Автореферат и диссертация по медицине (14.01.29) на тему:Определение белков теплового шока в моче и ткани почки, значение в оценке активности и прогрессирования хронического гломерулонефрита

На правах рукописи

НЕПРИНЦЕВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В МОЧЕ И ТКАНИ ПОЧКИ, ЗНАЧЕНИЕ В ОЦЕНКЕ АКТИВНОСТИ И ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА

14.01.29 - нефрология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2Ь ЯНВ 2015

005558190

Москва-2015

005558190

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук Бобкова Ирина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, директор НИИ нефрологии, заведующий кафедрой пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Смирнов Алексей Владимирович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нефрологии и гемодиализа ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ермоленко Валентин Михайлович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «.^0 » 2015 года в

часов на заседании диссертационного совета Д. 208.040.05 при ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (119991, Москва, Трубецкая ул., д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49 и на сайте Первого МГМУ им. И.М. Сеченова www.mma.ru

Автореферат разослан » 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Брагина Анна Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Среди механизмов, определяющих течение и исход заболеваний почек, в настоящее время наиболее изучены повреждающие звенья патогенеза. Однако, как показали результаты экспериментальных исследований, течение патологического процесса в почке, независимо от его этиологии, определяется балансом локально воздействующих повреждающих факторов и противостоящих им механизмов самозащиты, среди которых особое место занимают белки теплового шока (БТШ) [Kitamura М. et al. 1999, Beck F-X. et al. 2000, Chan R.W. et al. 2006, Ortega L.M. et al 2010].

Благодаря достижениям современной молекулярной биологии установлены фундаментальные защитные функции БТШ, которые заключаются в поддержании нормальной структуры белков в клетке. В качестве шаперонов БТШ облегчают образование вторичной и третичной структуры белков, участвуют в репарации частично денатурированных протеинов, в деградации и элиминации не подлежащих восстановлению белков [Маргулис Б.А. 2001, Ивашкин В.Т., Драпкина О.М. 2011].

Роль БТШ в механизмах, ограничивающих повреждение почечной ткани, а также их иммунорегуляторная функция при хроническом гломерулонефрите (ХГН) изучены недостаточно. Данное направление исследований представлено, главным образом, экспериментальными и единичными клиническими работами по оценке экспрессии отдельных БТШ в различных структурах почки [Venkataseshan V.S. et al. 1996, Trieb К. et al. 2005, Marzec L. et al. 2009]. Практически отсутствуют публикации по определению экскреции данных протективных факторов с мочой на разных этапах течения ХГН.

Вместе с тем, изучение БТШ, способных модулировать процессы повреждения в почке, приобретает особый интерес для понимания основных закономерностей прогрессирования ХГН и представляется перспективным для разработки новых методов торможения нефросклероза.

Цель исследования

Оценить состояние системы самозащиты почки у больных ХГН по уровню экскреции с мочой и экспрессии в ткани почки БТШ, уточнить значение этих факторов как показателей активности и критериев прогноза ХГН.

Задачи исследования

У больных с различными вариантами течения ХГН:

1. Определить экскрецию с мочой основных защитных БТШ-27 и БТШ-70 и уровень циркулирующих антител (АТ) к БТШ-70 в сыворотке крови, установить их связь с клиническими признаками активности ХГН.

2. Сравнить мочевые и сывороточные показатели БТШ-27 и БТШ-70 с уровнем в моче провоспалительного интерлейкина 6 (ИЛ-6) и противовоспалительного интерлейкина 10 (ИЛ-10).

3. Изучить в ткани почки локализацию и интенсивность экспрессии БТШ-70, оценить количество регуляторных противовоспалительных Т-клеток (Т рег).

4. На основании проведенных клинико-морфологических корреляций установить значение защитных БТП1 как критериев активности и прогноза ХГН.

Научная новизна

Впервые в клинических условиях на разных этапах течения ХГН оценен баланс повреждающих и защитных факторов в сопоставлении с клиническими признаками активности и выраженностью морфологических изменений в почке.

Впервые у больных с разными вариантами ХГН проведена комплексная оценка внутри- и внеклеточных защитных эффектов БТШ на основе определения уровня в моче и экспрессии в ткани почки БТШ-27 и БТШ-70 (белков-шаперонов клеточного происхождения) и измерения уровня в сыворотке крови АТ к поверхностным иммунодоминантным эпитопам БТШ-70.

Впервые в клинических условиях для оценки роли БТШ в регуляции иммунного воспаления уровень антител к БТШ-70 у больных ХГН изучен в сопоставлении с количеством в ткани почки Т-регуляторных лимфоцитов и содержанием в моче продуцируемого данными клетками противовоспалительного цитокина ИЛ-10.

Практическая значимость

На основании полученных результатов исследования разработан неинвазивный метод мониторирования локально-почечных механизмов, противостоящих повреждению в почке, что имеет значение для прогнозирования течения ХГН и его ответа на лечение.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных активным ХГН, независимо от его морфологического варианта, увеличивается экскреция с мочой и экспрессия в ткани почки факторов внутриклеточной защиты - БТШ-27 и БТШ-70, выраженность которых коррелирует с показателями клинической активности (уровнем ПУ, тяжестью НС, наличием дисфункции почек).

2. При высокоактивных формах ХГН (с НС, особенно в сочетании с нарушением функции почек) развивается дисбаланс продукции в почке воспалительных и противовоспалительных цитокинов, характеризующийся повышением экскреции с мочой ИЛ-6, снижением уровня в моче ИЛ-10 с уменьшением в ткани почки пула его клеток-продуцентов - Т-регуляторных (БохРЗ+) лимфоцитов; во взаимосвязи с этими нарушениями наблюдается снижение в сыворотке крови уровня АТ к БТШ-70, что отражает ослабление противовоспалительной защиты почки, в том числе, в результате нарушения внеклеточных иммунорегуляторных эффектов БТШ.

3. Определение у больных ХГН мочевых и сывороточных показателей БТШ-27 и БТШ-70, отражающих их клеточные и внеклеточные защитные эффекты, является информативным неинвазивным методом оценки локально-почечных механизмов, противостоящих повреждению в почке, что имеет значение для прогнозирования течения нефрита и ответа на лечение.

Внедрение результатов работы в практику

Основные положения диссертации включены в лекционный курс на кафедре нефрологии и гемодиализа ИПО Первого МГМУ имени И.М.Сеченова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе, 6 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы

Апробация работы состоялась 30 июня 2014 года на совместном заседании кафедры нефрологии и гемодиализа ИПО, отдела нефрологии НИЦ, кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии медико-профилактического факультета Первого МГМУ имени И.М.Сеченова, кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.

Ломоносова. Материалы работы доложены на Пленуме правления научного общества нефрологов России (НОНР) (г. Ульяновск, ноябрь 2012 г.), на 50 и 51 международных конгрессах Европейского общества нефрологов и Европейской ассоциации диализа и трансплантации (ERA-EDTA) (Стамбул, май 2013г.; Амстердам, июнь 2014г.), на ежегодных конференциях Первого МГМУ имени И.М. Сеченова «Декабрьские чтения в клинике имени Е.М. Тареева» (декабрь 2013г. и 2014г.).

Личный вклад автора Автором лично проведены планирование работы, поиск и анализ литературы по теме диссертации, набор пациентов, клиническое обследование больных, формирование базы данных, статистическая обработка, обобщение и анализ полученных результатов. Автором освоены методики определения цитокинов и БТШ в моче и сыворотке крови методом ELISA. Вклад автора является определяющим в обсуждении результатов исследования в научных публикациях и докладах.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.29 — «нефрология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно - пунктам 2, 4, 6 и 11 паспорта нефрологии.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 104 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы исследования», «Результаты собственного исследования», «Обсуждение результатов исследования», заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Список литературы содержит 139 источников, из которых 26 отечественных и 113 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 26 рисунками, 6 таблицами, содержит 4 клинических наблюдения.

База проведения исследования Исследование проведено в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е.М. Тареева (Университетская клиническая больница №3) Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (директор - академик РАН, профессор H.A. Мухин). Общеклинические и специальные исследования проведены в подразделениях Первого МГМУ имени И.М. Сеченова: в межклинической иммунологической лаборатории (зав. — А.Г.Серова),

в межклинической биохимической лаборатории (зав. — Т.Н. Александровская), изучение биопсийного материала выполнено профессором В.А. Варшавским на кафедре патологической анатомии.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Обследовано 85 больных ХГН: 36 женщин и 49 мужчин в возрасте от 16 до 67 лет (медиана 35,5 [27; 51] лет), наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева УКБ№3 ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова с 2011 по 2014 годы. Контрольную группу составили 10 практически здоровых лиц, сопоставимых с больными ХГН по полу и возрасту.

Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в группах больных, различающихся по степени активности ХГН. Клинико-лабораторная характеристика обследованных больных ХГН приведена в таблице 1.

Таблица 1

Клиническая характеристика обследованных больных ХГН Ме [25; 75%] (п=85)

Группа Показатели^ I группа (МС) п=34 II группа (НС) п=41 II А подгр. (умеренный НС) п=31 IIБ подгр. (выраженный НС) п=10 III группа (неактивный ХГН) п=10

Суточная ПУ (г/сут) 2,4 Г1.24; 3,5] 7,4 [5,28; 10,88] 6,4 Г4,8; 10,01 11,32 [7,52; 18,01 0,23 ГО,18; 0,3]

Альбумин сыворотки (г/л) 39,0 [36,7; 41,6] 25,0 [21,5; 28,7] 27,7 [24,8; 30,0] 19,0 [17,7; 19,9] 45,7 [42,7; 49,0]

Общий белок сыворотки (г/л) 62,4 [57,4; 67,4] 43,85 [38,7; 48,7] 46,6 [43,2; 49,7] 34,45 [33,6; 38,7] 70,2 [69,0; 75,0]

Креатинин сыворотки (мг/дл) 1,08 [0,85; 1,63] 0,98 [0,72; 1,44] 0,9 [0,72; 1,44] 1,33 [0,81; 1,44] 1,07 [0,95; 1,68]

СКФ (в пробе Реберга-Тареева) (мл/мин) 87,5 [55,0; 114,5] 92,0 [58,0; 109,0] 102,5 [87,0; 138,0] 63,0 [43,0; 105,0] 90,0 [62,0; 109,0]

АД сист. (мм рт.ст.) 130,0 [120,0; 140,0] 130.0 [120,0; 150.01 130,0 [120,0; 150,0] 130,0 [120,0; 135,0] 130,0 [120,0; 140,0]

АД диаст. (мм рт.ст.) 82,5 [80,0; 90,0] 85,0 [80,0; 90,0] 90,0 [80,0; 90,0] 80,0 [80,0; 85,0] 80,0 [80,0; 90,0]

В I группу включены 34 больных активным ХГН с выраженным мочевым синдромом (МС): у 23 больных ХГН изначально протекал с МС и персистировал в среднем в течение года, у 11 - МС был результатом неполной ремиссии нефротического синдрома (НС). Клинически эта группа характеризовалась протеинурией (ПУ) от 1 до 3,5 г/сут, у 13 пациентов она была изолированной, у 21 - сочеталась с эритроцитурией. У 7 больных наряду с ПУ выявлено нарушение функции почек (креатинин от 1,26 мг/дл до 2,97 мг/дл, СКФ - от 49 до 67 мл/мин), как проявление высокой активности нефрита. У 5 пациентов, несмотря на прием антигипертензивных препаратов, отмечалась артериальная гипертония (АГ) (АД 150/90-190/120 мм рт.ст.). Длительность нефрита в этой группе - 45 [9,5; 96] месяцев.

II группу составил 41 больной активным ХГН с НС. По степени тяжести НС были выделены подгруппы: П А, включающая 31 пациента с умеренным НС (ПУ 6,4 [4,8; 10] г/сут, альбумин сыворотки 27,7 [24,8; 30] г/л, общий белок сыворотки 46,6 [43,2; 49,7]), и П Б, в которую вошли 10 больных с выраженным НС (анасарка, ПУ 11,32 [7,52; 18] г/сут, гипоальбуминемия менее 20 г/л -в среднем 19 [17,7; 19,9] г/л, общий белок сыворотки 34,45 [33,6-38,7] г/л).

У 14 больных II группы наряду с НС выявлено нарушение функции почек (креатинин 1,55 [1,39; 1,99] мг/дл, СКФ - 53 [42; 71]) как проявление высокой активности нефрита, у 6 из них из них также отмечались выраженная гематурия и АГ (АД 160/100 - 180/110 мм рт.ст.), которые расценивались в рамках остронефритического синдрома. Длительность нефрита во II группе составила в среднем 11,5 [4; 42,5] месяцев, длительность НС к моменту обследования - 4 [2; 7] месяца.

В III группу вошли 10 пациентов с неактивным течением заболевания: 1-е латентным ХГН, 3-е ремиссией ХГН в результате иммуносупрессивной терапии. ПУ в этой группе была менее 0,5 г/сут; у 5 в сочетании с умеренной эритроцитурией. У 2 —х пациентов наблюдалась АГ до 150/100 мм рт.ст., поддающаяся коррекции антигипертензивными препаратами. У 4 пациентов было выявлено стойкое нарушение функции почек (креатинин сыворотки до 1,89 мг/дл, СКФ до 46,5 мл/мин), у остальных больных функция почек была сохранной.

У 72 пациентов диагноз был подтвержден морфологически: у 29 выявлен мезангиопролиферативный ГН (МПГН), у 13 -мезангиокапиллярный ГН (МКГН), у 13 - мембранозная нефропатия (МН), у 4 - нефрит с минимальными изменениями (МИ), у 7 -фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), у 6 — нефросклероз в исходе ХГН.

У 45 больных ХГН исследование молекулярных медиаторов проводили до начала иммуносупрессивной терапии, у остальных 40 пациентов - на фоне продолжения начатой ранее иммуносупрессивной терапии преднизолоном и/или цитостатиками, в том числе, в сверхвысоких дозах (внутривенные «пульсы») (у этих больных сбор мочи для исследования проводили в интервалах между «пульсами»).

Для оценки прогностического значения изменений БТШ при ХГН у 37 пациентов с активным нефритом был проанализирован характер течения заболевания и ответ на иммуносупрессивную терапию в течение ближайшего года наблюдения в зависимости от исходной величины AT к БТШ-70.

Специальные методы исследования

Наряду с общеклиническим обследованием, принятым для нефрологических больных, были применены специальные методы исследования.

В моче больных ХГН методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) были определены уровни:

- БТШ-27 и БТШ-70 (внутриклеточных защитных белков-шаперонов, поддерживающих целостность и функциональную активность клеток)

- ИЛ-6 (одного из наиболее активных цитокинов, участвующих в реализации иммунного ответа и воспалительной реакции),

ИЛ-10 (основного противовоспалительного цитокина, ингибирующего продукцию макрофагами и лимфоцитами медиаторов воспаления и экспрессию их рецепторов на поверхности клеток).

В сыворотке крови методом ELISA был исследован уровень:

- AT к БТШ-70 (отражают внеклеточные иммунорегуляторные эффекты БТШ-70 - участие в формировании пула регуляторных Т-клеток, секретирующих противовоспалительные цитокины, в том числе ИЛ-10).

Спектр изученных мочевых и сывороточных показателей и методы их определения представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели, изученные в моче и сыворотке крови больных ХГН

Изученные медиаторы Метод определения, наборы реактивов для исследования Количество больных ХГН

В моче

БТШ-70 ELISA, «Enzo» (США) 84

БТШ-27 ELISA, «Enzo» (США) 84

ИЛ-6 ELISA, «Invitrogen» (США) 84

ИЛ-10 ELISA, «eBioscience» (Австрия) 84

В сыворотке крови

AT к БТШ-70 ELISA, «Enzo» (США) 82

В ткани почек 39 больных ХГН иммуногистохимическим пероксидазным методом была изучена экспрессия:

- БТШ-70;

- РохРЗ (транскрипционный фактор Т-регуляторных клеток, используемый в качестве маркера этих клеток).

Спектр изученных иммуногистохимическим методом медиаторов, используемые наборы реактивов представлены в табл.3.

Таблица 3

Показатели, изученные в ткани почки больных ХГН

Изученные медиаторы Метод определения, наборы реактивов для исследования Количество больных ХГН

БТШ-70 «8рпп§Вюзаепсе» (США) 39

FoxP3 «5рпп§Вюзспепсе» (США) 39

Результаты иммуногистохимического исследования изученных медиаторов оценивали полуколичественным методом в баллах.

С помощью морфометрического подсчета (РохРЗ+) ядер было оценено число противовоспалительных клеток в ткани почки (в корковом слое на участке 1,5 мм2).

Методы статистической обработки

Статистический анализ данных проводили с применением стандартных статистических методик с помощью программы ЗТАТСБТССА 6,0. При анализе лабораторных данных и уровней медиаторов в моче и сыворотке крови, имеющих отличное от нормального распределение, оценивали медиану, разброс величин по отношению к медиане характеризовали показателем интерквартильного размаха (25; 75 процентили), куда входят 50% всех полученных показателей. При сравнении двух групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями, применялся непараметрический метод ранговой корреляции. Достоверность различий частот в двух группах оценивали с помощью критерия х2 с поправкой Йетса. Для оценки прогностического значения показателей применен метод Каплан-Майер, достоверность различий оценена по лог-ранговому критерию.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование экскреции БТШ-27 и БТШ-70 в моче больных ХГН

У больных ХГН выявлены изменения экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70, характер которых зависел от клинических особенностей заболевания. Так, у пациентов с МС (I группа) эти показатели имели тенденцию к увеличению, по сравнению со здоровыми и пациентами с неактивным течением ХГН (табл.4). В I группе наиболее высокие индивидуальные значения (превышающие медиану у больных с НС), были у трех больных с яркими признаками активности ХГН — ПУ субнефротического уровня, выраженной эритроцитурией и дисфункцией почек.

У пациентов с НС (II группа) увеличение уровня БТШ-27 и БТШ-70 в моче было статистически значимым, по сравнению с другими группами (табл.4). При выраженном НС (ПБ группа), характеризующимся анасаркой, массивной ПУ и тяжелой гипоальбуминемией, уровни БТШ-27 и БТШ-70 в моче были достоверно выше, чем при умеренном НС (ПА группа) (табл.4).

У больных ХГН с НС мочевые показатели БТШ-27 и БТШ-70 прямо коррелировали с величиной суточной ПУ (118=0,297 р<0,05 и Ия=0,263 р<0,05 соответственно) и обратно с уровнем альбумина сыворотки крови (115=-0,356 р<0,05; Ы5=-0,31 р<0,05) (рис.1).

Таблица 4

Уровень экскреции с мочой БТШ-27 и БТШ-70 у больных ХГН Ме [25; 75%] (п=84)

" ____________Показатель N БТШ-27 БТШ-70

Группа (нг/мл) (нг/мл)

Активный ХГН : 64

I. ХГН с MC 34 0,76 [0,68; 1,14] 0,43 [0,41; 0,451

П. ХГН с НС 30 1,1 [0,73; 1,83] * 0,46 [0,43; 0,5] *

II А. НС умеренный 23 0,94 [0,71; 1,73] 0,43[0,41; 0,51]

II Б. НС выраженный 7 1,88 [0,8; 7,195] * ** 0,6 [0,5; 2,5]* **

III. Неактивный ГН 10 0,72 [0,65; 0,98] 0,42 [0,41; 0,43]

Здоровые 10 0,73 [0,66; 0,96] 0,42 [0,40; 0,43]

* - р<0,05 по сравнению с I группой (ХГН с MC), III группой (неактивным

ХГН) и здоровыми ** - р<0,05 по сравнению с IIA группой (ХГН с умеренным НС)

СПУ, г/сут

Альбумин сыворотки, г/л

Рис. 1. Взаимосвязь уровней БТШ-27 и БТШ-70 в моче с протеинурией и альбумином сыворотки крови у больных ХГН с НС

Среди изученных нами БТШ более тесная взаимосвязь с выраженностью ПУ и тяжестью НС была получена для Б'ГШ-27, что находит объяснение в свете современных представлений об участии этого защитного белка в поддержании цитоскелета актинсодержащих почечных клеток (тубулоцитов, подоцитов), в частности, в регуляции формы ножек подоцитов. Экспериментальными исследованиями на моделях протеинурических форм ГН подтверждено образование в поврежденных подоцитах фосфорилированных изоформ БТШ-27, утрачивающих защитные свойства [Зтоуег IV. Е е1 а1. 1996, 2002]. Установлена взаимосвязь выявленных нарушений метаболизма БТШ со слиянием ножек подоцитов - ключевым звеном развития нефротической ПУ; показано выделение БТШ из поврежденных подоцитов в мочу.

Мы не выявили зависимости уровня мочевой экскреции исследуемых БТШ от морфологических типов ХГН, а также различий по данным показателям в группах больных с непролиферативными и пролиферативными формами ХГН. Максимальные индивидуальные уровни БТШ-27 и БТШ-70 в моче отмечались у 4-х больных с ФСГС и МН, клинически проявлявшихся выраженным НС, у части — в сочетании с дисфункцией почек.

Исследование экспрессии БТШ-70 в ткани почек больных ХГН

Для подтверждения локально-почечного происхождения БТШ, экскретируемых с мочой, мы провели иммуногистохимическое исследование ткани почки больных ХГН.

БТШ-70 выявлялся в клубочках (где экспрессировался, главным образом, в подоцитах, в меньшей степени - в париетальных клетках капсулы Шумлянского-Боумена), а также в тубулоинтерстиции (в эпителиальных клетках канальцев, строме, клетках лимфогистиоцитарного инфильтрата, миофибробластах) (рис.2).

У всех больных активным ХГН с выявленной экскрецией БТШ-70 с мочой мы обнаружили этот белок и в ткани почки. В целом изменения БТШ-70 в ткани почки и моче у больных ХГН были однонаправленными (увеличивались при активных формах ХГН, главным образом, при НС), что подтверждает возможность использования мочевого показателя для оценки процессов, происходящих в ткани почки.

Экспрессия БТШ-70 в клубочке почки (подоциты, париетальный эпителий) у больного ХГН с НС (х400)

Экспрессия БТШ-70 в тубулоинтерстиции почки

(канальцы, строма) у больного ХГН с НС (х400)

Рис. 2. Экспрессия БТШ-70 в структурах почки у больных ХГН

При всех активных протеинурических формах ХГН, независимо от его морфологического варианта, преобладала тубулоинтерстициальная локализация БТШ-70. Так, выраженная (2 и более баллов) экспрессия БТШ-70 в тубулоинтерстиции отмечалась у 70% больных с НС и лишь у 30% пациентов с МС, тогда как умеренная экспрессия БТШ-70 в клубочках почек обследованных пациентов выявлялась с одинаковой частотой (рис.3). Полученные нами данные подчеркивают значимость изменений БТШ в формировании тубулоинтерстициальных изменений при ХГН.

100% 90% 80% 70%

3? — 60% X

ь 50% со

° 40% ^ 30% 20% 10% 0%

к'=6,8 р<0,01

Х^-3,9 р<0,01

100%

90%

80%

X 70% ГО

т 60%

Ю

>- 50% ^

со 40%

О

^ 30% 20%

10% 0%

[Б

^-0,27 р>0,05

МС НС

Интенсивность экспрессии:

МС

+ 1 балл, ++ 2 балла,

НС

+++ 3 балла

Рис. 3. Частота выявления тубулоинтерстициальной и гломерулярной экспрессии БТШ-70 у больных ХГН

Интенсивность тубулоинтерстициальной экспрессии БТШ-70 прямо коррелировала с показателем его мочевой экскреции, отражая индукцию синтеза БТШ в этих структурах почки в процессе повреждения (рис.4).

1+ 2+ 3+ Экспрессия БТШ-70 в ТИ

Рис. 4. Взаимосвязь между интенсивностью тубулоинтерстициальной экспрессии БТШ-70 и уровнем БТШ-70 в моче у больных ХГН

У больных с НС наиболее выраженная окраска БТШ-70 выявлялась в эпителиальных клетках канальцев, она прямо коррелировала со степенью ПУ (рис.5). В свете современных представлений о механизмах нефротоксичности ПУ, это можно расценивать как защитную реакцию тубулярных клеток в ответ на повреждение не только иммунными факторами, но и компонентами ПУ.

>

с

о

•

| Р 8=0,362 р<0 05 • •

—"

• «¿....«Я,!-

•

• •

1 ■ • •

• •

1+ 2+ 3+

Экспрессия БТШ-70 в канальцах Рис. 5. Взаимосвязь между экспрессией БТШ-70 в канальцах почки с выраженностью протеинурии у больных ХГН

Исследование уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 в моче больных ХГН

Мы оценили баланс про- и противоспалительных интерлейкинов (ИЛ-6 и ИЛ-10) в моче больных ХГН в сопоставлении с изменениями мочевых показателей БТШ.

Экскреция с мочой ИЛ-6 во всех группах больных активным ХГН была достоверно выше, чем у здоровых и пациентов с латентным течением заболевания (табл.5), ее величина прямо коррелировала с выраженностью ПУ (115=0,378 р<0,01) и длительностью сохраняющейся активности ХГН (1^=0,344 р<0,01). У больных ХГН с НС средний уровень ИЛ-6 в моче превышал таковой у пациентов с МС. При тяжелом НС экскреция ИЛ-6 с мочой была достоверно выше, чем у пациентов с умеренным НС, коррелируя с выраженностью гипопротеинемии и гипоальбуминемии (11з=-0,389 р<0,05 и 115=-0,412 р<0,05 соответственно). У больных ХГН с НС мочевой показатель ИЛ-6 прямо коррелировал с величиной сывороточного креатинина (118=0,530 р<0,01) и обратно - с СКФ (Яз=-0,505 р<0,01).

Таблица 5

Уровень экскреции с мочой ИЛ-6 у больных ХГН Ме [25; 75%] (п=84)

——-__^Г1оказатель N ИЛ-6 в моче

Группа (нг/мл)

I. ХГН с MC 34 5,44 [1,3; 12,8]°

II. ХГН с НС 30 9,97 [1,95; 25,6]° *

IIA. НС умеренный 23 9,21 [0,45; 16,38] °

IIB. НС выраженный 7 11,2 [2,61; 82,9]°*-

III. Неактивный ГН 10 5,35 [0,41; 13,1]

Здоровые 10 2,05 [1,05; 4,26]

° - р<0,05 по сравнению со здоровыми * - р<0,05 по сравнению с I и III группами ■ - р<0,05 по сравнению с IIА группой (ХГН с умеренным НС)

При нарастании активности ХГН (формировании НС, усугублении его тяжести) наряду с увеличением экскреции ИЛ-6 отмечалось повышение уровня в моче БТШ-27 и БТШ-70 (рис.6). В группе больных с НС установлена прямая достоверная корреляция между мочевыми показателями ИЛ-6 и БТШ-27 (Rs=0,44 р<0,05). Полученные нами результаты подтверждают установленную в эксперименте активацию синтеза защитных БТШ в ответ на

воздействие повреждающих, в том числе, воспалительных цитокинов (индуцированная защита) \BeckF-X. е/ а1. 2000].

Изменения уровней в моче про- и противовоспалительных интерлейкинов у больных активным ХГН носили разнонаправленный характер: при росте экскреции ИЛ-6 у пациентов с МС, и особенно с НС, отмечалось резкое снижение экскреции ИЛ-10 (рис.6). Наибольший дисбаланс мочевых показателей ИЛ-6 и ИЛ-10 наблюдался при высокоактивном течении ХГН с выраженным НС, в том числе в сочетании с нарушением функции почек.

Мы полагаем, что прогрессирование ХГН может рассматриваться как состояние дезадаптации, характеризующееся несостоятельностью механизмов самозащиты почки в условиях активного воздействия медиаторов повреждения.

хгн с мс

■ БТШ-27 иБГШ-70 * р<0,05

мочой больных

Л! П С

умеренным НС

■ ИЛ-6 нИЛ-10 * р<0,05

ХГН с выраженным НС

ХГН с МС

ХГН с ХГН с

умеренным НС выраженным НС

Рис. 6. Экскреция ИЛ-6, ИЛ-10, БТШ-27, БТШ-70 с активным ХГН

Исследование антител к БТШ-70 в сыворотке крови больных ХГН

Помимо выполнения функции внутриклеточной защиты (в качестве белков-шаперонов) обсуждаются и внеклеточные эффекты БТШ. В эксперименте установлено, что экспрессируемые на поверхности клеток эпитопы собственных БТШ распознаются Т-лимфоцитами с формированием пула регуляторных Т-клеток CD4 CD25" (Трег), продуцирующих основной противовоспалительный ИЛ-10 и ограничивающих воспалительную реакцию в ее острой и хронической фазе [Paul A.G.A.et al. 2000].

Для оценки иммунорегуляторной функции БТШ мы изучили уровень циркулирующих AT к БТШ-70 в сыворотке крови и определили в инфильтратах ткани почек количество регуляторных Т-лимфоцитов по экспрессии ими фактора транскрипции FoxP3.

Сывороточный уровень антител к БТШ-70 у больных активным ХГН, как с МС, так и с НС, был значимо выше, чем у пациентов с латентным течением заболевания (рис.7). В то же время в общей группе пациентов с НС величина данного показателя была несколько ниже, чем при МС, и обратно коррелировала с уровнем ПУ (Rs= -0,439 р<0,05); в группе больных с выраженным НС эта связь имела наибольшую силу (Rs=-0,974 р<0,05).

Неактивный ГН ХГН с МС ХГН с НС Умеренный НС Выраженный НС

Рис. 7. Уровень антител к БТШ-70 в сыворотке крови больных ХГН

Наиболее значимое снижение уровня АТ к БТШ-70 мы выявили при высокоактивном течении заболевания, клинически характеризующимся сочетанием выраженного НС с преходящим

нарушением функции почек (рис.7), что, по-нашему мнению, подчеркивает значение нарушений иммунорегуляторных эффектов БТШ и недостаточности противовоспалительной защиты почки в целом при прогрессирующих формах нефрита. На это указывают и результаты проведенного нами морфометрического исследования.

Исследование регуляторных Т-клеток в ткани почек

С помощью морфометрического подсчета РохРЗ-положительных ядер мы оценили число противовоспалительных клеток в ткани почки.

РохРЗ экспрессировался преимущественно в интерстициальных воспалительных инфильтратах ткани почки (рис.8), а также выявлялся в строме и клубочках.

Экспрессия РохРЗ в интерстициальных Экспрессия РохРЗ в интерстициальных

клеточных инфильтратах у больных ХГН с клеточных инфильтратах у больных ХГН с умеренной ПУ (I группа) (х200) НС (II группа) (х200)

Рис. 8. Накопление (РохРЗ+) Т-регуляторных клеток в ткани почек больных ХГН

У больных ХГН с НС, по сравнению с пациентами с МС, отмечалось достоверное снижение в ткани почек РохРЗ+клеток (2 [0,44; 4] клеток/п.зр. и 8,5 [3; 16] клеток/п.зр. р<0,05 соответственно), и именно в этой группе пациентов мы выявляли резкое снижение уровня ИЛ-10 в моче (рис.6) и АТ к БТШ-70 в сыворотке крови (рис.7).

Прогностическое значение уровня антител к БТШ-70 в сыворотке крови у больных ХГН

Полученные нами данные и результаты экспериментальных исследований других авторов позволили предположить, что неэффективная регуляция хронического иммунного воспаления у

больных ХГН, в том числе с участием БТШ, может приводить к персистированию и дальнейшей хронизации болезни, и, напротив, при состоятельности этой системы можно прогнозировать более благоприятное течение нефрита.

Для подтверждения данного предположения мы проанализировали характер течения ХГН и ответ на иммуносупрессивную терапию у 37 пациентов с активным нефритом (12 с МС и 25 с НС) в зависимости от исходной величины AT к БТШ-70 (рис.9).

• ремиссия нет ответа

О S 10 15 20 25

длительность иммуносупрессии, мес.

Рис. 9. Частота достижения ремиссии ХГН в группах больных с разным исходным уровнем антител к БТШ-70 в сыворотке крови (п=37)

Купирование НС и/или достижение ремиссии ХГН в течение ближайших месяцев иммуносупрессивной терапии наблюдалось у больных с высоким (выше 21 пг/мл) исходным уровнем антител к БТШ-70 в сыворотке крови. Так, у 13 из 16 (81%) пациентов с высоким уровнем антител ответ на лечение был получен в течение 12 месяцев, у 50% - в течение ближайших 5 месяцев. Напротив, у 12 из 21 (57%) пациентов с титрами антител ниже 21 пг/мл НС персистировал, несмотря на проводимое более года лечение, рекомендованное для данных форм заболевания.

Комплексный анализ изменений изученных нами мочевых и сывороточных тестов на разных этапах течения ХГН показал, что по мере нарастания активности заболевания дисбаланс повреждающих и

защитных факторов, формируется с преобладанием воспалительного звена (рис.10).

Об активности воспалительной реакции в ткани почки и выраженности клеточного повреждения у больных ХГН свидетельствует снижение уровня АТ к БТШ-70 в сыворотке крови и повышение экскреции БТШ-27, БТШ-70 и ИЛ-6 с мочой. Усугубление дисбаланса данных показателей является неблагоприятным прогностическим признаком, указывающим на риск хронизации или прогрессирования болезни.

повреждения при разной степени активности ХГН

Таким образом, подтверждена возможность оценки механизмов «самозащиты» почки с помощью изучения одного из ее звеньев -белков теплового шока. Показано, что изменения мочевых и тканевых показателей БТШ у больных ХГН подчиняются одинаковым закономерностям, что предполагает локально-почечное происхождение БТШ, выявляемых в моче. Тесные корреляции изученных мочевых и сывороточных биомаркеров с клиническими и морфологическими признаками активности ХГН позволяют использовать эти показатели для мониторирования процессов, противостоящих механизмам повреждения в почке, и, следовательно, прогнозировать течение ХГН, что важно для определения тактики лечения больных на каждом этапе заболевания.

выводы

1. У больных активными формами ХГН, независимо от его морфологического варианта, увеличивается экскреция с мочой факторов внутриклеточной защиты - БТШ-27 и БТШ-70. Выраженность этих изменений определяется особенностями клинического течения заболевания, в первую очередь, уровнем ПУ, выраженностью НС, нарушением функции почек.

2. При иммуногистохимическом исследовании ткани почки у больных ХГН экспрессия БТШ-70 выявляется во всех структурах с преимущественной локализацией в тубулоинтерстиции. Интенсивность экспрессии прямо коррелирует с клиническими признаками активности ХГН и показателем мочевой экскреции БТШ-70, что позволяет рассматривать повышенные уровни БТШ в моче как отражение индукции механизмов внутриклеточной защиты локально в почке и, с другой стороны, как косвенный маркер повреждения почечной ткани.

3. У больных активным ХГН без НС пропорционально росту ПУ увеличивается экскреция с мочой провоспалительного ИЛ-6 и противовоспалительного ИЛ-10. При формировании НС и его усугублении у больных ХГН изменения этих цитокинов в моче становятся разнонаправленными: при продолжающемся росте уровня ИЛ-6 наблюдается резкое снижение ИЛ-10, что свидетельствует об ослаблении противовоспалительного звена общей системы самозащиты почки по мере нарастания активности ХГН.

4. У больных ХГН с НС (особенно в сочетании с дисфункцией почек), в отличие от пациентов с умеренной ПУ, выявляется снижение в сыворотке крови циркулирующих АТ к БТШ-70 одновременно с уменьшением в моче уровня противовоспалительного ИЛ-10, а в ткани почки - пула клеток-продуцентов ИЛ-10 - Т-регуляторных (БохРЗ+) лимфоцитов, что отражает нарушение при высокоактивных формах нефрита внеклеточных иммунорегуляторных эффектов БТШ и указывает на их связь с нарушением противовоспалительной защиты почки в целом.

5. О выраженности воспалительной реакции с повреждением клеток почечной ткани свидетельствуют снижение уровня циркулирующих АТ к БТШ-70 в сыворотке крови и высокое содержание БТШ-70 и БТШ-27 в моче больных ХГН. Прогрессирующий характер этих нарушений является

22

неблагоприятным прогностическим признаком, указывающим на риск хронизации воспаления, торпидного течения болезни и худшего ответа на лечение.

Практические рекомендации

Определение уровня мочевых и сывороточных показателей БТШ может быть использовано в качестве неинвазивного метода оценки активности и прогноза ХГН:

1. Увеличение экскреции с мочой БТШ-27-и БТШ-70 наряду с повышением уровня циркулирующих AT к БТШ-70 в сыворотке крови у больных ХГН отражает выраженность воспаления в почечной ткани с ответной активацией внутри- и внеклеточных защитных механизмов и может служить дополнительным критерием активности заболевания и показанием для иммуносупрессивной терапии.

2. Снижение AT к БТШ-70 в сыворотке крови при нарастающем уровне БТШ-27 и БТШ-70 в моче больных ХГН свидетельствует о выраженности воспалительной реакции с повреждением клеток и о несостоятельности механизмов, противостоящих этим процессам. Такой спектр изменений БТШ указывает на высокий риск хронизации воспаления и торпидного течения болезни, что обосновывает проведение более «агрессивной» патогенетической терапии наряду с применением средств нефропротекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Защитное действие белков теплового шока при заболеваниях почек. И.Н. Бобкова, Н.В. Чеботарева, Л.В. Козловская, Н.В. Непринцева. // Клиническая нефрология. - 2011. - № 6. - С. 59-66.

2. Клинической значение определения уровня антител к белку теплового шока 70 в сыворотке крови у больных хроническим гломерулонефритом. Н.В. Непринцева, Н.В. Чеботарева, И.Н. Бобкова, Л.В. Козловская. // Сборник тезисов Пленума правления НОНР «Проблема кардиоренальных взаимоотношений в современной нефрологии»,- 2012. - С. 106-107.

3. Оценка подоцитарного повреждения по выраженности подоцитурии и уровню экскреции с мочой защитного белка актинового цитоскелета подоцитов у больных хроническим гломерулонефритом. O.A. Еськова, Н.В. Непринцева, Н.В. Чеботарева, И.Н. Бобкова, Л.В. Козловская. // Сборник тезисов Пленума правления НОНР «Проблема кардиоренальных взаимоотношений в современной нефрологии». - 2012. - С. 50-52.

4. Clinical significance of heat shock protein 70 (HSP-70) serum level in patients with chronic glomerulonephritis. Natalia Neprintseva, Natalia Tchebotareva, Irina Bobkova, Lidiya Kozlovskaya. // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2013. - Volume 28, number SI. - ¡412.

5. Urinary excretion of podocyte's damage and self-defense factors in patients with chronic glomerulonephritis (CGN). Olga Eskova, Natalia Neprintseva, Natalia Tchebotareva, Irina Bobkova, Lidiya Kozlovskaya. //Nephrology Dialysis Transplantation. - 2013. - Volume 28, number SI. -il86.

6. Определение уровня в моче маркеров повреждения и факторов самозащиты подоцитов у больных хроническим гломерулонефритом. Н.В. Чеботарева, Н.В. Непринцева, О.А. Еськова, И.Н. Бобкова, JI.B. Козловская. // Клиническая нефрология.-2013.-№4. - С. 33-37.

7. Система самозащиты почки: современный взгляд на механизмы, определяющие течение и исход гломерулонефрита. И.Н. Бобкова, Н.В. Чеботарева, J1.B. Козловская, Н.В. Непринцева. // Нефрология и диализ. - 2013. - № 3. - С. 174-183.

8. Клиническое значение определения сывороточного и мочевого показателей белка теплового шока-70 у больных хроническим гломерулонефритом. Н.В. Чеботарева, И.Н. Бобкова, Н.В. Непринцева, JI.B. Козловская. // Альманах клинической медицины. - 2014. - № 30. - С. 18-24.

9. Исследование белка теплового шока молекулярной массой 70 кД в сыворотке крови и моче у больных хроническим гломерулонефритом. Н.В. Чеботарева, Н.В. Непринцева, И.Н. Бобкова, JI.B. Козловская. // Терапевтический архив. - 2014. №6 -С. 18-23.

10. Urinary levels of inflammatory, profibrogenic and kidney self-defense factors in patients with chronic glomerulonephritis (CGN). Natalia Neprintseva, Natalia Tchebotareva, Irina Bobkova, Lidiya Kozlovskaya. // Nephrology Dialysis Transplantation. - 2014. - Volume 29, number S3. - p. iii445-iii446.

11. Определение белков теплового шока в моче, сыворотке крови и ткани почки: значение в оценке активности и прогноза хронического гломерулонефрита. Н.В.Чеботарева, Н.В. Непринцева, И.Н. Бобкова, JI.B. Козловская, В.А. Варшавский. // Клиническая нефрология. - 2014. - № 5. - С. 6-11.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертония

АТ - антитела

БТШ - белки теплового шока

БТШ-27 - белки теплового шока с молекулярной массой 27 кДа

БТШ-70 - белки теплового шока с молекулярной массой 70 кДа

ИЛ-6 - интерлейкин 6

ИЛ-10 - интерлейкин 10

Ме - медиана

МН - мембранозная нефропатия

МИ - минимальные изменения

МКГН - мезангиокапиллярный гломерулонефрит

МПГН - мезангиопролиферативный гломерулонефрит

МС - мочевой синдром

НС - нефротический синдром

ПН - почечная недостаточность

ПУ - протеинурия

СКФ - скорость клубочковой фильтрации

СПУ - суточная протеинурия

Трег - регуляторные Т-лимфоциты

ТИ - тубулоинтерстиций

ФСГС - фокально-сегментарный гломерулосклероз

ХГН - хронический гломерулонефрит

ХПН - хроническая почечная недостаточность

заметок

Объём 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 251478 Подписано в печать 15 декабря 2014 г.

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912X772801001 Адрес: 105066. г. Москва, Лефортовский пер., дом 8, корпус 2. Тел. 728-97-17, +7(499)261-78-22. http://www.onlinecopy.ru