Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Тест аллергической альтерации лейкоцитов в диагностике лекарственной гиперчувствительности

На правах рукописи

СТЕПАНОВА ЕВГЕНИЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ТЕСТ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ АЛЬТЕРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель наук РФ В.Б. Гервазиева

доктор медицинских наук Г.Л. Осипова

доктор медицинских наук О.Ю. Филатов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Защита состоится 18 ноября 2004 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, дом 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан 15 октября 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

юог-Ч

d4b 83 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Рост распространенности аллергических заболеваний, связанный с неблагоприятной экологической обстановкой, а также широкое применение ксенобиотиков, которые не существуют в естественной среде, а потому трудно утилизируются ферментными системами организма, служат тем фоном, на котором все чаще в практике врачей любых специальностей встречается лекарственная гиперчувствительность (J11 Ч).

ЛГЧ является одним из описанных видов нежелательных побочных эффектов лекарственных веществ (Pichler WJ. et Tilch J., 2004 г.)

Параллельно росту числа лекарств, используемых для лечения, увеличивается возможность возникновения на них различных побочных реакций. В нашей стране, поданным Латышевой Т.В. (1996 г.), только в амбулаторной практике побочные реакции на лекарства регистрируются у 5 % пациентов. Причем, до 15% из них приходится на истинные аллергические реакции. В США ЛГЧ отмечают 15-30 % пациентов (Patterson R. et al., 1997 г.)

Разнообразие проявлений ЛГЧ определяется совокупностью истинных аллергических и псевдоаллергических реакций на медикаменты. Известно, что формирование истинной лекарственной аллергии возможно с участием всех иммунологических механизмов, описанных в классификации Coombs R.R.A. et Gell P.G.H. (1975 г.)

Лекарственная аллергия — повышенная иммунологическая реакция на медикаменты, развивающаяся на повторное введение препаратов, которая обусловлена наличием антител и иммунных Т-клеток, образовавшихся при первичном контакте с антигеном.

Псевдоаллергические реакции клинически неотличимы от аллергических реакций немедленного типа, но протекают

ьръ&тт^тшшыч т-лимфоци-БИБЛИОТЕКА I

тов. В псевдоаллергических реакциях выделяют только две стадии — патохи-мическую и патофизиологическую. В патохимической стадии высвобождаются те же медиаторы, что и при немедленных истинных аллергических реакциях.

Наиболее полно на сегодняшний день исследована аллергия наантибио-тики-пенициллины из группы р-лактамов (Adkinson N.F., 1977 г., Blanca M., 1999 г., Baldo В.А., 2001 г.) Пенициллиновая аллергия является своеобразным «золотым стандартом» при разработке и характеристике диагностических тестов ЛГЧ.

Для диагностики псевдоаллергических реакций, поданным литературы, отработан лишь метод хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов (XJI ПЯЛ) с нестероидными противовоспалительными препаратами и местным анестетиком новокаином (Чаусова C.B., 1997 г., Филатов О.Ю., 1999 г., Кузнецова Н.М., 2000 г.)

Современные диагностические методы ЛГЧ позволяют, в основном, идентифицировать аллергию реагинового типа, что является их недостатком. Так, например, ИФА, PACT выявляют только «избыток» свободных антител в сыворотке крови, но не определяют антитела, связавшиеся с базофилами и другими лейкоцитами. Применение этих тестов ограничивается еще и тем набором реагентов (пенициллиновый, ампициллиновый и др.), которые производят фирмы. Кроме того, многие методы требуют использования лабораторных животных (тест Шелли) или же являются дорогостоящими (ИФА, PACT), а потому зачастую недоступными практическому здравоохранению.

Широко применяемое для диагностики поллинозов, бытовой иэпидер-мальной аллергии кожное тестирование малопригодно для определения чувствительности к медикаментам, так как использование нативных лекарств, в большинстве случаев являющихся гаптенами, низкоинформативно, а специальные лекарственные аллергены разработаны на сегодняшний день только для (3-лак-тамных антибиотиков. Проведение провокационных тестов (теста торможения естественной эмиграции лейкоцитов, подъязычная и конъюнктивальная пробы,

дозированная провокация) лекарственными препаратами имеет много противопоказаний и опасно развитием системных реакций вплоть до анафилактического шока.

Практическому здравоохранению требуются доступные безопасные для больного, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью тесты диагностики ЛГЧ, которые учитывали бы гетерогенность лежащих в ее основе патогенетических механизмов. По-видимому, наиболее эффективным путем совершенствования диагностики ЛГЧ является поиск лабораторных методов, в основе которых лежит исследование цельной крови, а не отдельных ее компонентов. В этой связи мы использовали существующий тест аллергической альтерации лейкоцитов, который хорошо зарекомендовал себя в диагностике пол-линозов (Гервазиева В.Б., 1968 г.) и попытались оценить его информативность в отношении гиперчувствительности к некоторым лекарственным аллергенам и псевдоаллергенам.

Цель исследования

Адаптировать тест аллергической альтерации лейкоцитов для диагностики лекарственной гиперчувствительности, протекающей как с участием иммунологических механизмов, так и по псевдоаллергическому типу, и оценить его информативность в сравнении с другими методами аллергодиагностики.

Задачи исследования

1. Сформировать на основании аллергологического анамнеза группы больных с лекарственной гиперчувствительностью к Р-лактамным антибиотикам, местным анестетикам и контрольную группу и дать им клинико-иммунолошческую характеристику.

2. Адаптировать тест аллергической альтерации лейкоцитов in vitro и применить его для определения гиперчувствительности к медикаментам.

3. Оценить роль факторов, содержащихся в сыворотке крови и клеточной взвеси больных людей в формировании альтерации лейкоцитов in vitro.

4. Сравнить информативность теста аллергической альтерации лейкоцитов и методов твердофазного ИФА, хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов, кожного тестирования и дозированной провокации для диагностики лекарственной гиперчувствительности к антибиотикам р-лакта-мам и местным анестетикам.

Научная новизна

1. Установлена возможность использования теста аллергической альтерации лейкоцитов для выявления лекарственной аллергии на бензилпенициллин и ампициллин и гиперчувствительности к новокаину и лидокаину.

2. Показано, что ведущим фактором альтерации лейкоцитов in vitro под влиянием бензилпенициллина являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту, тогда как специфические IgG-антитела не участвуют в развитии секреторной дегрануляции лейкоцитов больных лекарственной аллергией на бензилпенициллин.

3. Впервые установлено, что содержание IgG4-airraTen к основной детерминанте пенициллина в сыворотке крови одинаково у больных, перенесших немедленные и отсроченные аллергические реакции на бензилпенициллин и у здоровых людей.

4. Установлено, что альтерация лейкоцитов in vitro под воздействием новокаина осуществляется при участии факторов, ассоциированных как с клетками, так и с сывороткой крови больных, причем сывороточный фактор является термолабильным.

Практическая значимость

1. Для повышения уровня диагностики аллергии на бензилпенициллин методами кожного тестирования и аллергической альтерации лейкоцитов целесообразно использование двух антигенных детерминант пенициллина (пе-нициллоилполилизина и бензилпенициллина) и проведение анализа лекарственной гиперчувствительности в первые три месяца после манифестации заболевания.

2. Наиболее информативными для исследования повышенной чувствительности к местным анестетикам являются лабораторные методы, которые проводятся с использованием цельной крови пациентов (тест аллергической альтерации лейкоцитов, метод хеми люминесценции полиморфноя-дерных лейкоцитов).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования легли в основу Методического пособия для врачей «Тест аллергической альтерации лейкоцитов для диагностики лекарственной аллергии», утвержденного Ученым Советом Министерства Здравоохранения Российской Федерации 16 июля 2002 г.

Оптимизированный метод аллергической альтерации лейкоцитов используется для диагностики лекарственной гиперчувствительности в клинической практике Аллергологического центра при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Республиканской детской клинической больницы г- Чебоксары и диагностического центра «Юнимед лабораториз» г. Москвы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тест аллергической альтерации лейкоцитов позволяет установить лекарственную гиперчувствительность к Р-лактамным антибиотикам и местным анестетикам. По своей информативности он превосходит кожное тестиро-

вание и сравним с дозируемой провокацией, иммуноферментным анализом и методом хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов.

2. Ведущим фактором альтерации полиморфноядерных лейкоцитов больных in vitro под влиянием бензилпенициллина являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту. Альтерация лейкоцитов под влиянием местного анестетика новокаина осуществляется при участии факторов, ассоциированных как с клетками, так и с сывороткой крови больных, и реализуется через воздействие на лейкоциты гистамина, высвобождающегося при дегрануляции базофилов.

3. Повышение эффективности диагностики аллергии на бензилпенициллин в тесте аллергической альтерации лейкоцитов обеспечивается одновременным использованием двух пенициллиновых антигенных детерминант (пенициллоилполилизина и бензилпенициллина) и проведением этого теста в первые три месяца после манифестации заболевания.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на четвертом и пятом Всероссийских форумах с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2000 г., 2001 г.), на научных конференциях молодых ученых ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (2000 г., 2001 г.), на четвертом конгрессе РААКИ (2001 г.)

Основные положения диссертации изложены в 6 печатных работах. Апробация диссертации состоялась 21.05.04 на заседании отдела аллергологии и неинфекционной иммунологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 150 листах машинописного текста, иллюстрированы 10 таблицами и 9 рисунками. Диссертация состоит из введения, четырех глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список использованной литературы включает 156 источников, из них 62 — на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Нами обследовано 582 пациента в возрасте от 10 до 63 лет с немедленными реакциями ЛГЧ на бензилпенициллин, ампициллин, новокаин и лидокаин и 68 человек с нормальной переносимостью этих медикаментов. Опытные и контрольная группы были однородны по полу и возрасту.

По данным анамнеза, аллергией на бензилпенициллин страдали 129 пациентов, на ампициллин — 125, на оба эти антибиотика одновременно — 87 человек. Непереносимостью новокаина страдали 120, алидокаина— 115 больных. О неблагоприятных реакциях на оба испытуемых местных анестетика сообщали 6 пациентов.

Материалами для исследования служили образцы цельной гепаринизиро-ванной крови и сывороток крови больных ЛГЧ и здоровых людей. В работе использовали коммерческие реагенты: бензилпенициллина натриевая соль (Р. 64.288.41), ампициллина натриевая соль (Р. 74.140.6), новокаина 1 % и 0,5 % р-ры (Р. 71.380.35), лидокаина гидрохлорид 2 % р-р («Ферейн», Россия), антиген для кожного тестирования пенициллоилполилизин (ППЛ) PRE-PEN («SCHWARZ PHARMA INC», США), ППЛ («GALKLtd», США), диски для ИФА с сорбированными аллергенами ампициллина и лидокаина («CYPRESS

DIAGNOSTICS», Бельгия), мышиные моноклональные антитела против IgE, IgG, IgG^ человека и иммуноглобулиновые IgE, IgG, IgG4 калибраторы (ООО «Полигност», Россия).

Для оценки ЛГЧ к медикаментам использовали тест аллергической альтерации лейкоцитов (TAAJI) (Медуницын Н.В., Гервазиева В.Б., 1967 г.) в нашей модификации. Нами были отработаны контрольные параметры альтерации лейкоцитов под влиянием лекарственных веществ и разводящих реагентов, введено понятие показателя альтерации (процент измененных гранулоцитов в препарате) для количественной оценки интенсивности реакции, а также дозы медикаментов, которые не приводят к запредельной стимуляции ПЯЛ и последующему их лейколизису. В основе предложенной модификации ТААЛ лежит учет морфологических изменений живой клетки в результате секреторной де-грануляции.

ТААЛ применили для установления гиперчувствительности к причинным, согласно данным анамнеза, медикаментам у всех больных. Исследование с аллергеном основной пенициллиновой детерминанты — ППЛ проводили у 53 больных с ЛГЧ на бензилпенициллин.

Количественное содержание IgE, IgG, ^О^антител к медикаментам определяли в образцах сывороток крови, взятых у больных не более чем через 3 мес. после аллергической реакции на лекарство с помощью ИФА по методике, разработанной в лаборатории аллергодиагностики ГУ НИИ вакцин и сывороток им И.И. Мечникова РАМН.

ХЛ ПЯЛ определяли по методике, разработанной на кафедре общей патологии РГМУ. Измерение ХЛ ПЯЛ проводили на хемилюминометре, имеющем в качестве основного узла ФЭУ-127. Объем измерительной кюветы составлял 5 мл. Интенсивность ХЛ регистрировалась на самописце.

Определение абсолютного количества лейкоцитов и процентного содержания форменных элементов в периферической крови проводили в соответствии с общепринятой методикой (В.Н. Федосеева и др. 1993 г.)

Капельное, скарнфикационное и внутрикожное тестирование проводили больным не позднее чем через 3 мес. после перенесенной реакции ЛГЧ по методике, описанной А.Д. Адо (1976 г.)

Дозированную провокацию осуществляли в соответствии с методикой Schatz М„ 1992 г., модифицированной нами. В условиях реанимационной готовности последовательно подкожно с интервалом 20-30 минут вводили по ОД мл 0,0005 % и 0,5 % стерильных р-ров новокаина, далее 0,5 мл и 1 мл 0,5 % р-ра этого анестетика до появления местных или общих симптомов ЛГЧ к препарату.

Для избежания психогенной реакции пациентов на введение медикамента и для исключения из исследования людей с высокой неспецифической реактивностью кожи, обследуемым проводили предварительное «слепое» тестирование с использованием плацебо (0,9 % р-р хлорида натрия для инъекций).

Наблюдение за состоянием здоровья пациентов вели еще 72 часа после окончания провокационного исследования.

Изучение факторов, влияющих на альтерацию лейкоцитов in vitro, проводили с помощью разработанного нами теста пассивной аллертческой альтерации лейкоцитов на примере клеточной взвеси и сывороток крови 80 больных ЛГЧ на бензилпенициллин и новокаин.

В этом эксперименте использовали трижды отмытую средой Хенкса клеточную взвесь здоровых людей с 1(0) группой крови и отрицательным резус-фактором, а также сыворотку крови IV(A,B) группы крови здоровых доноров.

Изучение роли специфических IgE- HlgG-антител кШТЛ в альтерации ПЯЛ проводили на модели пассивной сенсибилизации клеток крови здоровых доноров. Истощение сывороток крови больных проводили мышиными моно-клональными анти-IgE и анти-^О-антителами.

Определяя роль гистамина в возникновении альтерации ПЯЛ in vitro под влиянием новокаина, при проведении ТААЛ, в образцы крови перед добавлением медикамента вносили диаминооксидазу (0,5 ЕД/мл).

Для исследования вклада в альтерацию лейкоцитов эозинофилов и базофилов, которые являются основными источниками гистамина среди клеток крови, перед добавлением анестетика в пробы крови вносили стабилизатор клеточных мембран интал (0,098 мМ) и выдерживали 1 час при 37 °С.

Информативность всех применявшихся методов аллергодиагностики оценивали по двум критериям: чувствительность метода — процент его положительных результатов в ipynne больных и специфичность метода - - процент его отрицательных результатов в группе контроля.

Обработку цифрового материала результатов исследования проводили в соответствии с общепринятыми методами статистики (Бредфорд Хилл А., 1958 г., Плохинский Н.А., 1970 г.) и с помощью прикладных программ Statis-tica 6.0 (StatSoft, USA) и Excel XP (Microsoft, USA).

Результаты исследований и их обсуждение

Большинство реакций ЛГЧ на антибиотики бензилпенициллин и ампициллин у обследованных нами больных протекали в виде крапивницы и/или отека Квинке (49 %) и полиморфных, чаще всего, макулярных, папулезных и везикулярных высыпаний (41 %). Основная часть (73%) реакций ЛГЧ на местные анестетики проявлялась в виде крапивницы и/или отека Квинке.

Чувствительность ТААЛ была довольно высокой в отношении всех испытанных нами реагентов и в среднем составила 76,5 %. К ампициллину были получены положительные результаты у 79 % пациентов, заявлявших о лекарственной аллергии на этот антибиотик. Выявить аллергию на бензилпенициллин при использовании бензилпенициллина и ППЛ по отдельности удалось у 69 % и 51 % больных, соответственно.

Была установлена высокая чувствительность ТААЛ и в отношении местных анестетиков (86 % для новокаина и 88 % для лидокаина). Специфичность ТААЛ оказалась высокой при тестировании со всеми использованными препаратами. В среднем она составила 94 %.

Методом ИФА IgE-антитела к ГОШ были обнаружены в сыворотке крови у 28 из 53 больных и у 5 из 30 здоровых человек (р < 0,01) в количестве от 1,7 до7,8КЕ/л. Таким образом, чувствительное!ь этого метода определения Ш*Ч к бензилпенициллину была 53 %, а специфичность — 83 %.

К ампициллину IgE-антитела в ИФА определены в сыворотках крови 80 % больных. Специфичность метода была 100 %.

Наличие IgE-антител к лидокаину в сыворотке крови удалось установить у 5 % больных. Такая низкая чувствительность метода, вероятно, объяснима редкой встречаемостью реагинового механизма ЛГЧ к местноанестезирующим препаратам. Вероятность обнаружить IgE-антитела к лидокаину после перенесенной немедленной реакции на этот препарат, по данным литературы, составляет от 0,5% до 10%. По мнению AnibarroB. et Seoane F.J. (1998 г.), Patterson R. et al. (2000 г.), Finder R.L. et Moore P.A. (2002 г.), большинство реакций ЛГЧ к местным анестетикам являются псевдоаллергическими.

IgG и 1§04-антитела к ППЛ присутствовали в сыворотках крови всех обследованных больных аллергией на бензилпенициллин (п = 53) и всех здоровых людей (п - 30). Однако, количество IgG у больных было вдвое выше (183,1 ±4,7 мкг/мл), чем у здоровых (89,3 ± 9,8 мкг/мл, р<0,05). Количество IgG4-aHTHTe;i у больных и здоровых было одинаковым (5,8 ± 6,7 мкг/мл и 5,7 ± 4,9 мкг/мл, р > 0,05).

С помощью метода ХЛ оценивали изменение активности ПЯЛ под влиянием новокаина.

Показатели стимулированной ХЛ ПЯЛ после инкубирования крови с медикаментом у больных были 0,61 -ь 0,13, что оказалось гораздо ниже (р < 0,01) аналогичных показателей в группе сравнения (0,94 ± 0,05). Чувствительность метода составила 93 %, а его специфичность — 96 %.

Кожные пробы по сравнению с ТААЛ и другими использованными нами тестами, оказались низкоинформативными в исследовании ЛГЧ. Так, при проведении тестирования капельным, скарификационным и внутрикожным мето-

дами, была установлена их высокая специфичность по отношению к исследуемым медикаментам. Чувствительность же этих тестов была низкой, за исключением исследования аллергии на бензилпенициллин. При использовании аллергена ППЛ (PRE-PEN) чувствительность скарификационного метода оказалась 38 %. Взаимосвязаны с данными анамнеза также были результаты скарифика-ционных кожных проб с новокаином, оказавшиеся положительными у 22 % больных (х2 = 4,5; р > 0,95).

Дозированная провокация с новокаином оказалась наиболее чувствительным из примененных нами методов диагностики лекарственной непереносимости in vivo. С помощью этого исследования выявить ЛГЧ удалось у 71 % больных, которые не реагировали на кожное тестирование. Специфичность метода составила 100 %.

При одновременной оценке результатов скарификационного, внутрикож-ного методов и дозированной провокации у 59 пациентов, которым проводили последовательное in vivo тестирование с новокаином, было установлено, что такая тактика исследования позволяет идентифицировать ЛГЧ у 81 % больных. По информативности такое последовательное тестирование с анестетиком сопоставимо с ТААЛ и методом ХЛ ПЯЛ.

Факторы крови, влияющие на альтерацию гранулоцитов in vitro в ТААЛ, исследовали с помощью методики непрямого ТААЛ с использованием клеточной взвеси и сывороток крови 60 больных ЛГЧ к бензилпенициллину.

Для выявления роли факторов сыворотки крови больных в альтерации гранулоцитов к отмытой средой Хенкса клеточной взвеси здоровых доноров 1((0)а,Р) группы крови добавляли сыворотку крови больных ЛГЧ и инкубировали 30 минут при 37 °С. Чтобы установить, каково участие факторов, ассоциированных с клетками крови больных в возникновении секреторной дегра-нуляции ПЯЛ in vitro, к отмытой средой Хенкса клеточной взвеси больных добавляли сыворотку крови здоровых доноров IV((A,B)0) группы крови и инкубировали при том же режиме. Далее алгоритм постановки и учета реакции

не отличался от такового для ТААЛ. В качестве контроля использовали пробы, состоящие из сывороток 1У((А,В)0) группы крови и отмытой клеточной взвеси 1((0)а,Р) группы крови здоровых доноров, а также пробы, состоящие из отмытой клеточной взвеси больных и их собственной сыворотки крови.

У всех пациентов, участвовавших в данном исследовании, сенсибилизация

• к медикаменту была установлена на основании анамнеза и положительных ре-

I

зультатов кожного тестирования с ППЛ и бензилпенициллином. При проведе-

♦ нии ТААЛ с кровью этих больных были зарегистрированы высокие значения показателей альтерации (41,18 ± 3,46 %).

Анализ полученных результатов эксперимента выявил, что основная роль в альтерации лейкоцитов под действием бензилпенициллина принадлежит факторам, находящимся в сыворотке крови больных (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние факторов сыворотки и клеток крови на аллергическую

альтерацию лейкоцитов в присутствии бензилпенициллина

№ п/п Состав опытных проб Значение ПА* в процентах (М±т) Достоверность различий

1. Клетки здоровых доноров и сыворотка крови здоровых 8,00 ± 3,22 PI, 2 <0,01

2. Клетки здоровых доноров и сыворотка крови больных 48,16 ± 13,90 P2, з > 0,05

3. Клетки больных и их собственная сыворотка крови 48,00 ± 3,42 РЗ,4<0,01

4. Клетки больных и сыворотка крови здоровых доноров 19,62 ± 6,01

* ПА — показатель альтерации

Так, добавление к клеточной взвеси здоровых людей сыворотки крови больных ЛГЧ приводило к увеличению показателей альтерации лейкоцитов под влиянием антибиотика до уровня таковых в пробах, содержащих клетки крови и сыворотку больных (р2, з > 0,05). Эти значения были существенно выше, чем в контрольных пробах, содержащих клеточную взвесь и сыворотку крови людей, не страдавших пенициллиновой аллергией (р!; 2 < 0,01).

Не было установлено существенного влияния факторов, содержащихся в клеточной взвеси больных ЛГЧ на количество лейкоцитов, претерпевших морфологические изменения под влиянием бензилпенициллина. Так, если к клеткам больных добавляли сыворотку крови здоровых доноров, значения показателя альтерации снижались по сравнению с таковыми в пробах, содержащих клеточную взвесь больных с их собственной сывороткой крови (Рз,4<0,01).

Таблица 2.

Роль специфических антидел в реализации in vitro аллергической альтерации лейкоцитов больных с сенсибилизацией к пенициллоилу (ППЛ)

№ п/п Состав опытных проб с ППЛ Значение ПА в процентах (М±ш) Достоверность различий

1. Клетки здоровых доноров и сыворотка крови больных 38,00 ±1,27 pi, 2 < 0,01 pi, 3 > 0,05

2. Клетки здоровых доноров и сыворотка крови больных, истощенная анти-1лЕ-антителами 17,71 ±3,22

3. Клетки здоровых доноров и сыворотка крови больных, истощенная анти-^О-антителами 36,16 ±3,90

Известно, что иммунологической основой немедленной гиперчувствительности служит взаимодействие между антигеном и клетками-мишенями, на поверхности которых фиксированы антитела (реагины), относящиеся к IgE и, возможно, к IgG4. Для того чтобы установить, антитела каких изотипов участвуют в формировании аллергической альтерации лейкоцитов in vitro, мы проводили истощение сывороток крови больных моноклональными антителами против соответствующих иммуноглобулинов.

Истощение сывороток крови больных с установленной ЛГЧ к ППЛ моноклональными анти-^Е-антителами приводило к достоверному снижению показателей альтерации в непрямом TAAJI (р^ 2 < 0,01) (табл. 2). Истощение в этих сыворотках IgG-антител не изменяло значений теста (plj3 > 0,05).

Таким образом, нами было установлено, что ведущим фактором альтерации гранулоцитов больных под влиянием пенициллинов являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту, и что IgG-антитела не принимают участие в развитии секреторной дегрануляции лейкоцитов больных пени-циллиновой ЛГЧ.

Изучая роль клеточных и гуморальных факторов крови в реализации ЛГЧ к новокаину, мы провели исследование в непрямом ТААЛ с клеточной взвесыо и сыворотками крови 20 пациентов ЛГЧ к этому местному анестетику и 10 здоровых людей (рис. 1).

При исследовании смеси клеточной взвеси здоровых доноров с 1(0) группой крови и сывороткой больных, показатели альтерации оказались практически таким же, как при использовании тех же лейкоцитов с сывороткой здоровых людей: 17,9 ± 6,1 % и 14,3 + 2,6 %, соответственно (р];2 > 0,05).

На клеточной взвеси крови больных не удалось воспроизвести альтерацию лейкоцитов после внесения сыворотки IV(A, В) группы крови здоровых людей. Показатель альтерации в этих пробах был 16,4 ± 4,3 % и не отличался от такового в пробах с клетками и сывороткой здоровых людей (р1;3 > 0,05). При добавлении к клеточной взвеси больных сыворотки их собственной крови, уда-

о4

гх,

I

л

м

I

а

50 40

30 20 10 0

Показатель альтерации с новокаином

1. Щ клеточной взвеси здоровых и сыворотки здоровых,

2. Ц клеточной взвеси здоровых и сыворотки больных,

3. §§ клеточной взвеси больных и сыворотки здоровых,

4. Ц клеточной взвеси больных и их собственной сыворотки,

5. § клеточной взвеси больных и сыворотки других больных,

6. Ц клеточной взвеси больных и прогретой сыворотки больных.

Рисунок 1. Роль ^моральных и клеточных факторов крови

в формировании аллергической альтерации лейкоцитов под влиянием новокаина.

валось зарегистрировать высокую альтерацию ПЯЛ под воздействием новокаина. В таких пробах показатель альтерации составил 42,5 ± 3,0 % (рз,4 < 0,001). Практически такие же значения альтерации лейкоцитов после воздействия новокаина были получены при соединении клеток больных с сывороткой одно-группной крови от других больных: 38,4 ± 2,2 % (р4_ 5 > 0,05, р3> 5 < 0,001). Если же сыворотки больных прогревали 30 минут при 56 °С, прежде чем соединить с клетками крови, это ингибировало дегрануляцию ПЯЛ (27,6 ± 3,2 %, Р4,б<0,05).

Таким образом, при исследовании механизма ЛГЧ к новокаину, приводящего к активации ПЯЛ in vitro, нами было установлено, что факторы, влияющие на альтерацию лейкоцитов, находятся одновременно как в клеточной взвеси, так и в сыворотках крови больных. Это подтвердило предположение, что самыми подходящими для исследования повышенной чувствительности к местным анестетикам являются те методы, которые проводятся с использованием цельной крови пациентов (ТААЛ, ХЛ ПЯЛ и др.), а не отдельных ее компонентов.

Далее исследовали роль гистамина и основных его источников в крови (ба-зофилов) в формировании секреторной дегрануляции ПЯЛ в ТААЛ на примере образцов крови 20 больных и 20 здоровых добровольцев (рис. 2).

Исследуя роль гистамина в реализации альтерации лейкоцитов, в образцы крови перед добавлением медикамента вносили диаминооксидазу (0,5 ЕД/мл). Это приводило к снижению альтерации (27,75 ± 6,44 %) под воздействием новокаина по сравнению с показателями альтерации в таких же пробах без добавления фермента (42,3 ± 5,0 %, р < 0,05).

Для исследования вклада базофилов, как источника гистамина, в альтерацию ПЯЛ, перед добавлением анестетика в пробы крови вносили стабилизатор клеточных мембран интал (0,098 мМ) и выдерживали 1 час при 37 °С. Предварительная обработка клеток крови инталом тоже приводила к снижеиию значений альтерации под влиянием новокаина в пробах крови больных людей (Р < 0,01).

Таким образом, нами было установлено, что альтерация ПЯЛ in vitro под влиянием местного анестетика новокаина осуществляется через воздействие на лейкоциты гистамина, высвобождающегося при дегрануляции базофилов.

При анализе полученных результатов диагностики ЛГЧ различными методами (рис. 3) было установлено, что совпадение результатов исследования сенсибилизации к 111 1Л методами ТААЛ и ИФА было очень высоким — 96 %, а при исследовании аллергии к ампициллину оно наблюдалось у 80 % больных.

,г 40 -

£30

¡2 20 -

й

а о С

10 1

о

Показатель альтерации лейкоцитов с новокаином

1. | крови больных,

2. | 1 крови больных с инталом,

3. Ш крови больных с диаминооксидазой.

Рисунок 2. Влияние диаминооксидазы (0,5 ЕД/мл) и интала (0,098 мМ) на альтерацию лейкоцитов больных под воздействием новокаина.

Между собой результаты определения ЛГЧ к новокаину методами ТААЛ и ХЛ ПЯЛ совпадали у 93 % больных и здоровых доноров (всего 53 человека).

Данные кожных проб и ТААЛ совпадали у 60 % больных. А при учете результатов кожного тестирования и последующей дозированной провокации, такое совпадение наблюдали у 96 % пациентов.

Анализируя результаты, полученные при сравнении различных методов исследования ЛГЧ, следует отметить несомненное преимущество лабораторной диагностики, а также комплексного подхода к определению ЛГЧ, протекающей как с участием иммунологических механизмов, так и псевдоаллергических реакций.

100 н

1. ■ИФАсППЛ

2. §§ ИФА с ампициллином

3. Ц ХЛ ПЯЛ

4. Щ кожные пробы с ППЛ

5. Щ дозированная провокация с новокаином

Рисунок 3. Совпадение результатов ТААЛ и методов сравнения, %.

Так, проведение диагностики аллергии к бензилпенициллину с двумя антигенными детерминантами (ППЛ и бензилпенициллин) повышает информативность ТААЛ и кожного тестирования с 51 % и 38 % до 92 % и 62 %, соответственно. Это в 1,5-2 раза выше, чем при аналогичном исследовании с каким-либо одним из этих реагентов.

При исследовании ЛГЧ к антибиотикам, чувствительность ТААЛ заметно снижалась с увеличением временного интервала между клинической манифестацией лекарственной аллергии и исследованием альтерации лейкоцитов (рис. 4).

р < 0,05

р < 0,05

менее 3-х месяцев

более 12-ти месяцев

Рисунок 4. Зависимость чувствительности ТААЛ у пациентов с ЛГЧ на антибиотики Р-лактамы от давности заболевания.

100,

мО Н

и § *

-а

Ч ев

а ^

X Р со ь о т

Р

50

и 5

менее 3-х 3-12 более 12-ти месяцев месяцев месяцев

Рисунок 5"-

Так, если от момента возникновения аллергической реакции на медикамент до взятия крови на исследование проходило не более 3-х месяцев, вероятность выявить сенсибилизацию к бензилпенициллину или ампициллину составляла 89%. Если исследование проводили через 3-12 месяцев после клинических проявлений ЛГЧ, то чувствительность метода снижалась, и специфи-

ческий аллерген удавалось вьивить в 71 % случаев. Если анализ проводили спустя 1 год и более, сенсибилизацию к медикаменту определяли только у 44 % больных.

Подобная тенденция характерна и для других методов аллергодиагаости-ки, основанных на выявлении иммуноглобулинов (ИФА, PACT, РПГА) и связана со снижением в сыворотке крови реагиновых IgE-антител после прекращения контакта с аллергеном.

Снижения диагностической ценности TAAJT при установлении повышенной чувствительности к новокаину и лидокаину с увеличением интервала между манифестацией ЛГЧ и проведением исследования не было отмечено (рис. 5). Это косвенным образом указывает на то, что хотя клинические проявления ЛГЧ напоминали аллергические реакции 1-го типа по классификации P.G.H. Gell et P.R.A. Coombs (1975 г.), повышенная чувствительность не была связана с продукцией реагинов. По-видимому, факторы, опосредующие секреторную дегрануляцию лейкоцитов в ТААЛ под влиянием местных анестетиков, сохраняются в крови дольше, чем иммуноглобулины.

Таким образом, проведенное исследование позволило оптимизировать диагностику ЛГЧ к антибиотикам ß-лактамам и местноанестезирующим медикаментам, а также предложить практическому здравоохранению безопасный и высокоинформативный метод определения повышенной чувствительности больных к лекарствам — ТААЛ. Этот метод несложен в исполнении, требует небольшого объема исследуемого материала (100 мкл), реактивов и времени (35-40 мин.) Из дорогостоящего оборудования для его проведения необходим лишь флюоресцентный микроскоп. ТААЛ позволяет одновременно исследовать ЛГЧ к нескольким медикаментам или другим аллергенам.

ВЫВОДЫ

1. Адаптированный для диагностики ЛГЧ тест аллергической альтерации лейкоцитов, оказался высокоинформативным методом выявления сенсибилизации к р-лактамным антибиотикам и непереносимости местных анестетиков по чувствительности и специфичности сравнимым с методами дозированной провокации, ИФА, хемилюминесценции полиморфноядер-ных лейкоцитов и превышающим показатели кожного тестирования.

2. Выявлено, что ведущим фактором аллергической альтерации лейкоцитов больных под влиянием бензилпенициллина являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту, тогда как антитела класса IgG не влияют на показатели альтерации лейкоцитов.

3. Показано, что альтерация лейкоцитов in vitro под влиянием новокаина зависит от гистамина и осуществляется при участии совокупности клеточных и термолабильных сывороточных факторов крови больных.

4. Установлено, что одновременное использование для диагностики лекарственной аллергии к бензилпенициллину двух антигенных детерминант (пе-нициллоилполилизина и бензилпенициллина) повышает чувствительность теста аллергической альтерации лейкоцитов с 51 % до 92 %, а чувствительность кожного тестирования — с 38 % до 62 %.

5. Установлено, что чувствительность теста аллергической альтерации лейкоцитов с р-лактамными антибиотиками снижается с увеличением интервала между манифестацией заболевания и проведением исследования, а с местными анестетикам — не изменяется со временем.

6. Показано, что в сыворотке крови больных лекарственной аллергией на бензилпенициллин содержание IgG-антител к пенициллоилполилизину выше, чем у здоровых людей, тогда как содержание специфических IgG4

к основной детерминанте пенициллина у больных и здоровых людей одинаково.

7. Выявлено, что наиболее информативным методом диагностики гиперчувствительности к новокаину in vivo является дозированная провокация, чувствительность которой составляет 71 %. Последовательное использование методов скарификационного, внутрикожного тестирования и дозированной провокации с новокаином повышает частоту выявления лекарственной гиперчувствительности к этому анестетику до 81 %.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Степанова Е.В., ГюнтерЕ.А., Кузнецова Н.М., Гервазиева В.Б.— Гиперчувствительность к местным анестетикам (МА): сравнение некоторых методов аллергодиагностики. — Медицинская иммунология. — Т. 2. — №2, —2000, —С. 197-198.

2. Гюнтер Е.А., Степанова Е.В., Сверановская В.В., Гервазиева В.Б.— Аллергическая альтерация лейкоцитов у больных лекарственной непереносимостью. — Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — №5. —2001, —С. 58-61.

3. Степанова Е.В., Сверановская В.В., Кузнецова Н.М., Гервазиева В.Б, — Исследование механизмов альтерации лейкоцитов у больных с непереносимостью некоторых лекарств (на модели новокаина). — Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — № 6. — 2001. —С. 59-63.

4. Гервазиева В.Б., Степанова Е.В., ЖироваС.Н., Воробьева H.JL, Понтер Е.А. — Сравнение информативности некоторых методов диагностики лекарственной аллергии. — Сборник трудов 4-го Конгресса РААКИ «Со-

временные проблемы аллергологам, иммунологии и иммунофармаколо-гии» — Т. 2. — М., — 2001 — С. 521.

5. Гервазиева В.Б., Степанова Е.В., ГюнтерЕ.А., Сверановская В.В., Жарова С.Н., Воробьева H.J1. — Аллергическая альтерация лейкоцитов in vitro при пенициллиновой аллергии. — Медицинская иммунология. — Т. 4. — №3.-2002. — С. 453-458.

6. Гервазиева В.Б., Степанова Е.В., Гюнтер Е.А. — Тест аллергической альтерации лейкоцитов для диагностики лекарственной аллергии. Пособие для врачей. — М., — 2002. — 12 С.

Подписано в печап. 8.10.2004 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ №420

Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул Русаковская, д. 1. т. 264-30-73 \vww.blok01 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций

№19314

РНБ Русский фонд

2005-4 14588

Общий рост распространенности аллергических заболеваний, связанный с неблагоприятной экологической обстановкой, а также широкое применение ксенобиотиков, которые не существуют в естественной среде, а потому трудно утилизируются ферментными системами организма, служат тем фоном, на котором все чаще в практике врачей любых специальностей встречается лекарственная гиперчувствительность.

Лекарственная гиперчувствительность является одним из описанных видов побочных эффектов лекарственных веществ [22, 123].

Параллельно росту числа лекарств, используемых для лечения, увеличивается возможность возникновения на них различных нежелательных реакций. Как сообщают Новиков Д.К. и др. (2001 г.), осложнения фармакотерапии отмечаются у 6-15 % больных, находящихся в отечественных стационарах [34], а в США, по данным Patterson R. et al. (1997 г.) — у 15-30 % пациентов [37].

Развитие острой реакции на лекарство зависит от многих факторов, в первую очередь, от особенностей самого организма (генотипа, определяющего характер иммунного ответа), а также от воздействия окружающей среды, состояния больного (обострение хронического заболевания, профилактическое назначение медикамента, острое заболевание и т.д.). Оно может зависеть и от характеристик самого препарата: его фармакологического действия, фармакокинетики, дозирования, способа введения, лекарственного взаимодействия и т.д. Возможность острой реакции на лекарство не только существует у любого человека, но и определяется и формируется в зависимости от структуры самого антигена в каждом конкретном случае [37, 38, 42, 53, 91, 126].

Множество клинических форм проявления реакций гиперчувствительности на медикаменты определяется сочетанием разнообразных механизмов, участвующих в развитии этой реакции и генетическим контролем.

В какой-то степени частота аллергии объясняется распространенностью применения препарата. Escolano F. etal. в 1998 году обследовали 1218 больных (754 женщин и 464 мужчин), находившихся на лечении в хирургическом стационаре. Из них 159 (13,05 %) человек сообщили о наличии аллергии к лекарствам, причем на антибиотики реакции были в 54,7 %, рентгеноконтрастные вещества в 6,1 %, местные анестетики в 4,7 % случаев [92].

Разнообразие проявлений лекарственной гиперчувствительности определяется совокупностью истинных аллергических и псевдоаллергических реакций на медикаменты. Известно, что формирование истинной лекарственной аллергии возможно с участием всех иммунологических механизмов, описанных в классификации Coombs R.R.A. et Gell P.G.H. (1975 г.).

Лекарственная аллергия — повышенная иммунологическая реакция на медикаменты, развивающаяся на повторное введение препаратов, которая обусловлена наличием антител и иммунных Т-клеток, образовавшихся при первичном контакте с антигеном.

Псевдоаллергические реакции клинически неотличимы от аллергических реакций немедленного типа, но протекают без участия антител и Т-лимфоцитов. В псевдоаллергических реакциях выделяют только две стадии — патохимическую и патофизиологическую. В патохи-мической стадии высвобождаются те же медиаторы, что и при немедленных истинных аллергических реакциях.

До сих пор основным методом диагностики лекарственной аллергии является аллергологический анамнез. Лабораторные методы являются вспомогательными, а их применение ограничено высокой стоимостью и тем, что большинство из них специфичны для реакций, протекающих по какому-либо одному, чаще реагиновому, патогенетическому механизму [1,4, 5,44, 56, 70, 83,118,120].

Современные диагностические методы гиперчувствительности к лекарствам позволяют, в основном, идентифицировать аллергию ре-агинового типа, что является их недостатком. Так, например, ИФА, PACT выявляют только «избыток» свободных антител в сыворотке крови, но не определяют антитела, связавшиеся с базофилами и другими лейкоцитами. Применение этих тестов ограничивается еще и тем набором реагентов (пенициллиновый, ампициллиновый и др.), которые производят фирмы. Кроме того, многие методы требуют использования лабораторных животных (тест Шелли) или же являются дорогостоящими (ИФА, PACT), а потому зачастую недоступными практическому здравоохранению.

Наиболее полно на сегодняшний день исследована аллергия на антибиотики-пенициллины из группы ß-лактамов (Adkinson N.F., 1977 г., Blanca M., 1999 г., Baldo В.А., 2001 г.). Пенициллиновая аллергия является своеобразным «золотым стандартом» при разработке и характеристике диагностических тестов лекарственной аллергии.

Для диагностики псевдоаллергических реакций, по данным литературы, отработан лишь метод хемилюминесценции полиморфноядер-ных лейкоцитов (ХЛ ПЯЛ) с нестероидными противовоспалительными препаратами и местным анестетиком новокаином (Чаусова C.B., 1997 г., Филатов О.Ю., 1999 г., Кузнецова Н.М., 2000 г.).

Широко применяемое для диагностики поллинозов, бытовой и эпидермальной аллергии кожное тестирование малопригодно для определения чувствительности к медикаментам, так как использование нативных лекарств, в большинстве случаев являющихся гаптенами, низкоинформативно, а специальные лекарственные аллергены разработаны на сегодняшний день только для р-лактамных антибиотиков. Проведение провокационных тестов (теста торможения естественной эмиграции лейкоцитов, подъязычная и конъюнктивальная пробы, дозированная провокация) лекарственными препаратами имеет много противопоказаний и опасно развитием системных реакций вплоть до анафилактического шока [20, 45, 124].

Практическому здравоохранению требуются доступные безопасные для больного, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью тесты диагностики лекарственной гиперчувствительности, которые учитывали бы гетерогенность лежащих в ее основе патогенетических механизмов. По-видимому, наиболее эффективным путем совершенствования диагностики такой гиперчувствительности является поиск лабораторных методов, в основе которых лежит исследование цельной крови, а не отдельных ее компонентов. В этой связи мы использовали существующий тест аллергической альтерации лейкоцитов, который хорошо зарекомендовал себя в диагностике поллино-зов [10] и попытались оценить его информативность в отношении гиперчувствительности к некоторым лекарственным аллергенам и псевдоаллергенам.

Цель исследования:

Адаптировать тест аллергической альтерации лейкоцитов для диагностики лекарственной гиперчувствительности, протекающей как с участием иммунологических механизмов, так и по псевдоаллергическому типу, и оценить его информативность в сравнении с другими методами аллергодиагностики.

Задачи исследования:

1. Сформировать на основании аллергологического анамнеза группы больных с лекарственной гиперчувствительностью к (3-лактам-ным антибиотикам, местным анестетикам и контрольную группу и дать им клинико-иммунологическую характеристику.

2. Адаптировать тест аллергической альтерации лейкоцитов in vitro и применить его для определения гиперчувствительности к медикаментам.

3. Оценить роль факторов, содержащихся в сыворотке крови и клеточной взвеси больных людей в формировании альтерации лейкоцитов in vitro.

4. Сравнить информативность теста аллергической альтерации лейкоцитов и методов твердофазного ИФА, хемилюминесценции по-лиморфноядерных лейкоцитов, кожного тестирования и дозированной провокации для диагностики лекарственной гиперчувствительности к антибиотикам {3-лактамам и местным анестетикам.

Научная новизна:

1. Установлена возможность использования теста аллергической альтерации лейкоцитов для выявления лекарственной аллергии на бензилпенициллин и ампициллин и гиперчувствительности к новокаину и лидокаину.

2. Показано, что ведущим фактором альтерации лейкоцитов in vitro под влиянием бензилпенициллина являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту, тогда как специфические IgG-антитела не участвуют в развитии секреторной дегрануляции лейкоцитов больных лекарственной аллергией на бензилпенициллин. и

3. Впервые установлено, что содержание IgG4-aHTiiTen к основной детерминанте пенициллина в сыворотке крови одинаково у больных, перенесших немедленные и отсроченные аллергические реакции на бензилпенициллин и у здоровых людей.

4. Установлено, что альтерация лейкоцитов in vitro под воздействием новокаина осуществляется при участии факторов, ассоциированных как с клетками, так и с сывороткой крови больных, причем сывороточный фактор является термолабильным.

Практическая значимость

1. Для повышения уровня диагностики аллергии на бензилпенициллин методами кожного тестирования и аллергической альтерации лейкоцитов целесообразно использование двух антигенных детерминант пенициллина (пенициллоилполилизина и бензилпени-циллина) и проведение анализа лекарственной гиперчувствительности в первые три месяца после манифестации заболевания.

2. Наиболее информативными для исследования повышенной чувствительности к местным анестетикам являются лабораторные методы, которые проводятся с использованием цельной крови пациентов (тест аллергической альтерации лейкоцитов, метод хеми-люминесценции полиморфноядерных лейкоцитов).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования легли в основу Методического пособия для врачей «Тест аллергической альтерации лейкоцитов для диагностики лекарственной аллергии», утвержденного Ученым Советом Министерства Здравоохранения Российской Федерации 16 июля 2002 г.

Оптимизированный метод аллергической альтерации лейкоцитов используется в клинической практике Аллергологического центра при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Республиканской детской клинической больницы г. Чебоксары и диагностического центра «Юнимед лабораториз» г. Москвы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Тест аллергической альтерации лейкоцитов позволяет установить лекарственную гиперчувствительность к |3-лактамным антибиотикам и местным анестетикам. По своей информативности он превосходит кожное тестирование и сравним с дозируемой провокацией, иммуноферментным анализом и методом хемилюми-несценции полиморфноядерных лейкоцитов.

2. Ведущим фактором альтерации полиморфноядерных лейкоцитов больных in vitro под влиянием бензилпенициллина являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту. Альтерация лейкоцитов под влиянием местного анестетика новокаина осуществляется при участии факторов, ассоциированных как с клетками, так и с сывороткой крови больных, и реализуется через воздействие на лейкоциты гистамина, высвобождающегося при дегрануляции базофилов.

3. Повышение эффективности диагностики аллергии на бензилпе-нициллин в тесте аллергической альтерации лейкоцитов обеспечивается одновременным использованием двух пенициллиновых антигенных детерминант (пенициллоилполилизина и бензилпенициллина) и проведением этого теста в первые три месяца после манифестации заболевания.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Выводы

1. Адаптированный для диагностики лекарственной гиперчувствительности тест аллергической альтерации лейкоцитов оказался высокоинформативным методом выявления сенсибилизации к Р-лактамным антибиотикам и непереносимости местных анестетиков по чувствительности и специфичности сравнимым с методами дозированной провокации, ИФА, хемилюминесценции поли-морфноядерных лейкоцитов и превышающим показатели кожного тестирования.

2. Выявлено, что ведущим фактором аллергической альтерации лейкоцитов больных под влиянием бензилпенициллина являются антитела класса IgE со специфичностью к медикаменту, тогда как антитела класса IgG не влияют на показатели альтерации лейкоцитов.

3. Показано, что альтерация лейкоцитов in vitro под влиянием новокаина зависит от гистамина и осуществляется при участии совокупности клеточных и термолабильных сывороточных факторов крови больных.

4. Установлено, что одновременное использование для диагностики лекарственной аллергии к бензилпенициллину двух антигенных детерминант (пенициллоилполилизина и бензилпенициллина) повышает чувствительность теста аллергической альтерации лейкоцитов с 51 % до 92 %, а чувствительность кожного тестирования — с 38 % до 62 %.

5. Установлено, что чувствительность теста аллергической альтерации лейкоцитов с (3-лактамными антибиотиками снижается с увеличением интервала между манифестацией заболевания и проведением исследования, а с местными анестетикам — не изменяется со временем.

6. Показано, что в сыворотке крови больных лекарственной аллергией на бензилпенициллин содержание IgG-антител к пеницилло-илполилизину выше, чем у здоровых людей, тогда как содержание специфических IgG4 к основной детерминанте пенициллина у больных и здоровых людей одинаково.

7. Выявлено, что наиболее информативным методом диагностики гиперчувствительности к новокаину invivo является дозированная провокация, чувствительность которой составляет 71 %. Последовательное использование методов скарификационного, внутрикожного тестирования и дозированной провокации с новокаином повышает частоту выявления лекарственной гиперчувствительности к этому анестетику до 81 %.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании анализа анамнестических данных, мы выбрали 582 пациентов для исследования информативности ТААЛ и некоторых других методов диагностики лекарственной аллергии.

Это были люди, в историях болезни которых прослеживалась четкая связь между назначением бензилпенициллина, ампициллина, новокаина или лидокаина и появлением симптомов гиперчувствительности.

У 85 % пациентов, страдавших аллергией на антибиотики, удалось установить, что возникновению клинических проявлений предшествовал период сенсибилизации. Остальные 15 % больных были включены в исследование благодаря другим признакам, указывающим на наличие лекарственной аллергии к исследуемым р-лактамам (четкой связи развития клинических проявлений с приемом медикамента, эффекту элиминации).

У всех пациентов клинические симптомы непереносимости развивались не позднее чем через восемь часов после приема лекарства и напоминали симптомы реакций гиперчувствительности немедленного типа.

Среди больных, у которых были аллергические реакции на антибиотики из группы Р-лактамов, 90 % человек обладали атопической конституцией. У пациентов с гиперчувствительностью к местным анестетикам, наличие атопии удалось установить в 66 % случаев. Эти значения гораздо выше, чем встречаемость аллергических заболеваний в популяции [3, 11, 20, 44], поэтому мы полагаем, что лекарственная гиперчувствительность к изучаемым препаратам более характерна для людей, у которых генетически детерминирована склонность к аллергии.

Первое место среди сопутствующих заболеваний принадлежало лабораторно подтвержденному дисбактериозу кишечника, его суб-компенсированной (87 %) и декомпенсированной (13 %) формам. Такими нарушениями микробиоценоза страдали 418 пациентов (71 %). Это патологическое состояние, как известно, сопровождается нарушением обмена гистамина и может провоцировать развитие аллергических и псевдоаллергических реакций [6, 36].

Подавляющее большинство аллергических реакций на антибиотики у обследованных нами больных протекали в виде крапивницы и/или отека Квинке (49 %) и полиморфных, в основном, макулярных, папулезных и везикулярных высыпаний (41 %).

Большинство реакций повышенной чувствительности к анестетикам (73 %) проявлялись в виде крапивницы и/или ангионевроти-ческого отека.

В момент обследования у всех пациентов лекарственная аллергия, а также сопутствующие заболевания находились в стадии ремиссии. В образцах крови 120 больных и 68 здоровых человек, включенных нами в контрольную группу, количество лейкоцитов было от 4000 до 7000, что соответствует физиологической норме здорового человека исследуемой возрастной категории, которая варьирует от 4000 до 9000 лейкоцитов в 1 мм3. Процентное содержание форменных элементов белой крови у всех обследованных нами людей находилось в пределах возрастной нормы [35].

Для оценки гиперчувствительности к медикаментам использовали ТААЛ (Медуницын Н.В., Гервазиева В.Б., 1967 г.) в нашей модификации. Нами были отработаны контрольные параметры альтерации лейкоцитов под влиянием лекарственных веществ и разводящих peaгентов, введено понятие показателя альтерации (ПА) (процент измененных гранулоцитов в препарате) для количественной оценки интенсивности реакции, а также дозы медикаментов, которые не приводят к запредельной стимуляции ПЯЛ и последующему их лейколизису. В основе предложенной модификации ТААЛ лежит учет морфологических изменений живой клетки в результате секреторной дегрануля-ции.

Этим методом мы определяли наличие сенсибилизации к бен-зилпенициллину, пенициллоилполилизину, ампициллину, новокаину и лидокаину у 582 человек, страдавших, по данным анамнеза, немедленными или отсроченными аллергическими реакциями.

Чувствительность ТААЛ была довольно высокой в отношении всех испытанных нами реагентов. К ампициллину были получены положительные результаты у 79 % пациентов, заявлявших о лекарственной аллергии на этот антибиотик. Выявить аллергию на пенициллин при использовании бензилпенициллина и пенициллоилполилизина по отдельности удалось у 69 % и 51 % больных, соответственно. Но при оценивании результатов метода у 53 пациентов, которым проводилось одновременное тестирование с обоими этими реагентами, выяснилось, что у 27 из них реакция на пенициллоилполилизин была положительной, в крови 39 из этих больных была высокая альтерация на бензилпенициллин (в том числе у 17 человек с позитивными реакциями на пенициллоилполилизин). Следовательно, общий уровень диагностики пенициллиновой аллергии при использовании двух реагентов составил 92 %. Была также установлена высокая чувствительность теста аллергической альтерации лейкоцитов и в отношении местных анестетиков (86 % для новокаина и 88 % для лидокаина).

Специфичность метода оказалась высокой при тестировании со всеми использованными препаратами. Она изменялась от 87% при тестировании с пенициллоилполилизином до 100 % при исследовании с лидокаином.

Чувствительность метода была практически одинаковой для различных клинических форм реакций на медикаменты.

При исследовании лекарственной аллергии на антибиотики, чувствительность метода заметно снижалась с увеличением временного интервала между манифестацией заболевания и исследованием альтерации лейкоцитов.

Так, если от момента возникновения клинических проявлений до взятия крови для исследования проходило не более 3-х месяцев, вероятность выявить сенсибилизацию к бензилпенициллину или ампициллину составляла 89 %. Если исследование проводили через 3-12 месяцев после возникновения аллергической реакции, аллерген удавалось выявить в 71 % случаев. Если анализ проводили спустя 1 год и более, сенсибилизацию выявляли только у 44 % больных.

Подобная тенденция характерна и для других методов аллерго-диагностики, основанных на выявлении иммуноглобулинов (ИФА, PACT, РПГА, кожных проб) [15, 33, 37, 47, 77, 84, 91, 98, 139] и имеет объяснение. Дело в том, что, как по нашим данным, так и по мнению многочисленных авторов, занимающихся исследованием лекарственной аллергии к р-лактамным антибиотикам, подавляющее большинство немедленных и отсроченных аллергических реакций на эти медикаменты связаны со специфическими IgE-антителами [5, 37, 73, 78, 91, 155]. Уровень этих иммуноглобулинов в периферической крови со временем снижается, если контакт с аллергеном прекращен. Установлено, что после аллергической реакции на бензилпенициллин время полураспада IgE-антител к этому лекарству составляет 55 дней [37, 76, 156]. Хотя имеются литературные данные, что специфические антитела класса IgE к ß-лактамам удавалось обнаружить в сыворотке крови даже спустя 10 лет после анафилактического шока [76].

Снижения диагностической ценности ТААЛ в отношении установления повышенной чувствительности к местным анестетикам при увеличении интервала между манифестацией заболевания и проведением исследования не было отмечено. Это косвенным образом указывает на то, что хотя клинические проявления заболевания напоминали аллергические реакции 1-го типа по классификации P.G.H. Gell и P.R.A. Coombs (1975 г.) [86], повышенная чувствительность не была связана с продукцией реагинов, а имела другие механизмы. По-видимому, факторы, опосредующие секреторную дегрануляцию ПЯЛ под влиянием местных анестетиков, сохраняются в крови дольше, чем иммуноглобулины.

И действительно, специфические IgE-антитела к лидокаину в сыворотке крови удалось установить только у 5 % (всего одного человека) больных с давностью реакции на препарат не более 3-х месяцев. У остальных пациентов с подтвержденной гиперчувствительностью к этому местноанестезирующему препарату в ТААЛ и/или при кожном тестировании, IgE-антитела выявлены не были.

Иммуноферментным методом IgE-антитела к основной детерминанте пенициллина были обнаружены в сыворотке крови у 28 из 53 обследованных больных аллергией на этот антибиотик и у 5 из 30 здоровых человек (р < 0,01) в количестве от 1,7 до 7,8 КЕ/л. Таким образом, чувствительность метода в отношении установления лекарственной аллергии на пенициллин была 53 %, специфичность оказалась высокой (83 %). Эти показатели сравнимы с аналогичными характеристиками ТААЛ.

Количество специфических IgE-антител к пенициллоилполилизи-ну не отличалось у больных и здоровых людей, в крови которых эти иммуноглобулины были обнаружены (р > 0,05). Средний уровень IgE-антител в сыворотке крови у больных составил 5,1 ± 1,1 КЕ/л, а у здоровых 4,2 ± 0,9 КЕ/л.

К ампициллину IgE-антитела определены в сыворотках крови 8 из 10 пациентов с установленной лекарственной аллергией на этот препарат. Следовательно, чувствительность метода в отношении выявления сенсибилизации к ампициллину составила 80 %.

Средний уровень специфических к ампициллину IgE-антител был 7,4 ±1,2 КЕ/л. В сыворотках крови здоровых людей не удалось обнаружить IgE-антител к ампициллину.

IgG и ^04-антитела к пенициллоилполилизину присутствовали в сыворотках крови всех больных и здоровых людей. Однако, количество специфических антител класса IgG у больных было выше (183,1 ± 4,7 мкг/мл), чем у здоровых (89,3 ± 9,8 мкг/мл, р < 0,05). Содержание ^С4-антител в этих группах не различалось (р > 0,05). У больных пенициллиновой аллергией специфических ^Огантител сыворотке крови было 5,8 ± 6,7 мкг/мл, в то время как у здоровых ^С4-антител к пенициллоилполилизину — 5,7 ± 4,9 мкг/мл.

Таким образом, нами установлено, что иммуноферментное выявление специфичных к аллергену IgE-антител является информативным и сравнимым с ТААЛ методом идентификации аллергии на ß-лактамные антибиотики. Прогностическим признаком в отношении пенициллиновой лекарственной аллергии может служить содержание специфичных к аллергену антител-IgG в сыворотке крови более 180 мкг/мл. Выявление ^С4-антител не является диагностически значимым методом диагностики аллергии на ß-лактамные антибиотики.

Диагностическая значимость определения специфических IgE-антител к лекарственным аллергенам давно и хорошо известна [5, 21, 102, 111, 144]. Чувствительность методов ИФА и PACT, по данным различных авторов, составляет в отношении пенициллоилполилизина от 33 % до 59 %, а для ампициллина 69 % и 66 %, и является наиболее высокой в первые 3 месяца после аллергической реакции [34, 37, 48, 67,142].

Вероятность же обнаружить IgE-антитела к лидокаину, по данным литературы, составляет от 0,5 % до 10 % после перенесенной немедленной реакции на этот препарат [37, 68, 94, 133], что согласовывается с полученными нами результатами.

Роль IgG-антител в патогенезе лекарственной аллергии еще до конца не ясна. Безусловно, наличие специфических IgG к пенициллину в сыворотках крови людей, которые нормально переносят этот препарат, указывает на формирование своего рода иммунной реакции к антибиотику. IgG-антитела к пенициллину определялись многими авторами с использованием различных методик. Levine В.В. etal. (1964 г.) [109] определили, что 100 % людей, получавших пенициллин хоть один раз в жизни, содержат в сыворотке своей крови IgG-антитела к нему. Adkinson N.F. (1977 г.) [64] обнаружил, что после короткого курса терапии бензилпенициллином без каких-либо осложнений, у 60 % людей в сыворотке крови появились IgG-антитела к этому антибиотику.

Torres M.J. et al. (1998 г.) [143] установили, что IgG-антитела к бензилпенициллину встречаются во всех сыворотках больных и здоровых людей, даже если они не получали Р-лактамные антибиотики никогда в жизни. По-видимому, это явление объясняется широким применением пенициллинов в ветеринарии для лечения животных, молоко и мясо которых попадает на рынок продуктов питания, а также широкой распространенностью плесневых грибов-пенициллинов в окружающей человека среде. Отсутствуют антител-IgG к пенициллину только у новорожденных [143].

Полученные нами результаты согласовываются с данными других авторов. Так, Torres M.J., Mayorga С., Pamies R. et al. (1999 г.) [144] выявили, что содержание специфических IgG к бензилпеницил-лину в сыворотках крови больных лекарственной аллергией не зависит от формы клинической манифестации, но оно гораздо выше, чем содержание аналогичных антител у здоровых людей. Они определяли содержание IgG-антител в единицах оптической плотности и установили, что у больных значения результатов теста находились в диапазоне 0,516 ± 0,355 или 0,612 ± 0,402, а у здоровых — 0,166 ± 0,098 или 0,193 ± 0,101 (р< 0,001).

Сведения об исследовании 1§С4-антител к лекарствам не встречаются в доступной нам литературе.

С помощью метода XJI оценивали изменение активности ПЯЛ под влиянием новокаина.

Показатели стимулированной ХЛ ПЯЛ после инкубирования крови с медикаментом у больных были 0,61 ± 0,13, что оказалось гораздо ниже (р < 0,01) аналогичных показателей в группе сравнения (0,94 ±0,05).

Чувствительность метода составила 93 %, а его специфичность — 96 %.

Метод хемилюминесценции ПЯЛ, являющийся и по нашим, и по литературным данным высокоинформативным для идентификации причинного лекарственного аллергена или псевдоаллергена [18, 58], оказался не только сравним по чувствительности с ТААЛ, но и их результаты коррелировали в 93 % случаев.

В норме большинство нейтрофилов пребывает в инертном, покоящемся состоянии. Их функциональные возможности раскрываются только на фоне стимулирующих воздействий. К наиболее ярким проявлениям реактивности зрелого нейтрофила относятся перестройка метаболизма, миграция, адгезия, поглощение, образование пищеварительных вакуолей, секреторная дегрануляция.

Стимуляция радикально меняет метаболический профиль ней-трофила. К наиболее ярким сдвигам относится резкое увеличение расхода глюкозы в реакциях гексозомонофосфатного шунта. Одновременно возрастают потребление кислорода и образование оксидантов с мощным энергетическим потенциалом. Избыток энергии реализуется путем выделения тепла, повышенной химической активности либо эмиссией квантов света (хемилюминесценция).

На основании наших наблюдений можно предположить, что активация ПЯЛ новокаином может приводить как угнетению в них секреции активных форм кислорода, так и к секреторной дегрануляции этих клеток.

При проведении тестирования капельным, скарификационным и внутрикожным методами, была установлена высокая специфичность этих тестов по отношению к исследуемым медикаментам. Чувствительность этих исследований была низкой за исключением исследования аллергии на пенициллин. При использовании специального аллергена большой пенициллиновой детерминанты (PRE-PEN), чувствительность скарификационного метода была 38 %.

У 21 больного лекарственной аллергией на бензилпенициллин при суммировании результатов скарификационного тестирования с бензилпенициллином и пенициллоилполилизином выяснилось, что одновременное использование этих реагентов повышает чувствительность исследования с 38 % до 62 %.

Результаты скарификационного исследования с этими двумя реагентами не совпадали полностью. То есть, в большинстве случаев, пациенты были чувствительны к какому-либо одному из этих растворов, что, вероятно, было связано с сенсибилизацией к различным антигенным детерминантам медикамента.

По мнению многих отечественных и зарубежных исследователей, скарификационное и прик- тестирование с каким-либо одним реагентом из пенициллиновых детерминант малоинформативно и составляет от 14 % до 68 %. Однако, использование для диагностики набора, включающего по крайней мере пенициллоилполилизин и аллерген из смеси «малых» пенициллиновых детерминант, повышает чувствительность метода до 69-77 % [37, 81, 113, 138, 139].

Суммируя эти сведения и результаты нашего исследования, можно утверждать, что для диагностики аллергии к пенициллину недостаточно применения какого-либо одного аллергена. Для повышения информативности кожного тестирования одновременно должно проводиться кожное тестирование с несколькими реагентами, включающими основную (пенициллоилполилизин) и хотя бы одну «малую» детерминанту (бензилпенициллин, ампициллин или смесь «малых» детерминант).

Взаимосвязаны с данными анамнеза также были результаты ска-рификационных кожных проб с новокаином, оказавшиеся положительными у 22 % больных (%2 = 4,5; р > 0,95).

Наиболее высокая чувствительность скарификационного метода в отношении всех испытуемых лекарств, наблюдалась у пациентов, непереносимость медикаментов у которых клинически проявлялась в форме крапивницы и/или ангионевротического отека. Например, у больных, у которых после подслизистых инъекций новокаина возникала крапивница и/или ангионевротический отек, чувствительность скарификационного метода с этим местным анестетиком составила 25,5 %.

Для других нозологических форм чувствительность метода была ниже (0 % у больных с бронхоспазмом и 13,9 % у пациентов с полиморфными высыпаниями).

Дозированная провокация оказалась наиболее чувствительным из примененных нами методов диагностики лекарственной непереносимости in vivo. С помощью этого исследования, у 71 % больных, которые не реагировали на кожное тестирование, удалось выявить повышенную чувствительность к анестетику.

Если же оценивать одновременно результаты скарификационно-го, внутрикожного методов и дозированной провокации у 59 пациентов, которым проводили последовательное in vivo тестирование с новокаином, видно, что такая тактика исследования позволяет идентифицировать гиперчувствительность у 81 % больных.

Поскольку многие авторы считают, что подавляющее большинство немедленных и отсроченных реакции на местные анестетики не являются иммунными, а протекают по псевдоаллергическому типу, и потому не проводят с этими медикаментами кожных проб, сведения о применении кожного тестирования гиперчувствительности к мест-ноанестезирующим препаратам немногочисленны. Тем не менее известно, что чувствительность скарификационного и прик- методов составляет около 10 % [58, 80, 82, 87,116,117].

В большинстве известных нам исследований in vivo, авторы применяли различные модификации дозируемой провокации медикаментом. Shatz М. (1992 г.) [134] методом дозированной провокации удалось идентифицировать причинный анестетик в 68 % случаев.

Мы предложили диагностический алгоритм, включающий последовательное кожное и дозированное провокационное тестирование. На наш взгляд, такой подход не только повышает информативность исследования, но и является менее опасным, так как начинается с минимального и поверхностного контакта с медикаментом.

Анализируя результаты, полученные при сравнении ТААЛ и различных лабораторных и клинических методов исследования, следует отметить несомненное преимущество комплексного подхода к диагностике лекарственной гиперчувствительности, протекающей как с участием иммунологических механизмов, так и по псевдоаллергическому типу.

Так, проведение диагностики аллергии к бензилпенициллину с двумя антигенными детерминантами (пенициллоил и бензилпени-циллин), повышает информативность ТААЛ и кожного тестирования до 92 % и 62 %, соответственно. Это в 1,5-2 раза выше, чем при аналогичном исследовании с каким-либо одним из этих лекарственных аллергенов.

Следует отметить, что чувствительность методов лабораторной диагностики была выше, чем кожного тестирования и с {3-лактамными антибиотиками, и с местными анестетиками. Например, только 8 пациентов из 27 с установленной сенсибилизацией в ИФА или ТААЛ, позитивно реагировали на кожное тестирование с пенициллоилполи-лизином. Из 39 больных с высокими значениями альтерации ПЯЛ положительными результатами кожного тестирования обладали только 9.

Нам показалась интересной способность ПЯЛ больных отвечать повышением альтерацией на воздействие причинных аллергенов и псевдоаллергенов. Было решено изучить роль некоторых факторов в стимуляции такой секреторной активности.

Как известно, мобилизация гранул не всегда связана с отмиранием ПЯЛ. Это, прежде всего, функция живой клетки, которая проявляется при адекватном раздражении. Такие нейтрофилы сохраняют жизнеспособность, не теряют ферментов цитоплазмы, но количество гранул снижается или они совсем исчезают. Дегрануляция может быть истинной, когда гранулы целиком выталкиваются из клетки (экзоци-тоз), но чаще выделяются только растворимые компоненты и происходит вторичное запустевание гранул — секреторная дегрануляция [28, 39].

Это явление можно наблюдать при стимуляции ПЯЛ растворимыми агентами, которыми являются большинство лекарственных препаратов. Дегрануляция связана общими механизмами с поглощением, хемокинезом и хемотаксисом. Все они зависят от гликолиза, Са2+, свободных сульфгидрильных групп, не нуждаются в окислительно-восстановительных реакциях.

Известно, что целый ряд факторов плазмы может вызывать де-грануляцию нейтрофилов. Из таких стимуляторов изучены компоненты комплемента, иммуноглобулины, калликреин, лимфокины [28, 29, 39, 59, 72,].

Что касается иммуноглобулинов, не все активируют ПЯЛ. Это связано с особенностями межмолекулярных взаимоотношений, которые складываются на уровне плазматической мембраны. При помощи рецепторов к Бс-фрагменту нейтрофил дифференцирует разные классы иммуноглобулинов, реагируя лишь на 1§0 и ^А. Наиболее активны которые наряду с СЗЬ и С5а принадлежат к числу самых сильных и хорошо изученных стимуляторов ПЯЛ [28, 39, 62].

Известно также, что у больных атопической бронхиальной астмой, ПЯЛ периферической крови и бронхоальвеолярного лаважа эк-прессируют РсеШ рецептор, стимуляция которого приводит к высвобождению ИЛ-8, являющего нейтрофильным хемотаксическим фактором [99,145].

ПЯЛ принадлежит к наиболее реактивным клеткам крови. Его реакции отражают не только прямое взаимодействие со стимулирующим агентом. Нередко они обусловлены предварительной активацией других гуморальных и клеточных факторов.

По наблюдениям А.Н. Маянского и Д.Н. Маянского (1989 г.), функциональная перестройка ПЯЛ служит более чувствительным показателем скрытой и клинически выраженной сенсибилизации, чем эозинофилия [28]. На фоне положительных провокационных проб в крови больных поллинозами уже через 10 секунд обнаруживаются факторы, хемотаксичные для нейтрофилов. Их появление коррелирует с активацией тучных клеток и согласуется с данными о накоплении значительного числа ПЯЛ в очагах немедленных аллергических реакций.

Факторы, влияющие на аллергическую альтерацию лейкоцитов in vitro, исследовались нами при использовании в опыте клеточной взвеси и сывороток крови 60 больных лекарственной аллергией на бензилпенициллин. У всех пациентов сенсибилизация к этому антибиотику была установлена на основании данных анамнеза, положительных результатов кожного тестирования, ИФА. В крови всех этих людей при проведении прямого теста аллергической альтерации лейкоцитов были зарегистрированы высокие ПА (41,18 ± 3,46 %).

Анализ полученных результатов исследования выявил, что основная роль в альтерации лейкоцитов под действием бензилпенициллина принадлежит факторам, находящимся в сыворотке крови больных.

Добавление к клеточной взвеси здоровых людей сыворотки крови больных лекарственной аллергией приводило к увеличению ПА лейкоцитов под влиянием бензилпенициллина до уровня ПА в пробах, содержащих клетки крови и сыворотку больных лекарственной аллергией (р > 0,05). Эти значения были существенно выше, чем в контрольных пробах, содержащих клеточную взвесь и сыворотку крови людей, не страдавших пенициллиновой аллергией (р < 0,01).

Не было установлено существенного влияния факторов, содержащихся в клеточной взвеси больных лекарственной аллергией на количество лейкоцитов, претерпевших морфологические изменения под влиянием бензилпенициллина. Так, если к клеткам больных добавляли сыворотку крови здоровых доноров, значения ПА снижались по сравнению с таковыми в пробах, содержащих клеточную взвесь больных с их собственной сывороткой крови (р < 0,01).

Известно, что иммунологической основой феномена гиперчувствительности немедленного типа служит взаимодействие между антигеном и клетками-мишенями, на поверхности которых фиксированы антитела, относящиеся к 1§Е и определенным подклассам Некоторые из клеток-мишеней (прежде всего тучные клетки и базофилы) одновременно выполняют эффекторные функции. При иммуностиму-ляции они секретируют биологически активные вещества (медиаторы гиперчувствительности немедленного типа), которые вызывают типичные острые функциональные изменения — вазодилятацию, повышение проницаемости сосудов, спазм гладкой мускулатуры [13, 28, 38,62].

В нашем эксперименте истощение сывороток крови больных с установленной гиперчувствительностью к основной детерминанте пенициллина анти-^Е-антителами приводило к достоверному снижению ПА в тесте пассивной альтерации лейкоцитов. Истощение в этих же сыворотках ^в-антител не изменяло значений этого показателя.

Таким образом, было установлено, что ведущим фактором аллергической альтерации лейкоцитов больных под влиянием пеницилли-нов являются антитела класса ^Е со специфичностью к медикаменту и что специфические ^в-антитела не принимают участие в развитии секреторной дегрануляции лейкоцитов больных лекарственной аллергией на бензилпенициллин.

Изучая участие клеточных и гуморальных факторов крови в реализации повышенной чувствительности к новокаину, мы провели исследование методом пассивной аллергической альтерации лейкоцитов клеточной взвеси и сывороток крови 20 пациентов, страдавших повышенной чувствительностью к новокаину и 10 здоровых людей.

При постановке пассивного теста аллергической альтерации лейкоцитов с новокаином, клеточной взвесью здоровых доноров 1(0) группы крови и сывороткой больных, ПА оказался практически таким же, как при использовании тех же лейкоцитов с сывороткой здоровых людей: 17,9 ± 6,1 % и 14,3 ± 2,6 %, соответственно (р > 0,05).

На клеточной взвеси от больных не удалось воспроизвести альтерацию лейкоцитов под влиянием новокаина после внесения сыворотки IV(A, В) группы крови здоровых людей. ПА в этих пробах был 16,4 ± 4,3 % и не отличался от ПА в пробах с клетками и сывороткой здоровых людей (р > 0,05).

Однако, при добавлении к клеточной взвеси больных сыворотки их собственной крови, удавалось зарегистрировать высокую альтерацию лейкоцитов под воздействием новокаина. В таких пробах ПА составил 42,5 ±3,0% (р< 0,001). Практически такие же значения ПА были получены при соединении клеточной взвеси больных с сывороткой одногруппной крови от других больных (38,4 ± 2,2 %).

Если же сыворотки людей, страдавших гиперчувствительностью к анестетику, прогревали 30 минут при 56 °С прежде чем соединить с клетками крови, это ингибировало секреторную дегрануляцию ПЯЛ.

Таким образом, при исследовании механизмов повышенной чувствительности к новокаину, которые приводят к активации ПЯЛ in vitro, нами было установлено, что факторы, приводящие к альтерации лейкоцитов, находятся как в клеточной взвеси, так и в сыворотках крови больных. В этой связи, вероятно, самыми подходящими для исследования повышенной чувствительности к местным анестетикам являются те методы, которые проводятся с использованием цельной крови пациентов (ТААЛ, ХЛ ПЯЛ, реакция выброса ионов калия и др.), а не отдельных ее компонентов.

Сывороточные факторы, обуславливающие секреторную дегра-нуляцию нейтрофилов больных, являются термолабильными. Возможно, к этим факторам относятся компоненты комплемента, которые, как известно, теряют свою активность при получасовом прогревании при 56 °С [10, 55].

Хорошо известно, что активированный комплемент вызывает различные реакции нейтрофила — хемокинез и хемотаксис, повышение адгезивности и поглощения, секреторную дегрануляцию, усиление кислородзависимого метаболизма. Основное значение имеют производные СЗ- и С5-факторов комплемента. Кроме того, на поверхности нейтрофила обнаружены рецепторы к СЦ-, С4Ь- и Н-факторам. Обратная связь проявляется на уровне активации или, напротив, инактивации отдельных факторов комплемента производными стимулированного ПЯЛ [28,39, 62].

Функциональные контакты ПЯЛ и комплемента принадлежат к числу наиболее ярких механизмов в системе гуморально-клеточной кооперации. Производные, возникающие в цепи реакций классического, альтернативного пути или в результате прямого протеолиза отдельных факторов комплемента, фиксируют на нейтрофиле действие многочисленных экзогенных и эндогенных стимулов, которые вне такого опосредования были бы инертны. Главными эффекторами служат продукты расщепления СЗ и С5 — вместе они способны возбудить все или большинство реакций ПЯЛ. Производные СЗ (СЗЬ, ¡СЗЬ) наиболее активны в связанной форме, С5 (С5а) — стимулируют ней-трофил в жидкой фазе[28,39,62].

Таким образом, нам удалось установить, что подавляющее большинство реакций гиперчувствительности к местным анестетикам, которые клинически протекают по немедленному типу, не связаны с продукцией иммуноглобулинов и, вероятно, обусловлены особенностями системы комплемента и факторов ее регуляции. Такая специфическая альтерация лейкоцитов осуществляется при участии факторов, ассоциированных как с клетками, так и с сывороткой крови больных, причем сывороточный фактор является термолабильным.

Чтобы установить, являются ли такие реакции псевдоаллергическими, то есть гистаминозависимыми, или же в их основе лежит фер-ментопатия, мы исследовали роль гистамина и основных его источников in vitro (базофилов и тучных клеток) в формировании секреторной дегрануляции ПЯЛ.

Для исследования роли гистамина в возникновении у больных новокаиновой непереносимостью in vitro альтерации лейкоцитов под влиянием этого анестетика, исследовали морфологию лейкоцитов 20 больных и 20 здоровых добровольцев.

Исследуя роль гистамина в реализации альтерации лейкоцитов, в образцы крови перед добавлением медикамента вносили диамино-оксидазу (0,5 ЕД/мл). Это приводило к снижению ПА (27,75 ± 6,44 %) под воздействием анестетика по сравнению с ПА в таких же пробах без добавления фермента (42,3 ± 5,0 %, р < 0,05).

Для исследования вклада в альтерацию лейкоцитов базофилов, которые являются основными источниками гистамина среди клеток крови, перед добавлением анестетика в пробы крови вносили стабилизатор клеточных мембран интал (0,098 мМ) и выдерживали 1 час при 37 °С.

Предварительная обработка клеток крови инталом тоже приводила к снижению значений ПА под влиянием новокаина в пробах крови больных людей (р < 0,01).

Таким образом, нами было установлено, что альтерация поли-морфноядерных лейкоцитов in vitro под влиянием местного анестетика новокаина осуществляется через воздействие на лейкоциты гиста-мина, высвобождающегося при дегрануляции базофилов.

Механизмы и характер клеточной кооперации, приводящие к активации ПЯЛ под влиянием новокаина у людей, страдающих повышенной чувствительностью к этому анестетику, до конца не ясен.

В основе хемокинетической реакции нейтрофилов, которая наблюдается при инкубации антигенов с кровью больных, лежит, как считается, опосредованная стимуляция [59].

Известно, что нейтрофилы, подобно многим клеткам (эозинофи-лам, лимфоцитам, моноцитам, тромбоцитам, эндотелиоцитам и др.), содержит факторы, побуждающие тучные клетки к выделению вазо-активных медиаторов [28]. В то же время, в нейтрофилах человека обнаружена гистаминаза (диаминооксидаза) — фермент, разрушающий один из главных медиаторов немедленной аллергии и псевдоаллергии— гистамин [22, 52, 108]. Не исключено, что быстрая аккумуляция этих клеток в очагах гиперчувствительности немедленного типа и активация в сосудистом русле при системной анафилаксии направлены на снятие интоксикации и восстановление нарушенного гомео-стаза. В этом случае, подобно эозинофилам, нейтрофил участвует не в развитии, а в замыкании каскадного патологического процесса.

Возможно, именно это проявление свойств ПЯЛ мы и регистрируем в ТААЛ.

Понятно, что реакции, стимулированные местными анестетиками можно отнести к псевдоаллергическим, так как они, во-первых, клинически напоминают немедленные или отсроченные аллергические реакции, во-вторых, как нам удалось установить, альтерация лейкоцитов in vitro под влиянием новокаина у чувствительных больных осуществляется при участии гистамина, высвобождающегося при дегра-нуляции базофилов. Гистамин является ключевым фактором в стимуляции альтерации ПЯЛ, так как разрушение его диаминооксидазой приводит к блокированию секреторной дегрануляции лейкоцитов (альтерации), а в-третьих, гиперчувствительность не зависит от иммуноглобулинов, так как не передается пассивно сывороткой больных лейкоцитам здоровых доноров.

Таким образом, проведенное исследование позволило оптимизировать диагностику лекарственной гиперчувствительности к антибиотикам Р-лактамам и местноанестезирующим медикаментам, а также предложить практическому здравоохранению безопасный и высокоинформативный метод определения повышенной чувствительности больных к лекарствам — ТААЛ. Этот тест по чувствительности и специфичности не уступает методам ИФА, ХЛ ПЯЛ и дозированной провокации и превосходит кожное тестирование. Предлагаемый нами метод несложен в исполнении, требует небольшого объема исследуемого материала (100 мкл), реактивов и времени (35-40 мин.). Из дорогостоящего оборудования для его проведения необходим лишь флюоресцентный микроскоп. Кроме того, ТААЛ позволяет выявлять лекарственную гиперчувствительность, протекающую как с участием иммунологических механизмов, так и по псевдоаллергическому типу.