Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Общие закономерности и диагностическое значение изменения образования активных форм кислорода лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах

На правах рукописи

0® ¿¿^¿"З

ФИЛАТОВ ОЛЕГ ЮРЬЕВИЧ

Общие закономерности и диагностическое значение изменения образования активных форм кислорода лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах

14.00.36 - аллергология, иммунология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1999

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете.

Научный консультант: заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.И. Пыцкий Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.А. Стенина член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор И.С. Гущин

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Н.В. Медуницын

Ведущее учреждение:

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится « в 14.00 на

заседании диссертационного Совета Д 084.14.06 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117869 г. Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан « « 1999г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат медицинских наук Т.Е. Кузнецова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Общепризнанным является участие полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в патогенезе аллергических процессов в качестве клеток-эффекторов (Беклемишев Н.Д., 1986; Гущин И.С., 1998; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Пыцкий В.И. и др., 1999; Jagerl., 1988).

При этом отмечается как количественное изменение этих клеток в тканях, так и изменение их функциональной активности (хемотаксис, способность поглощать и переваривать бактерии, ферментативная активность и т.д.) (Аравийский Р.А.,1975; Барсуков A.A. и др., 1985; Гончарук З.Н., 1975; Kubo А et al, 1987; Miklaszewska М. Et al, 1988). Особое внимание уделяется способности ПЯЛ секретировать активные формы кислорода (АФК), поскольку именно с ними во многом связана способность этих клеток осуществлять завершенный фагоцитоз, цитотоксичность и бактерицидность (Babior В.М., 1978; Dallegri F et al, 1987; Humphreys I.M. et al, 1987; Iyer G.Y. et al, 1961). АФК могут способствовать также изменению секреции некоторых медиаторов аллергии, что также модифицирует течение аллергического процесса (Гущин И.С. и др., 1989). Чаще всего для исследования способности клеток секретировать АФК используется метод измерения хемилюминесценции (ХЛ), поскольку этот метод весьма точно отражает динамику секреции этих метаболитов (Владимиров Ю.А. и др., 1989; Allen R.C. et al, 1972; Aquilar A.D.; Serrono E„ 1989; Westman J.A., 1986). При этом при аллергических процессах наблюдалось как увеличение ХЛ, так и ее угнетение, что свидетельствует о неоднозначности изменения секреции АФК (Даниляк И.Г. и др., 1992; Казначеева Л.Ф. и др., 1998;

з

Филатов О.Ю. и др. , 1989; Jenkins F.M. et al, 1987; Lindberg R.E. et a], 1982).

Определяющую роль в изменении XJI ПЯЛ при аллергических процессах играет аллерген, воздействие которого приводило к развитию специфического угнетения XJI ПЯЛ (Пыцкий В.И. и др., 1985; Пыцкий В.И., Филатов'О.Ю., 1992). Очевидно, что в основе этого феномена лежит изменение секреции АФК ПЯЛ, однако закономерности этого явления остались недостаточно изученными. Не ясно, как изменяется секреция АФК лейкоцитами в зависимости от стадии аллергического процесса, изменение активности каких ферментов обуславливает изменение секреции АФК ПЯЛ под действием аллергенов и какими механизмами вызываются эти изменения. Не ясно также, как изменяется секреция АФК лейкоцитами крови при псевдоаллергических процессах, и какое влияние на эти изменения оказывают вещества, вызывающие псевдоаллергию. Поскольку метод ХЛ достаточно прост в постановке и безопасен, возникла необходимость оценить возможность использования этого феномена в диагностических целях.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось установить общие закономерности и некоторые механизмы изменений образования активных форм кислорода лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах, оценить диагностическое значение этих изменений.

Задачи исследования. Выполнение поставленной цели потребовало решения следующих задач:

- определить характер изменения секреции АФК лейкоцитами крови под воздействием аллергена при некоторых аллергических заболеваниях (поллиноз, атопическая бронхиальная астма, непереносимость пенициллина);

- определить характер изменения секреции АФК лейкоцитами крови при некоторых псевдоаллергических заболеваниях (непереносимость ненаркотических анальгетиков);

- определить характер изменения секреции АФК лейкоцитами под влиянием аллергена при экспериментальных аллергических процессах I и III типов ( анафилактический шок, феномен Артюса);

- оценить вклад НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной систем клетки в изменение секреции АФК лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах;

- определить возможность прямого и опосредованного воздействия аллергена на ПЯЛ, приводящего к изменению секреции АФК лейкоцитами крови при аллергических процессах;

- определить роль гистамина в изменении секреции АФК лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах;

- оценить диагностическое значение изменения секреции АФК лейкоцитами крови под влиянием аллергена при аллергических и псевдоаллергических процессах.

Научная новизна исследования: Нами впервые установлено, что:

1. Инкубация крови больных аллергическими заболеваниями (поллиноз, атопическая бронхиальная астма, лекарственная аллергия) с аллергенами в различных диапазонах доз приводит к развитию фазового изменения ХЛ ПЯЛ. Малые дозы атлергенов усиливают ХЛ ПЯЛ, а большие - угнетают.

2. Характер изменения ХЛ лейкоцитов под влиянием аллергенов при аллергических заболеваниях зависит от их стадии. В стадию ремиссии аллергического заболевания аллергены усиливают ХЛ ПЯЛ, а в стадию обострения - угнетают.

3. Инкубация крови экспериментальных животных, у которых был воспроизведен аллергический процесс, с аллергеном в разных диапазонах доз приводит к специфическому фазовому изменению ХЛ.

4. Инкубация анальгина и салицилата натрия с кровью больных , страдающих непереносимостью анальгина и аспирина приводит к дозозависимому угнетению XJI лейкоцитов крови.

5. В патогенезе изменения секреции АФК при аллергических и псевдоаллергических процессах играет роль изменение активности НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы ПЯЛ.

6. В механизмах изменения ХЛ под действием аллергена и псевдоаллергена при аллергических и псевдоаллергических процессах принимает участие гистамшг.

Научно-практическая значимость и внедрение работы.

Полученные результаты легли в основу разработки диагностического теста in vitro, который может быть использован для выявления аллергена, ответственного за сенсибилизацию, что особенно важно в случае лекарственной аллергии, где диагностика in vivo приводит к развитию осложнений. Этот тест может быть использован для выявления лекарственных препаратов, вызывающих псевдоаллергические реакции. Диагностический тест используется в медицинской практике 1 ГКБ г. Москвы, поликлиник МВД и МО. Тест защищен авторским свидетельством на изобретение за №1436643.

Полученные результаты в значительной степени расширяют существующие сегодня представления об участии полиморфноядерных лейкоцитов в патогенезе аллергических и псевдоаллергических процессов, что создает основу для разработки новых подходов к патогенетически обоснованному лечению аллергических и псевдоаллергических заболеваний. Полученные данные используются в

г.

лекциях и на практических занятиях, проводимых на кафедре общей патологии МБФ РГМУ и факультета социальной медицины Государственной Академии им. Маймонида.

Апробация работы. Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований Российского государственного медицинского университета и апробирована на совместной научной конференции кафедр иммунологии, нормальной физиологии, патологической физиологии, общей патологии РГМУ и отдела иммунологии МЛК РГМУ.

Основные положения работы были доложены на Всесоюзной конференции « М.В.Ломоносов и Север « ( Архангельск, Россия, 1986), 1 Национальной конференции Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (Москва, Россия, 1997), XVI Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Канкун, Мексика, 1997), 1 Международном симпозиуме по фундаментальным проблемам и применению современных хеми- и биолюминесцентных исследований в химии, биохимии, медицине и образовании (Дрезден, Германия, 1997), Международном симпозиуме « Человек и катастрофы: проблемы обучения новым технологиям и подготовки специалистов к действиям в чрезвычайных ситуациях « ( Москва, Россия, 1999).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. При экспериментальных аллергических процессах и атопических заболеваниях вследствие действия аллергена на полиморфноядерные лейкоциты в этих клетках развивается изменение секреции АФК, носящее фазовый характер в зависимости от диапазона концентраций аллергена.

2. Проявление фазового характера изменения секреции АФК лейкоцитами определяется стадией аллергического процесса. В стадию

обострения аллергических процессов развивается угнетение секреции АФК под действием аллергена, а в стадию ремиссии - активация секреции АФК.

3. При воздействии на лейкоциты крови ненаркотических анальгетиков, вызывающих псевдоаллергические реакции, дозозависимо угнетается их способность секретировать АФК.

4. Изменение секреции АФК под воздействием аллергена и псевдоаллергена возникает как результат изменения активности НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы в ПЯЛ.

5. Изменение секреции АФК лейкоцитами крови при аллергическом и псевдоаллергическом процессах вызывается в значительной мере действием гистамина, высвобождающегося из базофилов.

6. Изменение ХЛ, развивающееся под действием аллергена, может быть использовано для диагностики, а именно для выявления сенсибилизирующего аллергена или псевдоаллергена.

Публикации результатов и исследований.

По материалам диссертации опубликовано 22 печатные работы.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 190 страницах машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 20 рисунками. Указатель литературы включает 216 источников (отечественных - 69, зарубежных -147).

Материалы и методы исследования.

Клинический раздел работы представлен результатами исследования крови у 182 больных аллергическими и

псевдоаллергическими заболеваниями из I ГКБ г. Москвы, стационара Института иммунологии, поликлиники МО РФ, поликлиники МВД РФ, ЦКБ МПС. В качестве контроля было обследовано 115 здоровых доноров. Возраст обследованных колебался в пределах от 16 до 57 лет, средний возраст составлял 34 года. Обследовались лица обоих полов, причем мужчины составляли 52%, а женщины — 48%. Рапспределение больных по нозологическим формам было следующее:

— больные поллинозом — 56 человек, из них больные поллинозом в стадии обострения — 15 человек, в стадии ремиссии — 41 человек;

_ больные атонической бронхиальной астмой — 26 человек, из них

больные в стадии обострения — 10 человек, в стадии ремиссии — 16 человек;

— больные лекарственной аллергией к пенициллину — 16 человек;

_ больные с непереносимостью ненаркотических анальгетиков — 84

человека, из них с непереносимостью анальгина —44 человека , аспирина — 40 человек, в том числе с непереносимостью обоих препаратов -12 человек.

Экспериментальный раздел работы представлен результатами исследования крови у 128 лабораторных животных. Их них 62 составляли кролики в возрасте 2-х лет, весом 3-4 кг. Другую группу составляли 66 морских свинок 6-8 месячного возраста.

У людей для исследований брали образцы цельной гепаринизироваиной крови, взятой натощак из локтевой вены. Выделение лейкоцитов проводили осаждением в присутствии декстрана по методу Воуш (1968), а также в гредиенте плотности фиколл-уротраст по методу English и Anderson (1974). Подсчет количества клеток осуществлялся при окраске их метиленовой синью. Жизнеспособность оценивали с использованием окраски трипанового синего. Тест

восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) проводили по методу Okamura et al (1976) в модификации Гордиенко С.М. (1983). Результат оценивали в единицах оптической плотности (что отражает количество экстрагированного формазана на 1 млн. клеток).

Измерение хемилюминесценции (XJI) ПЯЛ проводили на хемилюминометре, имеющем в качестве основного узла ФЭУ-127. Общий объем измерительной кюветы составлял 5 мл. Интенсивность ХЛ регистрировалась на самописце. В кювету помещали исследуемую суспензию клеток (0,5-1,0 млн), добавляли 0,25 мл люминола (Ю^М) и доводили объем суспензии до 3 мл средой Хенкса. Измеряли уровень спонтанной ХЛ. После этого вводили в суспензию 0,1-0,25 мл стимулятора - сульфат бария (2 мг/мл). Регистрировали общую стимулированную ХЛ. Для того, чтобы учесть изменение ХЛ, вносимое уровнем спонтанной, мы рассчитывали интенсивность индуцированной ХЛ (1Ш1Д), как разность общей и спонтанной. Интенсивность ХЛ выражали в условных единицах. Регистрировали также время развития максимальной интенсивности вспышки (tmax)

Для измерения ХЛ цельной крови в кювету помещали 0,5-1,0 мл исследуемой крови, добавляли 0,5 мл люминола (104М) и доводили объем до 4,5 мл.

Активность НАДФН-оксидазы определяли по методу Wymann et al (1987). Этот метод основан на том, что используя азид натрия, можно получить полное подавление активности клеточной миелопероксидазы, метаболизирующей перекись водорода. В то же время, добавляя в систему экзогенную пероксидазу (пероксидазу хрена), которая не чувствительна к действию азида в высоких концентрациях, можно регистрировать люминольную ХЛ, отражающую выделение перекиси

водорода НАДФН-оксидазной системой клетки. Результат измерения XJI представлен в относительных единицах.

При обработке экспериментальных данных использовали стандартные статистические расчеты по Стьюденту. Все результаты в данной работе представлены в виде М + т, где М - средне арифметическое значение параметра, m - ошибка среднего.

Результаты исследования и обсуждение.

Закономерности изменения секреции АФК при аллергических процессах

Аллерген в процессе развития аллергического процесса, воздействуя на ПЯЛ, изменяет многие функциональные характеристики этих клеток. В частности, происходит изменение показателей фагоцитарной активности, активности лизосомальных ферментов, хемотаксической активности. Изменяется также и способность ПЯЛ секретироватъ АФК.

Для выявления закономерностей секреции АФК были проведены исследования при экспериментальных аллергических процессах у животных и у людей, страдающих поллинозом, атопической бронхиальной астмой и лекарственной аллергией на пенициллин. В эксперименте были использованы модели аллергических реакций III типа у кроликов и I типа у морских свинок. Для того, чтобы определить характер изменения секреции АФК лейкоцитами под влиянием аллергена в ходе развтттия аллергического процесса, мы провели исследование изменения люминольной ХЛ лейкоцитов крови под воздействием аллергена у кроликов при воспроизведении феномена Артюса. Феномен Артюса воспроизводили введением нормальной лошадиной сыворотки (НЛС) периодичностью

раз в пять дней в течение месяца. Количество животных опытной группы составляло 18, контрольной - также 18 (им вводили вместо HJIC физиологический раствор). У всех животных опытной группы в месте введения на 10-15 сутки возникал очаг воспаления, а на 20-25 сутки -очаг некроза с изъязвлением и кровоизлияниями. У кроликов обеих групп, начиная со вторых суток, из краевой вены уха брали кровь и проводили инкубацию проб крови с различными концентрациями аллергена (НЛС) при 37°С 60 минут. После этого измеряли люминольную ХЛ ПЯЛ. Параметры ХЛ этих проб соотносили к параметрам ХЛ контрольных проб (инкубация крови со средой Хенкса вместо НЛС) и выражали в относительных единицах. Изменение индуцированной ХЛ ПЯЛ крови кроликов под действием аллергена (НЛС) в процессе развития феномена Артюса представлено на рис.1. Как видно из рисунка, характер изменения ХЛ зависит от концентрации аллергена (титра НЛС). При малых концентрациях (титр НЛС 1.60000) наблюдалось увеличение интенсивности ХЛ в первые 5 дней после первого введения НЛС. Затем интенсивность ХЛ снижалась. Ее средние величины находились на нижней границе нормальных колебаний ХЛ. Большие концентрации аллергена (НЛС 1:3000) в значительной степени угнетали ХЛ уже начиная с 5 суток эксперимента, и это угнетение выявлялось длительное время ( еще 40 суток ) после прекращения введения НЛС.

Известно, что существует общебиологическая закономерность, постулирующая , что то, что угнетает функцию при больших концентрациях, должно ее стимулировать при малых. Поэтому мы решили проверить действует ли эта закономерность в стадии устойчивого угнетения ХЛ при использованных нами концентрациях НЛС.

Рис. 1. Зависимость индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов крови кроликов от времени в процессе феномена

Артюса

3,5 т

О

О 2 5 8 10 20 25 30 35 40 45 50 60 70

Время, сутки

ХЛ крови кроликов опытной группы, инкубированной с НЛС в разведении 1:3000 -ХП крови кроликов опытной группы, инкубированной с НЛС в разведении 1:60000 1ХЛ крови интактных кроликов, инкубированной с НЛС

С этой целью брали кровь у кроликов на 30 -ые сутки эксперимента и инкубировали ее с пятью концентрациями НЛС от гомеопатических ( 1:3000000 ) до больших ( 1:30 ). Результаты представлены на рис 2. Видно, что большие концентрации НЛС ( 1:3000 и 1:30 ) вызывали как обычно, угнетение ХЛ, а малые ( 1:3000000 и 1:300000 ) -стимулировали ее. И хотя различие недостоверно , наблюдающийся в обоих точках однонаправленный результат свидетельствует о существовании стадии стимуляции. Аналогичные исследования, проведенные на ранних этапах эксперимента напротив показали наличие выраженной стадии стимуляции, преобладающей над стадией угнетения.

Рис. 2. Зависимость индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов крови кроликов от концентрации (разведения) НЛС на 30 сутки развития феномена Артюса.

1:3000

ч-н

1:3000000 1:300000 1:60000

Разведение аллергена (НЛС)

-ХЛ крови кроликов опытной группы на 30 сутки

---ХЛ крови интактных кроликов

Таким образом, аллерген вызывал как подавление, так и стимуляцию ХЛ в зависимости от концентрации на раннем этапе аллергической реакции, тогда как по мере развития аллергической реакции преобладало угнетающее действие аллергена. Причем это фазовое изменение ХЛ, отражающее фазовое изменение секреции АФК, под действием аллергена (НЛС) было специфическим, поскольку инкубация крови интактных кроликов с НЛС не приводила к изменению ХЛ.

Для выяснения вопроса, будет ли подтверждаться наблюдаемый эффект специфического угнетения ХЛ ПЯЛ большими дозами аллергена при экспериментальных аллергических реакциях 1 типа, мы провели исследование изменения ХЛ при воспроизведении анафилактического шока у морских свинок. Для этого морских свинок разделили на две

группы - опытную (26 животных) и контрольную (20 животных). Животных опытной группы сенсибилизировали введением НЛС (0,2мл), животным контрольной группы проводили инъекцию физиологического раствора. Через две недели, в стадии сенсибилизации, у морских свинок брали кровь для хемилюминесцентпого исследования. Для того, чтобы подтвердить, что свинки действительно сенсибилизированы, у части опытных свинок воспроизводили анафилактический шок введением разрешающей дозы HJIC (0,5мл). При этом морские свинки опытной группы погибали при признаках удушья (при вскрытии - диффузная эмфизема легких), а у контрольных животных изменений не развивалось. Инкубация крови сенсибилизированных морских свинок с аллергеном (НЛС 1:3000) приводила к развитию подавления индуцированной ХЛ ПЯЛ в опытной группе (0,43 ±0,11) и отсутствию изменений ХЛ у интактных свинок (0,97 ±0,24). Таким образом, и в этой экспериментальной модели мы получили подтверждение того, что инкубация с аллергеном приводит к специфическому угнетению секреции АФК лейкоцитами, что отражается в изменении ХЛ.

Для того, чтобы определить, будет ли воспроизводиться обнаруженная нами фазовая зависимость ХЛ от стадии аллергического процесса и концентрации аллергена при аллергических заболеваниях, мы провели исследование люминол-зависимой ХЛ ПЯЛ крови больных поллинозом, атопической бронхиальной астмой и непереносимостью пенициллина.

Пробы крови больных поллинозом в стадии обострения (14 человек) и ремиссии (27 человек) инкубировали с пыльцевыми аллергенами, стандартизованными по единицам белкового азота (PNU). Для обследования выбирались больные, дававшие выраженную реакцию (+++, ++++) при постановке кожных проб. В каждом случае контрольной

пробой служила проба, инкубированная вместо аллергена с разводящей жидкостью. Относительная индуцированная интенсивность ХЛ (отношение опытных проб к контрольным) у больных поллинозом представлена на рис.3. Как видно из рисунка, в стадии обострения у больных поллинозом развивалось угнетение ХЛ, тогда как у больных поллинозом в стадии ремиссии дозы аллергена в диапазрне от 1 РЬШ/мл до 10 РЫи/мл приводили к активации ХЛ.

Рис. 3. Зависимость индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов крови больных поллинозом от концентрации предварительно инкубированного аллергена.

3 т

■О

Б 2,5 -о

X

о -!-1-1-1-1-1-1-1-1-!

О 0,01 0,05 1 5 10 50 100 500 1000

Концентрация аллергена, РЫУ/мл

----ХЛ крови больных поллинозом в стадии обострения, инкубированной со

специфическим аллергеном

-ХЛ крови больных поллинозом в стадии обострения, инкубированной с

неспецифическим аллергеном

---ХЛ крови больных поллинозом в стадии ремиссии, инкубированной со

специфическим аллергеном

......ХЛ крови больных поллинозом в стадии ремиссии, инкубированной с

неспецифическим аллергеном

Таким образом, реактивность клеток крови, секретирующих АФК менялась в зависимости от стадии заболевания и концентрации специфических аллергенов. Те дозы аллергена, которые в стадию обострения вызывали угнетение образования АФК, в стадию ремиссии вызывали усиление образования АФК. Это изменение было специфичным, поскольку инкубация крови с аллергенами, которые давали отрицательные кожные пробы, не приводили к изменению ХЛ.

Для выявления общих закономерностей в изменениях реактивности клеток, секретирующих АФК, были проведены аналогичные исследования у больных атопической бронхиальной астмой в стадии обострения (10 человек) и ремиссии (16 человек). Пробы крови этих больных инкубировали с аллергенами и затем измеряли ХЛ. Изменение относительной индуцированной ХЛ крови больных атопической бронхиальной астмой в зависимости от концентрации аллергена и стадии заболевания представлено на рис. 4.

Как видно из рисунка, в стадию обострения бронхиальной астмы у больных наблюдалось развитие угнетения ХЛ под действием аллергена (домашняя пыль), тогда как в стадию ремиссии - активация в диапазоне доз аллергена 1-10 РИи/мл. Использование для инкубации аллергенов, к которым отсутствовала реакция со стороны кожных проб, не приводило к изменению ХЛ. Следовательно, и у этих больных наблюдается изменение реактивности клеток, секретирующих АФК, в зависимости от стадии и концентрации аллергена, аналогичные изменениям у больных поллинозом. Специфичность этого изменения подтверждается также и тем, что инкубация крови здоровых доноров (20 человек) с препаратами аллергенов не приводила к изменению ХЛ.

Ч

Рис. 4. Зависимость индуцированной хемилюминесценции

лейкоцитов крови больных атопической бронхиальной астмой от концентрации предварительно инкубированного аллергена.

6 0 0,01 1 10 50 юоо

Концентрация аллергена, РЫи/мл

......ХЛ крови больных бронхиальной астмой в стадии обострения, инкубированной

с аллергеном домашней пыли

-ХЛ крови больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии, инкубированной с

аллергеном домашней пыли

---ХЛ крови больных бронхиальной астмой, инкубированной с неспецифическим

пыльцевым аллергеном

Для того, чтобы определить, как характер аллергена влияет на изменение ХЛ, мы измеряли ХЛ в группе больных с аллергией к пенициллину (16 человек) в стадии обострения, которая проявлялась в виде крапивницы и отека Квинке. Пробы крови предварительно инкубировали с пенициллином в различных концентрациях (от 0,035 до 350 ед/мл) или со средой Хенкса (контрольные пробы). Результат определения зависимости уровня относительной индуцированной ХЛ от концентрации пенициллина в образцах крови больных аллергией к пенициллину и здоровых доноров представлен на рис. 5.

/

Рис. 5. Зависимость индуцированной хемилюминесценции лейкоцитов крови больных с непереносимостью пенициллина и здоровых доноров от концентрации предварительно инкубированного пенициллина

Концентрация пенициллина, ЕД/мл

-ХЛ крови здоровых доноров

---ХЛ крови больных с непереносимостью пенициллина

Из рисунка следует, что у больных наблюдалась ингибиция XJI под воздействием пенициллина в концентрации 3,5-350 ед/мл. У здоровых доноров в концентрации 3,5 ед/мл угнетения не наблюдалось, тогда как инкубация с 350 ед/мл приводила к развитию угнетения (по-видимому, неспецифического).

Таким образом, даже в том случае, когда при аллергическом заболевании мы проводили инкубацию крови с гаптеном, эффект специфического изменения секреции АФК ПЯЛ воспроизводился. Это свидетельствует об универсальности изменений реактивности ПЯЛ при воздействии на них аллергенов разных типов ( как полных аллергенов, так и гаптенов).

Закономерности изменения секреции ЛФК при непереносимости

ненаркотнческих противовоспалительных препаратов 1

Для того, чтобы оценить роль иммунных механизмов в реализации феномена специфического изменения секреции АФК ПЯЛ, мы проводили исследование ХЛ крови при псевдоаллергическом процессе на примере непереносимости ненаркотических анальгетиков - аспирина и анальгина. Клинически непереносимость проявлялась в виде крапивницы, отека Квинке, аспириновой астмы, ринита, анафилактоидного шока. Для сравнения проводилось обследование группы здоровых доноров, не имевших в ближайшем анамнезе контакта с данными лекарственными препаратами. Пробы крови больных, '

чувствительных к анальгину (44 человека) и здоровых доноров (19 )

человек) инкубировали с анальгином в различных концентрациях в течение часа. В контрольных пробах проводилась инкубация крови с равным объемом среды Хенкса. После этого измеряли ХЛ и ее параметры соотносили к параметрам ХЛ контрольных проб. Результат представлен на рис. 6. Мы обнаружили у здоровых лиц достоверное отличие ХЛ от контроля отсутствовало, хотя увеличение дозы препарата (0,75мМ и более) приводило к появлению тенденции к подавлению ХЛ, что свидетельствует о токсическом действии анальгетика, а уменьшение его дозы ( 0,3 мМ и менее ) - приводило к появлению тенденции к увеличению ХЛ. У больных на всех концентрациях анальгина уровень относительной ХЛ был достоверно ниже уровня ХЛ здоровых. При этом, начиная с концентрации анальгина 0,75мМ, выявлялось более выраженное, зависимое от дозы , достоверное угнетение ХЛ.

Рис. 7. Влияние салицилата натрия на индуцированную хемилюминесценцию крови здоровых доноров и больных, чувствительных к аспирину

1,2

Т

о

0,8

0,6

0,4

0,2 --

О

30

0,3 1,5 7,5 15

Концентрация салицилата натрия, мМ -ХЛ крови здоровых доноров, инкубированной с салицилатом натрия

---ХЛ крови больных с повышенной чувствительностью к аспирину,

инкубированной с салицилатом натрия

1

Таким образом, у больных с непереносимостью НПВП можно отметить дозозависимое угнетение секреции АФК ПЯЛ, отражающееся в угнетении ХЛ под действием исследованных лекарственных препаратов, вызывающих псевдоаллергическую реакцию. Следовательно, изменение секреции АФК ПЯЛ может не обязательно быть связано с действием иммунных механизмов на эти клетки.

Рис. 6. Влияние анальгина на индуцированную хемилюминесценцию крови здоровых доноров и больных, чувствительных к анальгину

15

ш

1.4 Т

1,2 -1

0,8 -0,6 -0,4 0,2 +

О 4

I-1-

О 0,003 0,03 0,15 0,3 0,75 1,5 3

Концентрация анальгина, мМ — ХЛ крови здоровых доноров, инкубированной с анальгином

—I 15

---ХП крови больных с повышенной чувствительностью к анальгину,

инкубированной с анальгином

Аналогичное исследование проводилось и в группе больных с непереносимостью аспирина (40 человек) и здоровых доноров (15 человек), пробы крови которых предварительно инкубировались с салицилатом натрия. Результат представлен на рис. 7. Он аналогичен результату с действием анальгина, с той только разницей, что использование салицилата потребовало использования больших доз. У здоровых доноров токсическое угнетение наблюдалось только при концентрации салицилата ЗОмМ. ХЛ больных на всех концентрациях была достоверно ниже ХЛ здоровых доноров.

Диагностическое значение изменения хемнлюмннесценнин крови при аллергических и псевдоаллергических заболеваниях

В аллергологии важнейшей проблемой диагностики является выявление сенсибилизирующего аллергена. Для того, чтобы исключить осложнения при постановке диагностических тестов необходимо, чтобы эти тесты проводились in vitro. В связи с этим, нам представляется возможным предложить к использованию диагностический тест, выявляющий сенсибилизирующий аллерген, на основании полученных нами результатов. И, действительно, используя инкубацию образцов крови с аллергенами в концентрации 10 PNU/мл у больных атопическими заболеваниями ( например, поллиноз, атопическая бронхиальная астма ) в стадии обострения, в случае последующего угнетения ХЛ, индуцированной сульфатом бария, более, чем на 15% в опытных образцах ( кровь, инкубированная с аллергеном ) по сравнению с контрольными образцами ( кровь, инкубированная с разводящей жидкостью ) можно сделать заключение о том, что данный аллерген вызывает повышенную чувствительность. В то же время в случае, если аналогичное обследование, проведенное с аллергеном в концентрации 110 PNU/мл у тех же больных в стадии ремиссии заболевания выявит повышение ХЛ более, чем на 35% можно будет сделать заключение о том, что данный аллерген вызывает гиперчупстпителыгостъ. Аналогичным образом можно использовать хемилюминесцентиый метод и для диагностики лекарственной непереносимости к пенициллину, для чего необходимо проводить предварительную инкубацию образцов крови больных с пенициллином в концентрации 3,5 - 35 ед/ мл. При этом, если последующее измерение ХЛ выявит ее подавление более, чем

на 15%, такой результат можно оценить как положительный ( т.е. пенициллин вызывает у больного повышенную чувствительность). Оценка диагностических критериев рассматриваемого теста проводилась по общепринятой методике статистической обработки клинических данных ( Zar J.H., 1974 ; Galen R.S., Gambino S.R., 1975 ). По нашим данным, точность диагностики для больных атопическими заболеваниями в стадии обострения составила 92,6%, в стадии ремиссии - 91,3%, а у больных с непереносимостью пенициллина - 88,5%. Специфичность теста составляла 89%, 89% и 90% соответственно. Хемилюминесцентный метод также может быть использован для диагностики псевдоаллергических заболеваний. Так, в частности, если проводить инкубацию крови больных с повышенной чувствительностью к ненаркотическим анальгетикам с этими лекарственными препаратами ( на примере анальгина ( 1,5мМ ) и салицилата натрия ( 15мМ )) с последующим измерением стимулированной ХЛ, то можно сделать вывод о повышенной чувствительности к этим препаратам, если интенсивность ХЛ в опытном образце снизится по сравнению с контролем более, чем на 20%. Точность метода для данной категории больных составила 90,9%, а специфичность 94,1%. Таким образом, предварительная инкубация образцов крови с аллергенами и псевдоаллергенами с последующим измерением ХЛ позволяет с высокой точностью и специфичностью выявить аллерген ( псевдоаллерген ), ответственный за развитие гиперчувствительности. Указанная методика является достаточно простой в исполнении, быстрой и безопасной для больного, что и обуславливает ее преимущество перед большинством существующих методов.

Чтобы убедиться в этом, мы определяли изменение активности НАДФН-оксидазы хемшпоминесцентным методом по \Vymann е1 а1 (1987) у кроликов на 30-е сутки воспроизведения феномена Арпоса, а также у морских свинок через 2 недели после сенсибилизации их НЛС. Предварительно пробы инкубировали с аллергеном (НЛС 1:3000). Нам не удалось обнаружить достоверного отличия опытных проб (инкубированных с аллергеном) от контрольных (инкубированных со средой Хенкса) ни у кроликов - 0,94±0,15, ни у морских свинок -0,90±0,12.

Таким образом, подавление ХЛ ПЯЛ, развивающееся под воздействием аллергена при экспериментальных аллергических процессах, в значительной степени связано с угнетением активности миелопероксидазы ПЯЛ.

В связи с этим возник вопрос, чем отличается механизм подавления ХЛ ПЯЛ при псевдоаллергических реакциях на НТТВП от такового при аллергических процессах Для решения этого вопроса тем же методом определяли активность НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной ферментных систем ПЯЛ крови больных с непереносимостью анальгина и аспирина. Предварительно пробы крови инкубировали с этими лекарственными препаратами (опытные пробы) и средой Хенкса (контрольные пробы). Интенсивность ХЛ опытных проб соотносили к интенсивности ХЛ контрольных проб. Результат представлен на рис.8.

Как видно из рисунка, воздействие малых концентраций салицилата натрия и анальгина (0,ЗмМ) приводит к угнетению активности НАДФН-оксидазы. В то же время, отсутствие выраженного угнетения люминолыюй ХЛ можно объяснить, по видимому, одновременной активацией миелопероксидазы в ПЯЛ.

Механизмы изменения секреции АФК при аллергических и

псевдоаллергических процессах Изменение секреции АФК ПЯЛ при аллергическом процессе под воздействием аллергена, а также при псевдоаллергическом процессе ставит вопрос о том, как именно изменяется секреция тех или иных АФК. Поскольку по мнению целого ряда авторов (Даниляк И.Г. и др., 1992; Миловидова Т.В., 1983; Нагоев Б.С., Шубин М.Г. 1981) выработку супероксидного радикала можно оценить с помощью НСТ-теста, мы использовали этот метод для оценки изменения секреции супероксида под действием аллергена при экспериментальном аллергическом процессе. Индуцированная сульфатом бария НСТ-активность ПЯЛ определялась у кроликов на 30 сутки воспроизведения феномена Арпоса (13 животных) и у интакгных кроликов (10 животных). Предварительно пробы крови инкубировались с аллергеном (НЛС, титр от 1:3 до 1:3000) или со средой Хенкса (контрольная проба), после чего определяли отношение НСТ-активности опытных и контрольных проб. Только инкубация с большими концентрациями аллергена (титр НЛС 1:3) приводила к некоторому снижению относительной НСТ-активности -0,74 ±0,18. Инкубация с меньшими концентрациями аллергена не приводила к изменению НСТ-активности в опытной группе животных. Отсутствовало изменение НСТ-активности и в контрольной группе. Поскольку супероксид является продуктом НАДФН-оксидазы, можно предположить, что наблюдаемая нами ингибиция ХЛ ПЯЛ после инкубации крови с аллергеном (НЛС 1:3000) не связана с подавлением активности НАДФН-оксидазы, напротив того, определяется изменением миелопероксидазной реакции.

Рис. 8. Влияние анальгина и салицилата натрия на образование пероксида водорода в крови больных с непереносимостью анальгетиков

0,3 мМ 15,0 мМ салицилат натрия

0,3 мМ 15,0 мМ анальгин

□ ХЛ крови, определенная по УУутапп ■ ХП крови, инкубированной с анальгетиком

Большие (15мМ) концентрации этих двух препаратов оказывают различное влияние: салицилат натрия увеличивает активность НАДФН-оксидазы, а анальгин вызывает еще большее ее угнетение. Угнетение люминолыюй ХЛ под воздействием больших доз салицилата натрия обусловлено очевидно угнетением активности миелопероксидазы, тогда как под воздействием анальгина - угнетением НАДФН-оксидазы и, возможно, миелопероксидазы.

Таким образом, развитие дозозависимого угнетения ХЛ при псевдоаллергических процессах под воздействием вызывающих их веществ может быть связано с угнетением активности как НАДФН-

оксидазы, так и миелопероксидазы, что отличает их действие от действия аллергенов. Эти различия представлены в таблице 1.

Таблица 1

Различия характера и механизма секреции АФК ПЯЛ при аллергии и псевдоаллергии ( непереносимость НПВП)

при аллергии при псевдоаллергии

характер изменения ХЛ фазовая зависимость от концентрации аллергена дозовая зависимость от концентрации псевдоаллергена

общие механизмы угнетения ХЛ за счет угнетения активности миелопероксидазы за счет угнетения активности НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы в зависимости от НПВП и его дозы

Дальнейший анализ механизма изменений секреции АФК потребовал решения вопроса о том, каким образом аллерген или псевдоаллерген оказывает влияние на активность НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы. Что это - прямое действие на клетки или оно опосредуется какими-то факторами плазмы крови?

Для решения этого вопроса на 30-е сутки воспроизведения феномена Артюса у кроликов (10 животных) мы проводили инкубацию проб, содержащих кровь, суспензию ПЯЛ, а также суспензию ПЯЛ и мононуклеаров с аллергеном (НЛС 1:3000). Результат представлен на рис.9.

Рис. 9. Воздействие инкубации антигена (НЛС) в разведении 1:3000 с кровью, лейкомассой или суспензией ПЯЛ на ХЛ лейкоцитов кроликов на 30 сутки воспроизведения феномена Артюса

Ч Ш 1,4 Т

X

О 1,2 --

.0 1 -

ь

о

со 0,8 -

о

ш н X 0,6 --

5

К го 0,4

м

о 0,2 -

0 1 0 -

о

кровь

леикомасса

ПЯЛ

■ ХЛ проб кроликов опытной группы □ ХЛ проб интактных кроликов

Из рисунка видно, что ХЛ подавляется вне зависимости от состава пробы экспериментальных кроликов при отсутствии изменения ХЛ у интактных кроликов, хотя степень угнетения в пробе с цельной кровью несколько выше по сравнению с остальными пробами.

Следовательно, аллерген оказывает прямое угнетающее действие на лейкоциты, образуя иммунный комплекс с антителами, ассоциированным с поверхностью клетки. Очевидно, что такими антителами могут являться реагины, ассоциированные с высокоафинным рецептором на мембране базофилов и эозинофилов (Гущин И.С., 1998, Чучалин А.Г., 1997). Поскольку содержание эозинофилов в суспензии ПЯЛ невелико, они не вносят существенного вклада в изменение ХЛ

сенсибилизированных животных. Таким образом, можно предположить, что ХЛ ПЯЛ угнеталась вследствие действия на нейтрофилы медиаторов, высвобождающихся из базофилов при образовании на их поверхности комплекса аллерген-реагин Нельзя исключить и возможность образования иммунного комплекса аллерген-^ в на поверхности самих нейтрофилов, поскольку на этих клетках присутствуют рецепторы для

Для того, чтобы убедиться в том, что изменение секреции АФК может определяться реагинами, мы провели следующие эксперименты. Клетки интактных кроликов инкубировали с плазмой (в том числе и прогретой при 56°С 4 часа) крови опытных кроликов на 30-е сутки воспроизведения феномена Артюса. После этого удаляли плазму и клетки инкубировали с аллергеном (НЛС 1:3000) или средой Хенкса (контрольная проба). Относительная ХЛ (отношение интенсивности ХЛ проб, инкубированных с НЛС, к контрольным) представлена на рис.10.

Из рисунка следует, что только инкубация ПЯЛ интактного кролика с непрогретой плазмой сенсибилизированного кролика приводила к развитию угнетения ХЛ ПЯЛ под действием аллергена, в то время как инкубация с прогретой плазмой не приводила к достоверному угнетению ХЛ. Следовательно, только образование иммунного комплекса аллергена с термолабильным антителом (по-видимому, реагином) на поверхности базофилов приводит к их дегрануляции, что инициирует последующие изменения секреции АФК ПЯЛ.

Поскольку изменение секреции АФК ПЯЛ может опосредоваться воздействием медиаторов, секретируемых базофилами, возникла необходимость оценить их роль и прежде всего гистамина в реализации этих изменений.

Рис. 10. Индуцированная хемилюминесценция ПЯЛ интактных кроликов при инкубации ПЯЛ с плазмой сенсибилизированных и здоровых кроликов и далее с НЛС в разведении 1:3000

■ Инкубация ПЯЛ с плазмой крови сенсибилизированных кроликов □ Инкубация ПЯЛ с прогретой плазмой крови сенсибилизированных кроликов Ш Инкубация ПЯЛ с плазмой крови интактных кроликов

Для выяснения вопроса о роли гистамина в развитиии вызванного аллергеном изменения секреции АФК ПЯЛ мы провели следующие эксперименты. В первой серии экспериментов изучалось воздействие на кровь больных поллинозом аллергенов в присутствии диаминоксидазы-фермента, метаболизирующего гистамин. Результат измерения

относительной индуцированной XJI крови больных поллинозом в стадии ремиссии, обострения и здоровых доноров представлен на рис. 11.

Рис. 11. Зависимость индуцированной хемилюминесценции крови больных поллинозом и здоровых доноров под действием аллергена

(10 PNU) от различных концентраций 3 диаминоксидазы.

0,25

Концентрация диаминоксидазы, ЕД/мл Ш ХЛ крови больных поллинозом (ремиссия) □ ХЛ крови здоровых доноров ■ ХЛ крови больных поллинозом (обострение)

Мы наблюдали снижение интенсивности ХЛ у больных поллинозом в стадии ремиссии по мере увеличения концентрации диаминоксидазы в пробе, причем при концентрации 0,5 ед/мл отмечали полную отмену ферментом вызванной аллергеном активации ХЛ. У больных поллинозом в стадии обострения наблюдалось увеличение интенсивности ХЛ под действием диаминоксидазы вплоть до полной отмены угнетения, вызванного действием аллергена. Полученный результат свидетельствует о том, что у больных атопическими

заболеваниями (на примере поллиноза) специфическое изменение секреции ПЯЛ под действием аллергена может быть связано с автивацией этих клеток посредством высвобождаемого гистамина.

Следующая серия экспериментов была призвана подтвердить предположение о связи специфического изменения ХЛ под действием аллергенов с воздействием . на ПЯЛ гистамина. Для этого мы инкубировали пробы крови больных поллинозом и здоровых доноров с гистамином в различных концентрациях. После этого определяли относительную индуцированную ХЛ, причем контролем служили пробы, инкубировавшиеся со средой Хенкса. Результат представлен на рис.12.

Из этих данных следует, что изменение ХЛ под действием гистамина у больных поллинозом сходно с изменением ХЛ у этих же больных под действием аллергена (см.рис.З). Так, инкубация крови больных поллинозом в стадии ремиссии с гистамином приводило к увеличению интенсивности ХЛ, и только использование гистамина в концентрации 54 мМ приводило к угнетению ХЛ. У больных в стадии обострения наблюдалось угнетение ХЛ, усиливающееся по мере увеличения дозы гистамина. Достоверное изменение ХЛ в группе здоровых доноров отсутствовало. Это различие во влиянии гистамина на ХЛ больных поллинозом и здоровых доноров может быть связано с разной экспрессией гистаминовых рецепторов ПЯЛ в этих группах или же с большей концентрацией гистамина в плазме больных. Эти результаты в сочетании с результатами, полученными в опытах с диаминоксидазой (рис.11), свидетельствуют о том, что наблюдаемое нами специфическое изменение ХЛ больных поллинозом действительно может быть в определяющей степени связано с воздействием на ПЯЛ гистамина и зависит от способности ПЯЛ реагировать на это воздействие.

Рис. 12. Индуцированная хемилюминесценция крови больных поллинозом и здоровых доноров, предварительно инкубированной с различными концентрациями гистамина по отношению к контрольной

пробе

5,4x10-9 5,4x10-7 5,4x10-5 5,4x10-4 5,4x10-3 5,4x10-2 Концентрация гистамина, М

-ХЛ крови больных поллинозом (ремиссия)

---ХЛ крови больных поллинозом (обострение)

......ХЛ крови здоровых доноров

В литературе имеются сообщения об участии медиаторов, высвобождающихся из гранул тучных клеток и, в частности, гистамина в патогенезе псевдоаллергической реакции, вызываемой ненаркотическими анальгетиками (Ог2е1е\У8ка-Кгуто\¥5ка I. а! а1, 1994; Яап^еск V. Е1 а1, 1984). Поэтому возникла необходимость определить, будет ли гистамин опосредовать вызываемое ненаркотическими

1,8 т

О

анальгетиками подавление ХЛ у больных с непереносимостью данной группы препаратов. Результат измерения относительной индуцированной ХЛ больных с непереносимостью аспирина после предварительной инкубации образцов крови с салицилатом натрия (15мМ) и анальгином (1,5мМ) соответственно в присутствии диаминоксидазы (0,5 ед/мл) представлен на рис.13 и 14.

Рис. 13. Влияние диаминоксидазы (0,5 ЕД/мл) на снижение ХЛ под действием салицилата натрия (15 мМ) у чувствительных к аспирину пациентов

ИХЛ крови, инкубированной с салицилатом, у здоровых доноров

ОХЛ крови, инкубированной с салицилатом, у больных, чувствительных к аспирину

□ ХЛ крови, инкубированной с диаминоксидазой, у больных, чувствительных к аспирину

□ ХЛ крови, инкубированной с диаминоксидазой и салицилатом, у больных, чувствительных к аспирину

Как видно из рисунков, диаминоксидаза в обоих случаях нивелировала вызванное анальгетиком подавление ХЛ. Таким образом, полученные результаты показывают, что у больных с псевдоаллергическими реакциями непереносимости . анальгетиков

гистамин може также опосредовать изменение секреции АФК ПЯЛ, развивающееся под действием данных препаратов.

Рис. 14. Влияние диаминоксидазы (0,5 ЕД/мл) на снижение ХЛ под действием анальгина (1,5 мМ) у чувствительных к анальгину пациентов

■ ХЛ крови, инкубированной с анальгином, у здоровых доноров

ВХЛ крови, инкубированной с анальгином, у больных,

чувствительных к анальгину □ ХЛ крови, инкубированной с диаминоксидазой, у больных,

чувствительных к анальгину НХЛ крови, инкубированной с диаминоксидазой и анальгином, у больных, чувствительных к анальгину

Для того, чтобы подтвердить роль гистамина в реализации подавления секреции АФК ПЯЛ при псевдоаллергии, мы проводили предварительную инкубацию проб крови больных с непереносимостью

аспирина и анальгина с инталом, препаратом, стабилизирующим мембраны. После этого пробы инкубировали с анальгетиком и затем определяли XJI. Результат представлен на рисунках 15 и16.

Рис. 15. Влияние интала (0,098 мМ) на изменение ХЛ крови больных, чувствительных к анальгину, под воздействием анальгина (1,5 мМ)

«5

га

5 g . 1,5 т

г U с?

¡3 о §• 1

о ё £ 0,5 -

о о 5 1

f ä о-

О Ё

s

■ ХП крови, инкубированной с а на гь тоном, здоровых доноров

□ ХЛ крови, инкубированной с анагьгином, богьных, чувствитегьных к анальгину

ЯХЛ крови, инкубированной с инталом и анальгином, богьных, чувствитегьных к анальгину

После инкубации крови больных с непереносимостью анальгина с анальгином в присутствии интала в значительной степени уменьшалось угнетение ХЛ, вызванное анальгином (рис 15). Инкубация крови здоровых доноров с анальгином в данной концентрации не привела к изменешпоХЛ

Схожий результат мы получили при инкубации проб крови больных с непереносимостью аспирина с салицилатом натрия , с салицилатом и инталом (рис 16 ). Следовательно, и в случае развития псевдоаллергических реакций угнетение секреции АФК ПЯЛ, вызванное ненаркотическими анальгетиками, опосредовалось через действие гистамина на ПЯЛ.

Рис. 16. Влияние интала (0,098 м) на изменение ХЛ крови больных, чувствительных к аспирину, под воздействием салицилата натрия (15,0 мМ)

г

■ ХЛ крови, инкубированной с сагицилатом натрия, здоровых доноров

□ ХЛ крови, инкубированной с сагмцплатом натрия, больных, чувствительны аспирину

О ХЛ крови, инкубированной с инталом и салицилатом натрия, больных, чувствигегъных к аспирину

Заключение

Таким образом, полученные нами результаты показали, что по мере развития аллергического процесса происходит изменение способности фагоцитов крови синтезировать активные формы кислорода в ответ на стимуляцию. В стадию ремиссии, а также при воздействии небольших концентраций аллергена, происходит активация окислительного метаболизма стимулированных фагоцитов. Это в свою очередь приводит к увеличению секреции АФК, выражающейся в усилении ХЛ и, следовательно, к усилению цитотоксичной и бактерицидной способности фагоцитов. Длительное воздействие аллергена (в стадию обострения) и, в особенности, его значительных концентраций приводит к угнетению секреции АФК. При этом прежде всего угнетается наиболее токсическая система - миелопероксидаза-галоид.

Наблюдаемое изменение секреции активных форм кислорода возможно реализуется через термолабильный фактор плазмы, в качестве которого, очевидно, выступают реагины, способные образовывать иммунный комплекс с аллергеном на поверхности базофилов и эозинофилов. Освободившийся из базофилов гистамин в свою очередь воздействует на ПЯЛ, что и приводит к изменению активности в этих клетках ферментных систем, ответственных за секрецию активных форм кислорода.

При этом эффект гистамина на фагоциты зависит от его концентрации и способности клеток реагировать на гистамин. Изменение этой способности происходит, по-видимому, вследствие изменения экспрессии гистаминовых рецепторов на поверхности фагоцитирующих клеток при аллергическом процессе. Псевдоаллергическая реакция, которая может также сопровождаться освобождением гистамина, приводит к угнетению способности клеток синтезировать АФК. При этом отсутствует сколько-нибудь заметная фаза активации, а угнетение может быть связано не только со снижением активности миелопероксидазы, но и со снижением активности НАДФН-оксидазы.

Изменения секреции ПЯЛ можно оценить также таким образом, что рассматриваемые, метаболические изменения, развивающиеся под действием длительной и (или) массивной аллергенной активации, являются, по-видимому, приспособительной защитной реакцией, благодаря которой происходит ограничение неспецифической цитотоксичности фагоцитов. Это предположение подтверждается помимо наших данных данными литературы, свидетельствующими о том, что при обострении аллергического процесса или при введении экспериментальным животным разрешающей дозы аллергена в ПЯЛ

угнетается целый ряд функций, таких как хемотаксис (Читаева В.Т., Бондарева Г.П., 1981), фагоцитарная активность и завершенный фагоцитоз (Хабиджанов Б.Х., 1974). По-видимому, это изменение функций ПЯЛ также опосредовано через действие на эти клетки гистамина (Абарбарчук А.И., 1982; Гунин А.Г. и др., 1990). Можно предположить, что имеющая место в стадию обострения аллергического процесса длительная и (или) массивная аллергенная активация ПЯЛ, реализующаяся через гистаминовый механизм, подавляет развитие банального воспаления, сопровождающегося гистолизом, в котором нейтрофил является основной клеткой-эффектором. Это позволяет включить более избирательно действующие механизмы иммунного воспаления. Эта реакция предохраняет организм от развития чрезмерных повреждений в очаге аллергического воспаления, связанных с воздействием активных форм кислорода (рис. 17). Включением этого механизма, помимо других причин, можно по-видимому, объяснить развитие у атопических больных кожных, бронхиальных и других инфекционных процессов (кожные поражения, вызванные золотистым стафилококком, у больных атопическим дерматитом; бактериальный синусит у больных поллинозом; развитие активного инфекционного процесса, нередко с длительно персистирующей инфекцией при бронхиальной астме...).

С другой стороны, поскольку подавление активности системы миелопероксидазы может приводить к избыточному накоплению супероксида, который, увеличивая содержание гидроперекисей в мембранах базофилов и тучных клеток, может увеличивать поступление кальция через кальциевые каналы, что в свою очередь приведет к высвобождению гистамина (Гущин И.С. и др., 1989). Такое увеличение секреции гистамина замыкает порочный крут.

Рис. 17. Роль изменения секреции активных форм кислорода ПЯЛ в патогенезе аллергического процесса.

Активированны): иммунный механизм

Баз офилы, тучные клетки |

I

Высвобождение Слабое

большого высвобождение

количества гистамина

гистамина (неспецифическое4)

I 1 1

Состояние сенсибилизации

Экспрессия гистаминовых рецепторов

I

Кроме того, полученные нами данные позволяют предложить диагностический тест для выявления аллергена, ответственного за сенсибилизацию организма. В основу диагностического теста положена способность аллергена в зависимости от концентрации изменять XJI крови больных аллергическими заболеваниями, что позволяет выявлять аллерген, ответственный за сенсибилизацию. По нашим данным точность диагностики атопических заболеваний составляет не менее 91%, лекарственной аллергии - 89%. При этом диагностика хемилюминесцентным методом безопасна (поскольку проводится in vitro), достаточна проста и занимает мало времени. Диагностика может с одинаковым успехом проводиться на любой стадии аллергического процесса, а также при псевдоаллергических процессах. Все это определяет диагностическую значимость полученных результатов.

Выводы

1. При экспериментальных аллергических процессах и атопических заболеваниях воздействие аллергена на полиморфноядерные лейкоциты приводит к фазовому изменению способности этих клеток секретировать активные формы кислорода, что отражается в изменении хемилюминесценции.

2. Фазовое изменение секрекции активных форм кислорода лейкоцитами под воздействием аллергена зависит как от дозы аллергена, так и от стадии аллергического процесса. В стадии обострения широкий диапозон доз аллергенов вызывает угнетение образования активных форм кислорода и лишь малые (гомеопатические) дозировки стимулируют их образование. В стадии ремиссии происходит сдвиг стимулирующего влияния

аллергенов в сторону более высоких дозировок, которые в стадии обострения вызывали угнетение образования активных форм кислорода. Это свидетельствует об изменении реактивности полиморфноядерных лейкоцитов по ходу развития аллергического процесса.

з. При псевдоаллергическом процессе воздействие на полиморфноядерные лейкоциты псевдоаллергенов (анальгин, салицилат натрия) приводит к развитию дозозависимого угнетения секреции активных форм кислорода, отражающегося в подавлении хемилюминесценции. При этом фазовых изменений не выявлено.

а . В основе изменения секреции АФК при действии аллергенов на полиморфноядерные лейкоциты при аллергическом и псевдоаллергическом процессе лежит изменение активности НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы этих клеток.

5. При аллергическом процессе изменение активности указанных выше ферментных систем реализуется через термолабильный фактор плазмы, которым являются реагины, способные образовывать иммунный комплекс с аллергеном на поверхности базофилов и эозинофилов.

6. Изменение секреции активных форм кислорода под влиянием аллергенов при аллергических и псевдоаллергичсских процессах осуществляется через воздействие на лейкоциты гистамина, высвобождающегося при деграпуляции базофилов.

7. Гистамин, воздействуя на лейкоциты ' крови больных атопическими заболеваниями, вызывает фазовое изменение интенсивности хемилюминесценции, в отличие от здоровых доноров, у которых такие изменения не выявляются.

8. Изменение хемилюминесценции под влиянием аллергенов и псевдоаллергенов может быть использовано как диагностический тест, направленный на выявление аллергена или псевдоаллергена, ответственного за гиперчувствительность.

Практические рекомендации

Работа представляет собой экспериментально-теоретическое исследование, направленное на выявление общих закономерностей и диагностического значения изменения образования активных форм кислорода лейкоцитами крови при аллергических и псевдоаллергических процессах. Исследование, проведенное в работе, позволило более полно судить о механизмах участия полиморфноядерных лейкоцитов в патогенезе аллергических и псевдоаллергических реакций. Полученные данные по изменению функциональной активности лейкоцитов при аллергии можно использовать в области аллергологии и патологической физиологии. Разработанный на основе метода диагностический тест может быть использован в аллергологических клиниках с целью выявления сенсибилизирующего аллергена и лекарственного препарата, вызывающего непереносимость у пациентов. Содержательная часть работы может быть использована в учебном процессе в курсах общей патологии и патологической физиологии аллергических процессов.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Изменение хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови при воздействии охлаждающего фактора // «М.В.Ломоносов и Север» Тез. докл. Всесоюзн. конф,- Архангельск, 1986, стр.459-461 (совм. с Сюсюкиным Ю.П., Шерстневым М.П.) ;

2. Способ выявления сенсибилизации организма при аллергических заболеваниях // Авторское свидетельство №1436643 от 13.12.85, зарегистр. 08.07.88 (совм. с Пыцким В.И., Сюсюкиным Ю.П. и Шерстневым М.П.).;

3. Кортизолрезистентная фракция лимфоцитов (КРФЛ) при введении брюшнотифозных антигенов // « Молекул, и клеточные аспекты клин, иммунологии» Республ. сб. научн. тр. под ред. Л.В.Ковалъчука, А.Н.Чередеева, 2 МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова - М., 1989, стр. 13 (совм. с Балякиным Ю.В., Арутюновой Е.Э, Сюсюкиным Ю.П.) ;

4. Хемилюминесценция лейкоцитов периферической крови кроликов при воспроизведении феномена Арпоса на фоне отравления фосфамидом. // «Молекул, и клеточные аспекты клин, иммунологии» Республ. сб. научн. тр. под ред. Л.В.Ковальчука, А.Н.Чередеева, 2 МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова- М„ 1989, стр.181-183, (совм. с Джаббаровым Р.Д., Сюсюкиным Ю.П., Балякиным Ю.В. и др.);

5. Оценка фагоцитарной активности лейкомассы крови при некоторых аллергических заболеваниях методом хемшпоминесценции // «Теоретические, экспериментальные и прикладные исследования биологических систем» Республ. сб. научн. тр.-М., 1991, стр.156-159, (совм. с Сюсюкиным Ю.П.);

6. Хемилюминесценция лейкоцитов как отражение сенсибилизации морских свинок при воспроизведении анафилактического шока // «Аллергология и иммунопатология в клинике и эксперименте», вып.2, РГМУ -М„ 1992, стр.105-107, (совм. с Пыцким В.И.) ;

7. О механизме ингибиции хемилтоминесценции лёйкоцитов периферической крови кроликов при феномене Арпоса // «Аллергология и иммунопатология в клинике и эксперименте», вып.2, РГМУ - М., 1992, стр. 107-110, (совм. с Пыцким В.И.) ;

8. Изменение люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови кроликов при инкубации со специфическим аллергеном в процессе развития феномена Артюса // «Пат. физиол. и эксперим. терапия», 1992, №5-6, стр.41-43 (совм. с Пыцким В.И.);

9. Оценка изменения секреции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами под воздействием специфического аллергена при феномене Артюса у кроликов // «Бюлл. эксперим. биологии и медицины», 1994, №2, стр.163-165 (совм. с Балякиным Ю.В., Андрющенко А.А.) ;

10. К механизму специфического подавления стимулированной хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов при аллергических процессах // «Бюлл. эксперим. биологии и медицины», 1994, №3, стр.299-302 (совм. с Пыцким В.И.);

11. Phenomenon of specific inhibition of luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes under the influence of allergen // «J.Invest.Allergol.& Clin.Immunol.», 1996, v.6, №4, p.256-260, (with Pytsky V.I.);

12. The mechanism of specific inhibition of stimulated chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes in allergic processes // «J.Invest.Allergol.& Clin.Immunol.», 1996, v.6, №5, p.320-323, (with Pytsky V.I.) ;

13. In vitro diagnosis of pseudoallele reaction to sodium salicylate and metamizole sodium (Analgin) // XYI Intern. Congr. Allergol. & Clin. Immunol., Cancun, Mexico, 1997, p.46 (with Pytsky V.I.);

14. Role of histamine in inhibition of stimulated luminol-dependent chemiluminescence (CL) of blood leukocytes induced by salicylate sodium or metamizole sodium (analgin) in aspirin or/and analgin sensitiw patients // «Eur,J.Chem. & Clin.Biochem.», 1997, v.35, №9, p.94, (with Pytsky V.I.);

15. Влияние ненаркотических анальгетиков на интенсивность люминол-зависимой хемилюминесценции периферической крови больных с непереносимостью этих препаратов // «Совр. пробл. аллергол., клин, иммунол. и иммунофармакол.» - М., 1997, стр.441, (совм. с Чаусовой C.B., Бондаревой Г.П., Пыцким В.И.) ;

16.К механизму специфического подавления хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов при экспериментальных аллергических процессах // «Совр. пробл. аллергол., клин, иммунол. и иммунофармакол.» - М., 1997, стр.665, (совм с Нехаевой E.H., Чаусовой C.B., Арутюновой Е.Э. и др.) ;

17.Использование хемилюминесцентного метода в диагностике реагиновой аллергии //»Человек и катастрофы: проблемы обучения новым технологиям и подготовки населения и специалистов к действиям в чрезвычайных ситуациях» Междунар. симпозиум 1-2 июня 1999 г., Москва, М., 1999, стр. 93 ;

18. К вопросу о воздействии аллергенов на функциональную активность полиморфноядерных лейкоцитов // «Человек и катастрофы: проблемы обучения новым технологиям и подготовки населения и специалистов к действиям в чрезвычайных ситуациях» Междунар. симпозиум 1-2 июня 1999 г., Москва, М., 1999, стр. 90 (совм. с Банщиковой З.Е. и Малаховой О.В.);

19.0пределение лекарственной непереносимости хемилюминесцентным методом // «Человек и катастрофы: проблемы обучения новым технологиям и подготовки населения и специалистов к действиям в чрезвычайных ситуациях» Междунар. симпозиум 1-2 июня 1999 г., Москва, М„ 1999, стр. 91 ;

20. Роль гистамина в нарушении функций фагоцитов при воздействии аллергенов // «Человек и катастрофы: проблемы обучения новым

технологиям и подготовки населения и специалистов к действиям в чрезвычайных ситуациях» Междунар. симпозиум 1-2 июня 1999 г., Москва, М., 1999, стр. 92 (совм. с Банщиковой З.Е. и Малаховой О.В.);

21.Изменение хемилюминесценции крови под воздействием аллергенов и его диагностическое значение // Рос.Гос.мед.Ун-т - М., 1999 - 23 е.: 7 ил,- Библиогр.: 26 назв. Деп. в ВИНИТИ за N 2480- В99 ;

22.Роль гистамина в изменении секреции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами под воздействием аллергенов // Рос.Гос.мед.Ун-т - М., 1999 - 22 е.: 7 ил.- Библиогр.: 24 назв. Деп. в ВИНИТИ за N 2479- В99