Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Онкомаркеры папиллярного рака щитовидной железы

на правах рукописи

РОЖКОВА Екатерина Борисовна

□0305753В

ОНКОМАРКЕРЫ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

/14.00.15. - «Патологическая анатомия»/

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003057538

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени ИМ СеченоваРосздрава

Научный руководитель - академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Пальцев

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Всеволод Борисович Золотаревский

доктор медицинских наук, профессор Аполлон Ирадионович Карселадзе

Ведущая организация Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится « KL » J-^AiS1_2007 г в /У- часов

на заседании диссертационного совета Д 208 040 01 при ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени И М Сеченова Росздрава (119991, Москва, Трубецкая ул , д 8, стр 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии имени ИМ Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д 49)

Автореферат разослан « »

2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, Владимир Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор Варшавский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

На долю рака щитовидной железы (РЩЖ) приходится от 1 до 4 % всех злокачественных опухолей, а как известно, смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире Эксперты ВОЗ разрабатывают новые подходы к диагностике РЩЖ, в которых рекомендуется использовать сочетание морфологического метода с молекулярно-биологическими и генетическими с определением биомолекулярных маркеров опухоли (ВОЗ, 2005) Изучение биомолекулярных маркеров и генетической нестабильности в РЩЖ имеет важное значение для определения ее злокачественного потенциала и выбора терапии

Одним из основных свойств опухоли является автономный безудержный рост, регуляция которого происходит по различным митогенетическим путям Каждая опухоль может быть индивидуальна в плане активации тех или иных митогенетических цепочек (МЦ), но в то же время могут существовать и стереотипные МЦ для определенных типов опухолей c-Met, c-erbB2, c-kit являются трансмембранными рецепторами к факторам роста (тирозинкиназами), которые активируют цитоплазматические киназы, а те - ядерные транскриптазы, что в конечном итоге приводит к росту опухолевой ткани [Sobnnho-Simoes М et al, 2005] Caveolin - 1 также участвует в нескольких МЦ ингибирует передачу сигналов от EGFR и ERK-2 к ядру и регулирует межклеточное взаимодействие посредством даун-регуляции Е-кадгерина [Cohén A W et al, 2004]

В литературе имеются единичные исследования по корреляции мутаций RAS и с клинико-патоморфологическими параметрами и

прогнозом послеоперационного течения папилярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ) [García-Rostan G. et al, 2003, Trovisco V. et al, 2004; Xing M et al, 2005]

Таким образом, в проблеме ПРЩЖ остаются нерешенными вопросы

• о роли маркеров пролиферации (Ki-67, c-kit, c-Erb В2, c-Met, caveolin-1, EGFR) и апоптоза (p53), дифференцировки (тиреоглобулин, RET-онкоген) и степени злокачественности (CD 10, НВМЕ-1) в ПРЩЖ,

• о частоте мутаций RAS при ПРЩЖ и их корреляцию с клинико-патоморфологическими параметрами,

• о частоте мутаций BRAF при ПРЩЖ и их корреляцию с клинико-патоморфологическими параметрами,

• о прогнозировании послеоперационной выживаемости больных с разными гистологическими вариантами и стадиями заболевания ПРЩЖ.

Целью настоящей работы явилось изучение маркеров пролиферации и апоптоза, дифференцировки и степени злокачественности, а также мутаций в генах RAS и BRAF в папиллярном, фолликулярном и оксифильном вариантах папиллярного рака щитовидной железы, позволяющих определить злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивов опухоли

Для реализации цели были поставлены следующие задачи

1. охарактеризовать морфологические и иммуногистохимические особенности папиллярного варианта (ПВ), фолликулярного варианта (ФВ) и оксифильного варианта (ОКФВ) ПРЩЖ в зависимости от стадии заболевания,

2. определить экспрессию опухолевых маркеров (р53, EGFR, RET-онкоген, тиреоглобулин, виментин, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD10, c-kit, Ki-67/MIB-l) (первых четырех посредством иммунногистохимии, остальных методом предварительной tissue microarray) в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

3. выявить мутации гена NRAS, HRAS экзоны 1 и 2 (посредством проведения ПЦР, SSCP, секвенирования) в в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ,

4. изучить мутации гена BRAF (посредством проведения ПЦР, SSCP,

секвенирования) в в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

5 провести анкетирование пациентов, перенесших оперативное вмешательство по поводу рака щитовидной железы для анализа выживаемости и рецидивирования; ,

6 оценить возможности прогнозирования выживаемости и рецидивирования у больных, перенесших оперативное вмешательство по поводу рака щитовидной железы, в зависимости от уровня экспрессии опухолевых маркеров (р53, ЕОРЯ, НЕТ-онкоген, тиреоглобулин, виментин, НВМЕ-1, с-Ме1, с-етЬ В2, сауео1т-1, СБ 10, с-кц, К1-67/МШ-1) и мутациий в генах (ВЕЛЕ, ЫМЯ, НМБ экзоны 1 и 2) в ПРЩЖ

Научная новизна.

С помощью комплекса морфологических и иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов была получена характеристика ПРЩЖ в зависимости от гистологического типа, стадии заболевания и наличия рецидивов опухоли Установлено, что пролиферация опухолевых клеток при разных гистологических типов ПРЩЖ осуществляется за счет работы различных МЦ, активность которых зависит от фенотипа опухоли В пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенетические цепочки с участием с-кН, с-егЬ В2, с-Ме^ сауео1ш-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с с-кИ, с-Ме^ с-егЬ В2, а в ОКФВ -сауео1ш-1, с-егЬ В2 и с-Ме1; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности В ходе опухолевой профессии ПРЩЖ, при развитии отдаленных метастазов и рецидивировании опухоли вклад в пролиферацию опухолевых клеток таких митогенетических стимулов, как с-Ы, с-егЬ В2 снижается, что, вероятно, компенсируется другими ростовыми факторами. Показано, что количество экспрессируемого р53 в ПРЩЖ не всегда является прогностическим фактором

Найдены молекулярные прогностические критерии Так, СИЮ увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть использован

как прогностический маркер. Риск рецидива ПРЩЖ возрастает при уменьшении уровня экспрессии тиреоглобулина, c-erb В2, c-Met и c-kit и увеличении уровня экспрессии EGFR RAS и BRAF мутации являются маркерами агрессивного поведения рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с МБЗ С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания Практическая значимость работы.

Разработаны иммуногистохимические и молекулярно-биологические критерии, позволяющие охарактеризовать злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивирования ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ Полученные результаты по участию разных МЦ в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ показывают необходимость разработки индивидуальных методов прогнозирования и дальнейшей таргетной терапии при лечении этих опухолей При ПРЩЖ р53 не всегда является прогностическим фактором за счет перекрестного реагирования антител В практической работе врачей-патологоанатомов и онкологов нами рекомендуется использование иммуногистохимического исследования ключевых факторов основных МЦ в ПРЩЖ (c-kit, c-erb В2, c-Met, caveohn-1), маркеров пролиферации (Ki-67), инвазивного роста (CD10) и злокачественности (НВМЕ-1), а также определение RAS и BRAF мутаций с целью прогнозирования течения заболевания, выживаемости и эффективности таргетной терапии

Основные положения, выносимые на заццпу. 1 Папиллярный, фолликулярный и оксифильный варианты папиллярного рака щитовидной железы отличаются молекулярно-биологическими особенностями и по-разному экспрессируют маркеры пролиферации, дифференцировки и степени злокачественности

2 Полиморфизм HRAS экзоиа 1 и NRAS мутации являются маркерами агрессивного поведения папиллярного рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза

3 Наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный маркер плохого прогноза при папиллярном раке щитовидной железы Обнаружена новая мутация в гене BRAF (кодон S604I) в опухолевой ткани папиллярного рака щитовидной железы

4. Прогноз у больных папиллярным раком щитовидной железы определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с морфотогичесюш баллом злокачественности н экспрессией онкомаркеров таких, как тиреоглобулин, c-erb В2, c-Met, с-kit, EGFR и р53 С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания

Апробация работы.

Апробация диссертации проведена 21 марта 2007 года на заседании кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО ММА им И М Сеченова Росздрава Материалы работы представлены на научных конференциях кафедры патологической анатомии ГОУ ВПО ММА им ИМ Сеченова Росздрава (апрель, декабрь 2006 г), на заседании общества тиреоидологов Института Патологии и Иммунологии города Порто (Португалия, апрель 2005 г), на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, январь 2004 г)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, из них 2 статьи в центральной печати

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения В приложении приводятся протоколы проведенных исследований Диссертация содержит 131 страницу машинописного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 19 рисунками (из них 27 микрофотографий, 23 гистограммы) Проанализировано 172 источника литературы, из них 11 отечественных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материал и методы исследования.

Исследование выполнено на операционном материале полностью удаленных щитовидных желез (ЩЖ) или их фрагментов от 59 больных, оперированных в ФХК ММА им ИМ Сеченова (34 случая за период 19981999 гг) и ГКБ № 61 (25 случаев за период 1998-2000 г г) по поводу узловых образований ЩЖ. Было изучено 3 основных гистологических варианта ПРЩЖ по максимально преобладающему характеру опухолевых структур ПВ, объединивший в себе классическую и инкапсулированную папиллярную карциному — 29 случаев, ФВ, объединивший в себе неинкапсулированный и инкапсулированный папиллярный рак с фолликулярным строением - 22 случаев, ОКФВ (рак из клеток Гюртля) - 8 случаев Кроме того, исследована окружающая ткань ПРЩЖ, где был диагностирован тиреоидит Хашимото (12 случаев), а также сохранная ткань щитовидной железы (8 случаев) В представленном материале женщины (52 случая) преобладали над мужчинами (7 случаев) в соотношении 7 4 1 Средний возраст больных ПРЩЖ составил 48 7 лет, возраст больных женщин был несколько выше по сравнению с мужчинами

В работе использовались гистологический и гистохимический методы

Технология множественно-тканных парафиновых блоков'. Tissue microarray - множественно-тканный парафиновый блок, в который из

донорных блоков перемещают столбики ткани в организованном порядке В данном случае было 24 столбика разных тканей на одном стекле - 22 образца ткани ЩЖ и 2 образца-контроля (аппендикс и селезенка\молочная железа) Готовые серийные гистологические срезы, сделанные по методике ТМА, окрашивались гематоксилином и эозином по общепринятым методикам

Иммуногистохимический метод Иммуногистохимические реакции проводились на серийных парафиновых срезах (тиреоглобулин, р53, RET — онкоген и EGFR) и на срезах, сделанных по методике ТМА (НВМЕ-1, c-Met, с-erb В2, caveolin-1, CD 10, c-kit и Ki67) Демаскировка антигена осуществлялась путем инкубации срезов в течение 20 минут в микроволновой печи при мощности 600 Вт в растворе 10 мМ цитратного буфера с pH 6 0 (тиреоглобулин, р53, RET -онкоген, EGFR, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD10, c-kit и Ki-67) Эндогенная пероксидаза блокировалась при обработке срезов в течение 10 мин в 3 % перекиси водорода. В качестве первичных антител использовались монокпональные антитела к тиреоглобулину (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1.100), продуюу экспрессии онкогенов RET (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1'40), р53 (DAKO, Германия, в концентрации 1 50) и EGFR (DAKO, Германия, в концентрации М00), HBME-l(DAKO, Германия, в концентрации 1.50), c-Met (Zymed, США, в концентрации 1 100), с-erb В2 (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1 60), caveolm-1 (BD Transduction Laboratories, С1ИА, в концентрации 1-400), CD 10 (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1:150), c-kit (DAKO, Германия, в концентрации 1 500), Ki-67 (Novocastra, Великобритания, в концентрации 1 50) В качестве вторичных антител использовались биотиншшрованные иммуноглобулины мыши и кролика (DAKO, Германия, в концентрации 1 200) В качестве фонового окрашивания применялся гематоксилин Позитивным контролем в реакциях с тиреоглобулином, р53 и EGFR являлись фолликулы окружающей ткани ЩЖ, в

'Выражаю искреннюю благодарность гдеофессорам М Собрино-Симоэшу и П. Соареш, а также молекул)фным биологам ИПАТИМУП (Института Патологии и Иммунологии Университета г Порто), Португалия за помощь в проведении исследовательской работы

реакциях с RET - онкогеном использовалась в качестве контроля ткань медуллярного рака ЩЖ Позитивным контролем в реакциях с НВМЕ-1, c-Met, с-erb В2, caveolin-l, CD 10, c-kit и Ki67 являлась ткань аппендикса. Негативный контроль проводился без первичных антител Результаты иммуногистохнмических реакций в случае цитоплазматической локализации продукта реакции (шреоглобулин, RET, EGFR, НВМЕ-1, c-Met, c-eib В2, caveolin-l, CD 10, c-kit) оценивались в баллах (от 1 до 6) методом полуколичественного анализа с учетом количества окрашенных клеток (п) п менее 20 % -1-2 балла, п от 20 до 50 % - 3-4 балла, п более 50 % - 5-6 баллов В случае ядерной локализации продукта реакции (р53, Ki-67) подсчитывался процент окрашенных ядер на 300 опухолевых клеток из разных участков препарата.

ПЦР, изучение конформационного одноцепочечного полиморфизма и секвенирование. ДНК опухоли была оценена на предмет точечных мутаций в кодонах 12 и 61 Я и NRAS, а также на наличие мутаций в гене BRAF экзон 15 путем ПЦР или последовательных реакций - ПЦР-SSCP При SSCP образцы были проанализированы гелевыми матрицами, повышающими обнаружение мутации (MDE, FMC BioProducts, США) при 180V и 8 С в течение 15 часов Продукты ПЦР-SSCP визуализировались стандартным серебрением ДНК Повторно амплифицированные участки ДНК были выделены, подвергнуты очистке посредством экзонуклеазы I («New England Biolabs», Великобритания) и щелочной фосфатазы («Amersham Biosciences», США) с последующим автоматическим секвенированием Секвенирование было выполнено на приборе ABI pnsm 3100 Genetic Analyser («Perkin-Elmer», США) Определялась частота мутаций BRAFV59n', H и NRAS в процентах.

Изучение прогноза по данным клинического обследования и разработок архивных материалов Было обследовано 25 пациентов, прооперированных за период 1998-2000 г г в московской городской клинической больнице № 61 по поводу узловых образований щитовидной железы, до операции и велось наблюдение за данными пациентами с момента операции и по сегодняшний день Были проведены разработка архивных материалов и анкетирование

данных пациентов для проведения сравнительного анализа между уровнем экспрессии опухолевых маркеров (р53, EGFR, ret-онкоген, тиреоглобулин, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolm-1, CD10, c-kit, Ki67, В RAF, II и NRAS) в ПРЩЖ и выживаемостью, метастазированием Для распределения больных по группам риска использован прогностический индекс, составленный D Вуаг и соавторами в 1979 году Суть индекса заключается в суммации баллов, определяющих по коэффициентам регрессии удельный вес ряда факторов в прогнозе, что служит основой построения групп риска

Статистический анализ Проводился корреляционный анализ по методу Спирмена во всей груше ПРЩЖ, а также - в ПВ и ФВ как наиболее многочисленных гистологических вариантах, определялся коэффициент отклонения средней с использованием программы Statistica for Microsoft Windows, version 5 0, StatSoft Inc, США Построение гистограмм и графиков осуществлялось с помощью компьютерной программы Microsoft Excel, 2002

Результаты исследования и их обсуждение.

1 Морфологическая характеристика, оценка злокачественного потенциала, прогноз с учетом гистологического варианта ПРЩЖ и стадии заболевания

Были выделены основные гистологические варианты ПРЩЖ, имевшие разное гистоархитектурное и цитологическое строение ПВ (29 случаев), ФВ (22 случая) и ОКФВ (8 случаев) Данные гистологические варианты имели общий критерий диагностики - наличие в опухолевых клетках патогномоничных ядер крупных, овальной или овально-округлой формы, оптически прозрачных, накладывающихся друг на друга, с бороздками и эозинофильными внутриядерными включениями, с неровными зазубренными контурами и редко встречающимися мелкими ядрышками Исключение в диагностике составил ОКФВ, для которого были характерны полиморфные, гиперхромные ядра с неровными контурами и хорошо выраженным

ядрышком Однако, этот вариант характеризовался исключительно сосочковым типом роста Средний возраст больных - 54,2 года

У всех больных с опухолью рТ3 и рТ4 были обнаружены рецидивы Летальность больных с опухолью рТ4 в 1,5 раза выше, чем при остальных Влияние гистологического строения ПРЩЖ проявляеся при длительном сроке наблюдения за больными, более 5 лет В сроки от б до 8 лет после операции рецидивы чаще развивались у больных ГТВ ПРЩЖ по сравнению с больными ФВ ПРЩЖ, также выживаемость больных в эти сроки была ниже при папиллярных формах опухолей В случаях при незначительном сроке наблюдения за больными (до 5 лет) незаменимыми оказываются такие вспомогательные методы, как иммуногистохимические и молекулярно-биологические

2. Иммуногистохимическая характеристика разных гистологических вариантов ПРЩЖ с учетом стадии опухолевой прогрессии Маркеры пролиферации и аиоптоза в ПРЩЖ. Экспрессия К1-67/М1В-1 в ПРЩЖ. Ю-67 экспрессировался во всел вариантах ПРЩЖ, кроме нормальной тиреоидной ткани, очагов тиреоидизации и метастазов Экспрессия Кл-67 во всех наблюдениях ПРЩЖ была достаточно низкой, что совпадает с данными других авторов Наибольший уровень экспрессии был выявлен в ФВ и составил 3,7 %, наименьший - в ПВ - 3 % (рис 1а) К1-67 - маркер пролиферации и активируется только в опухолевых клетках; отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ Достоверных различий в уровне экспрессии Кл-67 у пациентов с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ не было найдено (3,1 и 3,3 % соответственно; р=0,93)

Экспрессия с-кН в ПРЩЖ. Самый рысокий уровень с-кп был обнаружен в ПВ и составил 4,9 (рис 16) Примерно одинаковый уровень экспрессии с-кп обнаружен в остальных вариантах и нормальной тиреоидной ткани, а также очагах тиреоидизации Найдено, что у пациентов ФВ с

у

1а

16

Рисунок 1. Гистофаммы. Экспрессия онкомаркеров в разных гистологических вариантах ПРЩЖ. 1а-К]-67; 16-с-кк; 1в-с-егЬВ2; 1г-с-Ме1; 1д-сауео1т-1; 1е- СШО; 1ж-НВМЕ-1; 1з-ЕОГС; 1и - р53.

отдаленными метастазами уровень экспрессии с-кк ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (0 и 4,3 балла соответственно, р=<0,01) Полученные данные подтверждают изменчивость уровня экспрессии с-кП в ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ. Полученное нами резкое снижение содержания с-кк в рецидивирующих опухолях на первый взгляд противоречит тому, что, как известно, с-кк индуцирует сигналы, приводящие к быстрой пролиферации клеток Однако, как было установлено ранее, данный маркер обнаруживается в небольших количествах в неизмененной ткани щитовидной железы, возрастает в аденомах и слабо экспрессируется в ПРЩЖ Следовательно, можно высказать предположение, что с-кП рецептор вовлечен в контроль роста эпителия ЩЖ только на ранних стадиях опухолевой прогрессии. На более поздних стадиях роста ПРЩЖ главенствующее значение имеют другие МЦ В то же время, вероятно и низкий уровень пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ в целом также обусловлен потерей экспрессии с-кк.

Экспрессия с-егЬ В2 в ПРЩЖ. Самый высокий уровень экспрессии с-егЬ В2 в ПВ и составил 7,2, самый низкий - в ФВ (5 баллов; рис 1в) Следует отметить, что уровень экспрессии с-егЬ В2 в нормальной окружающей ткани ЩЖ достаточно высок (4,8 баллов). Полученные результаты показывают, что МЦ с с-егЬ В2 принимает участие в пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ. При этом наибольшая активность МЦ с с-егЬ В2 наблюдается в ПВ и в ОКФВ, также принимает участие в ФВ, но на более низком уровне активности. Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии с-егЬ В2 ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (2 и 6,2 балла соответственно; р<0,01) Полученные данные показывают, что с-егЬ В2 не имеет решающего значения на поздних стадиях роста ПРЩЖ

Экспрессия c-Met в ПРЩЖ. Самый высокий уровень экспрессии с-Ме1 был в ОКФВ и составил 6,3; самый низкий - в ФВ (5,2 балла, рисЛг) Была также выявлена экспрессия с-Ме1 в нормальной тиреоидной ткани и

тиреоидите, но намного ниже, чем в ПРЩЖ (4,2 балла). Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии с-Ме1 достоверно ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (4 и 5,1 балла соответственно; р=0,049). Это объясняется ролью, которую играет МеШСР-Я в патогенезе этой формы рака, поскольку он способствует росту клеток, поляризации их мембран, то по всей видимости его потеря является одним из этапов канцерогенеза папиллярного рака, в результате которого опухоль преобретает более агрессивные свойства и увеличивает свои метастатические способности Таким образом, можно предположить, что снижение экспрессии с-Ме1 в ФВ является плохим прогностическим признаком

Экспрессия са\'еоНп-1 в ПРЩЖ. Сауео1т-1, выявленный в нашем исследовании, является туморогенным и отличается от нормально функционирующего тем, что активирует множество различных МЦ Самый высокий уровень экспрессии сауеоНп-1 зарегистрирован в ОКФВ (7,3 балла), самый низкий - в ФВ (5,9 баллов; рис 1д) Уровень экспрессии сауеоИп-1 в ПВ занимает промежуточное значение (6,8 балла). Уровень экспрессии в метастазах значительно ниже (5 баллов) по сравнению с первичной опухолью (8 баллов) Самое низкое содержание сауеоПп-1 выявлено в нормальной окружающей ткани ЩЖ (3,8 балла) Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии сауео1т-1 выше по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (8 и 6,7 балла соответственно; р=0,037) Прогностическое значение сауеоПп-1 объясняется его биологическими функциями в клетках Через сауеоНп-1 передаются митогенетические сигналы многих цепочек (БОРИ, ЯаГ, МЕК-1 и ЕЯК), на которые он оказывает ингибирующее действие в норме Широко распространенная ассоциация сауео1т-1 с кавеолами с многочисленными путями трансдукции сигнала предполагает, что преобразование нормально функционирующего сауео1т-1 в туморогенный служит общей точкой, которая функционально регулирует множество сигнальных путей Кроме

того, показано, что эндотелиальные клетки сосудов с избытком сауеоНп-1 принимают участие в усилении ангиогенеза в опухолях, что стимулирует рост опухоли

Экспрессия ЕС№ в ПРЩЖ. Средние значения экспрессии были довольно высокими и достигали 36 % и 30 % ЕСР11-положительных клеток при ПВ ПРЩЖ и ФВ ПРЩЖ соответственно, 50 % в ОКФВ, что говорит о более злокачественном потенциале ОКФВ ПРЩЖ, более неблагоприятном прогностическом значении и о более высоком риске рецидива (рис 1з)

Экспрессия р53 в ПРЩЖ. Мутантный р53 экспрессируется в ПРЩЖ Средние значения экспрессии были довольно высокими и достигали 27,1 % и 34,8 % р53-положительных клеток при ПВ ПРЩЖ и ФВ ПРЩЖ соответственно, 37 % в ОКФВ (рисЛи). Более высокий уровень экспрессии р53 в инкапсулированных формах ПРЩЖ по сравнению с неинкапсулированными можно интерпретировать тем, что в инкапсулированных формах за счет перекрестного реагирования антител мы выявили нормальный дикий тип р53, а уже в неинкапсулированных -мутантный р53. Но более высокая экспрессия р53 при ФВ ПРЩЖ 34,8 %, чем при ПВ ПРЩЖ 27,1 % противоречит данным других авторов и может быть интерпретирована неоднозначно. Один из вариантов- при ФВ ПРЩЖ нормальный р53 еще функционирует, при ПВ ПРЩЖ мы опеределили мутантный р53 Следует также сказать, что количество экспрессируемого р53 не всегда является прогностическим фактором

Маркеры степени злокачественности ПРЩЖ. Экспрессия СОЮ в ПРЩЖ. Изменение экспрессии СОЮ в зависимости от гистологического строения ПРЩЖ самый высокий уровень экспрессии в ПВ (2,4 балла), и одинаково низкие уровни в ФВ и ОКФВ (2 балла; рис.1е) В нормальной тиреоидной ткани, очагах тиреоидизации и метастазах экспрессия СОЮ не обнаружена Достоверных различий в уровне экспрессии СБ 10 с метастазирующими и неметастазирующими опухоляги ФВ (2,1 и 2,3 балла соответственно) не выявлено (р=0,98) СБ 10

увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть использован как прогностический маркер (1,2 и 0,5 балла соответственно, р=0,032) Не следует забывать о том, что экспрессия CD 10 коррелирует с гистопатологическими критериями плохого прогноза, учитывая его роль в туморогенезе и прогностическом анализе

Экспрессия НВМЕ-1 в ПРЩЖ. Изменение экспрессии НВМЕ-1 в зависимости от гистологического строения- самый высокий уровень экспрессии в ПВ и в ОКФВ, самый низкий - в ФВ (рис 1ж) Достоверных различий в уровне экспрессии НВМЕ-1 у пациентов с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ (2,9 и 3,2 балла соответственно, р=0,96) не выявлено Полученные данные говорят о диагностической ценности НВМЕ-1 как положительного маркера злокачественности для дифференцированных карцином щитовидной железы, таких как папиллярный РЩЖ В нормальной тиреоидной ткани, очагах тиреоидизации и метастазах экспрессия НВМЕ-1 не обнаружена

Резюмируя полученные данные, следует отметить, что в пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1 При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb В2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-erb В2 и c-Met, в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности. CD 10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть использован как прогностический маркер (р=0,032) Определение уровня экспрессии НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD 10, c-kit и Ki-67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования

3 RAS мутации при ПРЩЖ

Проведенное исследование показывает, что полиморфизм и мутации RAS были идентифицированы в 4 из 59 опухолей (6,8 %) HRAS полиморфизм был обнаружен в 3 из 59 опухолей (5,1 %) За 8 лет послеоперационного наблюдения умер от заболевания только один пациент с мутацией NRAS (1,7

%), в то время как не было обнаружено ни одной мутации HRAS Одиночные формирующие RAS мутации были маркером плохой выживаемости в нашей группе, тогда как наличие полиморфизма не влияло на выживаемость Результаты нашего исследования демонстрируют явную связь между NRAS мутациями, а также HRAS полиморфизмом и неблагоприятным прогнозом Хотя необходимы дополнительные и особенно проспективные исследования, чтобы объяснить далее отношения между активацией RAS онкогена и неоплазией ЩЖ, наши результаты указывают, что генотипирование RAS может иметь существенную ценность как прогностический индикатор и может обеспечить обоснование новым методам лечения

4 BRAF мутации при ПРЩЖ

Обнаружена мутация BRAFvmE в 37,9 % ПВ ПРЩЖ Этот процент лежит в нижнем участке диапазона предыдущих сообщений о ПРЩЖ (36-69 %), но по существу имеет ограниченную ценность, так как мы демонстрировали также, что распространенность мутации существенно изменяется от одного гистологического типа до другого Мутация BRAFVS99E присутствовала в 36,4 % случаев ФВ ПРЩЖ (8/22), что не совпадает с данными литературы Мутация BRAFvmu присутствовала в 50 % случаев ОКФВ ПРЩЖ (4/8), что говорит о более плохом прогнозе данного варианта ПРЩЖ среди изученных нами В полученных нами результатах наличие мутаций BRAF не коррелирует с клинической стадией развития онкопатологии (р = 0,3), что противоречит данным литературы Найденная нами в одном из 22 случаев ФВ ПРЩЖ (4,5 %) необычная мутация в гене BRAF (кодон S604I), не описанная ранее в литературе, требует дальнейшего изучения Функциональное значение мутаций i?&4FV599E и BRAF86041 в канцерогенезе ПРЩЖ все еще остается неизвестным, хотя обычно им приписывают роль активации пути МАРК Низкая пролиферация и низкая апоптотическая активность ПРЩЖ, а так же антиапоптотическая роль BRAF, говорят в пользу более благоприятного прогноза течения заболевания, по сравнению с опухолями, несущими мутированный ген BRAF Таким

образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наличие мутации гена ВЯАР может быть использовано как потенциальный прогностический маркер при ПРЩЖ

5 Прогноз послеоперационной выживаемости при разных гистологических вариантах ПРЩЖ с учетом пола, возраста и молекулярно-биологических особенностей опухолей

Прогностический индекс (ПИ). Был изучен также ПИ, в который заложен многофакторный анализ, отражающий разные аспекты проявления ПРЩЖ, что позволяет более четко прогнозировать исход заболевания Из 25 больных с известными отдаленными результатами лечения, которые наблюдались от б до 8 лет после первичной операции, заболевание рецидивировало у 9 пациентов (36 %). Рецидив явился причиной смерти 1 больной, которая погибла от местного распространения и генерализации опухолевого процесса Всего выжило в сроки от 6 до 8 лет 23 больных (92 %) (1 больная умерла от инфаркта миокарда через 4 года после перенесенной операции без признаков рецидива и метастазов в течение всего периода наблюдения) Суммарная летальность составила 8 % Группа риска значительно влияла на возникновение рецидивов и выживаемость больных в сроки от 6 до 8 лет после операции с возрастанием группы риска увеличивался процент рецидивов, снижалась выживаемость больных Факторы, влияющие на послеоперационное течение болезни. Пол больного. В сроки от 1 года до 8 лет после первичной операции под наблюдением находились 2 мужчин и 23 женщины В процентном отношении рецидив у женщин развивался в несколько раз чаще, чем у мужчин, также и летальность среди женщин значительно превышала таковую среди мужчин Однако после статистической обработки этих данных можно заключить, что в настоящих исследованиях пол больных не влиял на частоту развития рецидивов (р = 0,226) и 8-летнюю выживаемость (Х2 = 0,91)

Возраст больных. Для исследования влияния возраста на прогноз все 25 находившихся под наблюдением больных в сроки от б до 8 лет после первичной операции были разделены на две возрастные группы Первую группу, к которой принадлежали больные моложе 45 лет, составили 10 человек, и вторую группу, к которой принавдлежали больные в возрасте 45 лет и старше, составили 15 человек В сроки от 6 до 8 лет после операции выживаемость больных, чей возраст был менег 45 лет, составила 100 %, в то же время выживаемость больных из группы 45 лет и старше в эти же сроки наблюдения равнялась 86,7 % Процент рецидивов в группе больных 45 лет и старше в 9 раз превышал таковой из группы больных моложе 45 лет. После статистической обработки данных можно сказать, что выживаемость больных моложе 45 лет в сроки от 6 до 8 лет после операции превышала выживаемость больных, возраст которых равнялся 45 годам или превышал эту границу (%2 ~ 4,23, уровень значимости а - 5 %)

Особенности экспрессии онкомаркеров у 9 больных с рецидивом ПРЩЖ. Достоверных различий в уровне экспрессии Кл-67 у пациентов с и без рецидива не выявлено (3,3 и 3,4 % соответственно, р=1,0)

Средний уровень экспрессии с-кк составил 4,3 в группе больных без рецидива и 1,6 у больных с рецидивом (р=0,02б) Полученные данные подтверждают изменчивость уровня экспрессии с-ки в ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, которую наблюдали многие авторы. Полученное нами резкое снижение содержания с-ки в рецидивирующих опухолях на первый взгляд противоречит тому, что, как известно, с-Ы индуцирует сигналы, приводящие к быстрой пролиферации клеток Однако, как было установлено ранее, данный маркер обнаруживается в небольших количествах в неизмененной ткани щитовидной железы, возрастает в аденомах и слабо экспрессируется в карциномах ЩЖ. Следовательно, можно высказать предположение, что с-кИ рецептор вовлечен в контроль роста эпителия щитовидной железы только на ранних стадиях опухолевой прогрессии

У пациентов с рецидивом уровень экспрессии с-егЬ В2 в первичной опухоли значительно ниже, чем без рецидива (1,25 и 6,3 балла соответственно, р<0,01) Полученные результаты показывают, что МЦ с с-етЬ В2 принимает участие в пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ

У пациентов с рецидивом уровень экспрессии с-Ме1 был ниже, чем без рецидива (4,7 и 5,9 балла соответственно, р=0,048) Это объясняется ролью, которую играет МеШОР-Л в патогенезе этой формы рака, поскольку МевТЮР-К. способствует росту клеток, поляризации их мембран, то по всей видимости его потеря является одним из этапов канцерогенеза папиллярного рака, в результате которого опухоль преобретает более агрессивные свойства и увеличивает свои метастатические способности Таким образом, можно предположить, что снижение экспрессии с-Ме1 в ФВ является плохим прогностическим признаком

Достоверных различий в уровне экспрессии сауео1т-1 у пациентов с и без рецидива ПРЩЖ не выявлено (5,9 и 6,8 балла соответственно, р=0,67)

Средний уровень экспрессии ЕвРЯ составил 2,78 в группе больных без рецидива и 3,3 у больных с рецидивом, что позволяет утверждать, что высокий уровень экспрессии ЕСРК имеет неблагоприятное прогностическое значение и ассоциирован с высоким риском рецидива

Средний уровень экспрессии р53 составил 3,56 в группе больных без рецидива и 2,66 у больных с рецидивом Более высокий уровень экспрессии р53 в первой группе больных по сранению со второй можно интерпретировать тем, что в группе больных без рецидива за счет перекрестного реагирования антител мы выявили нормальный дикий тип р53, а уже у больных с рецидивом - мутантный р53 Следует также сказать, что количество экспрессируемого р53 не всегда является прогностическим фактором

Средний уровень экспрессии тиреоглобулина составил 4,24 в группе больных без рецидива и 3,4 у больных с рецидивом Полученные данные позволяют утверждать, что чем меньше уровень экспрессии тиреоглобулина

(тем менее дифференцирован ПРЩЖ), тем больше вероятность развития рецидивов

ЫЕТ-онкоген экспрессировался только в одном случае (больной с ОКФВ ПРЩЖ) и уровень экспрессии составил 2,0, а частота экспрессии -20 %. В группе больных без рецидива ЛЕТ-онкоген был обнаружен в 4 случаях, а частота его экспрессии была равна 8,2 %, средний уровень экспрессии составил 1,13 При увеличении частоты экспрессии Г1ЕТ-онкогена имеется тенденция к увеличению риска рецидивирования ПРЩЖ

Достоверных различий в уровне экспрессии СБ 10 и НВМЕ-1 у пациентов с п без рецидива не выявлено (2,0 и 2,1 балла, р=0,99, 3,0 и 33 балла; р=0,9б соответственно)

После статистической обработки можно сказать, что уровень экспрессии тиреоглобулина, БОРЯ, с-егЬ В2, с-Мй и с-Ы значительно влиял на возникновение рецидивов после операции (%1 = 5,11 и = 12,11 соответственно) Однако малое число случаев не позволяет рассчитывать на достоверность полученных результатов в подгруппах, соответствующих гистологическим вариантам

Пролиферация опухолевых клеток при разных гистологических типах ПРЩЖ осуществляется за счет работы различных МЦ, активность которых зависит от фенотипа опухоли В ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, при развитии отдаленных метастазов и рецидивировании опухоли общий уровень пролиферации раковых клеток не меняется, при этом вклад в пролиферацию опухолевых клеток таких митогенетических стимулов, как с-Ы, с-ЕгЬ В2 снижается, что, вероятно, компенсируется другими ростовыми факторами

В заключение следует сказать, что ПИ, как и любая другая схема, в том числе и построенная на основе многофакторного анализа, не лишен некоторых условностей Тем не менее он может использоваться для изучения результатов хирургического лечения больных ПРЩЖ, что и было сделано в настоящей работе

Выводы:

1. В пролиферации опухолевых клеток папиллярного рака щитовидной железы активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-erb В2, c-Met, caveohn-I При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb В2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-erb В2 и c-Met, в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности.

2. Наивысшим злокачественным потенциалом, судя по выраженности морфологических проявлений и экспрессии биомолекулярных маркеров, обладает оксифильный вариант ПРЩЖ, наименьшим — фолликулярный вариант ПРЩЖ, папиллярный вариант занимает промежуточное место Факторами повышенного риска у больных папиллярным раком щитовидной железы являются возраст старше 45 лет и прорастание опухолью капсулы щитовидной железы

3 Риск рецидива папиллярного рака щитовидной железы возрастает при уменьшении уровня экспрессии тиреоглобулина, c-erb В2, c-Met и c-kit и увеличении уровня экспрессии EGFR.

4 Количество экспрессируемого р53 в ПРЩЖ не всегда является прогностическим фактором, поскольку в ходе опухолевой прогрессии возможны потеря обеих аллелей гена или развитие глубоких мутаций, приводящих к отсутствию синтеза данного белка, что в свою очередь может потенциировать опухолевый рост

5 Определение уровня экспрессии НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveohn-1, CD10, c-kit и Ki-67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования

6 RAS мутации являются маркером агрессивного поведения папиллярного рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза.

7 Наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный прогностический маркер при папиллярном раке щитовидной железы

8. Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с морфологическим баллом злокачественности. С возрастанием 1руппы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от б до 8 лет после операции Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Рожкова ЕБ «Экспрессия р53 и EGFR в папиллярном раке щитовидной железы». Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, III Конференция молодых ученых России с международным участием с. 232-233, Москва, 2004 г.

2 Рожкова Е.Б. «Рак щитовидной железы: прогнозирование выживаемости и рецидивирования с помощью определения онкомаркеров и прогностического индекса» Тезисы работ участников открытого российского конкурса на лучшую научную работу студентов 2004 года по разделу «медицинские науки», с. 8-9, Москва, 2005 г.

3. Рожкова Е Б, Коган Е.А, Sobrinho-Simoes М., Soares Р., Пальцев М А. Онкомаркеры в дифференциальной диагностике и прогнозе при папиллярном раке щитовидной железы II Всероссийский Съезд Патологоанатомов -2006-т II-с 355-357.

4. Рожкова Е Б, Коган Е А, Середин В.П, Пальцев М А Прогностическое значение экспрессии тиреоглобулина и онкомаркеров (р53, EGFR, ret-онкогена) в различных вариантах папиллярного рака щитовидной железы Клинико-морфологическое и иммуногистохимическое исследование // Арх. пат. - 2006- т. 68, вып. 4 -с 8-11.

5. Рожкова ЕБ., Коган Е.А., Пальцев МА. Мутации гена RAS в папиллярном раке щитовидной железы. // Молекулярная медицина. -2007-№ 1-е 37-41.

ММЛ им И M Сеченов!! Подписано в печпи» 2007 i

I ирпж 100 экземпляров

Актуальность темы.

Проблема рака щитовидной железы (РЩЖ) занимает в современной онкологии особое место по нескольким причинам. Во-первых, отмечается тенденция к увеличению числа заболеваний РЩЖ, что, вероятно, связано с ухудшением экологической обстановки: повышением радиационного фона, распространением химических канцерогенов. На долю РЩЖ приходится от 1 до 4 % всех злокачественных опухолей, а как известно, смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире [3, 6, 42]. Во-вторых, верификация карцином ЩЖ, особенно дифференцированных форм сложна, в связи с неоднородностью их гистологического строения и сложной дифференцировкой опухолевых клеток. Эксперты ВОЗ разрабатывают новые подходы к диагностике РЩЖ, в которых рекомендуется использовать сочетание морфологического метода с молекулярно-биологическими и генетическими с определением биомолекулярных маркеров опухоли [165]. Изучение биомолекулярных маркеров и генетической нестабильности в РЩЖ имеет важное значение для определения ее злокачественного потенциала и выбора терапии [147].

Одним из основных свойств опухоли является автономный безудержный рост, регуляция которого в норме происходит по различным митогенетическим путям. Каждая опухоль может быть индивидуальна в плане активации тех или иных митогенетических цепочек (МЦ), но в то же время могут существовать и стереотипные МЦ для определенных типов опухолей [38, 147]. C-Met, c-erbB2, c-kit являются трансмембранными рецепторами к факюрам роста (тирозинкиназами), которые активируют цитоплазматические киназы, а те - ядерные транскриптазы, что в конечном итоге приводит к росту опухолевой ткани [147]. Caveolin - 1 также участвует в нескольких МЦ: ингибирует передачу сигналов от EGFR и ERK-2 к ядру и регулирует межклеточное взаимодействие посредством даун-регуляции Екадгерина [38].

В литературе имеются единичные исследования по корреляции мутаций RAS и BRAFA/599t с клинико-патоморфологическими параметрами и прогнозом послеоперационного течения ПРЩЖ [56, 155, 167].

Таким образом, в проблеме ПРЩЖ остаются нерешенными вопросы: о морфологических и иммуногистохимических особенностях ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ в зависимости от стадии заболевания; о роли маркеров пролиферации (Ki-67, c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1, EGFR) и апоптоза (p53), дифференцировки (тиреоглобулин, RET-онкоген) и степени злокачественности (CD 10, НВМЕ-1) в ПРЩЖ; о частоте мутаций RAS при ПРЩЖ и их корреляцию с клинико-патоморфологическими параметрами; о частоте мутаций BRAF при ПРЩЖ и их корреляцию с клинико-патоморфологическими параметрами; о прогнозировании послеоперационной выживаемости больных с разными гистологическими вариантами и стадиями заболевания ПРЩЖ.

Целью настоящей работы явилось изучение иммуногистохимических и молекулярно-биологических маркеров пролиферации (Ki-67, c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1, EGFR, мутаций в генах RAS и BRAF) и апоптоза (р53), дифференцировки (тиреоглобулин, RET-онкоген) и степени злокачественности (CD10, НВМЕ-1) в папиллярном, фолликулярном и оксифильном вариантах папиллярного рака щитовидной железы, позволяющих определить злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивов опухоли.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. охарактеризовать морфологические и иммуногистохимические особенности ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ в зависимости от стадии заболевания;

2. определить экспрессию опухолевых маркеров (р53, EGFR, ret-онкоген, тиреоглобулин, виментин, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, кавеолин, CD 10, сkit, Ki-67/MIB-l) (первых четырех посредством иммунногистохимии, остальных методом предварительной tissue microarray) в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

3. выявить мутации гена NRAS, HRAS экзоны 1 и 2 (посредством проведения ПЦР, SSCP, секвенирования) в в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

4. изучить мутации гена BRAF (посредством проведения ПЦР, SSCP, секвенирования) в в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ;

5. провести анкетирование пациентов, перенесших оперативное вмешательство по поводу рака щитовидной железы для анализа выживаемости и рецидивирования;

6. оценить возможности прогнозирования выживаемости и рецидивирования у больных, перенесших оперативное вмешательство по поводу рака щитовидной железы, в зависимости от уровня экспрессии опухолевых маркеров (р53, EGFR, ret-онкоген, тиреоглобулин, виментин, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, кавеолин, CD 10, с-kit, Ki-67/MIB-l) и мутациий в генах (BRAF, NRAS, HRAS экзоны 1 и 2) в ПРЩЖ.

Научная новизна.

С помощью комплекса морфологических и иммуногистохимических и молекулярно-биологических методов была получена характеристика ПРЩЖ в зависимости от гистологического типа, стадии заболевания и наличия рецидивов опухоли.

Установлено, что пролиферация опухолевых клеток при разных гистологических типах ПРЩЖ осуществляется за счет работы различных МЦ, активность которых зависит от фенотипа опухоли. В пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенегические цепочки с участием c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb В2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-erb В2 и c-Met; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности. В ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, при развитии отдаленных метастазов и рецидивировании опухоли вклад в пролиферацию опухолевых клеток таких митогенетических стимулов, как с-kit, c-erb В2 снижается, что, вероятно, компенсируется другими ростовыми факторами. Показано, что количество экспрессируемого р53 в ПРЩЖ не всегда является прогностическим фактором.

Найдены молекулярные прогностические критерии. Так, CD10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть также использован как прогностический маркер. Риск рецидива ПРЩЖ возрастает при уменьшении уровня экспрессии тиреоглобулина, c-erb В2, c-Met и c-kit и увеличении уровня экспрессии EGFR. RAS и BRAF мутации являются маркерами агрессивного поведения рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза. Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с МБЗ. С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания.

Практическая значимость работы.

Разработаны иммуногастохимические и молекулярно-биологические критерии, позволяющие охарактеризовать злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивирования ГГВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ. Полученные результаты по участию разных МЦ в ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ показывают необходимость разработки индивидуальных методов прогнозирования и дальнейшей таргетной терапии при лечении этих опухолей. При ПРЩЖ р53 не всегда является прогностическим фактором за счет перекрестного реагирования антител. В практической работе врачей-патологоанатомов и онкологов нами рекомендуется использование иммуногистохимического исследования ключевых факторов основных МЦ в

ПРЩЖ (c-kit, c-erb B2, c-Met, caveolin-1), маркеров пролиферации (Ki-67), инвазивного роста (CDIO) и злокачественности (НВМЕ-1); а также определение RAS и BRAF мутаций с целью прогнозирования течения заболевания, выживаемости и эффективности таргетной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ПВ, ФВ и ОКФВ ПРЩЖ отличаются молекулярно-биологическими особенностями и по-разному экспрессируют маркеры пролиферации (Ki-67, c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1, EGFR) и апоптоза (p53), дифференцировки (тиреоглобулин, RET-онкоген) и степени злокачественности (CDIO, НВМЕ-1).

2. Полиморфизм HRAS экзона 1 и NRAS мутации являются маркерами агрессивного поведения ПРЩЖ и неблагоприятного прогноза.

3. Наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный маркер плохого прогноза при ПРЩЖ. Обнаружена новая мутация в гене BRAF (кодон S604I) в опухолевой ткани ПРЩЖ.

4. Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с МБЗ и экспрессией онкомаркеров таких, как тиреоглобулин, c-erb В2, c-Met, c-kit, EGFR и р53. С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: на заседании общества тиреоидологов Института Патологии и Иммунологии города Порто (Португалия, апрель 2005 г.), III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, январь 2004 г.) и неоднократно обсуждались на конференциях кафедры патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова.

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 5 работ, из них 2 статьи в центральной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы.

выводы

1. В пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, с-Met, c-erb В2, а в ОКФВ - caveolin-1, c-erb В2 и c-Met; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности.

2. Наивысшим злокачественным потенциалом, судя по выраженности морфологических проявлений и экспрессии биомолекулярных маркеров, обладает оксифильный вариант ПРЩЖ, наименьшим -фолликулярный вариант ПРЩЖ, папиллярный вариант занимает промежуточное место. Факторами повышенного риска у больных ПРЩЖ являются возраст старше 45 лет и прорастание опухолью капсулы ЩЖ.

3. Риск рецидива ПРЩЖ возрастает при уменьшении уровня экспрессии тиреоглобулина, c-erb В2, c-Met и c-kit и увеличении уровня экспрессии EGFR.

4. Количество экспрессируемого р53 в ПРЩЖ не всегда является прогностическим фактором, поскольку в ходе опухолевой прогрессии возможны потеря обеих аллелей гена или развитие глубоких мутаций, приводящих к отсутствию синтеза данного белка, что в свою очередь может потенциировать опухолевый рост.

5. Определение уровня экспрессии НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD 10, c-kit и Ki-67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования.

6. RAS мутации являются маркером агрессивного поведения рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза.

7. Наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный прогностический маркер при ПРЩЖ.

8. Прогноз у больных ПРЩЖ определяется значением прогностического индекса, который коррелирует с МБЗ. С возрастанием группы риска увеличивается процент рецидивов, снижается выживаемость больных, особенно в сроки от 6 до 8 лет после операции. Построенные на его основе группы риска могут применяться для прогнозирования исходов заболевания.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Верификация карцином ЩЖ, особенно дифференцированных форм сложна, в связи с неоднородностью их гистологического строения и сложной дифференцировкой опухолевых клеток. Эксперты ВОЗ разрабатывают новые подходы к диагностике РЩЖ, в которых рекомендуется использовать сочетание морфологического метода с молекулярно-биологическими и генетическими с определением биомолекулярных маркеров опухоли (ВОЗ, 2005). Изучение биомолекулярных маркеров и генетической нестабильности в РЩЖ имеет важное значение для определения ее злокачественного потенциала и выбора терапии.

Однако, комплексного исследования морфологических проявлений злокачественности, отражающих их разный злокачественный потенциал и выживаемости больных после операции; экспрессии опухолевых маркеров (р53, EGFR, ret-онкоген и тиреоглобулин, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD 10, c-kit, Ki-67, BRAF, H и NRAS) сразу в нескольких вариантах папиллярного рака щитовидной железы и выживаемостью больных после операции, метастазированием еще не проводилось.

В связи с вышеизложенным цель настоящего исследования состояла в изучении маркеров пролиферации и апоптоза, дифференцировки и степени злокачественности, а также мутаций в генах RAS и BRAF в папиллярном, фолликулярном и оксифильном вариантах папиллярного рака щитовидной железы, позволяющих определить злокачественный потенциал, прогноз послеоперационной выживаемости и рецидивов опухоли.

Для достижения поставленной цели на примере 59 случаев ПРЩЖ с помощью гистологического, морфометрического, иммуногистохимического, молекулярно-биологического методов исследования, а также анкетирования больных, разработки архивных материалов и клинического обследования пациентов выполнен ряд задач: охарактеризованы морфологические особенности основных гистологических вариантов ПРЩЖ; оценен

Иммуногистохимическое исследование показало, что гистологические варианты ПРЩЖ обладают характерными молекулярно-биологическими особенностями, отражающими различия в их злокачественном потенциале, судя по экспрессии онкомаркеров: НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, EGFR, р53, тиреоглобулина, ret-онкогена, CDIO, c-kit, Ki67.

Экспрессия Ki-67/MlB-l обнаруживалась в ядрах опухолевых клеток в виде коричневого окрашивания в опухоли. Ki-67 экспрессировался во всех вариантах ПРЩЖ, кроме нормальной тиреоидной ткани, очагов тиреоидизации и метастазов. Экспрессия Ki-67 во всех наблюдениях ПРЩЖ была достаточно низкой, что совпадает с данными других авторов. Наибольший уровень экспрессии был выявлен в ФВ и составил 3,7 %, наименьший — в ПВ - 3 %. Ki-67 - маркер пролиферации и активируется только в опухолевых клетках; отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ. Достоверных различий в уровне экспрессии Ki-67 у пациентов с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ не было найдено (3,1 и 3,3 % соответственно) (р=0,98).

Одним из основных свойств опухоли является автономный безудержный рост, регуляция которого в норме происходит по 17 митогенетическим путям. Каждая опухоль может быть индивидуальна в плане активации тех или иных МЦ, но в то же время могут существовать и стереотипные МЦ для определенных типов опухолей. c-Met, c-erb В2, c-kit являются трансмембранными факторами роста (тирозинкиназами), которые активируют в свою очередь цитоплазматические киназы, а те - ядерные транскриптазы, что в конечном итоге приводит к бесконтрольному и безудержному росту опухолевой клетки. Caveolin-1 также участвует в нескольких митогенетических цепочках: ингибирует передачу сигналов от EGFR и ERK-2 к ядру и регулирует межклеточное взаимодействие посредством даун-регуляции Е-кадгерина.

C-kit экспрессировался во всех наблюдениях, продукт реакции локализовался в цитоплазме и на апикальной мембране опухолевых клеток в виде темно-коричневого окрашивания этих клеточных структур. Самый высокий уровень c-kit был обнаружен в ПВ и составил 4,9. Примерно одинаковый уровень экспрессии c-kit обнаружен в остальных вариантах и нормальной тиреоидной ткани, а также очагах тиреоидизации. Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии c-kit ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (0 и 4,3 балла соответственно) (р=<0,01). Полученные данные подтверждают изменчивость уровня экспрессии c-kit в ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ. Полученное нами резкое снижение содержания c-kit в рецидивирующих опухолях на первый взгляд противоречит тому, что, как известно, c-kit индуцирует сигналы, приводящие к быстрой пролиферации клеток. Однако, как было установлено ранее, данный маркер обнаруживается в небольших количествах в неизмененной ткани щитовидной железы, возрастает в аденомах и слабо экспрессируется в карциномах ЩЖ. Следовательно, можно высказать предположение, что c-kit рецептор вовлечен в контроль роста эпителия щитовидной железы только на ранних стадиях опухолевой прогрессии. На более поздних стадиях роста ПРЩЖ главенствующее значение имеют другие МЦ. В то же время, вероятно и низкий уровень пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ в целом также обусловлен потерей экспрессии c-kit.

Экспрессия c-erb В2 была обнаружена во всех наблюдениях в виде темно-коричневого зернистого окрашивания в основном в цитоплазме и на апикальной мембране опухолевых клеток, несколько реже - только на апикальной мембране клеток, а также в коллоиде опухолевых фолликулов. Самый высокий уровень экспрессии c-erb В2 в ПВ и составил 7,2, самый низкий - в ФВ (5 баллов). Следует отметить, что уровень экспрессии c-erb В2 в нормальной окружающей ткани ЩЖ достаточно высок (4,8 баллов). Полученные результаты показывают, что МЦ с c-erb В2 принимает участие в пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ. При этом наибольшая активность МЦ с c-erb В2 наблюдается в ПВ и в ОКФВ, также принимает участие в ФВ, но на более низком уровне активности. Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии c-erb В2 ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (2 и 6,2 балла соответственно) (р<0,01). Полученные данные показывают, что c-erb В2 не имеет решающего значения на поздних стадиях роста ПРЩЖ.

C-Met экспрессировался во всех наблюдениях, продукт реакции локализовался в ядрах и цитоплазме опухолевых клеток в виде темно-коричневого окрашивания этих клеточных структур. Самый высокий уровень экспрессии c-Met был в ОКФВ и составил 6,3; самый низкий - в ФВ (5,2 балла). Была также выявлена экспрессия c-Met в нормальной тиреоидной ткани и тиреоидите, но намного ниже, чем в ПРЩЖ (4,2 балла). Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии c-Met достоверно ниже по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (4 и 5,1 балла соответственно) (р=0,049). Это объясняется ролью, которую играет Met/HGF-R в патогенезе этой формы рака, поскольку Met/HGF-R способствует росту клеток, поляризации их мембран, то по всей видимости его потеря является одним из этапов канцерогенеза папиллярного рака, в результате которого опухоль преобретает более агрессивные свойства и увеличивает свои метастатические способности. Таким образом, можно предположить, что снижение экспрессии c-Met в ФВ является плохим прогностическим признаком.

Caveolin-1, выявленный в нашем исследовании, является туморогенным и отличается от нормально функционирующего тем, что активирует множество различных МЦ. Caveolin-1 экспрессировался во всех наблюдениях, продукт реакции локализовался в цитоплазме, на апикальной мембране и в ядрах опухолевых клеток, а также в сосудах и строме опухолевых фолликулов и окружающей ткани в виде темно-коричневого окрашивания этих клеточных структур. Самый высокий уровень экспрессии caveolin-1 зарегистрирован в ОКФВ (7,3 балла), самый низкий - в ФВ (5,9 баллов). Уровень экспрессии caveolin-1 в ПВ занимает промежуточное значение (6,8 балла). Уровень экспрессии в метастазах значительно ниже (5 баллов) по сравнению с первичной опухолью (8 баллов). Самое низкое содержание caveolin-1 выявлено в нормальной окружающей ткани ЩЖ (3,8 балла). Найдено, что у пациентов ФВ с отдаленными метастазами уровень экспрессии caveolin-1 выше по сравнению с неметастазирующими опухолями ФВ (8 и 6,7 балла соответственно) (р=0,037). Прогностическое значение caveolin-1 объясняется его биологическими функциями в клетках. Через caveolin-1 передаются митогенетические сигналы многих цепочек (EGFR, Raf, МЕК-1 и ERK), на которые он оказывает ингибирующее действие. В опухолях обнаружен «туморогенный» caveolin-1, который, напротив, стимулирует передачу митогенетических сигналов. Широко распространенная ассоциация caveolin-1 с кавеолами с многочисленными путями трансдукции сигнала предполагает, что преобразование нормально функционирующего caveolin-1 в туморогенный служит общей точкой, которая функционально регулирует множество сигнальных путей. В этой модели, объединенная потеря нормально функционирующего caveolin-1 и супрессоров опухоли или дополнительная активация онкогена, может быть достаточной, чтобы вызвать преобразование клетки и/или потенциальное преобразование фенотипа, разрушая связанный нисходящий путь передачи сигнала, регулирующего цикл клетки. Кроме того, показано, что эндотелиальные клетки сосудов с избытком caveolin-1 принимают участие в усилении ангиогенеза в опухолях, что стимулирует рост опухоли.

EGFR экспрессировался во всех наблюдениях, продукт реакции локализовался преимущественно в цитоплазме опухолевых клеток в виде темно-коричневых включений. Средние значения экспрессии были довольно высокими и достигали 36 % и 30 % EGFR-положительных клеток при ПВ ПРЩЖ и ФВ ПРЩЖ соответственно, 50 % в ОКФВ, что говорит о более злокачественном потенциале ОКФВ ПРЩЖ, более неблагоприятном прогностическом значении и о более высоком риске рецидива.

Корреляция степени экспрессии EGFR с величиной морфологического балла злокачественности в различных вариантах ПРЩЖ имела разный характер. Полученные данные позволяют предположить, что ФВ ПРЩЖ обладает меньшим злокачественным потенциалом, поскольку МБЗ этих опухолей оказался ниже по сравнению с МБЗ ПВ ПРЩЖ.

Мутантный р53 экспрессировался во всех наблюдениях, продукт реакции локализовался в ядрах и цитоплазме опухолевых клеток в виде темно-коричневого окрашивания этих клеточных структур. р53 экспрессируется в ПРЩЖ. Средние значения экспрессии были довольно высокими и достигали 27,1 % и 34,8 % р53-положительных клеток при ПВ ПРЩЖ и ФВ ПРЩЖ соответственно, 37 % в ОКФВ.

Более высокий уровень экспрессии р53 в инкапсулированных формах ПРЩЖ по сравнению с неинкапсулированными можно интерпретировать тем, что в инкапсулированных формах за счет перекрестного реагирования антител мы выявили нормальный дикий тип р53, а уже в неинкапсулированных - мутантный р53.

ФВ имеет самые низкие показатели МБЗ и самую высокую экспрессию р53, уровень р53 в ПВ более 1 см увеличивается по мере увеличения МБЗ. Экспрессия р53 в ОКФВ была одной из самых низких - 5,5 %.

Но более высокая экспрессия р53 при ФВ ПРЩЖ 34,8 %, чем при ПВ ПРЩЖ 27,1 % противоречит данным других авторов и может быть интерпретирована неоднозначно. Один из вариантов: при ФВ ПРЩЖ нормальный р53 еще функционирует, при ПВ ПРЩЖ мы опеределили мутантный р53.

Следует также сказать, что количество экспрессируемого р53 не всегда является прогностическим фактором.

Экспрессия ТГ выявлялась в виде темно-коричневого зернистого окрашивания в основном в цитоплазме и на апикальной мембране опухолевых клеток, а также в коллоиде опухолевых фолликулов, несколько реже - только на апикальной мембране клеток.

ТГ был выявлен во всех случаях. Во всей исследуемой группе ПРЩЖ уровень ТГ имел слабую обратную корреляционную связь с МБЗ (г= -0,31, р=0,01) за счет корреляции с частотой инвазии сосудов (г= -0,49, р=0,04). Изменение экспрессии тиреоглобулина в зависимости от морфологического балла злокачественности в папиллярном и фолликулярном вариантах имело разный характер. В папиллярном варианте экспрессия тиреоглобулина снижалась по мере увеличения морфологического балла злокачественности (г = -0,54, р = 0,02) в основном за счет корреляции со степенью контакта опухоли с окружающими тканями (г = -0,71, р= 0,001). Особенностью экспрессии тиреоглобулина в фолликулярном варианте явилось то, что с увеличением морфологического балла злокачественности изменение этого маркера не имело даже тенденции к снижению.

Как известно, выраженность экспрессии ТГ напрямую зависит от степени дифференцировки опухоли: чем ниже уровень экспрессии ТГ, тем ниже вплоть до полного отсутствия экспрессия этого маркера. Поэтому можно предположить, что низкая экспрессия ТГ отражает высокий злокачественный потенциал гистологических вариантов ПРЩЖ. Снижение экспрессии ТГ является показателем снижения степени дифференцировки и фактором более плохого прогноза. Экспрессия тиреоглобулина была обнаружена во всех изученных опухолях, где она выявлялась в виде темно-коричневого зернистого окрашивания в основном в цитоплазме и на апикальной мембране опухолевых клеток, а также в коллоиде опухолевых фолликулов, несколько реже - только на апикальной мембране клеток. Таким образом, тиреоглобулин является гистогенетическим маркером ПРЩЖ.

Экспрессия RET-онкогена обнаруживалась в цитоплазме опухолевых клеток в виде коричневого окрашивания с очаговым или диффузным характером локализации в опухоли.

При сравнении МБЗ RET+ и RET- опухолей оказалось, что МБЗ RET+ ПРЩЖ был ниже по сравнению с RET- ПРЩЖ - 8,2 и 9,6 баллов, соответственно. Однако, эта разница не достоверна вследствие малого количества RET+ опухолей.

В московском регионе этот специфичный для ПРЩЖ онкоген встречается достаточно редко, приблизительно с одинаковой частотой присутствуя на разных стадиях опухолевой прогрессии.

Полученные данные позволяют предположить, что RET+ ПРЩЖ обладает меньшим злокачественным потенциалом, поскольку МБЗ этих опухолей оказался ниже по сравнению с МБЗ RET- ПРЩЖ, и соответствуют данным Soares et al. и Tallini et al., которые назвали более благоприятный RET+ ПРЩЖ бонсайским фенотипом.

Экспрессия CD 10 была обнаружена во всех изученных опухолях, где она выявлялась в виде темно-коричневого зернистого окрашивания в основном в мембранах и цитоплазме опухолевых клеток. Изменение экспрессии CD 10 в зависимости от гистологического строения ПРЩЖ: самый высокий уровень экспрессии в ПВ (2,4 балла), и одинаково низкие уровни в ФВ и ОКФВ (2 балла). В нормальной тиреоидной ткани, очагах тиреоидизации и метастазах экспрессия CD 10 не обнаружена. Достоверных различий в уровне экспрессии CD 10 с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ (2,1 и 2,3 балла соответственно) не выявлено (р=0,98). CD 10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть также использован как прогностический маркер (1,2 и 0,5 балла соответственно) (р=0,032). Не следует забывать о том, что экспрессия CD10 коррелирует с гистопатологическими критериями плохого прогноза, учитывая его роль в туморогенезе и прогностическом анализе.

Экспрессия НВМЕ-1 была обнаружена во всех изученных опухолях, где она выявлялась в виде темно-коричневого зернистого окрашивания в основном в цитоплазме и на апикальной мембране опухолевых клеток, а также в коллоиде опухолевых фолликулов, несколько реже - только на апикальной мембране клеток. Изменение экспрессии НВМЕ-1 в зависимости от гистологического строения: самый высокий уровень экспрессии в ПВ и в ОКФВ, самый низкий - в ФВ. Достоверных различий в уровне экспрессии НВМЕ-1 у пациентов с метастазирующими и неметастазирующими опухолями ФВ (2,9 и 3,2 балла соответственно) (р=0,96) не выявлено. Полученные данные говорят о диагностической ценности НВМЕ-1 как положительного маркера злокачественности для дифференцированных карцином щитовидной железы, таких как папиллярный РЩЖ. В нормальной тиреоидной ткани, очагах тиреоидизации и метастазах экспрессия НВМЕ-1 не обнаружена.

Резюмируя полученные данные, следует отметить, что для ПВ характерны максимальные значения таких маркеров, как c-erb В2, caveolin-1, c-met и минимальное значение уровня экспрессии CD 10. Для ФВ характерны максимальные значения уровня экспрессии для caveolin-1, c-met и минимальное значение уровня экспрессии CD 10. Для ОКФВ характерны максимальные значения таких маркеров, как caveolin-1, c-met, c-erb В2 и минимальные значения уровня экспрессии для НВМЕ-1 и CD 10. В пролиферации опухолевых клеток ПРЩЖ активированы митогенетические цепочки с участием c-kit, c-erb В2, c-Met, caveolin-1. При этом в ПВ наиболее активна митогенетическая цепочка с c-kit, c-Met, c-erb В2, а в ОКФВ -caveolin-1, c-erb В2 и c-Met; в ФВ принимают участие все митогенетические цепочки, но на более низком уровне активности. CD10 увеличивается при инвазии больше, чем в 2 раза и может быть также использован как прогностический маркер (р=0,032). Определение уровня экспрессии НВМЕ— 1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD 10, c-kit и Ki67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования.

В нашем исследовании изучалась молекулярная биология ПРЩЖ, являющаяся базисом для понимания молекулярной биологии конкретных вариантов ПРЩЖ и молекулярных подходов к их терапии. Были рассмотрены молекулярные механизмы патогенеза наиболее часто встречающихся вариантов ПРЩЖ на примере МЦ с участием таких трансмембранных факторов роста (тирозинкиназами), как c-Met, c-erb В2, с-kit, а также caveolin-1, на основании которых можно основывать молекулярную терапию ПРЩЖ посредством селективного ингибирования

МЦ маленькими молекулами, типа иматиниб (иматиниба мезилат, Гливек). Также в поддержании роста ПРЩЖ особое значение имеет изученная нами молекула Ki-67, маркер клеточной пролиферации, осуществляет вход (G0) и выход (G], S,G2) клеток в определенных участках митотического цикла. CD 10 - маркер инвазии, экспрессия которого увеличивается более чем в 2 раза (р=0,032) в тех опухолях ПРЩЖ, где наблюдается инвазия в капсулу и окружающие ткани ЩЖ вне зависимости от варианта ПРЩЖ. Изученный нами маркер злокачественности НВМЕ-1 подтверждает сложившееся мнение о наибольшем злокачественном потенциале такого варианта ПРЩЖ, как ОКФВ.

Определение уровня экспрессии тиреоглобулина, р53, RET-онкогена, EGFR, НВМЕ-1, c-Met, c-erb В2, caveolin-1, CD 10, c-kit и Ki67 отражает злокачественный потенциал ПРЩЖ и может быть рекомендовано в целях прогнозирования.

Проведенное исследование показывает, что RAS мутации определяют биологические особенности карцином щитовидной железы, характеризующееся агрессивным поведением. Например, в группе из 59 пациентов за 8 лет послеоперационного наблюдения умер от заболевания только один пациент мутацией NRAS, в то время как не было обнаружено ни одной мутации HRAS.

Одиночные формирующие RAS мутации были маркером плохой выживаемости в нашей группе, тогда как наличие полиморфизма не влияло на выживаемость.

Результаты этого исследования демонстрируют явную связь между NRAS мутациями, а также HRAS полиморфизмом и неблагоприятным прогнозом. На основании полученных данных можно предположить что ПРЩЖ с RAS мутациями чувствителен к препаратам типа фарнезильной трансферазы, которые могут быть рекомендованы в качестве дополнительных химиотерапевтических средств.

Было показано, что RAS мутации являются маркером агрессивного поведения рака щитовидной железы и неблагоприятного прогноза. Хотя необходимы дополнительные и особенно проспективные исследования, чтобы объяснить далее отношения между активацией RAS онкогена и неоплазией щитовидной железы, наши результаты указывают, что генотипирование RAS может иметь существенную ценность как прогностический индикатор и может обеспечить обоснование новым методам лечения.

Обнаружена мутация в 37,9 % папиллярного варианта

ПРЩЖ. Этот процент лежит в нижнем участке диапазона предыдущих сообщений о ПРЩЖ (36-69 %), но по существу имеет ограниченную ценность, так как мы демонстрировали также, что распространенность мутации существенно изменяется от одного гистологического типа до другого.

Мутация BRAFvmE присутствовала в 36,4 % случаев фолликулярного варианта ПРЩЖ (8/22), что не совпадает с данными литературы.

Мутация BRAFV599L присутствовала в 50 % случаев оксифильного варианта ПРЩЖ (4/8), что говорит о более плохом прогнозе данного варианта ПРЩЖ среди изученных нами.

В полученных нами результатах наличие BRAF-MyrawiPi не коррелирует с клинической стадией развития онкопатологии (р = 0,3), что противоречит данным литературы.

Найденная нами в одном из 22 случаев фолликулярного варианта ПРЩЖ (4,5 %) необычная мутация в гене BRAF (кодон S604I), не описанная ранее в литературе, требует дальнейшего изучения.

Функциональное значение мутаций BRAFV599E и BRAF86041 в канцерогенезе щитовидной железы все еще остается неизвестным, хотя обычно им приписывают роль активации пути МАРК. Низкая пролиферация и низкая апоптотическая активность ПРЩЖ, а так же антиапоптотическая роль BRAF, говорят в пользу более благоприятного прогноза течения заболевания, по сравнению с опухолями, несущими мутированный ген BRAF.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наличие мутации гена BRAF может быть использовано как потенциальный прогностический маркер при ПРЩЖ.

Следовательно, наивысшим злокачественным потенциалом, судя по выраженности морфологических проявлений злокачественности и экспрессии онкомаркеров, обладает оксифильный вариант ПРЩЖ, наименьшим - фолликулярный вариант ПРЩЖ, а папиллярный вариант ПРЩЖ занимает промежуточное место.

Был изучен также ПИ, в который заложен многофакторный анализ, отражающий разные аспекты проявления ПРЩЖ, что позволяет более четко прогнозировать исход заболевания. В зависимости от значений ПИ больные были разделены на группы риска, каждая из которых представляет собой относительно однородную категорию больных с похожими возможностями к выживанию. ПИ использован для изучения результатов хирургического лечения больных ПРЩЖ как наиболее адекватно отражающая прогноз схема, построенная на основе мультифакторного анализа.

Из 25 больных с известными отдаленными результатами лечения, которые наблюдались от 6 до 8 лет после первичной операции, заболевание рецидивировало (локальный рецидив опухоли, развитие метастазов в региональные лимфоузлы шеи, развитие имплантационных метастазов опухоли в рубец, их сочетание) у 9 пациентов (36 %). Рецидив явился причиной смерти 1 больной, которая погибла от местного распространения и генерализации опухолевого процесса. Всего выжило в сроки от 6 до 8 лет 23 больных (92 %) (1 больная умерла от инфаркта миокарда через 4 года после перенесенной операции без признаков рецидива и метастазов в течение всего периода наблюдения). Суммарная летальность составила 8 %.

Группа риска значительно влияла на возникновение рецидивов и выживаемость больных в сроки от 6 до 8 лет после операции: с возрастанием группы риска увеличивался процент рецидивов, снижалась выживаемость больных.

Была выявлена связь между уровнем экспрессии онкомаркеров и рецидивированием ПРЩЖ: чем меньше уровень экспрессии тиреоглобулина (тем менее дифференцирован ПРЩЖ), тем больше вероятность развития рецидивов.

Достоверных различий в уровне экспрессии Ki-67 у пациентов с и без рецидива не выявлено (3,3 и 3,4 % соответственно) (р=1,0).

Средний уровень экспрессии c-kit составил 4,3 в группе больных без рецидива и 1,6 у больных с рецидивом (р=0,026). Полученные данные подтверждают изменчивость уровня экспрессии c-kit в ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, которую наблюдали многие авторы. Полученное нами резкое снижение содержания c-kit в рецидивирующих опухолях на первый взгляд противоречит тому, что, как известно, c-kit индуцирует сигналы, приводящие к быстрой пролиферации клеток. Однако, как было установлено ранее, данный маркер обнаруживается в небольших количествах в неизмененной ткани щитовидной железы, возрастает в аденомах и слабо экспрессируется в карциномах ЩЖ. Следовательно, можно высказать предположение, что c-kit рецептор вовлечен в контроль роста эпителия щитовидной железы только на ранних стадиях опухолевой прогрессии.

У пациентов с рецидивом уровень экспрессии c-erb В2 в первичной опухоли значительно ниже, чем без рецидива (1,25 и 6,3 балла соответственно) (р<0,01). Полученные результаты показывают, что МЦ с с-erb В2 принимает участие в пролиферации опухолевых клеток при ПРЩЖ.

У пациентов с рецидивом уровень экспрессии c-Met был ниже, чем без рецидива (4,7 и 5,9 балла соответственно) (р=0,048). Это объясняется ролью, которую играет Met/HGF-R в патогенезе этой формы рака, поскольку Met/HGF-R способствует росту клеток, поляризации их мембран, то по всей видимости его потеря является одним из этапов канцерогенеза папиллярного рака, в результате которого опухоль преобретает более агрессивные свойства и увеличивает свои метастатические способности. Таким образом, можно предположить, что снижение экспрессии c-Met в ФВ является плохим прогностическим признаком.

Достоверных различий в уровне экспрессии caveolin-1 у пациентов с и без рецидива ПРЩЖ не выявлено (5,9 и 6,8 балла соответственно) (р=0,67).

Средний уровень экспрессии EGFR составил 2,78 в группе больных без рецидива и 3,3 у больных с рецидивом, что позволяет утверждать, что высокий уровень экспрессии EGFR имеет неблагоприятное прогностическое значение и ассоциирован с высоким риском рецидива.

Средний уровень экспрессии р53 составил 3,56 в группе больных без рецидива и 2,66 у больных с рецидивом. Более высокий уровень экспрессии р53 в первой группе больных по сранению со второй можно интерпретировать тем, что в группе больных без рецидива за счет перекрестного реагирования антител мы выявили нормальный дикий тип р53, а уже у больных с рецидивом - мутантный р53.

Следует также сказать, что количество экспрессируемого р53 не всегда является прогностическим фактором.

Достоверных различий в уровне экспрессии CD 10 у пациентов с и без рецидива не выявлено (2,0 и 2,1 балла соответственно) (р=0,99).

Достоверных различий в уровне экспрессии НВМЕ-1 у пациентов с и без рецидива не выявлено (3,0 и 3,3 балла соответственно) (р=0,96).

После статистической обработки можно сказать, что уровень экспрессии тиреоглобулина, EGFR, c-erb В2, c-Met и c-kit значительно влиял

2 2 на возникновение рецидивов после операции (% = 5,11 и % = 12,11 соответственно). Однако малое число случаев не позволяет рассчитывать на достоверность полученных результатов в подгруппах, соответствующих гистологическим вариантам.

Пролиферация опухолевых клеток при разных гистологических типах ПРЩЖ осуществляется за счет работы различных МЦ, активность которых зависит от фенотипа опухоли. В ходе опухолевой прогрессии ПРЩЖ, при развитии отдаленных метастазов и рецидивировании опухоли общий уровень пролиферации раковых клеток не меняется, при этом вклад в пролиферацию опухолевых клеток таких митогенетических стимулов, как c-kit, c-erb В2 снижается, что, вероятно, компенсируется другими ростовыми факторами.

В заключение следует сказать, что ПИ, как и любая другая схема, в том числе и построенная на основе многофакторного анализа, не лишен некоторых условностей. Тем не менее он может использоваться для изучения результатов хирургического лечения больных ПРЩЖ, что и было сделано в настоящей работе.