще незначительно. Выявление в периферической крови клеток с высоким (гиперплоидным) содержанием ДНК может быть связано только с появлением пролиферирующих клеток и говорит о наличии патологии в этой системе [Новик А.А., 2001; Потапнев М.П., 2003; Хисамова Н.Ф., 2005]. Пролиферативная активность отражает индивидуальные свойства опухоли, ее определение необходимо не только для биологической характеристики, но и для определения прогноза заболевания [Мазурик В.К., 2001; Бычкова Н.В., 2004]. Наряду с этим существует мнение о том, что прогностическое значение

плоидности опухолевых клеток вторично и отражает лишь воздействие внешних по отношению к опухоли факторов [Pinto А.,1999; Chassevent А., 2001].

В практической медицине, как правило, в большинстве случаев опухолевые процессы изучаются при развитых клинических проявлениях. Злокачественные новообразования приводят к увеличению лимфатических узлов уже на ранних стадиях заболевания, но принимаются за воспалительную лимфадено-патию, так как клиническая картина еще не ясна и лабораторные данные неспецифичны [Дурнов JI. А., и др., 2002]. Существующие в настоящее время комплексы исследования заболеваний, сопровождающихся гиперплазией лимфо-идной ткани, не содержат дифференциально-диагностических тестов, которые могут быть использованы в качестве объективных критериев [Колыгин Б.А.,1990; Динова Е.А.,2007]. Особенно это касается спорных клинических случаев, когда необходима своевременная биопсия лимфатического узла. Это ведет к выбору широким кругом врачей наблюдательной тактики, назначению неадекватной а, следовательно, неэффективной терапии.

Особую значимость при формировании подходов к дифференциальной диагностике доброкачественного и злокачественного лимфопролиферативного синдрома у детей имеет изучение взаимосвязей между иммунобилогическими показателями и функциональными характеристиками клеток. В литературе отсутствуют данные о комплексных исследованиях по изучению иммунологических характеристик клеток и пролиферативной активности. Современный про-точно-цитометрический анализ дает возможность с высокой степенью достоверности проводить диагностику, осуществлять мониторинг и прогнозировать течение процесса. Весьма актуальной проблемой, в связи с этим, является разработка на основе проточной цитометрии принципов дифференциальной диагностики доброкачественного лимфо-пролиферативного синдрома и гемобласто-зов, в частности лимфом и острых лейкозов.

Цель исследования

Разработать иммунобиологические лабораторные критерии для дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий и гемобластозов у

детей на основании иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии периферической крови, костного мозга и биоптатов.

Задачи исследования

1 Оценить иммунобиологические особенности лимфаденопатий у детей на основании показателей общегематологических, иммунологических, имму-ноферментных методов исследований.

2 Охарактеризовать плоидность и кинетику клеточного цикла периферической крови и биоптатов при лимфаденопатиях.

3 Определить плоидность и кинетику клеточного цикла клеток костного мозга и периферической крови методом проточной ДНК-цитометрии при им-мунофенотипировании острых лейкозов у детей.

4 Проанализировать характер распределения иммуногенетических признаков в зависимости от плоидности клеток при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников на основании диагностического НЬА - типи-рования.

5 Провести лабораторный мониторинг эффективности полихимиотерапии с использованием методов проточной цитометрии при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников.

6 Провести сравнительный анализ показателей иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии костного мозга, биоптатов и периферической крови при остром лимфобластном лейкозе и лимфомах у детей.

7 Разработать алгоритм лабораторного обследования больных на основе показателей иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии периферической крови для дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий, лимфом и острых лимфобластных лейкозов.

8 Разработать диагностическую компьютерную программу на основе нейронных сетей и результатов иммунофенотипирования острых лимфобластных лейкозов у детей Республиканской детской клинической больницы за период 2002-2010гг.

Научная новизна исследования

Впервые на основе проточной цитофлюориметрии клеток костного мозга, биопсийного материала и периферической крови определены иммунобиологические лабораторные критерии доброкачественных лимфаденопатий и гемобла-стозов у детей: доброкачественные лимфаденопатии, острые лейкозы и лимфо-мы характеризуются однонаправленными иммунопатологическими реакциями в виде снижения количества естественных киллерных клеток (С016+56+) и В-лимфоцитоза в периферической крови. Выявлены различия в показателе экспрессии маркера ранней активации СБ25+: высокий уровень при острых лим-фобластных лейкозах (18%) и лимфомах (28%) и низкий при лимфаденопатиях (7,5%). Впервые установлены дифференциально-диагностические маркеры не-ходжкинских лимфом. В отличие от лимфобластного лейкоза из клеток предшественников опухолевые клетки при лимфомах характеризуются высокой интенсивностью экспрессии цитоплазматического и мембранного анеупло-идный клон характеризуется отсутствием пролиферации. По результатам диагностического НЬА-типирования установлена генетическая детерминированность возникновения анеуплоидного клона в костном мозге при остром лим-фобластном лейкозе из В-клеток предшественников.

Впервые обосновано значение плоидности и кинетики клеточного цикла в дифференциальной диагностике доброкачественных лимфаденопатий и гемо-бластозов у детей. Доброкачественные лимфаденопатии у детей характеризуются диплоидным типом гистограмм и высокой пролиферативной активностью лимфоидных клеток периферической крови по сравнению с контрольной группой. Маркерами пре-В острого лимфобластного лейкоза являются анеуплоидия бластных клеток костного мозга и высокая интенсивность экспрессии цитоплазматического Властные клетки костного мозга при В-2 остром лим-фобластном лейкозе характеризуются диплоидным набором хромосом и экспрессией антигена ранних предшественников С034т. Гематологическая ремиссия при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников характеризуется исчезновением анеуплоидного клона бластных клеток в костном

мозге и периферической крови. Высокий уровень клеток в фазе пролиферации (Б = 0,4-3,0 %) и появление анеуплоидного клона в периферической крови являются маркерами злокачественности процесса.

Практическая значимость работы

Показано диагностическое и прогностическое значение определения пло-идности и кинетики клеточного цикла периферической крови и биопсийного материала у детей с синдромом увеличенных лимфатических узлов.

Выявление методом ДНК-цитометрии анеуплоидного клона в костном мозге и периферической крови, является отражением опухолевой трансформации при гемобластозах. Определен иммунофенотипический профиль анеупло-идных бластных клеток костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В - клеток предшественников. В ходе сравнительного анализа установлено, что В2 - лимфобластный лейкоз характеризуется диплоидным типом гистограмм, ВЗ - анеуплоидным. Определено прогностическое значение индекса анеупло-идных клеток при ВЗ- остром лимфобластном лейкозе: благоприятным является ДНК> 1.16, так как для этих больных характерна большая продолжительность ремиссии.

При мониторинге полихимиотерапии установлено, что восстановление кроветворения при полной гематологической ремиссии сопровождается исчезновением анеуплоидного клона как в костном мозге, так и в периферической крови, а также повышением пролиферативной активности и экспрессии маркера готовности клеток к апоптозу (СБ95+).

Предложен алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролифера-тивного синдрома у детей, позволяющий сократить сроки обследования пациентов с лимфаденопатиями различного генеза и определить на ранних сроках заболевания показания к проведению биопсии лимфатического узла с целью морфологической верификации.

Разработанная компьютерная программа на основании результатов имму-нофенотипирования бластных клеток костного мозга позволяет упростить про-

цесс постановки диагноза у больных с острым лимфобластным лейкозом из клеток предшественников.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертационного исследования внедрены в клиническую практику лечебных и лабораторных подразделений ГБУЗ «Республиканская детская клиническая больница» (РДКБ), используются в учебно-педагогическом процессе на кафедрах лабораторной диагностики Института последипломного образования, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО БГМУ МЗ и СР РФ).

Основные результаты работы, касающиеся ДНК-цитометрии периферической крови, представлены в учебных пособиях: «Области применения ДНК-цитометрии периферической крови в педиатрической практике» (Уфа, 2010), «Диагностическое НЬА-типирование в педиатрической практике» (Уфа, 2010).

Положения, выносимые на защиту

1 При лимфаденопатиях, острых лейкозах и лимфомах методом иммуно-фенотипирования установлены однонаправленные иммунопатологические реакции в виде депрессии естественной киллерной цитотоксичности, В-лимфоцитоза, изменений маркера ранней активации СБ25+: высокий уровень экспрессии при гемобластозах и низкий - при доброкачественных лимфаденопатиях.

2 ДНК-гистограммы периферической крови при доброкачественных лимфаденопатиях характеризуются диплоидным набором хромосом и пролифера-тивной активностью превышающей показатели контрольной группы. При гемобластозах выявляются как диплоидный, так анеуплоидный клоны клеток периферической крови. Кинетика клеточного цикла при лимфомах/лейкозах с экспансией злокачественных клеток в системный кровоток отличается высокой

пролиферативной активностью; при отсутствии вовлеченности периферической крови в патологический процесс установлена низкая пролиферация клеток.

3 Выявление анеуплоидных бластных клеток костного мозга методом ДНК-цитометрии является дополнительным критерием при верификации вариантов острого лимфобластного лейкоза из В-клеток предшественников.

4 Иммунобиологическими критериями достижения гематологической ремиссии при лабораторном мониторинге эффективности полихимиотерапии при остром лимфобластном лейкозе наряду с иммунофенотипированием являются показатели ДНК-цитометрии костного мозга и периферической крови.

5 Показатели ДНК-цитометрии периферической крови: анеуплоидия и высокий показатель пролиферативной активности (S-фаза клеточного цикла) являются одними из показаний для проведения в ранние сроки биопсии лимфатического узла при лимфопролиферативном синдроме.

6 Наличие цитоплазматических и мембранных IgM+, низкая пролифера-тивная активность анеуплоидных клеток характеризует клеточный состав не-ходжкинских лимфом удетей.

7 Разработанный алгоритм лабораторной диагностики на основе показателей периферической крови позволяет проводить дифференциальную диагностику доброкачественного лимфопролиферативного синдрома и гемобластозов у детей на ранних стадиях опухолевого процесса.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов: Всеросийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты оказания стационарной медицинской помощи детям, новые технологии специализированной медицинской помощи» (Уфа, 2007); на рабочем совещании по проточной цитометрии "BD FACS Users Meeting" (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2010); на XIV конгрессе педиатров России с международным участием (Моск-

ва, 2010); Всеросийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2011).

Диссертация доложена и обсуждена на совместном заседании кафедр лабораторной диагностики ИПО, факультетской терапии, кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, оториноларингологии, фундаментальной и прикладной микробиологии, ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития (протокол № 9 от «10» сентября 2011 г.).

Диссертация апробирована на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (протокол № 10 от «14» октября 2011г.).

Публикации

По теме исследования в печати опубликовано 23 научные работы, в том числе 15 в журналах, включенных в перечень рецензируемых и рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук, 1 монография, методическое руководство, свидетельство о государственной регистрации программы № 2010615112 от 9.08.2010 г. Новизна исследования подтверждена патентом РФ №2416795 от 27.01.2010.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 189 страницах компьютерного текста, содержит 36 таблиц и 37 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (6 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 294 источника, в том числе 143 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Основу работы составили результаты комплексного клинико-иммунологического лабораторного обследования 300 детей с лимфаденопатия-ми и гемобластозами, находившихся на стационарном лечении и амбулаторном обследовании в ГБУЗ РДКБ Республики Башкортостан.

В процессе работы на базе лаборатории иммунологии с отделением клинической иммунологии РДКБ было обследовано: 156 детей с доброкачественными лимфаденопатиями в возрасте от 1 года до 10 лет.

С впервые установленным диагнозом острый лейкоз в исследование было включено 111 больных:

, острый лимфобластный лейкоз из клеток предшественников (ОЛЛ) 95 детей, в возрасте от 2 месяцев до 11 лет (медиана 4,5 года), распределение по полу: 43 мальчика и 46 девочек. Все дети получали программную полихимиотерапию по протоколам АЬЬ-ВРМ-90, А1Х-МВ-91 и А1Х-МВ-2002;

острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) 16 человек (9 мальчиков и 7 девочек) в возрасте от 13 месяцев до 13,5 года (медиана 10,5 года). С впервые установленным диагнозом - лимфома 33 пациента: В-клеточные лимфомы (п=21) возраст обследованных от 5 до 12 лет (медиана - 7), распределение по полу: 18 мальчиков и 3 девочки;

Т-клеточные лимфомы (п=12) в возрасте от 3 до 11 лет (медиана - 9) из них 7 мальчиков и 5 девочек.

Комплекс лабораторных исследований включал: ДНК-цитометрию и им-мунофенотипирование методом проточной цитометрии; определение аллелей антигенов 1-го класса главного комплекса гистосовместимости (НЬА-1); определение в сыворотке крови иммуноглобулинов классов А, М, в; определение специфических антител к герпес - вирусам.

ДНК-цитометрия клеток периферической крови, костного мозга и био-псийного материала с изучением плоидности и кинетики клеточного цикла методом проточной ДНК-цитометрии, основана на связывании ДНК с флуорес-

центным зондом пропидиума йодидом, который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла (G0/G1, S и G2+M). Образцы (не менее 20 ООО клеток) анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit. Иммунофенотипирование клеток периферической крови, костного мозга и биопсийного материала проводили с использованием моноклональных антител фирмы Becton Dickinson (США).

Определение аллелей антигенов 1-го класса главного комплекса гистосов-местимости (HLA-I, локусы А и В) проводили с помощью реакции комплемент - зависимой клеточной цитотоксичности по методу Терасаки с ипользованием наборов реагентов фирмы ГИСАНС (С.-Петербург) на базе лаборатории отделения трансплантации ГБУЗ РДКБ.

Определение иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини [Имельбаева Э.А. и др., 2004]. Специфические антитела к герпес - вирусам выявляли методом иммуноферментного анализа с применением тест систем Вектор-Бест на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Лазурит» (США).

Полученные результаты сравнивались с группой сопоставления, объединяющей 30 детей, показатели здоровья которых отвечали следующим требованиям: отсутствие жалоб на нарушения состояния здоровья в момент осмотра; эпизоды вирусных заболеваний не более 4 раз в течение года; отсутствие признаков аллергии и другой хронической патологии [Хайруллина P.M., 1999; Хи-самова Н.Ф., 2009].

У детей группы сопоставления по сравнению с показателями нормы по РФ (табл.1) установлено снижение уровня эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, СОЭ и достоверное увеличение уровня лимфоцитов в крови [Луговская С.А., Морозова В.Т., 2006].

Таблица 1 - Гематологические показатели у практически здоровых детей в сравнении со значениями нормы [Луговская С.А., Морозова В.Т., 2006]

Показатели периферической крови Группа сопоставления М ± ш (п=30) Средние показатели нормы, М±ш

Эритроциты (х10|2/л) 4,13 ± 0,06* 4,40 ±0,04

Гемоглобин (г/л) 121,0 ± 3,18 127,0 ±1,70

Тромбоциты (х 109/л) 243,0 ± 12,14* 275,0 ±2,24

СОЭ (мм/ч) 4,85 ±0,73* 8,00 ±0,30

Лейкоциты (х 109/л) 5,97 ±0,25* 7,0 ±0,15

Эозинофилы (%) 2,38 ±0,40 3,0 ±0,20

Нейтроф.сешент. (%) 48,46 ±2,04 47,50 ± 1,25

Лимфоциты (%) 43,15 ±2,03* 37,0± 0,80

Моноциты (%) 5,08 ±0,59 6,0± 0,30

*Различие статистически значимо (р<0,05)

Клеточное звено иммунитета у детей группы сопоставления характеризовалось: высоким уровнем эффекторных клеток СБ8+ (цитотоксических лимфоцитов), СБ16+56+ (естественных киллеров), СБ19+ (В-лимфоцитов), а также повышенным уровнем маркёра ранней активации (С025+). При сравнительной оценке гуморального звена иммунитета выявлено незначительное снижение уровня иммуноглобулина в (1£ в) (рис.1).

В группе сопоставления на основании анализа результатов ДНК-цитометрии клеток периферической крови установлено, что в норме показатели клеточного цикла варьируют в сравнительно узких пределах и характеризуются высокой стабильностью. В 100% случаев выявлялся диплоидный тип гистограмм, причём основная масса клеток (99,86±0,02%) находилась в вОЛ-фазе клеточного цикла. Доля клеток в стадии синтеза ДНК (Б-фаза) составляла

0,1 ±0,01%, в фазе 02-М - 0,04±0,01 %. Коэффициент вариации пика й0/1 составил 2,48 ± 0,09 % , что отражает достоверность полученных данных (табл.2).

Комп

С016

+

СО 19

СБ4/СВ8

4-

СБ 25

.+ НЬА-ОВГ

Рисунок 1- Иммунологические показатели практически здоровых детей

Таблица 2 - Распределение клеток периферической крови по плоидности и фазам клеточного цикла у детей группы сопоставления (п=30)

Фазы клеточного цикла

Плоид- вОЛ-фаза 02-фаза Б-фаза СУ%

ность клет.цикла клет.цикла клет.цикла

клеток

99,89 0,02 0,10 2,56

100 (99,83-99,91) (0,0-0,04) (0,09-0,12) (2,20-2,85)

Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде (^тскэууэ-ХР» с использованием современных пакетов прикладных программ «БТАШТССА 6.0». Для показателей, имеющих нормальное

распределение признака, вычислялись среднее арифметическое значение (М) и

15

стандартная ошибка среднего значения (ш). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялись медиана и интерквартильный размах (25 - 75 перцентилей). Достоверность различий оценивалась по критерию Манна-Уитни. Корреляционный анализ выполнялся по методу Спирмена с определением коэффициента ранговой корреляции (rs). Значения р<0,05 приняты статистически значимыми [ГланцС., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иммунологическая реактивность и показатели ДНК-цитометрии клеток периферической крови у детей с лимфаденопатиями

Увеличение лимфатических узлов (ЛУ), вызываемое различными причинами, является наиболее частым патологическим состоянием, с которым сталкивается педиатр общей практики [Moor SW.et al., Okolo S.N. et al., 2003; Баш-кина О.А. и др., 2004]. Необходимостью изучения особенностей иммунологической реактивности больных с лимфаденопатиями определяется как высокой распространенностью данной патологии, так и сложностью диагностики и зачастую невозможностью определения этиологического фактора.

По данным первичной обращаемости к врачу - иммунологу поликлиники ГБУЗ РДКБ ежегодно отмечается рост числа пациентов с лимфаденопатиями (ЛАП) - манифестным проявлением гиперплазии лимфоидной ткани. В структуре заболеваемости ЛАП занимают третье место после болезней респираторного тракта и аллергической патологии и составляют в среднем 5,9%.

Нами проведено обследование 156 детей с синдромом увеличенных лимфатических узлов из группы часто болеющих. Возраст пациентов составил от 1 года до 10 лет.

В ходе работы применен комплекс лабораторных исследований, включающий общий анализ крови, иммунологические исследования, иммунофено-типирование методом проточной цитометрии.

При анализе показателей гемоцитограммы у больных с ЛАП установлены лейкоцитоз (8,90х109/л), увеличение СОЭ (6,5мм/ч) и низкий уровень гемоглобина (103,5 г/л) (табл.3).

Таблица 3 - Показатели периферической крови у детей с лимфадено-

патиями

Показатели крови Лимфаденопатии (п= 156), Ме Группа сопоставления (п=30), Ме

Эритроциты(х 1017л) 4,0(3,6-4,8) 4,1 (4,0-4,2)

Гемоглобин (г/л) 103,5**(98,0-110,0) 122,0(114,0-127,0)

СОЭ (мм/ч) 6,5*(5,0-17,0) 4,0(3,0-7,0)

Лейкоциты (х107л) 8,9* *(7,5-10,8) 5,8 (5,3-6,6)

Нейтрофилы (%) 39,0(33,0-52,0) 48,0 (45,0-54,0)

Лимфоциты (%) 54.0 (44,0-60,0) 43,0 (38,0-48,0)

Различие с контролем статистически значимо: * - р<0,05; ** - р<0,01

Особенности иммунологического реагирования, по сравнению с группой сопоставления, характеризовались достоверным снижением маркера ранней активности СБ25+, подавлением киллерной активности (С016+56+)и уровня А на фоне В-лимфоцитоза (С019+) (рис.2).

% а гр.сопост г ПАП ...........-

70 тц_|... ........

Ы)

50 4 I -

40 30 20 10 ?: : -И'1- Г Г"*""! -I« ', 4 — | --—-—■■ - _- 1 1 ) • г-'т Р'-Т-Я.....- 1 ; Я , 41 гСЬ

и СОЗ Ш4 ССВ С019 С016 НАО? С095 СП25

Рисунок 2 - Иммунологические показатели периферической крови у детей с лимфаденопатиями

В связи с тем, что лимфаденопатия является клиническим проявлением пролиферации лимфоидной ткани, чрезвычайно актуальным является поиск новых методов оценки пролиферативной активности клеток. В нашей работе впервые для этих целей были использованы такие новейшие технологии как ДНК-цитометрия клеток периферической крови.

По результатам проведенных исследований, так же как и в группе сопоставления, гистограммы характеризовались диплоидным типом (табл.4), но при этом отмечалась более высокая пролиферативная активность клеток (Б- фаза клеточного цикла 0,16%) (р<0,05).

Таблица 4 - Распределение клеток периферической крови у детей с лимфа-денопатиями по плоидности и фазам клеточного цикла

Плоидность, фазы клеточного цикла Число клеток, Ме (%)

Дети с лимфаденопатиями (п= 156) Группа сопоставления (п= 30)

Диплоидные 100 100

G0/1 99,71*(99,58-99,85) 99,89(99,83-99,90)

G2 0,08(0,01-0,13) 0,02(0,0-0,04)

S 0,16*(0,10-0,26) 0,10(0,09-0,11)

CV 2,92**(2,65-3,69) 2,57(2,29-2,83)

Различие с контролем статистически значимо: * - р<0,05; ** - р<0,01

Большое значение в формировании синдрома увеличенных лимфатических узлов имеют герпес - вирусные инфекции, резистентные к терапии, с затяжным, хроническим течением [Ведь В.В., 2005; Терегулова Л.М., 2006]. Для определения фоновой инфицированности у детей с лимфаденопатиями проводились исследования на иммуноферментном анализаторе с определением уровней в сыворотке крови иммуноглобулинов классов G и М к цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ), вирусу простого герпеса 1,2 типов (ВПГ), вирусу Эпштейна-Барр (рис.3).

f

%

<ю 20

|влап агонтр. |

Рисунок 3 - Выявляемость специфических антител (1б в, %) к герпес-вирусам у детей с лимфаденопатиями

По результатам исследований у детей с ЛАП, в 96 % случаев определялся диагностически значимый уровень ^ в к ЦМВ (табл.5). При изучении других возбудителей (вирус Эпштейна-Барр и ВПГ 1,2-го типов) достоверной разницы в уровне фоновой инфицированное™ в исследуемых группах не выявлено. Специфические антитела ^ М у обследуемых отсутствовали.

Таблица 5 - Уровень специфических антител (Ig G) к цитомегаловирусной инфекции у детей с лимфаденопатиями

Антитела к ЦМВ (1вО) Дети с лимфаденопатиями (п=156) Группа сопоставления (п=30)

Абс. (Чел) Отн. (%) Абс. (Чел) Отн. (%)

Отсутствие антител 6 3,8 10 33,0

Средний уровень антител (превышение ОП крит. в 3-5раз) 90 58,2 15 50,0

Высокий уровень антител (превышение ОП крит. в 6 раз и более) 60 38,0 5 17,0

В настоящее время ЦМВ рассматривается как инфекционная болезнь иммунной системы, при которой длительная персистенция вируса сопровождается 1 инфицированием всех иммунокомпетентных клеток [Воробьев А.А., 2006; Яри-лин А А 2006; Chen W., 2003]. Выявленные особенности иммунологической

реактивности у детей с доброкачественной ЛАП, по нашему мнению, характеризуют функциональную недостаточность системы иммунитета.

В целях дифференциальной диагностики и строго по клиническим показаниям детям, находившимся на обследовании в ГБУЗ РДКБ, проведена биопсия лимфатических узлов с последующим исследованием биоптатов на проточном цитофлюориметре. При идентичной клинической картине выявлено два варианта иммунологических реакций: преобладание Т-клеточного звена (рис.4) и одинаковый уровень активности Т- и В-клеточного иммунитета (рис.5). Как в первом, так и во втором варианте отмечался высокий уровень клеток с маркерами С07+ СВ2+ (Т-лимфоциты) и НЬЛ-БК" (В-клетки и активированные Т-лимфоциты).

1дМ+ КА-ОК СОЗ Ш5 ОТ ССИ С07 С02

Рисунок 4 - Т-клеточный вариант иммунологических реакций у детей с лимфаденопатиями

Рисунок 5 - Т- В- клеточный вариант иммунного ответа у детей с лимфаденопатиями

Наряду с иммунофенотипированием, нами была проведена ДНК-цитометрия клеток биоптатов лимфатических узлов у детей с лимфаденопатия-ми. По результатам исследования клетки лимфоидной ткани имели диплоидный набор хромосом (100,0%) с высокой пролиферативной активностью: 6,09% клеток находились в 02-фазе клеточного цикла (фаза пролиферации), 93,91 % - в 00/1-фазе, в Б-фазе 0 % (рис. 6).

ж ||| **

1

"'''<*> с-,'« .к-.е.1« : Г А - Г»Цг-Л.,

Шг::

А&Ш

Рисунок 6 - ДНК-гистограмма клеток лимфоидной ткани больного с лимфаденопатией

По нашему мнению сопряженность общего количества лимфоцитов с маркером готовности клеток к апоптозу (С095+) и фазами пролиферации (Б- и 02), характеризует нарушения в системе апоптоза и высокую пролиферативную активность.

Таким образом, использование проточной цитометрии при обследовании детей с лимфаденопатиями позволило установить наряду с известными маркерами активности процесса - повышением СОЭ, лейкоцитозом, ряд принципиально новых положений: иммунопатологические реакции при доброкачественной гиперплазии лимфоидной ткани проявляются депрессией естественной киллерной цитотоксичности, В-лимфоцитозом и снижением маркера активации СБ25+ в крови. Лабораторными маркерами пролиферативной активности лимфоидной ткани являются: изменение кинетики клеточного цикла в виде высо-

кого уровня Б-фазы и сопряженность лимфоцитов периферической крови с фазой пролиферации 02 и маркером готовности клеток к апоптозу С095+.

Корреляционным анализом у больных с ЛАП установлены различные типы межклеточной кооперации между гематологическими показателями и маркерами пролиферации клеток периферической крови (рис.7).

-0,605 0,608

<—

- Обратные связи

— Прямые связи

Рисунок 7 - Взаимосвязи между гематологическими показателями и. данными ДНК-цитометрии при лимфаденопатиях

Результаты клинико-иммунологического исследования костного мозга и периферической крови у детей с острыми лейкозами

Злокачественные новообразования у детей в последние годы стали одной из важнейших проблем педиатрии. Достаточно отметить, что смертность от рака в развитых странах занимает второе место в структуре детской смертности [Аксель Е.М. 2002]. В Республике Башкортостан заболеваемость острыми лейкозами составляет в среднем 3,3 на 100000 детского населения. При подозрении на онкопатологшо, пациенты поступают в ГБУЗ РДКБ г.Уфы, где проходят обследование и лечение.

При диагностике гемобластозов нами был применен комплекс лабораторных методов, впервые апробированный при ЛАП, включающий иммунофено-типирование, определение плоидности и кинетики клеточного цикла.

Всего было обследовано 111 детей с впервые установленным диагнозом острый лейкоз (рис. 8).

ОМЛ

Т-ОЛЛ А^ЧММ

fi^ggЩ €

И ^^р^волл

- 79%

Рисунок 8 - Структура заболеваемости детей острым лейкозом

На основании результатов иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга самую многочисленную группу составили дети с острым лимфоб-ластным лейкозом из В-клеток предшественников.

Диагноз острый лимфобластный лейкоз из Т-клеток предшественников был выставлен в 6,0 % случаях, при этом Т-1 ОЛЛ-1случай, Т-2 ОЛЛ 2 случая, у 3-их пациентов установлен Т-3 ОЛЛ. Всем больным, наряду с иммунофено-типированием проведена ДНК-цитометрия костного мозга. В 5 случаях бласт-ные клетки были диплоидны и характеризовались высокой пролиферативной активностью: фаза 02 составляла в среднем 0,70 %, Б фаза - 10,70 %. В 1 случае I была выявлена анеуплоидия клеток костного мозга с высокой пролиферативной активностью (число клеток в Б-фазе 29,8 %). Из-за малочисленности группы не представлялось возможным проведение статистической обработки.

Острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) был диагностирован у 15,0 % обследованных на основании результатов морфологического, цитохимического и иммунологического исследования опухолевых клеток костного мозга. Были выявлены следующие варианты ОМЛ: ОМЛ-1 в 37,5%; ОМЛ-2 и ОМЛ-4 в 25,0 %, и ОМЛ-О -12,50 % случаев. По данным ДНК-цитометрии в 100% случаев

бластные клетки характеризовались диплоидным типом гистограмм с высокой степенью пролиферации (в Б-фазе находилось 11,50% клеток).

Как было отмечено, самую многочисленную группу составили дети в возрасте от 0 до 5 лет с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников.

Согласно современным представлениям, на иммунологические особенности опухолевой клетки оказывают влияние перестройки в геноме и отражением таких нарушений являются показатели плоидности и кинетики клеточного цикла. В связи с этим, изучение пролиферативной активности приобретает диагностическое и прогностической значение.

В зависимости от плоидности клеток костного мозга пациенты с диагнозом В-ОЛЛ были распределены на подгруппы: в первой подгруппе гистограммы характеризовались диплоидным типом (78 человек), во второй подгруппе (11 случаев) была выявлена анеуплоидия костного мозга: 30,54 % клеток были диплоидными, 62,28 % - анеуплоидными (табл.6).

Таблица 6 - Распределение клеток костного мозга у детей с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников по плоидности и фазам клеточного цикла

Плоидность, фазы клеточного цикла Число клеток, Ме (%) Р

ОЛЛ (дипл) (п= 78) ОЛЛ (анеупл) (п= 11)

Диплоидные 100,0 30,54 (16,99-61,76) 0,00

<30/1 89,94(85,34-4,45) 99,73 (98,12-100,0) 0,00

в2 0,67(0,22-1,81) 0,23 (0,0-1,88) 0,89

Б 7,85(4,33-12,60) 0,0(0,0) 0,0

СУ 3,0(2,68-3,90) 3,59 (2,68-4,57) 0,83

анеуплоидные 0,0 62,28 (22,88-83,01) 0,0

<30/1 0,0 85,36 (70,21-93,17) 0,0

в2 0,0 0,33 (0,0-0,81) 0,0

8 0,0 6,72 (2,90-19,73) 0,0

При изучении кинетики клеточного цикла установлено, что основная масса клеток костного мозга как при диплоидном, так и при анеуплоидном наборе хромосом находилась в С}0/1-фазе клеточного цикла. Пролиферативная активность оценивалась по Б- и 02-фазам клеточного цикла: в первой подгруппе Б-фаза составила 7,85 %, 02 фаза - 0,67 %, во второй подгруппе - Б фаза - 6,72 %, 02 фаза - 0,33 %.

При проведении иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга у больных выявлена экспрессия В-клеточных маркеров (суКЮ79а+, С019+, СБ22+, СОЮ+, су! 1ЕМ+, НТ.А-ОБГ, СБ34*). Антиген СБ 19' чаще отмечался в подгруппе с диплоидным типом гистограмм, частота встречаемости с^ ^М* была более высокой в подгруппе с анеуплоидией (рис.9).

вдиплоид

Ванеупл

бластыС079а+ С019+- СШ> С022 СОЮ Щ Н1АСН С034 С096

|дМ+

Рисунок 9 - Показатели иммунофенотипирования клеток костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников

Корреляционный анализ показателей иммунофенотипирования при В-ОЛЛ выявил множество прямых и обратных связей. Как для подгруппы с диплоидным, так и с анеуплоидным типом гистограмм, выявлены общие взаимосвязи между линейно-ассоциированными и линейно-неограниченными антигенами СЭ19+ - С034+(0,694), СБ19+ - НЬАЛЖ+ (0,621), С022+ - С034+(0,755), СО!(Г-СБ22+(0,671). Различия касались связей бластных клеток с фазами клеточного цикла: в подгруппе с диплоидией установлена высокая сопряженность стволовых клеток с фазой пролиферации 02 (СБ34+ - 02), в группе с анеуплоидией

выявлена корреляция с более зрелыми бластами - с>11§М+ (02 - суг ^М4). Этот

25

факт имеет дифференциально-диагностическое значение при постановке диагноза ВЗ-ОЛЛ (рис.10, 11).

Рисунок 10 - Корреляции между показателями иммунофено-типирования и ДНК-цитометрии клеток костного мозга у детей с острым лимфобластным лейкозом в подгруппе с диплоидным типом гистограмм

Необходимым условием при изучении анеуплоидного клона опухолевых клеток является определение индекса плоидности, представляющего собой соотношение между уровнем ДНК в лейкозных клетках к содержанию ДНК в диплоидных (нормальных). Согласно данным литературы [Chassevent А., 2001] прогностически благоприятными являются значения индекса ДНК> 1,16, при которых у пациентов наблюдается более длительная ремиссия (>5лет). При менее выраженной гиперплоидности бластов (индекс ДНК в диапозоне от 1,10 до 1,16) - прогноз неблагоприятный. В наших исследованиях в 27% случаев при анеуплоидии показатель индекса плоидности был <1,16, и на фоне проводимой терапии аплазия кроветворения сопровождалась септическим процессом.

Методом корреляционного анализа было выявлено, что высокие показатели индекса плоидности клеток сопряжены с уменьшением количества бластов,

несущих маркеры СБ34+ и С019+(рис.11). Как известно, антиген СБ34 -это маркер стволовой клетки, широко представленный на гемопоэтических предшественниках всех линий. Выраженность экспрессии СБ34+ антигена постепенно снижается по мере повышения степени дифференцировки клеток. Прогностическое значение этого антигена у детей до сих пор не установлено. Анализ выявленных нами обратных взаимосвязей (СЭ34+ - 02; СБ34+ - СБ95+; СБ34+ - индекс плоидности), позволил предположить, что наличие экспрессии СЭ34+ на бластных клетках при В-ЗОЛЛ достоверно ухудшает прогноз заболевания.

Рисунок 11 - Корреляции между показателями иммунофено-типирования и ДНК-цитометрии клеток костного мозга у детей с анеупло-идным типом гистограмм

В литературе практически отсутствуют данные о плоидности и кинетике

клеток периферической крови при острых лейкозах. Наряду с клинико-

иммунологическими исследованиями костного мозга, у детей с В-ОЛЛ прове-

27

дена ДНК-цитометрия крови. Было установлено, что основная масса клеток находилась в в 1-фазе клеточного цикла. Пролиферативная активность периферической крови превышала показатели контрольной группы. Так, при диплоидном типе гистограмм Б-фаза составила 0,90 %, при анеуплоидии (дети второй подгруппы) - 0,16%.

Сравнительный анализ гематологических показателей у больных с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников по отношению к группе сопоставления выявил высокие значения СОЭ, низкие показатели содержания эритроцитов, гемоглобина, а также тромбоцитопению и наличие властных клеток в периферической крови в подгруппе с диплоидным типом гистограмм. Отличительными особенностями подгруппы с анеуплоидией являются лейкопения и лимфоцитоз (табл.7).

Таблица 7-Данные лейкограммы капиллярной крови у детей с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников (Ме)

Показатели периферической крови Группа сопоставления (п=30) 1-я подгруппа с ОЛЛ (дипл) (п= 78) 2-я подгруппа с ОЛЛ (анеупл) (п=11)

Эритроциты (хЮ/л) 4Д (4,0-4,2) 2,9**(2,7-3,5) 3,2**(2,1-3,7)

Гемоглобин (г/л) 122,0(114,0-127,0) 96,5**(89,5-109,5) 82,0**(55,0-95,0)

СОЭ (мм/ч) 4,0 (3,0-7,0) 12,5**(6,0-31,5) 15,0** (6,055,0)

Лейкоциты (хЮ^/л) 5,8 (5,3-6,6) 5,1 (2,7-8,6) 2,7**( 1,7-3,6)

Тромбоциты (х 109/л) 223,0(210,0-278,0) 37,5**(13,0-206,0) 72,0**(24,0-205,0)

Бласты (%) 0 23,0**(0,0-75,0) 0*(0,0-10,0)

Нейтрофилы (%) 48,0 (45,0-54,0) 11,0**(6,0-26,0) 16,5** (7,018,0)

Лимфоциты (%) 43,0 (38,0-48,0) 40,0 (13,5-66,0) 73,5**(70,0-79,0)

Различие с контролем статистически значимо: * - р<0,05; ** - р<0,01

В зависимости от плоидности изучались изменения иммунологических показателей периферической крови (рис.12). Между подгруппами не выявлено достоверной разницы. Но при сравнении с группой контроля изменения были идентичны тем, что выявлены и при доброкачественных ЛАП: низкий уровень естественных киллерных клеток (СБ 16*56") и В-лимфоцитоз (СБ 19") что, безусловно, имеет значение в формировании опухолевого процесса.

|дв ста Ф4 038 СИ6 НА»? СС05 СС25

Рисунок 12- Иммунологические показатели периферической крови детей с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников

Одно из современных направлений в гематологии - это изучение патогенетической роли апоптоза в развитии опухолевого процесса. С позиций блокирования апоптоза кумулятивные процессы являются одними из ведущих в про-грессировании этих болезней. В процессе работы изучался показатель готовности клеток к апоптозу СБ95+ как в костном мозге, так и в периферической крови. Изменения по сравнению с группой сопоставления не были статистически значимыми. Для изучения взаимосвязей между показателями иммунофеноти-пирования и СБ95+ проведен корреляционный анализ. Патогенетическое значение, по нашему мнению, имеют связи СБ95+ со здоровыми клетками миелоид-ного ряда (СБ95+ - МРО; СБ95+ - С014т) и обратные взаимосвязи с бластами (С095+ - бласты; СП34+ - СП95"), что мы расценили как блокаду апоптоза, способствующую опухолевой прогрессии.

Ответ на программное лечение больных с острым лейкозом характеризуется скоростью формирования первичного ответа лейкозных бластов и в связи с этим является одним из основных и наиболее надежных прогностических факторов.

На основании морфологического исследования костного мозга в процессе полихимиотерапии выявлено, что практически во всех случаях образцы были бедноклеточными, процент бластных клеток в костном мозге варьировал от О до 5,0 %, что свидетельствует о гематологической ремиссии. В подгруппе, где опухолевые клетки в дебюте заболевания характеризовались диплоидным набором хромосом, в результате индукционной терапии наблюдалось повышение пролиферативной активности клеток костного мозга (в2 - 1,90 % и Б - 16,80 % фазы клеточного цикла). В подгруппе с анеуплоидией (п=11) в 27,0 % случаев развился септический процесс, наступила летальность. У 2 больных, рецидив наступил через 1,5 года, в процессе наблюдения регистрировались частые инфекции, по данным ДНК-цитометрии анеуплоидные клетки оставались в костном мозге и периферической крови. У 6 пациентов отмечалась клиническая картина полной гематологической ремиссии, а по мониторингу ДНК-цитометрии наблюдалось исчезновение анеуплоидного клона и трансформация анеуплоидного типа гистограммы в диплоидный.

Сопоставление данных ДНК-цитометрии клеток периферической крови с показателями до назначения химиотерапии выявило высокий уровень пролиферативной активности с тенденцией к снижению (0-й день - 0,91%, 33-ий день -0,55%). Изменения иммунологических показателей периферической крови характеризовались повышением Т-лимфоцитов СБЗ+, высоким уровнем хелпер-ных клеток СБ4+, а также естественных киллеров СБ16+56+ (рис.13). В ходе терапии повышается и уровень готовности клеток к апоптозу СБ95+.

%

в 1-й день 33-й день

8 5Í ~

—-В-i-

пв

, I

CD4

CD8

CD19

CD16 HLA-DR CD95 CD25

Рисунок 13 - Результаты иммунофенотипирования клеток периферической крови у больных с В-ОЛЛ

Проведен корреляционный анализ между показателями иммунофенотипирования и данными ДНК-цитометрии у больных с острым лимфобластным лейкозом из клеток предшественников до начала терапии и в процессе мониторинга. Анализ взаимосвязей выявил различные типы межклеточной кооперации. Было установлено, что в ходе химиотерапии сохранялись основные корреляции между маркерами В-лимфоцитов: CD19+- HLA-DR+ (0,531), CD22+- HLA-DR+ (0,597), CD19+-CD22+ (0,919), CD19+- CD79a+ (0,871). Изменились взаимосвязи между лейкоцитарным маркером и показателями клеточного цикла. Так, до начала химиотерапии определялась связь CD45+ с фазой пролиферации G2, в ходе полихимиотерапии установлена сопряженность с фазой постмитотического отдыха G1, что свидетельствует об угнетении пролиферации лейкоцитарного звена в результате терапии (рис. 14).

Известно, что ведущую роль в регуляции иммунных реакций играют антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигены) и полиморфизм HLA-системы ответственен за вариации иммунного ответа организма. Согласно рабочей гипотезе [Попов Е.А., 2007], гены HLA кодируют не только отдельные нозологические формы гемобластозов, но и характеризуют ту или иную клеточную линию кроветворения, к которой относится опухолевый субстрат лейкоза. Степень ассоциации между заболеванием и HLA-аллелем соответствующего локуса определяется так называемым показателем относительного риска (relative risk, RR).

Рисунок 14- Корреляции между показателями иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии костного мозга у детей при мониторинге острого лим-фобластного лейкоза из клеток предшественников

Целью наших исследований было изучение иммуногенетических маркеров острого лимфобластного лейкоза из В-клеток предшественников и риска возникновения анеуплоидного клона.

Согласно поставленной цели, мы провели НЬА-типирование 37 больных с острым лимфобластным лейкозом (30 человек с диплоидным, 7- с анеугоюид-ным типом гистограмм). Описательная характеристика спектра выявленных антигенов представлена в табл. 8.

Таблица 8 - Частота выявления аллелей, выявленных у больных с острым лейкозом из В-клеток предшественников_______

Аллель Частота аллелей с ОЛЛ(дипл), % Частота аллелей с ОЛЛ (анеупл), % RR

Al 70,0 14,3 4,9

А2 50,0 14,3 3,5

A3 10,0 14,3 0,7

А9 20,0 14,3 1,4

А10 10 0

А28 0 28.6

А19 0 42

В7 10 14,3 0,7

В8 40 14,3 2,8

В13 10,0 14,3 0,7

В14 10 0

В17 30 28,6 1,05

В35 10 0

В39 10 0

В40 0 14,3

В44,45(12) 10,0 0

В51 10 14,3 0,7

Сравнительный анализ показателей HLA - типирования двух подгрупп детей с В-ОЛЛ выявил наличие общего фенотипа - В17. Для оценки силы ассоциации между аллелями произведен расчет критерия относительного риска (RR) по формуле Wolf. Как видно из таблицы 8, значимыми для первой подгруппы были показатели Al (70%), А2 (50%), В8 (40%). Для второй подгруппы установлены следующие сочетания: А28 (28.57%), А19 (42%) (рис.15).

в Диплоид

«¡ш Яанеуплоид

р ffife

ш ЩШ В иг

тВйг Шм М Ш ЁН 1«.....I CF

v> Л'" J> J> # £ &

;

Рисунок 15 - Распределение HLA-аллелей 1-го класса, ассоциированных с острым лимфобластным лейкозом

Сравнительная лабораторная характеристика острых лейкозов и лимфом из клеток предшественников

По месту первичной локализации в костном мозге или лимфоидной ткани гемобластозы подразделяются на 2 группы: лейкозы и лимфомы. Лимфома -это разновидность злокачественных опухолей, поражающих прежде всего лимфатическую систему организма. Заболевание ранее неизлечимое в настоящее время при своевременном выявлении и применении современных методик может быть излечено или достигнута стойкая ремиссия [Smith М.А., 2002; Spag-nolo D., 2004].

За период с 2000 по 2009 гг. в ГБУЗ РДКБ под наблюдением врачей-онкологов находилось 33 пациента с диагнозом лимфома. В связи с тем, что иммунофенотип клеток лимфомы во многом определяет выбор протокола лечения, всем больным при постановке диагноза определялась линейная принадлежность опухолевых клеток биоптата лимфоузла, либо костного мозга методом проточной цитометрии. На основании проведенных исследований и согласно EGIL - классификации в 64% случаев были диагностированы В-клеточные, в 36% - Т-клеточные лимфомы (табл.9).

Таблица 9 - Распределение больных с В- и Т-клеточной лимфомой по полу

Возраст В-клет.лимф. (абс.) % Т-клет.лимф. Сабе.) %

0-5 лет 7 33 3 25

5-10 лет 6 29 6 50

10-17 лет 8 38 3 25

Пол: муж. 17 81 7 58

жен. 4 19 5 42

Всего больных 21 100 12 100

Как В-, так и Т-клеточные лимфомы чаще регистрировались среди мальчиков, для В-лимфом была характерна возрастная группа от 10 до 17лет, для Т -лимфом от 6 до Юлет (табл. 9).

С диагностических позиций и с целью верификации представляет интерес сопоставление результатов комплексных исследований при острых лимфобла-стных лейкозах и лимфомах, ранее примененного при ЛАП и включающих им-мунофенотипирование, определение плоидности и кинетики клеточного цикла.

Как известно, лимфомы у детей отличаются высоким потенциалом пролиферации [Jaffe Е., 2001; Laver J., 2005]. По данным ДНК-цитометрии в 19 случаях из 21 (90%) клетки биоптатов имели диплоидный набор хромосом, в 2-х случаях была обнаружена анеуплоидия. Кинетика клеточного цикла характеризовалась следующими особенностями: фаза синтеза ДНК (S-фаза) при остром лимфобластном лейкозе из В - клеток предшественников составила 7,85%, при В-клеточной лимфоме - 8,32%. Обращает на себя внимание отсутствие проли-феративной активности анеуплоидных клеток, что мы расценили как проявление злокачественности процесса, резистентного к химиотерапии, поскольку лишь в фазе пролиферации опухолевые клетки отвечают на проводимое лечение (табл.10).

Таблица 10 - Распределение клеток биоптатов по плоидности и фазам клеточного цикла при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников и В-клеточной лимфоме (Ме (%))

Плоидность, фазы клеточного цикла Число клеток, Ме (%)

В-лимфома (п= 21) В-ОЛЛ (п= 79)

Диплоидные 100 100

ею/1 91,15(78,77-95,00) 89,94(85.34-94,45)

в2 0,08(0,0-3,94) 0,67(0,22-1.81)

Б 8,32(6,20-13,46) 7,85(4,33-12,60)

СУ 4,50 3,00(2,68-3.90)

анеуплоидные 22,66(0,0-43,00)" 62,28(22,88-83,01)

СО/1 39,60(0,0-98,00)** 85,36(70,21-93,17)

в2 0,0** 0,33(0,00-0,81)

Б 0,0 6,72(2,90-19,73)

СУ 0,0 3,08(2,50-5,18)

Различие с контролем статистически значимо: * - р<0,05; ** - р<0,01

Иммунофенотипирование бластов костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников и опухолевых клеток биопсийного материала при В-клеточной лимфоме выявило, что отличительной особенностью лимфом является более низкий процент экспрессии В - клеточных маркеров (С019+, с>1С079а+, СШ2+, СЭ20+, СБ10+, НЬА-Б11+). Кроме того они характеризовались наличием зрелых клеток су^М1", мембранного (маркера лимфомы Беркитта) (рис.16).

.В-лимфм»»

ССЕО СП22 СОЮ |дм+ 1дМ+ ШЛИ* С034 С095

Рисунок 16- Показатели иммунофенотипирования костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников и В-клеточной лимфоме

Особенности кинетики клеточного цикла в группе детей с лимфомами отражены в корреляционных взаимосвязях между числом диплоидных клеток в в!-фазе и В-клеточными маркерами. В отличие от острых лейкозов из В-клеток предшественников, где бласты находятся в фазе пролиферации 02, при лимфо-мах для опухолевых клеток более характерна постмитотическая фаза - в1 (СБ19+ - й1; СБ22+ - С1; СБ79а+ - в!) (рис.17).

I Рисунок 17 - Корреляции между фазами пролиферации и клеточными мар-

керами при В-клеточной лимфоме

I

Таким образом, отличительными признаками лимфом от острых лейкозов, по нашему мнению, являются формирование опухоли более зрелыми клетками и отсутствие пролиферативной активности анеуплоидных клеток.

I 37

I

Алгоритм диагностики доброкачественных лимфаденопатий и гемо-бластозов

Проведенные нами исследования выявили различные изменения показателей периферической крови при ЛАП и при гемобластозах, что явилось основанием для разработки алгоритма, позволяющего проводить дифференцировку опухолевого процесса на ранних стадиях заболевания. В результате сравнительного анализа установлено, что для больных с доброкачественными ЛАП характерны высокие показатели эритроцитов, лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов, при более низком значении СОЭ (табл.11).

Таблица 11- Сравнительная характеристика гематологических показателей

у детей

Показатели периферической крови Группа сопоставления, (п=30), Ме ОЛЛ (п= 78), Ме Дети с лимфадено-патиями (п= 156), Ме

Эритроциты (х10,2/л) 4,1 (4,0-4,2) 2,9**(2,7-3,5) 4,0(3,6-4,8)

Гемоглобин (г/л) 122,0 (114,0-127,0) 96,5** (89,5-109,5) 103,5** (98,0-110,0)

СОЭ (мм/ч) 4,0 (3,0-7,0) 12,5** (6,0-31,5) 6,5* (5,0-17,0)

Лейкоциты (х109/л) 5,80 (5,3-6,6) 5,1 (2,7-8,6) 8,9**(7,5-10,8)

Нейтрофилы (%) 48,0 (45,0-54,0) 11,0**(6,0-26,0) 39,0 (33,0-52,0)

Лимфоциты (%) 43,0 (38,0-48,0) 40,0 (13,5-66,0) 54,0 (44,0-60,0)

Различие с контролем статистически значимо: * - р<0,05; ** - р<0,01

Показатели клеточного иммунитета характеризовались достоверно низким уровнем клеток с маркером ранней активации С025+ (рис. 18).

— ЛАП -СИпимф СГ2 0ЛЯ

1

Ж

Рисунок 18 - Сравнение иммунологических показателей у детей с лимфадено-патиями, лимфомами, острыми лимфобластными лейкозами из клеток предшественников и группой сопоставления

По результатам ДНК-цитометрии выявлены достоверные различия по количеству клеток в 02- и Б- фазах клеточного цикла. При лимфаденопатиях (рис.19) фаза 02 составила 0,08 %, фаза 8 - 0,16 %, при лимфомах 02фаза = 0,03 %, Б фаза = 0,90 %, при лейкозах в2 = 0,09, 8 = 0,91%.

Рисунок 19 - Сравнение показателей клеточного цикла периферической крови при лимфаденопатиях, острых лейкозах и лимфомах

Таким образом, при сравнении клинико-иммунологических показателей крови выявлены особенности, отличающие группу детей с доброкачественной гиперплазией лимфоузлов.

На основании анализа комплекса проведенных исследований был разработан алгоритм, составной частью которого являются числовые значения: лимфа-денопатии характеризуются лимфоцитозом (44-60%), снижением маркера ранней активации СБ25+ (7-11%) и высокими показателями пролиферативной активности (Б - фаза клеточного цикла 0,10-0,26%) (рис.20).

Рисунок 20 - Алгоритм лабораторной диагностики больных с острым лейкозом, доброкачественной и злокачественной гиперплазиями лимфоидной ткани

В последнее время возрастает значение информационного обеспечения медицинской деятельности. На основании данных иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга при ОЛЛ у детей РДКБ г.Уфы за период 20022010гг. совместно с сотрудниками кафедры технической кибернетики УГАТУ разработана компьютерная программа на основе нейронных сетей, содержащая информацию по иммунофенотипическим характеристикам 8-ми подвариантов острых лимфобластных лейкозов и позволяющая упростить процесс постановки диагноза.

Таким образом, мультипараметрическая проточная цитометрия является одним из оптимальных диагностических комплексов при обследовании больных с лимфаденопатиями и гемобластозами. Показатели иммунофенотипирования, плоидности и кинетики клеточного цикла клеток периферической крови, костного мозга и биопсийного материала характеризуют линейное происхождение, уровень дифференцировки, изменения количества ДНК, оценивается пролиферативная активность клеток как активно синтезирующих ДНК, так и находящихся в разных фазах 01-, 8-, 02- или М- клеточного цикла. Многофакторный анализ результатов проточной цитофлюориметрии позволяет проводить дифференциальную диагностику заболеваний протекающих с гиперплазией лимфатических узлов и своевременного выявления опухолевого процесса.

ВЫВОДЫ

1 Иммунобиологические особенности доброкачественных лимфаденопа-тий у детей обусловлены подавлением естественной киллерной цитотоксично-сти (СБ16+56") и экспрессии маркера СБ25+, В-лимфоцитозом, селективной недостаточностью 1цА и наличием фоновой инфицированности СМУ. Гематологические показатели характеризуются лейкоцитозом, низким уровнем гемоглобина и высоким показателем СОЭ.

2 При доброкачественных лимфаденопатиях установлен диплоидный тип гистограмм клеток периферической крови. Кинетика клеточного цикла характеризуется высокой пролиферативной активностью по сравнению с контрольной группой (С2- Б - фазы).

3 При иммунофенотипировании острых лейкозов методом проточной ци-тометрии в 79% случаев установлен острый лимфобластный лейкоз из В-клеток предшественников, в 6% - из Т-клеток предшественников и в 15% - острый миелобластный лейкоз. ДНК-гистограммы бластных клеток костного мозга характеризуются диплоидным набором хромосом. Анеуплоидия установлена у 10% обследованных с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников.

4 Дифференциально-диагностическим маркером позволяющим исключить В-1 и В-2 варианты острого лимфобластного лейкоза является выявление анеу-плоидного клона бластных клеток с низкой экспрессией маркера СБ19+и высокой интенсивностью цитоплазматического 1§М+.

5 Иммунобиологическими лабораторными критериями состояния гематологической ремиссии при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников являются: увеличение экспрессии СБ95+ , изменения показателей ДНК-цитометрии в виде полного исчезновения анеуплоидных бластных клеток в костном мозге и периферической крови, повышение уровня клеток в фазах

пролиферации (Б и 02).

6 Отсутствуют статистически достоверные различия между показателями иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии периферической крови у детей с острым лимфобластным лейкозом и неходжкинской лимфомой.

7 Анеуплоидные опухолевые клетки биоптатов лимфоидной ткани при неходжкинской лимфоме характеризуются отсутствием пролиферативной активности в отличие от бластных клеток костного мозга у детей с острым лимфобластным лейкозом из клеток предшественников.

8 На основе проточной цитометрии клеток периферической крови разработан алгоритм лабораторного обследования больных с лимфаденопатиями, острыми лейкозами, лимфомами который содержит маркеры, позволяющие проводить дифференциальную диагностику опухолевого процесса на ранних стадиях заболевания: анеуплоидия, высокие показатели пролиферативной активности клеток и экспрессии маркера активации С025+.

9 Разработана компьютерная диагностическая программа на основании нейронных сетей, позволяющая верифицировать восемь типов острого лимфоб-ластного лейкоза из Т- и В- клеток предшественников.

Практические рекомендации

1 Лабораторное обследование больных с лимфаденопатиями должно включать ДНК-цитометрию периферической крови. Выявление анеуплоидии и высокой пролиферативной активности клеток (S- и 02-фазы клеточного цикла) являются показаниями к проведению биопсии лимфатического узла.

2 Анеуплоидия клеток костного мозга и периферической крови, установленная по данным ДНК-цитометрии, является диференциально-диагностическим маркером В-3 острого лимфобластного лейкоза.

3 Высокий уровень индекса плоидности костного мозга и периферической крови (ДНК>1.16) является благоприятным прогностическим признаком при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников.

4 Компьютерная программа, разработанная на основе нейронных сетей и по результатам анализа кластеров дифференцировки костного мозга на проточном цитофлюориметре, упрощающая процесс постановки диагноза у больных с острым лимфобластным лейкозом и может быть использована в качестве обучающей программы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Хайруллина P.M., Хаматдинова З.Р., Гильманов А.Ж., Прогностические возможности проточной цитометрии в онкогематолопга // Клиническая лабораторная диагностика.- № 9 - 2004.- С. 38 - 39.

2 Хаматдинова З.Р., Хайруллина P.M., Гильманов А.Ж. Иммунофеноти-пическая характеристика острых лейкозов у детей в Республике Башкортостан // Клиническая лабораторная диагностика.- № 9. - 2004.-С.44.

3 Хайруллина P.M., Хаматдинова З.Р., Гильманов А.Ж., Чувилина Е.В., Хисамова Н.Ф. Проточная цитометрия в диагностике острых лейкозов у детей // Медицинская иммунология. - 2005. - №7 - С. 212.

4 Хаматдинова З.Р., Хайруллина Р.М., Гильманов А.Ж., Красавцева Т.Н. ДНК-цитометрия в диагностике острых лейкозов // Клиническая лабораторная

диагностика. - 2005. - № 9. - С. 45.

5 Khamatdinova Z., Gilmanov A; Khairullina R. Immune Phenotyping of Acute Leukemia in Children at Republic of Bashkortostan, Russia // EuroMedLab 2005 abstracts CD ROM. Glasgow, 8-12 May. 2005 - abstr. TP 4.21.

6 Хаматдинова 3.P., Хайруллина P.M., Хисамова Н.Ф., Красавцева Т.Н. Коэкспрессия миелоидных антигенов при В-ОЛЛ // Медицинская иммунология.* 2006.-№8.-С. 354.

7 Хаматдинова З.Р., Хайруллина Р.М., Хисамова Н.Ф., Красавцева Т.Н. Иммунофенотипическая характеристика бластных клеток при верификации острых лейкозов: материалы всеросийской научно-практической конференции «Современные аспекты оказания стационарной медицинской помощи детям». -

Уфа, 2007.-С. 213.

8 Хисамова Н.Ф., Хайруллина P.M., Хаматдинова З.Р., Гильманов А.Ж. ДНК-цитометрия периферической крови в педиатрической практике // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 9. - С.57.

9 Gilmanov A., Khairullina R., Khamatdinova Z. Phenotyping of marrow cells at acute leukemia in children // Clinical Chemistry. -2006. -Vol.52, No.6, suppl. - p. A73.

10 Хайруллина P.M., Хасанов Р.Ш., Хаматдинова З.Р. Организация специализированной иммунологической службы в Республике Башкортостан // Здравоохранение Башкортостана. - 2008. - № 3. - С. 8 -10.

11 Хисамова Н.Ф., Хаматдинова З.Р., Кальметьева Л.Р. Области применения ДНК-цитометрии в педиатрической практике // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. - № 3. - С. 51 - 54.

12 Хаматдинова З.Р., Хисамова Н.Ф., Хайруллина P.M. Иммунологическая реактивность и ДНК-цитометрия клеток периферической крови при онкологических заболеваниях у детей // Медицинская иммунология.- 2010. - Т.12, № 1-2. -С.65 - 70.

13 Хаматдинова З.Р., Хайруллина Р.М.,Еличева З.М., Усманова И.З., Ах-тямова Р.Х., Красавцева Т.Н. Иммуногенетические маркеры острых лейкозов // Вестник гематологии. - 2009. - Т.5, №4. - С. 64.

14 Хаматдинова Д.Р., Хаматдинова З.Р., Танеев А.Р. Автоматизация процесса диагностики острых лейкозов с использованием искусственных нейронных сетей // Нейрокомпьютеры: разработка, применение. - 2010. - № 11. - С.23 -26.

15 Хисамова Н.Ф., Кальметьева Л.Р., Хаматдинова З.Р. Перспективы использования ДНК-цитометрии в детской нефрологии // Пермский медицинский журнал. - Том 27, № 2.- 2010 - С. 67 - 73

16 Хаматдинова З.Р., Хайруллина P.M., Гильманов А.Ж., Терегулова Л.М. Особенности иммунологической реактивности при лимфоаденопатиях // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 9. - С. 12.

17 Ахметшин Р.З., Хаматдинова З.Р., Хисамова Н.Ф. Плоидность и кинетика клеточного цикла периферической крови при врожденных пороках развития // Актуальные проблемы педиатрии: сборник материалов XIV конгресса педиатров России с международным участием (15-18 февраля 2010года, Москва).

-М.-2010.-С. 249.

18 Хаматдинова З.Р., Хайруллина P.M., Еличева З.М., Ахтямова Р.Х., Красавцева Т.Н. Иммуногенетические особенности острого лимфобластного лейкоза // Актуальные проблемы педиатрии: сборник материалов XIV конгресса педиатров России с международным участием (15-18 февраля 2010года, Москва).

-М.-2010.-С. 248.

19 Хаматдинова З.Р. Прогностические возможности проточной цитомет-рии при диагностике неходжкинских лимфом у детей // Медицинская иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4 - 5. - С. 465 - 466.

20 Диагностическое HLA-типирование в педиатрической практике: учебно-методическое пособие / Кальметьева Л.Р., Ахметшин Р.З., Макарова Г.У., Хаматдинова З.Р., Хасанов Р.Р. -Изд-во Омега-Л, 2010.

21 Области применения ДНК-цитометрии периферической крови в педиатрической практике: методическое пособие для врачей / под ред. Хасанова Р.Ш., Хайруллиной P.M. Составители: Хаматдинова З.Р., Кальметьева JI.P., Хи-самова Н.Ф., Ахметшин Р.З., Пролыгина Д.Д., Давлетбаева Г.А., Имаева JI.P. // Уфа.-2010.-44 с.

22 Хаматдинова Д.Р., Танеев А.Р., Хаматдинова З.Р. Диагностика острых лимфобластных лейкозов у детей: свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010615112 от 9.08.2010 г.

Патент РФ

23 Хаматдинова З.Р., Хайруллина Р.М. Способ прогнозирования течения острых лейкозов: патент на изобретение № 2416795 от 27.01.2010.

ХАМАТДИНОВА ЗЕМФИРА РОБЕРТОВНА

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ КРИТЕРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФАДЕНОПАТИЙ И ГЕМОБЛАСТОЗОВ У ДЕТЕЙ

14.03.09- Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 10.12.2011. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 3,0. Уч.-изд. л. 3,0. Тираж 100 экз. Заказ № 5. 450000, г. Уфа, Ленина, 3, ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России