Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Окислительные ферментные системы в коррекции гипербилирубинемии

Р V Б 0&

11 1936

На правах рукописи УДК

АБДУЛМЕДЖИДОВ Лбдулмеджид Юнусовкч

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ В КОРРЕКЦИИ ГИПЕРЕИЛИРУБИНЕМИИ

(Экспериментальное исследование) Трансплантология и искусственные органы-14-00-41

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученной степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-1996

• Работа выполнена в НИИ физико-химической медицины Мидадравмадпромз РФ.

• Научные руководители-доктор медицинских наук, профессор

В.И.Сергиенко кандидат химических иа> к В.А.Постников

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор О.А.Машкоп доктор медицинских наук, профессор В.Г.Владимиров

Ведущая организация- НИИ трансплантологии и искусственных органов Мннларавмедпрома РФ.

Защита состоится « » —( 199о. В « » часов на заседании

специализированного совета Д 08466.02 при НИИ ФХМ Минздравмедпром России по адресу 11982? г. Москва, ул. М. Пироговская д. 1 а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ физико-химической медицины Минздраемедпрома России

Автореферат разослан « & ^ » _1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Васильева Л.Л.

. 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы и постановка задач

Моделирование работы печени - одна го важнейших задач современной медицины. Из всех функций печени детоксицирутощая является наиболее важной, так как при ее нарушении наступает быстрая гибель организма. Несмотря на успехи, достигнутые в разработке методов кшещени» детоксицирующей функции печени при экю- и эвдотоксикозах, интоксикации гидрофобными соединениями остаются наиболее тяжелыми, а летальность при них наиболее высокой.

Тяжесть интоксикаций гидрофобными токсинами и трудность их удаления связана с тем, что они не могут быть удалены не подвергшись бнотрансформация до более гидрофильных . веществ. Кроме того большинство гидрофобных веществ образует комплексы с белками крови.

Многие заболевания, приводящие к нарушению прс jeccoe глкжуронизации в печени, связанны с врожденным дефицитом глгакуронилтрансферазы в гепатоцитах (Болезнь Жильбера), а также нарушением функции гепатоцитов по конъюгации (Болезнь Криглера-Наяра), захвату и транспорту билирубина (Синдром Дубинина-Джонсона), а также гемолитическая болезнь новорожденных проявляется гипербилирубинемией. Основным токсическим метаболитом при этих видах гипербилирубинемнй является непрямой билирубин, относящийся к гидрофобным, вещесп-ам эндогенного происхождения. Наиболее ярко свои токсические свойства он проявляет при гемолитической болезни новорожденных.

Среди применяемых методов компенсации детоксикационной функции печени можно назвать экстракорпоральную перфузию крови через печень свиньи, бабуина, человека (Tiseman В . 1965), использование взвеси печеночных клеток (Островерхой Г. Е. 1975) использование искусу ственных клеток (Chang T.M.S.1979). При лечении гемолитической болезни новорожденных наиболее распространенным является замеиное переливание крови (ЗПК). Эта операция позволяет уменьшить концентрацию непрямого билирубина в среднем на 40%. Однако проведение этой манипуляции сопряжено с использованием значительных количеств донорской крови и чревато многими осложнениями. Хорошие результаты получены при моделировании процессов окисления билирубина электрохимическим методом (Sergicnko V.l., Vasiiiev Yu.B.1989). Большой mar в

решении проблемы гипербилирубннемии был сделан при использовании сорбциошшх методов дстоксикзции (Лопухин Ю.М., Молодеиков M.H.198Î). Многие образцы сорбентов испытаны в клинике, ио их промышленный выпуск до сих пор не налажен. Другие методы лечения гипербнлирубинемий (УФО, индукция печеночных ферментов, методы диализа) получили распространение в клинической практике, но их эффективность явне недостаточна при выраженной гипербилирубннемии (Моргулис W.C. и др. 1986., Абасог М.Т. 1987., Лужников Е.Л. и др.1991., Мостовников В.А. и соавт. 1993). В связи с этих поиск эффективных методов лечения гигербилирубинемии остается актуальным.

В последние годы созданы биоспецифические сорбенты на основе нмиобилнзо-ванных биоспецифических лнгандов (Miura Y. 1977., Sikita В.1988). Другой подход к соз< данию селективных систем удаления нежелательных компонентов основан на нспользова-нии фериента( специфичного к данному токсину (например, билирубиноксидазы), который может связать и трансформировать токсин в малетокенчиые продукты (Sung С 1986). Хотя в этом направлении достигнуты определенные успехи, тем не менее в обою случаях имеются существенные ограничения: в первом- количество извлекаемого токсин; ограничено содержанием аффинного лиганда, во втором- эффективность бнлнрубниоксн дазы существенно снижается в присутствии сывороточного альбумина, связывающего би лнрубин. Более общим подходом к повышению эффективности специфического удален и: токсичных продуктов представляется конструирование систем, включающих аффинны! лиганд н комплекс ферментов (Платэ H.A. и др. 1989., Sikita В. 1988).

В настоящей работе мы осуществили юпытку использовать для удаления бнли рубина систему, содержащую окислительные ферменты: пероксидазу хрена, глюкозоок сидазу и сывороточный альбумин. Мы предполагали, что в такой системе альбумин будс играть роль аффинного лнганда для билирубина, а выбранные ферменты будут окислят! сорбированный билирубин с помощью генерируемой ими активной формы кислорода.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработать окислительные ферментные системы для коррекции гипербнлирубииемии и оценить возможностьнх использования в экспериментах ня живопшх. '

ЗАДА™ РАБОТЫ

1. Разработать метод замены детоксицнрующей функции печени для удаления билирубина с использованием биоспецифнческнх окислительных ферментных систем в режиме гемояер-фузии и "лекарственной формы" для парентерального введения.

2. Определить оптимальный состав бноспецифических систем для использования в режиме гемосорбции, количество и соотношение ферментов, входящих в "лекарственную форму", необходимое для удаления билирубина из крови.

3. Определить влияние ферментной системы на нормальные показатели гомеостаза ин-тактных животных и животных с моделью гипербнлирубинемии.

4. Определить минимально действующие и предельно допустимые концентрации ферментов при их парентеральном введении.

5. На основании результатов эксперимента разработать рекомендации по дальнейшему использованию предложенного метода детоксикащш.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Показана принципиальная возможность создания искусственной ферментной системы для окисления гидрофобных соединений в печени человека.

С использованием окислительных ферментов разработаны две биоспецифические системы для удаления билирубина: одна в виде гидрогеля с (»иммобилизованными альбумином, перок-сидазой н глюкозооксидазой для окисления билирубина в процессе гемоперфузии; вторая- в виде «лекарственной фор»гы» для парентерального введения, где в качестве основных компонентов также использованы пероксидаза и глюкозоокевдаза.

Впервые проведено систематическое изу".ние поведения этих систем в модельных условиях и в экспериментах на животных. Определено, что при их использовании биотрансформа-

них билирубина привадит к его окислению до сущестаенно менее токсичного, водорастворимого ба-швердина.

Подобрано н обосновано оптимальное соотношение ингредиентов гидрогелевой системы а компонентов ферментной Смеси, используемой в качестве «лекарственной формы».

Определена степень безвредности обеих систем для организма жизопшх а, тем самый, показана принципиальная возможность их использования для лечения гипербилнрубииеыий у человека.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены на 54-конференцни студентов, молодых ученых к специалистов Дагестана по медицине (1995), на международном симпозиуме «Эндогенные интоксикации» в г. Санкт-Петербурге (1994) и на межлабораторных конференциях НИИ ФХМ (1992-1995 г.г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Материалы диссертации изложены на, страницах машинописного текста в

состоят из введения, обзора литературы, 3-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Список использованной литературы включает

источников, из них.

лг отечественных и //3 зарубежных. Работа иллюстрирована / 8> таблицами и ^ рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 210 стендовых опытах и в острых и хронических экспериментах на 10 беспородных собаках, массой от 6 до 12 кг, на 20 кроликах породы Шиншилла весом от 2,5-3,5 кг и 270 нелинейных белых мышах массой 18-20 тр. В опыт брали животных обоего пола. Распределение материала по сериям представлено в табл.1.

В работе использованы образцы биоспецифическнх гидрогелевых систем, синтезированных совместно с сотрудниками Института нефтехимического синтеза РАН. Эти системы

сключгяи в себя окислительные ферменты: перокседазу хрена и глкжозооксидазу, и аффинный яиганд для билирубина- сывороточный альбумин, соиммобилизованные на полиакрил-амидном геле. Представленные образцы огсличалисъ по соотношениям входящих компонентов «обозначались как Глюперокс-2, 3,3.1, 3, 8.(табл.2).

Таблица 1

Распределение материала по серди исследования

п\п Цель исследования

Количествц опытов

Количгство животных србаки кролики мыши

1.Выбор оптимальных образцов -биоспецифических ферментных систем для геыоперфузии и оптимизация количества ферментов, входящих нелекарственную форму" для парентерального введения на плазме детей с ГЕН

2.Изучения влияния гидрогелевых ферментных систем и "лекарственной формы" на биохимические параметры плазмы крови человека

3.Изучение общей токсичности на интактных животных

4.Изучение влияния гидрогелевых ферментных систем на биохимические, гематоморфологические показатели крови и гистост-руктуру органов здоровых животных

5.Изучение скорости окисления билирубина в организме здоровых животных (контрольная группа)и при лечении экспериментальной гилербилирубинемии с помощью растворимых ферментных систем

160

50

270

10

20

10

10

ИТОГО: 210 20 30 270

В работе использованы билирубин (БР) производства Пика (ФРГ), пероксидаза хрена (ПО) производства НПО Биохимреактив, Олайне (Латвия)-с активностью=720 сд\мг., глюкозооксидаза (ГО) производства Укрспиртпром ( Украина ) с активностью3120 ед\мг,

сыг рсточный альбумин человека (СА) производства Яеапа1 (Венгрия), элекгрофорегнческая чистота не менее 93%, акриламид (АА) производства Яеапа! (Венгрия).

Таблица 2

Состав образцов гидрогелевых систем для окисления билирубина

Образен Содержание, % в набухшем геле

СА ПО ГО АА

1.Глюперокс-2 4,1 0,08 0,08 1,4

2.Глюперокс-3 3,5 0,07 0,03 1.4

3.Глюперокс-3.1 4,0 0,1 0,02 1.5

4,Глюперокс-5 2,5 0,09 0,01 1,3

5,Глюперокс-8 2,3 0.1 0,02 1.2

1-4- Глюперокс-2,3,3.1,5- частицы гидрогелей неопределенной формы со средним размером 1,5 мм, 3- в форме плоской колонки с двумя слоями гидрогеля, между которыми протекает исследуемый раствор.

Испытания гидрогелевых систем г.роводнлн в статическом и динамическом режимах: в статическом- в пробирку помещали 0,3-1,0 г гидрогелевых систем и 5-10 мл плазмы, пробирки встряхивали при комнатной температуре в течение 60 минут; для выполнения динамических экспериментов собиралась установка, состоящая из перфузнонного насоса, колонки и магистралей. Перфузию плазмы через колонку осуществляли со скоростью от 0,2 до 7 мл\мнн. Направление перфузии снизу вверх. Объем колонки 1 мл, количество перфузируемой плазмы 10 мл. Время перфузии 60 минут. Пробы плазмы брали до и после перфузии. Концентрацию билирубина определяли спектрофотометрически на спектрофотометре Bekmaa DU-7 (США). Производился подсчет клеток крови на приборе Celtrgk-12 (NOVA) (США), рН крови измеряли на приборе Ионометр Frescnius(®Pr ). На автоанализаторе Centrifichem 400 (США) определяли' следующие биохимические показатели: общий белок, альбумин, глюкозу, неорганические фосфаты, калин, натрий, холестерин, триглицериды, активность аланннашшотран-сферазы н аспартатаминотрансфсразы. На интакгных кроликах была проведена серия экспериментов для выяснения гемосовмесгнмости гидрогелевых систем Глюперокс-3 и 3.1. У хро-

лтсоо под гехсекаловым наркозом катетеризировали бедренные сосуды и по артериовенозио-му контуру подключали аппарат гемосорбции АКСТ. Кровь для анализа брали из бедренной вены животного через определенные временные интервалы в течение 60 минут перфузии.

В процессе стендовых испытаний "лекарственной формы" на плазме, подобраны ми-яималмтс действующие хонцетрации ферментов и в дальнейших исследованиях за основу были взяты концентрации 0,29 ед\мл для пероксидазы и 0,32 ед\мл для глюкозоохеидазы. В пробирки, содержащие 10 мл плазмы добавляли ферментативную смесь. Во всех стендовых опытах пробы отбирали через равные промежутки времени в течение 60 минут. На иптахтных животных (мыши) изучали общую токсичность. Для определения острой токсичности растворы смеси ферментов вводили ввутрибрюшинно. Дозы увеличивали и уменьшали стократно по отношению к минимально действующим и в каждой серии^из 10 мышей производили визуальное наблюдение в течение 10 дней. Для определения хронической токсичности указанные дозы ферментов вводили мышам внутрпбрюшинно и внутривенно ежедневно на проятяжении трех дней. Паренхиматозные органы для гистологического исследования брали через 1 час, через б дней и 30 дней.

Раздел рагтгы по определению специфической активности проведен на животных с моделью гипербилирубинемни. Модель гипербилирубинемии создавали путем введения животным внутривенно растворов билирубина с таким расчетом, »ггобы его содержание в крови у, собак достигало в первой серии 20 мг%, во второй серии-50 мг%, у кроликов 10 мг% и 30 мг% соответственно. Сравнивали кинетику удаления билирубина из крови животных с гипербилирубинемии с его удалением при параллельном введении "лекарственной формы".

Все результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием {-критерия Стнодента. Критические значения во все случаях устанавливали с доверительной вероятностью р<шш = 5>» (р< или1 0,05).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Наиболее широко применяемые экстракорпоральные методы лечения гипербшшрубинг-мнй состоят либо в удалении билирубина из »ровотока, либо в сто окислении до нетоксичных продуктов, одним из которых является биливердин. В связи с этим, ферментативное окисление билирубина растворенным кислородом или другими естественными окислительными агентами, как альтернативный путь удаления билирубина, привлекает внимание исследователей. С этой точка зрения практический интерес могут представлять ферменты класса оксидаз н системы на нх основе.

В последнее время было показано (Зефнрова О.Н. и соавт.,1989 г), что комбинация по-роксидазы хрена и алкогольоксидазы эффективно окисляет билирубин до бидивердина в модельных условиях (фосфатный буфер рН-7,4, [СА-БР]=10~*М) и в плазме крови. Однако, для функционирования такой системы в физиологических условиях необходимо дополнительное введение этанола. В то же время среди ферментов класса оксидаз известна глкжозооксидаза, фермент осуществляющий окисление глюкозы с выделением перекиси водорода, а глюкоза является нормальным компонентом плазмы И присутствует в ней в значительных количествах (до 5-lOxlO'1 М). В связи с этим, в качестве обьекта исследований нами были выбраны системы на основе перокси-дазы и глюкозооксидазы как иммобилизованные на носителе, так и в растворе.

Таблице 3

Результаты окисления билирубина в модельном растворе в присутствии ферментативных гидрогелевых систем (1-60 мин, рН 7,4, fCA-EPJ-KT'M). ■

Гидрогелевые образцы Окисление билирубина, в %

1.Гпюперочс-2 68

2.Глюперокс-3 74

З.ГлюпфОкс-З.1 х 87

4.Глюперокс-5 56

5,Глюперокс-8 52

Результаты экспериментов на модельном растворе билирубина показали (табл.3), что яо всех случаях происходит окисление билирубина. Наиболее эффективно окисляли билирубин образцы под условным названием Глюперокс-3 и 3.1, которые были выбраны для дальнейших испытаний.

Результаты - опытов на плазме крови новорожденных с гемолитической болезнью показали (рис. 1 и 2), что наблюдается эффективное окисление билирубина в плазме.

до 1 БР. ммоль/л. 12» 10» 89 вв 40 20

■ 0

У-О Контроль. 2- ИГлюпероксЗ 3 - О Гтоперокс ».1

I - мин.

Рис.1. Снижение содержание (%) 'билирубина в плазме крови при инкубации в статическом режиме в сравнении с контролем. (1=60 мин.,п=10, р<0,05).

зоо т 200 180 100 •0 0

БР. мМоль/л

□ Контроль 1 Д-ОГлюпвроне 3 З-О Контроль 2 ^-□Глюгмрокс 3.1

• I—мин

Рис.2 .Снижение содержания {%) бширубина в плазме крови при перфузии через

сорбенты в сравнении с контролем в динамическом режиме. (1=60 мин.,п==10, р<0,05).

Однако, по сравнению с данными в модельных растворах (см. Табл.2.) удаление

билирубина из плазмы за одно и то же время меньше (87% в растворе, 46% в плазме). Возможно,

3

1

I

2

А

. о!о сС'угловлеио частичным шггибирозанием ферментов или разложением перемен водорода, а такж; тем, что билирубин связан белками крови. Основные биохимические параметры плазмы в течение всего времени перфузии достоверно не менялись.

' Проведенные испытания позволили перейти к экспериментам на цельной крови, где, в первую очередь, определяли гемосовмсст имость. При перфузии цельной крови через Глюперокс-3 и 3,1 в течение 60 мин. количество эритроцитов уменьшалось в среднем на 13%, тромбоцитов- на 14% и лейкоцитов- на 24%. Такое снижение количества форменных элементов является обычным для гемоперфузии, вероятно, обусловлено сд^бцней из подводящих магистралях и, возможно, на гидрогеле, г.к. на выходе из колонки не обнаружено измененных или разрушенных клеток крови, не изменился также и уровень свободного гемоглобина. Необходимо отметить, что такая убыль форменных элементов характерна для всех сорбентов, имеющих в своей структуре актигные групп*.. Поэтому наиболее перспективно их использование при плазмосорбции.

В связи со значительной сорбцией форменных элементов на мелкодисперсных образцах, для проверки работы иммобилизованных ферментных систем в режиме гемоперфузии на кроликах следующая серия экспериментов была выполнена на образце Глюперокс-8, изготовленном в форме плоской колонки. Результаты удаления билирубина у кроликов с моделью пшербилирубиие-мци представлены на рис.3.

Рис.3. Ихменение концентрации билирубина при гемоперфузии с использованием сорбента Гяюперокс-8 на кроликах (!- 60 мин., п-5) (

Из рнсушя 3 видно, что уро.'еиь билирубина в крови снижается в первыг 13 шт. пер-фузни, а затем остается на постоянном уровне на протяжении всего периода перфузии независимо от ее режима. При этом относительное снижение билирубина не превышает 16-17%, что связано, по-видимому, с недостаточным для такого режима работы содержанием иммобилизованных ферментов на поверхности полимерного сорбента. То есть, для эффективного удаления билирубина о режиме гемоперфузин необходимо или еще более снижать скорость гемоперфузин, что нежелательно ввиду риска тромбироваиия колонки, или существенно увеличивать активность ферментной системы на поверхности сорбента. Тем не менее, факт снижения билирубина в режиме гемоперфузин подтверждает, что, синтезированные гидрогелеаые системы способны окислять билирубин и в этом режиме. Для эффективного практического использования таких систем необходимы новые онструкцнониые решения в оборудовании для гемоперфузин, в частности, новые колонки с несколькими пмрогелевыми слоями.

Известно, что проведение гемосорбции на активированных углях и на ионообменных смолах вызывает в различной степени изменения кислотно-щелочного состояния организма. Результаты наших экспериментов показали, что рН, газовый состав и электролиты (К, Na) не менялись при использовании в качестве гемосорбента гндрогелевых систем. Остальные биохимические показатели крови модельных животных за время проведения перфузии также достоверно не менялись.

Таким образом, проведенные исследования показали, что гидрогелевыс сорбенты достаточно надежно работают в penante реальной гемоперфузин и позволяют эффективно удалять билирубин из крови подопытных животных. Дальнейшее усовершенствование конструкции сорб-ционной колонки и увеличение активности ферментной системы, иммобилизованной на сорбенте, позвйлиг предложить для практического здравоохранения новую, эффективную систему для удаления билирубина из крови.

Вторая часть нашей работы была связана с испытаниями ферментной системы на основе оксидаз для парентерального введения. Проведенные стендовые эксперименты на плазме с "лекарственной формой" показали однонаправленность процессов окислешм билирубина с происходящими в гкарогелевой системе. Цвет плазмы в пробирке становился зеленоватым и спектрофото-

метрически при этом регисфировали биливердин. Результаты окисления билирубина в плазме представлены на рис.4.

Из рис.4 видно, что при концентрации ферментов ПО*.Ч7 ед/мл н ГО=29 ел/мл и даже в два раза меньше билирубин а достаточно высоких концентрации (24 мг%) полностью окислялся в течение 30-40 минут. При десятикратном уменьшении концентрации ферментов процесс окисления замедлялся, и все же билирубин полностью окислялся в течение 60 минут. Для дальнейших исследований, как рабочие концентрации, выбраны ПО=3,7 ед/мл и ГО="2,9 ед/мл.

t мин

• ПО=37, ГО=29 ед\мл ПО=19, ГО=15 ед\мл ПО=3,7,ГО=2,9 ед/мл

Рис.4. Зависимость окисления БР от содержания ферментов в инкубируемой смеси (п-10, [СА-БР]=10~'М).

Проведенные специальные опыты показали {рис.5), что активность ферментативной системы охраняется длительное время и не исчерпывается при повторном увеличении концентрации билирубина. Видно, что при последовательном двухкратном добавлении билирубина в плазму (при однократном первоначальном введении ферментативной системы) ее активность сохраняется в теченне 90 минут, хотя окисление билирубша с каждым разом идет все более медленно.

Биохимитескне параметры плазмы при этом достоверно не менялись Наблюдалось некоторое снижение глюкозы, не выходящее за рамки нормы. Это обусловлено механизмом

действия фермптиЦ системы, в которой генерирование перекиси водорода, необходимой дчя окисления билирубина, происходит и счет окислила» глюкозы кислородом.

РисЛ Кинетика удаления билирубина из плазмы крови под воздействием ферментной системы. (1,2 повторно* введения билирубина, [СА-БР]-1в4М, [ПО]-31 ед\мл, [ГО]-29ед\мл).

Реальное» использования. такой ферментативной системы для лечения гипербилиру-бикемни можно было подтвердить только после соответствующих опытов по определению токсичности "лекарственной формы" н ее специфической фармакологической активности.

Результаты изучения острой токсичности представлены в табл. 4. Видно, что как отдельные ферменты, так и их смесь не обладают выраженным токсическим эффектом. Определена ЛД-50 для глюкозоокседазы» 32 мг\кг, перокекдазы™ 25 мг\кг и их смеси- 32\25 мг\кг, которые более чем в сто раз превышают рабочие концентрации ферментов (0,32-ГО, 0,25-П0,0,32\0,25 мг\кг соответственно). Эта результата позволяют отвести предлагаемую смесь ферментов по классу токсичности- к «ыалотоксичным» препаратам. Из этого также следует, что дозы "лекарственной формы* можно широко варьировать.

| . Результаты гистологических исследований паренхиматозж 'х органов также не выявили патологических изменений в разные сроки после введения ферментов в брюшную полость.

Та&лнца 4

Результаты из,учения острой токсичности ферментов и их смесей на мышах

Препарат Доза мг/кг Количество мышей в опыте Количество погибших иышей

1.Глюкозооксидаза 32 10 3

16 10 -

3,2 10 -

1,6 10 -

0,32 10 -

2-Пероксидаза 25 10 1

12,5 ю -

2,5 10 -

1,25 10 -

О, 25 10 -

3.Глыкозооксидаза

+пероксидаза 32/25 10 2

16/12,5 10 _ 7

3,2/2,5 10 -

1,6/1,25 10 -

0,32/0,25 10 -

В дальнейших исследованиях была определена специфическая активность "лекарственной формы" и ее влияние на биохимические и морфологические показатели крови животных с ги-пербилирубинемией. Результата этих опытов представлены на рис.б.в 7. Из рве. б видно, что в крови собак контрольной группы в течение 10 минут концентрация билирубина снижалась на 1820% и продолжала плавно снижаться, достигая к 1 часу 30% от исходной. В опытной группе животных, при введении смеси ферментов, наиболее выраженное (75-80%) снижение концентрации билирубина отмечалось в первые 10 минут, дальнейшее снижение было незначительным.

У кроликов (рис.7) конечный результат ( через 60 минут) был аналогичным предыдущему, но кинетика бил рубина при использовании «лекарственной формы» была более плавной. Не исключено, что это связано с видовыми особенностями, а именно, что з крови у кроликов присутствует перокендаза, которая может конкурировать с пероксидазой хрена в разложении переклей водорода.

Рис. б. Снижение концентрации билирубина в крови у собак с моделью гипербилирубинемии. (концентрация БР - 50 мг%, п"5,1=60мин). Контроль - внутривенное введение билирубина, опыт -внутривенное введение билирубина + «лекарственная форма».

Рис. 7. Снижение концентрации билирубина в крови у кроликов с моделью гипербияирубинемии (концентрация ЕР - 50 мг%, п~5, ¡"60 мин). Контроль - внутривенное введение билирубина, опыт -внутривенное введение билирубина + *лекарственная форма».

Изменение других биохимических параметров у кроликов контрольной и опытной групп представлены в табл.4.

Из таблицы видно,' что ни один из измеренных показателей практически не изменился в

; >

обеих группах животных

Таблица 4

Некоторые биохимические показатели крови, с моделью гилербилирубимгмии и при ее лечении (п= 5,1=60мин., П0\г0=0,25\0,32мг'жг)

Прмзр4 Ел шмер Исход 5« 10 И!Ш 15 мин ЗОмвя 60 мин

К О к 0 К о К О к о к О

Соаанлх г\п ®Д±Д2 вдао 6Щ4 6Ш32 ядда е±у мааз 6Щ1 «уад

Ач&мн ' йа 34ЛНД8 дацз 31Ш8 31.4Щ.7 Э0Д1Д8 31ДЩ7 ЭД7 31Д08 29ДЛ.7 ЗЦ2Щ7 Я2Щ7 ЗИЦ7

Глжт ЯЙД4 яшу ИЩИ: шиз 11ДЩЗ ад« ВДЭДЗ 7.Щ4 •дау 4ВДЗ

Мташ мКч «¡ад ХЙЩВ 5.4Ш2 ДЙЦ» «Щ да «ац т> «а« 5»1и

Хтэцш иМ\л даог 1КЩ1 ит та 1ЖЦ1 иш 1» 1.7ЙФ

Трввдрда 1,-ми №02 то 1ЛЮ2 .цваад 1.74Щ2 №01 цадз

АЛГ Шял даи ЙЙН4 19.4Н2 2ЗДЗ адии ДЙМ даед; адмз ДЩ5 25МД

лег 25,Ъ53 ад 2УИЗ 2Щ5Д адаи 25.4ВД ГЛ41 зщагр Д1±у имр

Нпрй 154Д7 иадз - !51±5й И9ИЗ 13Ш4Й МЗД4 кэдз ишу 1ФП7 ИЙ5? КИ57

Кпй 1В&П №025 ЭРй034 1И0Э9 З/ЩЯ ЗЙ02 З.Ж71 ДЭД27 ЗЭД21

Таблица 5.

Гематоморфологическпе показатели крови кроликов, с моделью гипербшшрубинемни

(БР-30 мг%, п=5,1=60 мин.)

Пэреыехры Ед. Исход 5 мин 10 мин 15 мин 30 юш 60 мин

ИЗМер К О К О К О К О К 0 К О

Лйиздш 1(Ал П.ШЯ ЩЯ1Д92 113Д8 11ДЮР 9,4109 6№Л 7.ЦД9 61ЙД7 9,Щ9 8£Ю8 9,4109

Эршро^иы 1(Ал 5ДЩЗ 5.ШДЗ 4ДЮ.2 4,1810,4 4^4 4.4ЩЗ 4Ж4 4ДЙ12 4.181ДЗ 4,ШДЗ

Трсм5силы . «Л* • 224117 23Ш7 202*16,7 214Ы9 20Ш6 20Ш7 212И7 197Й9 214±19 21Ш7 20Ш8 211±17

Гемхлйот г\лг- '- 9Ж+ 11.Щ5 8,8103 9,8±0,4 И.4Щ5 8,7*05 10,6±0,3 8,4Ю,4 12,6105 8ДЮ.4 11ДЮ,3 9ДЩ4

1адекхфиг % звдг ЗЙД2 37102 4Щ4 згидз ЗЙДЗ 37105 36104 -39*04 утт 35±0,4

1« 7ДЮ.014 7ДЮ.015 7ДЮ012 7,4Ш,017 7ДЮ.015 7,410018 7ДЩ015 7ДЮ012 7ДЮ013 7/ЫО019 7ДЮ012

К-внутривеяиое аведенте билирубина, о- внутривенное мчмгтг 6яднру6ина+ «лекарственна« форма»

Показатели морфологического состава крови и ее рН представлены в таб.5.

Из таблицы видно, что в контрольной группе происходит снижение эритроцитов и лейкоцитов на 25-27%, вызванное, очевидно, токсическим действием билирубина. Снижение этих показателей в опытной группе почти в три ррза меньше. Это, вероятно, обусловлено тем, что токсическое влияние билирубина уменьшается при его окислении ферментативной системой. Остальные показатели, включая рН крови существенно не менялись.

Эксперименты с парентеральным введением окислительных ферментных систем показали, что с их помощью можно добиться высокой эффективности окисления билирубина, несмотря на сю прочную связь с альбумином

Положительный эффект лечения гипербилирубинемии с помощью ферментативной композиции подтвержден гистологическими исследованиями. Так, у кроликов контрольной группы через два часа после введения билирубина в печеночных клетках отмечалась «токсическая» зернистость цитоплазмы и наличие в купферовских клетках желто-бурого пигмента. В группе леченных животных не определялась отечность гепатоцитов, желто-бурый пигмент в купферовских клетках практически отсутствовал.

Сравнивая результаты испытаний двух вариантов ферментных систем ( сорбента и растворимой смеси), можно предположить, что у новорожденных при гемолитической болезни лучше использовать парентеральное введение ферментной смес*, так как при этом исключается контакт с сорбентом , что позволит избежать отрицательного влияния на достаточно лабильные форменные элемент крови новорожденных.

Результаты работы показали, что окислительную детоксицирующую функцию печени можно с успехом моделировать с помощью биоспецифических окислительных ферментных систем, окисляющих гидрофобные токсичные соединения, переводя их в полярные, в результате чек> они легко могут выводиться из организма.

ВЫВОДЫ:

1 .Разработаны искусственные бноспецифические ферментные системы, позволяющие семтао стать билирубин а плазме я цельной кровя асах ■ режиме ^емоперфузин, так и при внутривенном введении.

2 .Проведены медико-биологические испытания ферментативной системы-пероксидаза, гяюкозооксидаза и сывороточный альбумин, иммобилизованной на матрице и показано, что такая система селективно удаляет билирубин в режиме гемоперфузии, практически не изменяя другие биохимические и морфологические показатели кроен. ■

3 .Установлено, что ферментативная сасгеыа-пероксндаза н глюкозоокстдатя-окисляет билирубин в крови, в плазме, полученной от новорожденных с ГШ в при парентеральном введения экспериментальным животным с моделью гипербнлирубннемш.

4.0прелелена эффективна;, доза "лекарственной формы"-0,25 мг/кг перокендазы и 0,32 мг/кг гдюкозоокоиаэы для лечения экспериментальной гипербилирубииемин, введение которой снижает содержание билирубина вдвое в течении 60 минут.

^.Установлено, что в указанных дозах "лекарственная форма" не вызывает отрицательных эффектов на показатели гоыеосгаза я на гпстоструюуру органов экспериментальных животных.

Практические рекомендации

1.ДетоксццирующуЮ функцию печени для удаления билирубина можно моделировать, используя искусственные ферментные системы на основе оксидаз- перокендазы хрена и глюкозо-окендазы- как в режиме гемоперфузии, так н при парентеральном введении.

2 .Достигнутая эффективность дегоксикации билирубина позволяет рассматривать использование ферментных систем как в-ьма перспективный метод и рекомендовать расширенные испытания подобных «реакторов» с целью их внедрения в практическую медицину для комплексного лечения гипербнлирубинемии.

Список дабот. опубликованных по теме:

1. Абдулмеджидов А.Ю., Мартынов А.К., Постников В.А., Сергкенко В.И. Пероксидаза хрена и глюкозооксидаза в окислении комплекса альбумин-билирубин. В кн. «Тезисы докладов 54-иаучной конференции студентов, молодых ученых и специалистов Дагестана по медицине», г. Махачкала, 1995 г. с. 56-57.

1п \rttro окисление билирубина в плазме больных гемолитической желтухи. В кп. «Тезисы докладов 54-научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов Дагестана по медицине», г. Махачкала 1995 г. с. 54-55.

3. Абдулмеджидов А.Ю., Постников В.А.. Сергиенко В.И., Коростелева ИГ., Багрпй Е.И. Изучения окисления билирубина в модельных растворах комплекса альбумин-билирубин. Вопросы медицинской химии-1996 г. -№1, с. 33-35.

4. Абдулмеджвдов А.Ю., Коростелева И.Г., Мартынов А.К., Постников В.А„ Сергиенко В.И. Окисление билирубина в плазме крови детей с гемолитической болезнью новорожденных в присутствии ферментативной системы пероксидаза-глюкозооксцдаэа. Вопросы медицинской химии - 19Р5 г,-№2, с. 18-21.

2. Абдулмеджидов А.Ю., Мартынов А.К., Постников В.А., Сергиенко В.И.

Тираж 400 ЭК