Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Средства активации систем детоксикации среди циклических и линейных производных мочевины

Щ. от " • ¿¿С ; :

У

СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ НИИ ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ ТОМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА

СО РАМН

На правах рукописи

НОВОЖЕЕВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

УДК 615.21: 615.35: 616.36

СРЕДСТВА АКТИВАЦИИ СИСТЕМ ДЕТОКСИКАЦИИ СРЕДИ ЦИКЛИЧЕСКИХ И ЛИНЕЙНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ МОЧЕВИНЫ (Экспериментальное исследование)

14.00.25 - Фармакология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

// Л

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор САРАТИКОВ A.C.

Томск - 1997

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ................................... 6-12

2. ИНДУКТОРЫ ЦИТОХРОМА Р-450 ПЕЧЕНИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ КЛИНИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ (Обзор ли-

13-47

тературы)......................................................................................

2.1 Индукторы фенобарбиталового типа................................. 13-30

2.2 Возможные механизмы действия индукторов ФБ-типа.... 3 0-3 7

2.3 Перспективы использования средств активации систем детоксикации в эксперименте и клинике.......................... 37-47

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 48-76

3.1 Экспериментальные животные.......................................... 48

3.2 Характеристика исследуемых препаратов, дозы, способы введения............................................................................... 48-56

3.3 Методы исследования систем биотрансформации............ 56-70

3.4 Экспериментальные модели патологии.............................. 70-76

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................. 77-267

4.1 Скрининг индукторов метаболизма ксенобиотиков среди циклических и линейных производных мочевины и ами-

77-119

дов........................................................................................

4.2 Механизм влияния циклических и линейных производ-

ных мочевины на цитохром Р-450-зависимую моноокси-

120-144

геназную систему печени крыс..........................................

4.3 Влияние ферментиндуцирующих средств на системы де-токсикации печени крыс в онтогенезе................................ 144-164

4.4 Эффективность ферментиндуцирующих средств при экспериментальной патологии печени............................... 164-267

4.4.1 Токсическое повреждение печени четыреххлори-стым углеродом и его коррекция ферментинду-

166-191

цирующими средствами........................................

4.4.2 Эффективность ферментиндуцирующих средств

при Б-галактозаминовом гепатите.......................... 191-207

4.4.3 Экспериментальный холестаз и его коррекция ферментиндуцирующими средствами.......... ......... 207-249

4.4.4 Влияние профилактического введения ферментиндуцирующих средств на экспериментальную

249-254

гипербилирубинемию у новорожденных крысят...

4.4.5 Влияние ферментиндуцирующих средств на функциональную активность монооксигеназной

255-267

системы печени в постишемическом периоде........

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................268-305

6. ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................................306-307

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................308-358

АЛАТ

АН

АНИТ

АЛ

АСАТ

БГМ

БД

БСФ

ГБ

ГР

ГТ

ГХБ

ДДЭ

ДМБ

ДМОБ

ДФПГ

ДХПОБ

ДХФИФ

МАДК

МДА

мое

мх

нт

ПААГ

ПАУ

ПОЛ

СОКРАЩЕНИЯ

аланинаминотрансфераза

р-гидроксилаза анилина

а-нафтилизотиоцианат

К-деметилаза аминопирина

аспартатаминотрансфераза

бензгидрилмочевина

бензидин

бромсульфалеин

гексобарбитал

глутатионредуктаза

глутатион- 8-трансфераз

гексохлорбифенил

1,1 -ди(п-хлорфенил)-2,2-дихлорэтилен 3,3 -диметилбензидина 3,3 -диметилокси-бензидина 1,1 -дифенил-2-пикрилгидразина (3,5-дихлор-пиридилокси)-бензол 2,6-дихлорфенолиндофенол моноамид дифеновой кислоты малонового диальдегида монооксигеназная система печени 3 -метилхолантрен неотетразолий синий полиакриламидный гель полиароматические углеводороды перекисное окисление липидов

ПФД перфтордекалин

ПХБ полихлорбифенил

ТБК 2-тиобарбитуровой кислотой

ТМБ 3,3,5,5-тетра-метилбензидина

ТСО транс-стильбеноксид

ТФД 2,4,6-три-фенилдиоксан-1,3

ТХБ тетрахлорбифенил

тэмэд КДЯ,К,Ы-тетраметил-этилендиамин

ФБ фенобарбитал

ФИС ферментиндуцирующие средства

ФМ фронтальные многоугольники

ФП флавопротеид

ФЦ феррицианид

ЩФ щелочная фосфатаза

ЭПР эндоплазматический ретикулум

ЯМР ядерный магнитный резонанс

Аш амил

Ви бутил

вг этил

Нех гексил

ьВи изобутил

ьРг изопропил

Ме метил

РСЫ прегненолон-1 ба-карбонитрил

РЬ фенил

Рг пропил

раствор додецилсульфата натрия

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Управление процессами биотрансформации чужеродных соединений - ксенобиотиков - в живом организме является важной проблемой современной биохимии, фармакологии и токсикологии [100, 109, 189, 381, 475]. Перспективным в этом направлении является создание и изучение новых селективных и малотоксичных индукторов ферментных систем, катализирующих биотрансформацию как ксенобиотиков, так и эндогенных веществ [44, 100, 228, 372].

Средства активации систем детоксикации или ферментиндуцирующие средства (ФИС)- важны для профилактики и лечения синдрома снижения де-токсицирующей функции печени, наблюдаемого при ряде патологических и физиологических состояний. Кроме того, они необходимы в связи с неблагоприятной экологической ситуацией во многих регионах [125, 213, 184]. Экологический стресс, которому подвергается все живое в индустриально развитом обществе, приводит к развитию «химической болезни», нарушению гомеостаза, заболеваниям гепатобилиарной системы [405]. Особенно страдают дети, так как у них не достаточно развиты системы биотрансформации ксенобиотиков. Наиболее уязвим детский организм в период пре- и постнатального развития, когда еще не сформирован гематоэнцефалический барьер и существует физиологическая незрелость систем детоксикации в печени, что приводит к нарушению пси-хо-эмоциональной сферы как у детей так и у взрослых [120, 189, 195, 292].

Как известно, детоксикация организма является патогенетически обоснованной и неотложной мерой при экзогенных отравлениях, связанных с передозировкой лекарств, в том числе принятых с суицидной целью, а также аддик-тивным потреблением токсикантов, наркотиков, психотропных средств, алкоголя и его суррогатов [45, 105, 229, 495].

Наибольший вклад в детоксикацию ксенобиотиков вносят две системы организма: цитохром P-450-зависимая монооксигеназная система клетки (филогенетически более древняя система защиты гомеостаза) и иммунная система организма [90]. Монооксигеназная система находится практически во всех клетках организма, ее ключевыми ферментами является суперсемейство цито-хромов Р-450 [126, 237, 320]. Наиболее развита монооксигеназная система в печени, и именно здесь осуществляется метаболизм большинства ксенобиотиков, поступивших в организм, а также эндогенных субстратов, таких как стероиды, билирубин, аскорбиновая и фолиевая кислоты и т.д. [228] На введение ксенобиотиков монооксигеназная система печени отвечает, как правило, активацией специфических форм цитохрома Р-450, ответственных за окислительный метаболизм, т.е. для этой системы характерен феномен ферментативной индукции: увеличение синтеза ферментного белка de novo в первые часы поступления ксенобиотика в гепатоцит. Иммунная система подключается лишь при повторном или хроническом поступлении ксенобиотика. Очень часто иммунная система подавлена при эндогенных и экзогенных интоксикациях. Введение искусственных антител против тех или иных ксенобиотиков, хотя и перспективно, но очень дорогостояще [89]. Следовательно, активация собственных детоксицирующих систем организма, особенно при физиологическом или патологическом снижении их активности - наиболее приемлемый путь детоксикации [44, 100, 161, 162, 237, 475].

В настоящее время выявлено и изучено сравнительно большое количество индукторов систем биотрансформации чужеродных соединений, в том числе и лекарств. Они отличаются друг от друга как по химической структуре, так и по механизму действия [106, 126]. Некоторые из них уже нашли применение в клинике. Другие применяются в эксперименте или представляют интерес для токсикологов. Вся группа ФИС в целом интересна с точки зрения понимания и поиска путей управления метаболизмом лекарственных веществ [44, 45, 100, 237, 403].

Вместе с тем, набор ферментиндуцирующих средств, применяемых в клинике, весьма ограничен и представлен главным образом фенобарбиталом и зик-сорином. Однако, малая широта терапевтического действия и наличие мощного седативного эффекта ограничивают применение фенобарбитала как средства активации систем детоксикации. Известный ферментиндуцирующий препарат с гепатопротекторной активностью зиксорин обладает умеренной ферментинду-цирующей активностью и рядом побочных эффектов [104, 114].

Таким образом, поиск новых оригинальных средств активации систем детоксикации, обладающих селективной ферментиндуцирующей активностью и низкой токсичностью, остается актуальной задачей фармакологии и токсикологии. Кроме того, не разработаны принципы и методические подходы к поиску и изучению ФИС, как самостоятельного класса фармакологических средств.

Перспективен поиск средств активации систем детоксикации среди циклических и линейных производных мочевины, обладающих широким спектром биологической активности. Они являются малотоксичными соединениями. Анализ тенденций развития фармакологических исследований также показывает перспективность поиска биологически активных веществ среди этого класса соединений [152, 458].

На кафедре фармакологии Сибирского государственного медицинского университета с 1960 года ведется направленный поиск биологически активных соединений с психотропной и нейротропной активностью. Созданы новые оригинальные малотоксичные антиконвульсанты - производные циклической (бензонал, бензобамил, галонал) и линейной (галодиф, безерил, бензгидрилмо-чевина) мочевин. Проведенные нами углубленные фармакологические и токсикологические исследования выявили у этих антиконвульсантов новое свойство -активировать детоксицирующие системы печени [142, 174].

Работа выполнена в соответствии с комплексной целевой программой «Здоровье человека в Сибири» и планом научно-исследовательских работ Си-

бирского государственного медицинского университета (№ государственной регистрации темы 01.85.0069846).

Основная часть работы выполнена на кафедре фармакологии и ЦНИЛе Сибирского государственного медицинского университета (Томск). Отдельные фрагменты - на базе НИИ психического здоровья Томского научного центра СО РАМН, Института молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН (Новосибирск).

Цель исследования - разработка основных принципов целенаправленного поиска и доклинического исследования специфической активности новых фер-ментиндуцирующих средств на примере циклических и линейных производных мочевины; создание новых высокоэффективных и малотоксичных ФИС.

Задачи исследования:

1.Провести скрининг индукторов метаболизма ксенобиотиков среди различных классов карбамидсодержащих соединений, преимущественно циклических и линейных производных мочевины, отбор наиболее перспективных соединений для дальнейшего углубленного их исследования.

2.Изучить механизм ферментиндуцирующего действия перспективных препаратов с учетом основных принципов современной ксенобиохимии.

3.Оценить эффективность новых соединений в сравнении с эталонными индукторами на экспериментальных моделях, адекватных некоторым физиологическим и патологическим состояниям человека.

4.Провести изучение новых ФИС на животных различных возрастных групп для оценки возможности их применения у детей.

5.Подготовить методические рекомендации по доклиническому изучению средств активации систем детоксикации.

Научная новизна. Впервые проведен скрининг ферментиндуцирующей активности среди 152 соединений, преимущественно линейных и циклических производных мочевины, и анализ зависимости их биологической активности от

химической структуры; отобраны 4 наиболее переспективных ферментиндуци-рующих препарата: бензонал и галонал - ацилпроизводные барбитуровой кислоты, галодиф - галогенпроизводное бензгидрилмочевины и безерил - производное изовалерилмочевины.

Изучен механизм ферментиндуцирующего действия указанных оригинальных индукторов метаболизма ксенобиотиков. Установлен тип ферментативной индукции монооксигеназной системы печени этими соединениями.

Показана высокая терапевтическая и профилактическая эффективность новых ФИС, не уступающая или превосходящая эталонные препараты - фенобарбитал и зиксорин, на следующих моделях патологии:

- токсический ССЦ-гепатит;

- О-галактозаминовый гепатит;

- подпеченочный холестаз;

- "обратимый" подпеченочный холестаз;

- внутрипеченочный АНИТ-холестаз;

- 20-минутная тотальная ишемия печени;

- викасоловая гипербилирубинемия крысят.

Установлена высокая ферментиндуцирующая активность новых препаратов в отношении монооксигеназной системы печени новорожденных и молодых животных обоего пола.

Показана возможность индукции детоксицирующих систем печени крысят при введении галонал а, бензонал а и безерил а беременным и кормящим самкам.

Разработаны принципы доклинического изучения новых ферментиндуци-рующих средств на основе современных представлений о путях регуляции процессов биотрансформации чужеродных и эндогенных соединений.

Предложена методология внеэкспериментального прогноза индукторов ФБ-типа по химической структуре соединения.

Научно-практическая ценность работы. Выявлено 4 перспективных фер-ментиндуцирующих средства: бензонал, галонал, галодиф и безерил, которые не уступают или превосходят эталонные индукторы - фенобарбитал и зиксорин по специфической ферментиндуцирующей активности и значительно менее токсичны.

Разработаны и утверждены Фармакологическим комитетом МЗ РФ «Методические рекомендации по доклиническому изучению средств активации систем детоксикации», 1993.

Получено 14 авторских свидетельств и патентов на изобретения.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на следующих научных форумах: III и IV Национальные Конгрессы «Человек и лекарство» (Москва, 1996; 1997); VI Всемирный Конгресс по биологической психиатрии (Ницца, 1997); XII Интернациональный Конгресс по фармакологии (Монреаль-Квебек, 1994); V и VI Всесоюзные Съезды фармакологов (Ереван, 1982; Ташкент, 1988); I Съезд Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); VII Международная конференция по биохимии и биофизике цитохрома Р-450 (Москва, 1991); Международная конференция «Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии»(Томск, 1997); Интернациональная конференция «Загрязнение окружающей среды» и «Нейроиммунные взаимодействия и окружающая среда» (Санкт-Петербург, 1995); Международная конференция по фундаментальным и прикладным проблемам охраны окружающей среды ( Томск, 1995); Всесоюзные конференции: по цитохрому Р-450 (Новосибирск, 1987; Ялта, 1989); по токсикологии (Москва, 1980); конференции по физиологии пищеварения (Тернополь-Львов, 1986; Томск, 1989); конференции по поиску биологически активных соединений (Купавна, 1989, 1990, 1992); Межреспубликанская конференция по фармакологии (Волгоград, 1989); 5-я Российская конференция «Актуальные вопросы гастроэнтерологии» (Томск, 1997); Проблемные комиссии по фармакологии

(Душанбе, 1987; Киев, 1989; Омск, 1992); Региональные конференции фармакологов Сибири и Дальнего Востока (Томск, 1987; Барнаул, 1996; Омск, 1997); Научно-практические конференции Сибирского государственного медицинского университета (1980, 1982, 1984, 1986, 1988, 1989, 1990, 1991, 1997); I, II, III итоговые конференции научно-производственного объединения фармакологов (Томск, 1986, 1988, 1990); Конференции НИИ психического здоровья Томского научного центра СО РАМН (Томск, 1995, 1996;1997).

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 70 работ в отечественных и зарубежных журналах, материалах конгрессов, съездов, конференций. Изданы «Методические рекомендации по доклиническому изучению средств активации систем детоксикации», Москва, 1993.

2. ИНДУКТОРЫ ЦИТОХРОМА Р-450 ПЕЧЕНИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ КЛИНИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ (Обзор литературы) Одним из наиболее значительных достижений биохимической фармакологии является открытие феномена ферментативной индукции, вызываемой многими чужеродными соединениями, в частности барбитуратами [431, 434]. Сущность этого явления заключается в обратимом увеличении активности ряда ферментов эндоплазматического ретикулума (ЭПР), так называемых многоцелевых монооксигеназ в клетках печени [157, 277].

Индукторы монооксигеназной системы печени - низкомолекулярные гидрофобные соединения, способные вызывать in vivo в микросомной фракции эу-кариотических клеток синтез одной или координированный синтез множественных молекулярных форм цитохрома Р-450, что обусловливает широкую субстратную специфичность монооксигеназной системы [126].

Из более чем семьсот известных ныне ксенобиотиков - индукт�