Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Обмен глутатиона в патогенезе развития рентгеноконтрастных нефропатий

На права* рукописи

004ЬОООО Г

ЖЕРЕГЕЛЯ Сергей Николаевич

ОБМЕН ГЛУТАТИОНА В ПАТОГЕНЕЗЕ РАЗВИТИЯ РЕНТГЕНОКОНТРАСТНЫХ НЕФРОПАТИЙ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 ИЮЛ ?0Ю

Санкт-Петербург 2010

004608837

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова» МО РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Карпищенко Анатолий Иванович доктор медицинских наук Глушков Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Войцицкий Анатолий Николаевич, доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Министерства здравоохранения Российской Федерации"

Защита диссертации состоится сентября 2010 года в часов на

заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.03 в ФГОУ ВПО «Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Автореферат разослан

Ы^О^ 2010 года

Ученый секретарь

доктор медицинских наук профессор

А.В. Дергунов

Актуальность. Рентгеноконтрастная нефропатия (РКН) стала важной клинической проблемой, растущей параллельно с широким распространением диагностических и лечебных процедур с использованием контрастных средств. По данным Американской ассоциации сердца, только в 2003 г. было проведено примерно 1 млн. 414 тыс. процедур коронарной ангиографии и 664 тыс. процедур коронарной ангиопластики (American Heart Association. Heart Disease and Stroke Statistics, 2006). Необходимость проведения этих процедур у больных сахарным диабетом (СД) обусловлена высоким риском развития ишемической болезни сердца, эталонным методом своевременной диагностики которой является коронарная ангиография. Рентгеноконтрастная нефропатия определяется при фиксировании подъёма уровня креатинина сыворотки на 44 мкмоль/л или на 25% от базового уровня в течение 48 часов после введения РКС при отсутствии альтернативных причин (Barrett B.J., Parfrey P.S., 2006). Показатель креатинина сыворотки сам по себе лишь относительно может отражать почечную функцию, особенно при прогрессировании почечной патологии.

РКН стала третьей по частоте причиной острой почечной недостаточности (ОПН) у госпитализированных пациентов (Nash К. et al., 2002). Она ассоциируется с длительной госпитализацией, необходимостью проведения диализа и высокой смертностью в период пребывания в стационаре и после выписки (Dangas G. et al., 2005). РКН обычно имеет преходящий характер: уровень креатинина повышается в течение трёх дней и возвращается к исходному через 10 дней (Marenzi G. et al., 2004). Распространённость РКН в общей популяции не превышает 2%. В группах высокого риска (пациенты пожилого возраста, с гипертензией, СД, СН и др.) распространённость РКН достигает 20-30% (Goldenberg I., Matetzky S., 2005). Существуют факторы риска, связанные с пациентом (группы высокого риска), а также не связанные с пациентом (применение высокоосмолярных, ионизированных контрастных препаратов, их вязкость и объём) (Pannu N. et al., 2006). Известно, что сочетание почечной недостаточности и СД значительно повышает риск развития ОПН. При одинаковой выраженности предсуществующей почечной патологии риск развития РКН выше у пациентов с СД. В то же время частота развития РКН при исходно нормальной функции почек была одинаковой в обеих группах больных (Rudnick M.R. et al., 1995). У пациентов с диабетической нефропатией (ДН) и уровнем креатинина 0,68 г/л частота развития РКН после проведения коронарографии достигала 92% (Weinrauch L.A. et al., 1977). Особенно высок риск у больных СД при почечной патологии недиабетического генеза. У пациентов без диабета и азотемии риск развития РКН достаточно низок (2%), он достоверно повышается у лиц с диабетом без почечной патологии (16%) и очень высок при сочетании диабета и азотемии (38%). Более того, одно из последних исследований показало достоверно частое развитие РКН при проведении коронарографии у лиц с почечной патологией и с предциабетом (нарушенной гликемией натощак в рамках метаболического синдрома) по сравнению с лицами без такового (Toprak О., Cirit М., 2006). Повышенный риск развития РКН при нарушении углеводного обмена тесно

сопряжён с его основными патогенетическими механизмами - развитием ишемического поражения почечной ткани вследствие снижения почечного кровотока и прямого нефротоксического воздействия при введении контраста (Ве1ге1Ш 8. е1 а1., 2005).

Экспериментальные исследования показали, что определенную роль в развитии РКН играет повышенное образованию свободных радикалов, оказывающих повреждающее действие на эпителиальные клетки канальцев. В связи с этим гипотетически оправдано применение Ы-ацетилцистеина и бикарбоната натрия для профилактики РКН, поскольку они способны смягчить эти негативные воздействия. Клинические и экспериментальные исследования доказывают важную роль в патогенезе РКН вида контрастного препарата (ЯисЫск М.Я. е1 а!., 1995). Важное значение, в индуцировании РКН, имеет доза вводимого контраста, высокое содержание в нём ионов, высокая вязкость, интраартериальное введение и др.

В настоящее время активно продолжается поиск средств профилактики развития РКН. Одним из перспективных препаратов является ацетилцистеин, обладающий антиоксидантными и вазодилатирующими свойствами, предотвращющий гибель эндотелиальных клеток ^¡зИЬапе Б. й а1., 2004). Однако, анализ данных литературы, посвященных этой теме, достаточно противоречивы. На сегодняшний день достаточно ограниченны доказательства того, что наряду с адекватной гидратацией он может использоваться в качестве стандартного профилактического средства у пациентов высокого риска РКН.

Таким образом, исследование механизмов защиты клетки, ведущее место среди которых занимает система глутатиона, при введении РКС позволяет более подробно изучить молекулярные механизмы токсического действия препаратов данного класса, а также биохимические механизмы их детоксикации.

Цель исследования. Определить вклад изменений обмена глутатиона в механизмы формирования рентгеноконтрастных нефропатий для оптимизации мероприятий по их профилактике, диагностике и лечению.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- определить динамику (в течение 5 суток) и провести сравнительный анализ изменений обмена глутатиона в различных органах белых беспородных крыс после введения рентгеноконтрастных препаратов омнипак-350 и гипак-76 в дозах 0,5 ЬО<о и и}50;

- определить динамику морфологических изменений почечной ткани и лабораторных показателей функции почек в тех же условиях у лабораторных животных;

провести сравнительный анализ морфологических изменений, стандартных лабораторных показателей (концентрация креатинина и мочевины) и изменений обмена глутатиона в условиях формирования экспериментальных рентгеноконтрастных нефропатий у лабораторных животных;

- определить эффект влияния рентгеноконтрастного препарата омнипак-350 в дозе 0,5 1Л35о на обмен глутатиона в различных тканях и лабораторные показатели функции почек у животных с экспериментальным сахарным диабетом;

- определить характер влияния представителей различных групп фармакологических препаратов (предшественника синтеза глутатиона -ацетилцистеина, препарата окисленного глутатиона - глутоксима, антигипоксанта - трисана, антиоксидантов мексидола и цитофлавина, дегидрированного аналога гормона коры надпочечников гидрокортизона -преднизолона) на динамику изменений исследуемых биохимических и морфологических показателей в тканях лабораторных животных при использовании неионного рентгеноконтрастного препарата омнипак-350 в дозе 0,5 ЬО50;

- определить динамику измений обмена глутатиона в эритроцитах пациентов на фоне проведения изолированного рентгеноконтрастного исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение рентгеноконтрастных препаратов оказывает выраженное влияние на обмен глутатиона в тканях почек и эритроцитах лабораторных животных в виде сдвигов тиол-дисульфидного равновесия, изменения активности ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатион-Б-трансферазы, глутатионпероксидазы.

2. Изменения обмена глутатиона носят дозозависимый характер и являются диагностически информативными при оценке тяжести рентгеноконтрастной нефропатии.

3. Введение рентгеноконтрастных препаратов на фоне экспериментального сахарного диабета приводит к потенцированию повреждающего действия на систему глутатиона в тканях почек, проявляющегося снижением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы.

4. Выраженность изменений обмена глутатиона в почках животных с экспериментальной рентгеноконтрастной нефропатией на фоне проводимой терапии отражает степень нефропротекторной активности ряда фармакологических препаратов.

Научная новизна. Проведена комплексная оценка обмена глутатиона в тканях лабораторных животных и эритроцитах пациентов при введении различных рентгеноконтрастных препаратов. Экспериментально обоснована возможность использования показателей системы обмена глутатиона в клетках крови в качестве лабораторных тестов для оценки тяжести поражения почек и эффективности лечения рентгеноконтрастных нефропатии.

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедрах токсикологии и патологической физиологии, а также кафедре клинической биохимии и

лабораторной диагностики Военно-медицинской академии. Диссертационное исследование выполнено по плану НИР, шифр «Цитотоксичность».

Апробация работы. Результаты работы доложены на итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов 1-го факультета Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 115-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2008), Российской и всеармейской научно-практической конференции «Вопросы нефрологии в практике терапевта и эндокринолога» (Санкт-Петербург, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 13 работ, из них 1 - в рецензируемом журнале, входящем в список изданий ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, включающих обзор литературы, общую характеристику материалов и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Работа изложена на 191 странице машинописного текста, содержит 61 рисунок и 43 таблицы (19 в тексте и 24 в приложении). Список литературы состоит из 134 источников, из них 53 отечественных и 81 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая схема проведения экспериментального исследования представлена в табл. 1.

В ходе экспериментального исследования проводили оценку влияния острого отравления омнипаком-350 и гипаком-76 в дозах LDS0 на состояние системы глутатиона в различных тканях лабораторных животных в различные сроки исследования.

Определение LD50 РКС проводили с использованием «табличного экспресс-метода» по В.Б. Прозоровскому (1994). Численные значения LD50 неионный омнипак-350 (водный раствор) и ионный гипак-76 (водный раствор) при внутрибрюшинном введении составили соответственно 20 и 16 г/кг массы животного.

Забой животных проводился через 1, 3 и 5 сутки после однократного введения препаратов в полулетальной дозе.

Для фармакологической коррекции цитотоксического действия омнипака-350 через 30 мин после его применения в дозе 20 г/кг животным внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 суток вводили один из следующих препаратов: ацетилцистеин - 3 % водный раствор в дозе 150 мг/кг массы, трисан - 1 % водный раствор в дозе 15 мг/кг, цитофлавин - 10 % водный раствор в дозе 100 мг/кг, мексидол - 1 % водный раствор в дозе 100 мг/кг, глутоксим - 1% водный раствор в дозе 100 мг/кг, преднизолон - водный раствор в дозе 0,02 мг/кг.

Таблица 1

Схема проведения экспериментального исследования

№ группы Доза гипака Доза омнипака Доза аллоксана Сроки исследо вания Препарат коррекции Количество животных

1 контроль 40

2 16 г/кг 1 сут 10

3 3 сут 10

4 5 сут 10

5 20 г/кг 1 сут 10

6 3 сут 10

7 5 сут 10

8 20 г/кг 5 сут Цитофлавин 10

9 5 сут Трисан 10

10 5 сут Мексидол 10

11 5 сут Ацетилцистеин 10

12 5 сут Глутоксим 10

13 5 сут Преднизолон 10

14 10 г/кг 5 сут 10

15 1,7 г/кг 5 сут 10

16 10 г/кг 5 сут 10

17 10 г/кг 1,7 г/кг 5 сут Преднизолон 10

Для моделирования рентгеноконтрастной нефропатии на фоне сахарного диабета животным вводили омнипак-350 в дозе 10 г/кг на 5-« сутки после введения аллоксана в дозе 1,7 г/кг массы тела животных. При проведении фармакологической коррекции ежедневно внутрибрюшинно вводили преднизолон в дозе 0,02 мг/кг в течение 5 суток:

Для обоснования возможности использования показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов в оценке тяжести и прогноза исхода почечной патологии было проведено исследование биологического материала (гемолизата эритроцитов) 20 мужчин в возрасте 45 - 55 лет, находившихся на стационарном лечении в клинике сердечно-сосудистой хирургии ВМедА им. СМ. Кирова и 442 ОВКГ. Исследование проводилось на 3 сутки после введения неионного РКС в диагностических дозах. В качестве сравнения использовались результаты исследования этих же больных до введения рентгеноконтраста.

При выполнении клинического раздела работы анализировали анамнез заболевания, медицинскую документацию догоспитального этапа, данные объективного исследования при поступлении в лечебное учреждение и в динамике, результаты общеклинического обследования (анализы крови, мочи, биохимическое исследование крови).

У экспериментальных животных в тканях печени, почек и эритроцитах, а также в эритроцитах пациентов определяли содержание восстановленного глутатиона (ВГ), уровень свободных сульфгидрильных групп белков (СГ) и активность ферментов системы глутатиона и сопряженных систем -глутатионредуктазы (ГР), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ), глутатион-Б-трансферазы (ГТ), глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы. Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА).

Концентрацию В Г определяли методом G.L. Ellman (1959) в модификации С.И. Глушкова (2006), заключавшейся в осаждении белка 20% раствором сульфосалициловой кислоты. Содержание СГ определяли согласно методике G. Bellomo et al. (1990). Концентрацию МДА определяли по методу М. Uchiyama (1978). Определение активности ферментов системы глутатиона проводили в гемолизате эритроцитов или в цитозольной фракции, полученной после центрифугирования гомогенатов тканей в течение часа при 150000 g на ультрацентрифуге L8-M («Beckman», США). Активность глутатионредуктазы определяли по методу I. Garlberg, В. Mannervik (1985), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы - по А. Kornberg et al. (1955), глутатионпероксидазы - по методу А.Н. Гавриловой и Н.Ф. Хмары (1986) с использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила, каталазы - по М.А. Королюку (1988), глутатион-8-трансферазы - методом W.H. Habig, W.B. Jakoby (1981). Расчет активности ферментов производили на грамм белка или гемоглобина (в гемолизате эритроцитов). Концентрацию белка определяли методом Лоури в модификации G.L. Peterson (1977), гемоглобина - гемиглобинцианидным методом.

Влияние рентгеноконтрастных препаратов и применявшихся средств фармакологической коррекции на тяжесть токсического поражения ткани почек оценивали по следующим биохимическим показателям, определяемым в сыворотке крови лабораторных животных: концентрация креатинина и мочевины. Биохимические показатели определялись на автоматическом биохимическом анализаторе «Synchron» («Beckman - Coulter», США).

Статистическ.ую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6,0». В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Проводился корреляционный анализ изменений показателей системы глутатиона в эритроцитах и ткани почек исследуемых животных. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t-критерию Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значения представлены в виде Xq, ± тх.

Для оценки значимости различий у людей применялись непараметрические методы статистики. Использовался критерий Вилкоксона (Wilcoxon matched pairs при р<0,05), который является альтернативой t-критерию Стьюдента для парных сравнений количественных данных в зависимых выборках.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное экспериментальное исследование, направленное на изучение особенностей обмена глутатиона и интенсивности протекания процессов ПОЛ в тканях печени, почек и эритроцитах лабораторных животных при введении различных групп рентгеноконтрастных препаратов, позволяет говорить о вовлечении изменений данной биохимической системы в механизмы повреждения клеток при развитии рентгеноконтрастных нефропатий.

Анализ полученных результатов указывает на тесную связь изменений изучаемых биохимических показателей в исследуемых органах с величиной используемой дозы РКС, длительностью введения, наличия провоцирующего фактора (СД).

Так, наиболее достоверные и выраженные изменения показателей системы глутатиона при использовании рентгеноконтрастных препаратов были выявлены в ткани почек. В ходе проведенного исследования отмечалось достоверное повышение содержания судьфгидрильных групп в ткани почек с максимальным проявлением при введении неоинного рентгеноконтрастного препарата в дозе 20 г/кг на 5 сутки исследования в 1,5 раза (р<0,05) выше контроля. Напротив, применение ионного рентгеноконтрастного препарата в среднесмертельной дозе приводило к снижению концентрации сульфгидрильных групп в этой ткани с максимальными проявлениями в 1 сутки на 41% ниже значений интактного контроля (рис. ]).

,80------г—-

160----------------------1------

1№Ш:Г1 1

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 1. Изменения концентрации сульфгидрильных групп белков в тканях почек при введении омнипака-350 в дозе 20 г/кг и гипака-76 в дозе 16 г/кг в течение 5 суток.

I . ' _ .. * I

т

4«

I 6

V ' 1

Зй ЁЙЙа

контроль 1 день 3 день 5 день

Шомнипак ЕЭгипак

Сдвиги тиол-дисульфидного равновесия приводят к нарушению активности тиолзависимых ферментов, таких как Г-6-ФДГ, ГР, ГТ, ГП.

При исследовании активности Г-6-ФДГ в ткани почек при применении ионного РКС в полулетальной дозе отмечался период компенсаторных изменений, проявившийся в виде достоверного увеличения активности данного фермента в 2,55 раза (р<0,05) по сравнению с интактным контролем на 1 сутки. К 3 суткам активность Г-6-ФДГ достоверно превышала показатели здоровых животных в 1,82 раза (р<0,05). При применении неионного РКС периода компенсаторных изменений выявлено не было. Напротив, на протяжении всего эксперимента наблюдалось достоверное выраженное снижение активности фермента. Так, в первые сутки она составила 27% (р<0,05) от уровня нормы и к 5 суткам увеличилась лишь до 43% (рис. 2).

зоо

250

200 % 150 100

50

0

а омнипак 0 гипак

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 2. Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в различных тканях при введении омнипака-350 в дозе 20 г/кг и гипака~76 в дозе 16 г/кг в течение 5 суток.

Активность других тиол-зависимых ферментов на протяжении всего эксперимента достоверно (р<0,05) снижалась и к 5 суткам составила для ГР -38,5%, ГТ - 38% и ГП - 51%, соответственно, по сравнению с интактным контролем. В то время как применение ионного рентгеноконтрастного препарата сопровождалось достоверным (р<0,05) снижением активности лишь ГР, которая к 5 суткам составляла 44% по сравнению с активностью данного фермента в контрольной группе. Активность ГТ и ГП увеличилась в 1,92 и 1,63 раза соответственно по сравнению с показателями интактной группы.

Нарушение активности антиоксидантных ферментов в условиях i применения РКС приводит к активации свободно-радикальных процессов. ' Подтверждением чего может служить достоверное повышение концентрации МДА в 1,5 раза на 3 сутки исследования при использовании неионного РКС в среднесмертельной дозе (рис. 3).

При применении РКС в дозах, эквивалентных диагностическим, изменения обмена глутатиона менее выражены при отсутствии функциональных изменений (концентрации мочевины и креатинина).

200

1 60 1 40 1 20 % 10 0 80 60 40 20 О

I___________ __________________________________ ОМ ДА__________________I

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 3. Изменения концентрации малонового диальдегида в различных тканях при введении омнипака-350 в дозе 20 г/кг в течение 5 суток.

Так, на фоне применения неионного рентгеноконтрастного препарата в дозе 10 г/кг массы тела (0,5 Ы)50) на 5 сутки значительных изменений дисульфидного равновесия и нарушения ферментативных систем в тканях почек выявлено не было. Отмечалось лишь незначительное достоверное снижение активности ГР на 29,2% (р<0,05) и каталазы на 25% по сравнению с интактным контролем (рис. 4).

В эритроцитах наблюдалось достоверное снижение концентрации сульфгидрильных групп в 2 раза (р<0,05), а также повышение активности ГР в 1,6 раза (р<0,05) и ГП на 18% (р<0,05). Данные изменения могут рассматриваться как функциональный ответ клетки на повреждающее действие неионного РКС (рис. 5).

контроль ВГ___СГ_МДА Г6ФДГ ГР__ГТ___ГП каталаза

Г __В 20 г/кг __Н10 г/кг _I

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 4. Изменения показателей обмена глутатиона в тканях почек лабораторных животных при введении омнипака-350 в дозах 10 и 20 г/кг на 5 сутки.

контроль ВГ

МДА Г6ФДГ ГР

ГП каталаза

П20 г/кг

010 г/кг

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 5. Изменения показателей обмена глутатиона в эритроцитах лабораторных животных при введении омнипака-350 в дозах 10 и 20 г/кг на 5 сутки.

По литературным данным, одной из основных причин провокации развития рентгеноконтрастной нефропатии является сахарный диабет. В связи с чем были исследованы показатели обмена глутатиона при введении неионного

рентгеннокотрастного препарата омнипак-350 в дозе 10 г/кг на фоне экспериментального аллоксанового сахарного диабета.

В ходе проведенного исследования было выявлено потенцирование нарушений обмена глутатиона, проявляющееся в виде достоверного снижения активности Г-6-ФДГ и ГР в ткани почек в 2 раза к 3 суткам исследования (рис. 6).

Снижение активности этих ферментов при введении омнипака-350 может быть связано с неконкурентным их ингибированием непосредственно молекулой РКС, а также энергетическим дисбалансом клетки, который присутствует при сахарном диабете.

Морфологическое исследование почечной ткани указывает на наличие определенных особенностей действия изученных средств на фоне введения рентгеноконтрастных препаратов различных групп.

120 100 80 60

20 0

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 6. Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы в тканях почек при введении омнипака-350 в дозе 10 г/кг на фоне экспериментального сахарного диабета на 3 сутки.

Полученные экспериментальные данные свидетельствует о том, что морфологические изменения почечной ткани совпадают с нарушением обмена глутатиона.

Уже через 1 сутки после введения РКС на фоне отсутствия достоверных изменений концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови происходят умеренные морфологические изменения в почечной ткани, проявляющиеся дистрофическими изменениями и некрозом нефроцитов канальцев, гибелью эпителия почечных канальцев. На этом фоне отмечаются ранние изменения обмена глутатиона в тканях почек в виде снижения концентрации СГ и активности Г-6-ФДГ, в тоже время в эритроцитах животных отмечается повышение концентрации СГ и снижение активности Г-6-ФДГ.

т

* * р—1— *

т * *

т

контроль

ЭСД

РКС

РКС на фоне ЭСД

СГ-6-ФДГ

К 3 суткам эксперимента на фоне выраженных нарушений обмена глутатиона в почечной ткани (увеличение концентрации МДА, снижение активности ГП) формируются морфологические изменения (полная десквамация почечного эпителия в канальцах), имеющие необратимый характер. В эти сроки становятся информативными принятые лабораторные маркеры развития РКН.

Следует отметить, что вероятные патологические механизмы, приводящие к повреждению нефроцитов и их гибели, у ионных и неионных РКС могут различаться. Так, в первом случае характерны некротические изменения по типу сухого - коагуляционного некроза; во втором случае действие неионных РКС реализуется через развитие гипоксии, следствием которой является баллонная гидропическая дистрофия и некроз. Однако, как в первом, так и во втором случае некробиотические изменения в почках приводят к развитию острой почечной недостаточности, несовместимой с жизнью.

Сравнительный анализ сдвигов обмена глутатиона и данных гистологического исследования в почечной ткани животных при использовании ионных и неионных РКС указывает на то, что наиболее выраженные биохимические и морфологические изменения при введении неионного препарата совпадают по срокам.

Данные изменения позволяют предположить возможность цитотоксического воздействия РКС на ткани почек, а нарушения системы глутатиона рассматривать как один из патогенетических этапов повреждения, что соответствует современной гипотезе развития РКН.

В процессе эксперимента была предпринята попытка уменьшить цитотоксическое действие неионного РКС, одновременно используя фармакологические препараты, индуцирующие эндогенный синтез глутатиона (ацетилцистеин), антиоксиданты (мексидол, цигофлавин) антигипоксанты (трисан), препараты окисленного глутатиона, обладающие детоксимодифицирующей функцией (глутоксим), синтетический аналог глюкокортикоидных гормонов коры надпочечников (преднизолон).

Наиболее существенные положительные результаты были отмечены на фоне терапии с использованием антигипоксанта трисана.

Проведенное исследование системы глутатиона и ПОЛ позволило установить, что применение трисана оказывало существенное положительное влияния на динамику всех показателей исследуемой системы в тканях отравленных животных. Так, в почечной ткани отмечалось достоверное снижение концентрации СГ в 1,70 раза (р<0,05) по сравнению с изменениями у отравленных животных и составило 95,5% от показателей интактной группы животных. Произошло увеличение активности всех ферментов до показателей контрольной группы животных. Достоверное (р<0,05) увеличение активности ферментов обмена глутатиона и ПОЛ по отношению к группе не леченых животных составило 1,85 раза для Г-6-ФДГ, 2,52 раза - для ГР, 2,71 - раза для ГТ, а также 2,57 и 1,48 раза - для ГП и каталазы, соответственно (рис. 7).

180 160 140 120 100

%

80 60 40 20 О

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

# - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой отравленных животных

Рис. 7. Влияние трисана на изменения показателей системы глутатиона в ткани почек при введении омнипака - 350 в суточной дозе 20 г/кг на 5 сутки

В тканях печени, где угнетающее действие РКС на обмен глутатиона было менее существенно, использование препарата фармакологической коррекции приводило к предотвращению падения концентрации ВГ.

Применение трисана достоверно (р<0,05) увеличивало содержание МДА выше значений группы животных, не получавших фармакологическую коррекцию (на 13,6%). При исследовании ферментативного звена отмечалась лишь тенденция к росту активности Г-6-ФДГ и достоверное (р<0,05) снижение активности ГР и ГП (на 29,2 и 42,2%, соответственно), по сравнению с не лечеными животными, в результате чего происходила нормализация показателей ГП и снижение активности ГР по сравнению с контролем.

Наиболее интересным, оказалось то, что в клетках красной крови при применении трисана произошла активизация процессов ПОЛ, что сопровождалось ростом концентрации МДА на 73,2% (р<0,05) и ферментов антиоксидантной защиты. Отмечалось увеличение активности ГП в 2,1 раза (р<0,05) и ГТ в 1,84 раза (р<0,05) по сравнению с интактной группой, а также стойкая тенденция к росту активности каталазы на 34,6%. Наблюдалось увеличение активности Г-6-ФДГ в 1,63 раза (р<0,05) по сравнению с не леченым контролем до значений интактной группы животных (рис. 8).

Таким образом, применение данного фармакологического препарата способствовало в той или иной степени нормализации практически всех показателей наиболее поражаемой почечной ткани до значений контрольной группы животных.

250 200 150

о/

/о

100 50 О

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

# - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой отравленных животных

Рис. 8. Влияние трисана на изменения показателей системы глутатиона в эритроцитах при введении омнипака - 350 в суточной дозе 20 г/кг на 5 сутки

Наличие корреляционных связей между изменениями показателей обмена глутатиона во внутренних органах, в частности, в ткани почек и в эритроцитах может стать предпосылкой их использования для оценки возможности развития РКН.

В ходе проведенного исследования установлена умеренная положительная корреляционная связь (коэффициент корреляции 0,53 и 0,69) между изменениями в эритроцитах и тканях почек активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионпероксидазы в первые сутки после применения неионного рентгеноконтрастного препарата.

Была проведена сравнительная оценка сроков появления достоверных изменений показателей нарушения функции почек (концентрации креатинина и мочевины) и обмена глутатиона при применении неионного РКС в суточной дозе 20 г/кг в течение 5 суток. Установлено, что изменения таких показателей обмена глутатиона, как активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионпероксидазы происходили в более ранние сроки (от 1 до 3 суток) и выявлялись при отсутствии достоверных изменений со стороны стандартных биохимических показателей (рис. 9).

Возможность использования показателей обмена глутатиона для оценки цитотоксического поражения почек при применении неионного рентгеноконтрастного препарата подтвердил проведенный дискриминантный анализ. Для его осуществления мы провели разделение экспериментальных животных на три группы: 1-я группа - морфологические признаки поражения почек отсутствуют; 2-я группа - морфологические признаки поражения почек

гЧ

□ не леченные

- ■ * X

# .

* #

А .Л

гХ

«I,

контроль ВГ СГ МДА Г-6-Ф-ДГ ГР ГТ ГП

1 после введения трисана

незначительны или умеренно выражены; 3-я группа - морфологические признаки поражения почек сильно выражены, а затем провели анализ изменений показателей системы глутатиона в эритроцитах этих животных (рис. 10).

Рис. 9. Активность Г-б-ФДГ, ГП и концентрация мочевины и креатинина в эритроцитах животных при введении неионного РКС в дозе 20 г/кг

1-я группа -морфологические признаки поражения почек отсутствуют;

2-я группа -морфологические признаки поражения почек незначительны и слабо выражены;

3-я группа морфологические признаки поражения почек значительны и сильно выражены.

Рис. 10. Канонические дискриминантные функции распределения животных, получавших омнипак-350, на морфологические группы поражения тканей почек на основе анализа показателей обмена глутатиона.

♦ Г" ¿'¿"а О* ■ : : ■ ■ я.'-.. , . . .. •

-5-4-3-2-1012345 Функция 1

При оценке чувствительности решающих правил выявлено, что точность диагностики по решающим правилам в среднем характеризуется достоверностью 92,8%, при этом для первой группы она составила 81,8%, для второй и третьей групп - 100%. Недостаточная точность диагностики для первой группы объясняется двумя причинами, связанными с временным фактором и летальностью. Во-первых, в данную группу морфологических признаков распределялись не только контрольные животные, но и часть переживших токсическое воздействие опытных крыс на поздних сроках наблюдения. В этом случае выраженность морфологических признаков поражения почечной ткани уже снижалась, а изменения со стороны обмена глутатиона еще сохранялись. Во-вторых, в третью группу не были включены погибшие животные с выраженными морфологическими сдвигами в тканях почек, так как биохимические исследования у них не проводились.

С целью определения информативности показателей обмена глутатиона в эритроцитах для оценки морфологических изменений в тканях почек при развитии РКН у лабораторных животных в наиболее ранние сроки нами проведен многомерный регрессионный анализ. Для построения уравнения регрессии были использованы показатели обмена глутатиона в эритроцитах отравленных животных на 1 сутки эксперимента.

Построенная корреляционная матрица позволила выявить, что существует прямая корреляционная связь морфологических изменений с такими факторами, как концентрация сульфгидрильных групп и обратная - с активностью Г-6-ФДГ и ГП. Данная корреляционная связь имеет умеренную выраженность.

Дисперсионный анализ определил значение коэффициента детерминации построенной модели более 0,5 (112:=0,6), что позволяет рассматривать её как информативную. Уровень значимости модели составил р=0,02б, таким образом данную модель, построенную на 3-х факторах можно считать значимой и достоверной.

Регрессионная модель прогноза развития морфологических изменений в тканях почек белых беспородных крыс, получающих омнипак-350 в дозе 20 г/кг, имеет вид:

У=2,252+0,025 *СГ-0,031 *Г-6-ФДГ-1,487*ГП

На рис. 11 видно, что группы животных с морфологическими признаками поражения почечной ткани (У>0,2) и без таковых (У< -0,2) отчетливо дифференцируются, при этом практически все случаи наблюдений попали в 95% доверительный интервал.

-1,0 -0,

0,0 0,2

у I 95% доверительтный интервал

Рис. 11. График линии регрессии прогнозируемых и наблюдавшихся случаев развития морфологических признаков поражения тканей почек у животных, получавших омнипак-350 в средне смертельной дозе.

В результате проведенного исследования экспериментально установлено, что определение концентрации СГ и активности Г-6-ФДГ и ГП в эритроцитах белых беспородных крыс, получающих омнипак-350 в дозе 20 г/кг, с высоким уровнем достоверности и значимости может быть использовано для прогноза развития морфологических изменений в тканях почек животных. Данное положение экспериментально обосновывает возможность использования показателей обмена глутатиона в эритроцитах в качестве лабораторных тестов для оценки тяжести поражения тканей почек на фоне применения РКС.

Основной целью проведения клинической части исследования явилось подтверждение экспериментально обоснованной гипотезы о возможности использования определения показателей системы глутатиона в эритроцитах пациентов при применении неионного РКС, а также для оценки эффективности новых средств цитопротекции в клинике. При исследовании показателей обмена глутатиона в эритроцитах человека на 3-е сутки после введения РКС выявлены тенденции подобные с изменениями в эритроцитах животных. Так, в эритроцитах пациентов отмечается снижение активности Г-6-ФДГ на 46,5% и ГП на 35,7% (рис. 12). Умеренная корреляция этих показателей в эритроцитах пациентов и лабораторных животных составляет 0,63 и 0,59 для Г-6-ФДГ и Г'П, соответственно (в эритроцитах животных на 3-е сутки отмечается уменьшение активности Г-6-ФДГ на 33,5% и ГП на 7,6%).

При сравнении этих показателей выявлено значение, близкое к статистически достоверному, до и после введения РКС (р=0,080 для обоих показателей).

% 60 —

* - достоверность отличия р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Рис. 12. Изменения активности ферментов в эритроцитах белых беспородных крыс и человека на 3-е сутки при введении РКС.

Данные изменения наблюдались при отсутствии достоверных изменений со стороны общепризнанных показателей нарушения функции почек (содержание мочевины, креатинина). Таким образом, определение активности этих ферментов в эритроцитах у человека можно использовать для оценки степени нарушения функционального состояния нефроцитов, а также прогноза вероятности развития РКН.

ВЫВОДЫ

1. Основными изменениями обмена глутатиона в тканях животных при введении рентгеноконтрастных препаратов в дозе 0,5 ЬЭ50 являются достоверное снижение ГР и каталазной активности на 25 - 30% в почках, а также увеличение ГР (на 65%) и ГП (на 18%) активности, снижение каталазной активности (на 40%) и концентрации СГ (в 2,0 раза) в эритроцитах на фоне отсутствия достоверных сдвигов со стороны лабораторных маркеров нарушения функции почек (концентрация креатинина и мочевины).

2. После введенния рентгеноконтрастных препаратов в среднесмертельных дозах на фоне необратимых морфологических изменений в тканях почек (некроз почечной паренхимы) и существенных нарушений их функции (увеличение концентрации мочевины в 1,81 раза и креатинина в 1,5 раза) отмечается достоверное снижение активности Г-6-ФДГ, ГР, каталазы, ГП и ГТ (в 1,8 - 2,6 раза) в тканях почек, а также повышение (р<0,05) концентрации СГ на 23,4% и снижение активности Г-6-ФДГ на 18% в эритроцитах.

3. Введение омнипака-350 животным с экспериментальным сахарным диабетом приводило к возникновению выраженных нарушений обмена

глутатиона в тканях почек в виде снижения (р<0,05) активности ГР и Г-б-ФДГ в 1,8 раза по сравнению с показателями контрольной группы.

4. Эффективность фармакологической коррекции проявилась в частичном восстановлении обмена глутатиона в тканях животных, наиболее ярко при использовании препарата антигипоксантного действия - трисана. Его применение приводило к снижению концентрации СГ до уровня физиологической нормы, достоверному увеличению активности ферментов обмена глутатиона в тканях почек: Г-б-ФДГ, ГР, Г'Т, ГП (в 1,9 - 2,7) раза, а также к увеличению активности ГП, ГТ, Г-б-ФДГ (в 1,63 - 2,1 раза) в эритроцитах.

5. Между изменениями обмена глутатиона в эритроцитах и тканях почек экспериментальных животных на фоне введения рснтгеноконтрастных препаратов существует положительная корреляция: для омнипака-350 в дозе LD50 г = 0,53 (Г-б-ФДГ) и г = 0,69 (ГП), и для гипака-7о в эквивалентной дозе

г = 0,52 (Г-б-ФДГ) и г = 0,49 (ГП). Получена математическая модель (уровень значимости р=0,026) позволяющая прогнозировать риск развития РКН у лабораторных животных основанная на определении концентрации СГ и активности Г-б-ФДГ и ГП в эритроцитах.

6. После проведения изолированного рентгеноконтрастного исследования пациентов, не имеющих признаков формирования рентгеноконтрастной нефропатии, основными биохимическими изменениями со стороны обмена глутатиона в эритроцитах явилось уменьшение активности Г-б-ФДГ и ГП (на 46,5% и 35,7%) по сравнению с показателями до введения РКС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве лабораторных тестов оценки риска развития и степени тяжести рентгеноконтрастных нефропагий у пациентов, подвергающихся диагностическим и лечебным процедурам с использованием контрастных средств, рекомендуется определение в эритроцитах активности Г-б-ФДГ и ГП.

2. Дополнительным методом оценки нефропротекторных свойств фармакологических препаратов для профилактики и лечения РКН является определение показателей обмена глутатиона в тканях экспериментальных животных и в эритроцитах пациентов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жерегеля С.Н. Динамика изменений концентрации восстановленного глутатиона в тканях печени на фоне развития острой почечной недостаточности вызванной введением ренгеноконтрастных препаратов / С.Н. Жерегеля, Л.В. Минаева, О.О. Ивойлов // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов 1 факультета,- СПб: ВМедА, 2007. - С. 42-43.

2. Жерегеля, С.Н. Глутатионредуктазная активность тканей почек в

2.0

условиях развития рентгеноконтрастных нефропатий на фоне экспериментального сахарного диабета / С.Н. Жерегеля, А.И. Карпищенко, О.О. Ивойлов и др. И Сборник тезисов Российской и всеармейской научно-практической конференции «Вопросы нефрологии в практике терапевта и эндокринолога». - СПб: ВМедА, 2008. - С. 47 - 48.

3. Жерегеля, С.Н. Изменения активное™ глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в почечной ткани животных при различной концентрации рентге] неконтрастного препарата / С.Н. Жерегеля, С.И. Глушков, О.О. Ивойлов и др. // Сборник тезисов Российской и всеармейской научно-практической конференции «Вопросы нефрологии в практике терапевта и эндокринолога». - СПб; ВМедА, 2008.-С. 49.

4. Жерегеля, С.Н. Изменения глюкозо-б-фосфатдегидрогеназной активности при формировании рентгеноконтрастных нефропатий на фоне экспериментального сахарного диабета / С.Н. Жерегеля, С.И. Глушков, О.О. Ивойлоз и др. // Сборник тезисов Российской и всеармейской научно-практической конференции «Вопросы нефрологии в практике терапевта и эндокринолога». - СПб: ВМедА, 2008. - С. 50 - 51.

5. Жерегеля, С.Н. Активность глутатионредуктазы в тканях экспериментальных животных при введении различных доз рентгеноконграстных препаратов / С.Н. Жерегеля, А.И. Карпищенко, С.И. Глушков, О.О. Ивойлов // Актуальные проблемы лабораторной диагностики / Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 115-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. - СПб: ВМедА, 2008.-С. 21.

6. Жерегеля, С.Н, Изменения глюкозо-б-фосфатдегидрогеназной активности при введении различных фармакологических групп рентгеноконтрастных препаратов / С.Н. Жерегеля, А.И. Карпищенко, С.И. Глушков, О.О. Ивойлов II Актуальные проблемы лабораторной диагностики / Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 115-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. - СПб: ВМедА, 2008. - С. 20 - 21.

7. Жерегеля, С.Н. Изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в почечной ткани животных при различной концентрации рентгеноконтрастного препарата / С.Н. Жерпгеля, А.И. Карпищенко, С.И. Глушков и др. // Вестник Российской Военно-медицинской академии.- СПб: 2008 - Приложение 1, № 3 (23).-С. 127.

8. Жерегеля, С.Н. Изменения активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в ткани почек лабораторных животных при индуцированной рентгеноконтрастной нефропатии / С.Н. Жерегеля, А.И. Карпищенко, С.И. Глушков, О.О. Ивойлов и др. // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. С. 505.

9. Жерегеля, 'C.IL Изменения обмена глутатиона в патогенезе рентгеноко1>:грастной нефропатии / С.Н. Жерегеля, С.И. Глушков,

А.И. Карпищенко, В.Я. Апчел // Вестник Российской Военно-медицинской академии.- СПб, 2010. - № 2 (30). — С. 163-166.

10. Карпищенко А.И. Изменения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгенсконтрастных нефропатий / А.И. Карпищенко, С.И. Глушков, С.Н. Жерегеля, и др. // Вестник Российской Военно-медицинской академии.- 2007-Приложение 1 (17), ч. 1.-С. 370.

11. Карпищенко А.И. Динамика глутатионредуктазной активности тканей почек в условиях развития ренгеноконтрастных нефропатий / А.И. Карпищенко, С.И. Глушков, С.Н. Жерегеля, Л.В. Минаева и др. // Вестник Российской Военно-медицинскон академии.- 2007 - Приложение 1 (17), ч. 1С. 370.

12. Минаева JI.B. Динамика изменений концентрации восстановленного глутатиона в тканях почек на фоне развития острой почечной недостаточности вызванной введением ренгеноконтрастных препаратов / Л.В. Минаева, С.Н. Жерегеля, О.О. Ивойлов // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета - СПб: ВМедА, 2007 - С. 9596.

13. Минаева Л.В. Органоспецифические изменения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности при формировании ренгеноконтрастных нефропатий / Л.В. Минаева, С.Н. Жерегеля, О.О. Ивойлов // Там же.- С. 94-95.

Формат 60x84/16 Заказ №596

Подписано в печать 24.06,10

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Типография ВМА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.

Актуальность. Рентгеноконтрастная нефропатия (РКН) стала важной клинической проблемой, растущей параллельно с широким распространением диагностических и лечебных процедур с использованием контрастных средств. По данным Американской ассоциации сердца, только в 2003 г. было проведено примерно 1 млн. 414 тыс. коронарных ангиографий и 664 тыс. операций коронарной ангиопластики [54]. Необходимость проведения этих процедур у больных сахарным диабетом (СД) обусловлена высоким риском развития ишемической болезни сердца, эталонным методом своевременной диагностики которой является коронарная ангиография. Рентгеноконтрастная нефропатия (РКН) определяется при фиксировании подъёма уровня креатинина сыворотки крови на 44 мкмоль/л или на 25% от базового уровня в течение 48 часов после проведения процедуры с контрастом при отсутствии альтернативных причин [58]. Уровень креатинина сыворотки сам по себе лишь относительно может отражать почечную функцию, особенно при прогрессировании почечной патологии.

РКН стала третьей по частоте причиной острой почечной недостаточности (ОПН) у госпитализированных пациентов [116]. Она ассоциируется с длительной госпитализацией, необходимостью проведения диализа и высокой смертностью в период пребывания в стационаре и после выписки [69, 111]. РКН обычно имеет преходящий характер: уровень креатинина повышается в течение трёх дней и возвращается к исходному уровню через 10 дней [110]. Распространённость РКН в общей популяции не превышает 2% [81]. В группах высокого риска (пациенты пожилого возраста, с предшествующей почечной патологией, СД, сердечной недостаточностью, гипотензией, анемией, дегидратацией, миеломной болезнью, при применении нестероидных противовоспалительных препаратов) распространённость РКН достигает 20-30% [82, 105]. Систематический анализ публикаций по данной проблеме за период с 1966 г. по январь 2006 г. определил факторы риска, связанные с пациентом (хронические почечные заболевания, СД, сердечная недостаточность, пожилой возраст, анемия, дисфункция левого желудочка), а также не связанные с пациентом (применение высокоосмолярных, ионизированных контрастных препаратов, их вязкость и объём) [118]. В большом рандомизированном исследовании (The Iohexol Cooperative Study) показано, что сочетание почечной недостаточности и СД значительно повышало риск развития ОПН. При одинаковой выраженности предсуществующей почечной патологии риск развития РКН выше у пациентов с СД. В то же время частота развития РКН при исходно нормальной функции почек была одинаковой в обеих группах больных [122]. У пациентов с диабетической нефропатией (ДН) и уровнем креатинина 0,68 г/л частота развития РКН после проведения коронарографии достигала 92% [130]. Особенно высок g риск у больных СД при почечной патологии недиабетического генеза [128]. У пациентов без диабета и азотемии риск развития РКН достаточно низок (2%), он достоверно повышается у лиц с диабетом без почечной патологии (16%) и очень высок при сочетании диабета и азотемии (38%) [102]. Более того, одно из последних исследований показало достоверно частое развитие РКН при проведении коронарографии у лиц с почечной патологией и с преддиабетом (нарушенной гликемией натощак в рамках метаболического синдрома) по сравнению с лицами без такового [127]. Повышенный риск развития РКН при нарушении углеводного обмена тесно сопряжён с его основными патогенетическими механизмами - развитием ишемического поражения почечной ткани (вследствие снижения почечного кровотока) и прямого нефротоксического воздействия при введении контраста [74,89].

Экспериментальные исследования показали, что определенную роль в развитии РКН играет повышенное образование свободных радикалов, оказывающих повреждающее действие на эпителиальные клетки канальцев. В связи с этим гипотетически оправдано применение N-ацетилцистеина и бикарбоната натрия для профилактики РКН, поскольку они способны смягчить эти негативные воздействия. Клинические и экспериментальные исследования доказывают важную роль в патогенезе РКН вида контрастного препарата [74, 122]. При этом чётко продемонстрировано достоверное снижение риска развития РКН при применении низкоосмолярных контрастных препаратов по сравнению с высокоосмолярными у лиц с изолированной почечной патологией или в сочетании с СД [125].

Помимо осмолярности, важное значение в индуцировании РКН имеют гиперхолестеринемия и гиперурикемия, часто выявляемые у больных СД 2 типа. В экспериментальных исследованиях показано, что гиперхолестеринемия способствует РКН за счет снижения продукции вазодилатирующего фактора - оксида азота [56]. Гиперурикемия сопровождается повышенным синтезом свободных радикалов, повышением уровня эндотелина-1, подавлением активности оксида азота [120].

Интерес как к средству профилактики РКН по-прежнему проявляется к ацетилцистеину, поскольку он обладает антиоксидантными свойствами (прямое удаление свободных радикалов и опосредованное через продукцию глутатиона), вазодилатирующими свойствами, предотвращает гибель эндотелиальных клеток [79, 88]. Несмотря на безопасность, простоту применения, дешевизну ацетилцистеина, на сегодняшний день достаточно ограниченны доказательства того, что наряду с адекватной гидратацией организма он может использоваться в качестве стандартного профилактического средства у пациентов с высоким риском развития РКН.

Таким образом, исследование системы глутатиона при введении РКС позволяет более подробно изучить молекулярные механизмы его токсического действия, кумулятивный эффект, а так же биохимические механизмы детоксикации этих соединений.

Цель исследования. Определить вклад изменений обмена глутатиона в механизмы формирования рентгеноконтрастных нефропатий для оптимизации мероприятий по их профилактике, диагностике и лечению.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- определить динамику (в течение 5 суток) и провести сравнительный анализ изменений обмена глутатиона в различных органах белых беспородных крыс после введения рентгеноконтрастных препаратов омнипак-350 и гипак-76 в дозах 0,5 LD50 и LD50;

- определить динамику морфологических изменений почечной ткани и лабораторных показателей функции почек в тех же условиях у лабораторных животных;

- провести сравнительный анализ морфологических изменений, стандартных лабораторных показателей (концентрация креатинина и мочевины) и изменений обмена глутатиона в условиях формирования экспериментальных рентгеноконтрастных нефропатий у лабораторных животных;

- определить эффект влияния рентгеноконтрастного препарата омнипак-350 в дозе 0,5 LD50 на обмен глутатиона в различных тканях и лабораторные показатели функции почек у животных с экспериментальным сахарным диабетом;

- определить характер влияния представителей различных групп фармакологических препаратов (предшественника синтеза глутатиона -ацетилцистеина, препарата окисленного глутатиона — глутоксима, антигипоксанта - трисана, антиоксидантов мексидола и цитофлавина, дегидрированного аналога гормона коры надпочечников гидрокортизона -преднизолона) на динамику изменений исследуемых биохимических и морфологических показателей в тканях лабораторных животных при использовании неионного рентгеноконтрастного препарата омнипак-350 в дозе 0,5 LD50;

- определить динамику измений обмена глутатиона в эритроцитах пациентов на фоне проведения изолированного рентгеноконтрастного исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение рентгеноконтрастных препаратов оказывает выраженное влияние на обмен глутатиона в тканях почек и эритроцитах лабораторных животных в виде сдвигов тиол-дисульфидного равновесия, изменения активности ферментов - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, глутатионредуктазы, глутатион-8-трансферазы, глутатионпероксидазы.

2. Изменения обмена глутатиона носят дозозависимый характер и являются диагностически информативными при оценке тяжести рентгеноконтрастной нефропатии.

3. Введение рентгеноконтрастных препаратов на фоне экспериментального сахарного диабета приводит к потенцированию повреждающего действия на систему глутатиона в тканях почек проявляющееся снижением активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы.

4. Выраженность изменений обмена глутатиона в почках животных с экспериментальной рентгеноконтрастной нефропатией на фоне проводимой терапии отражает степень нефропротекторной активности ряда фармакологических препаратов.

Научная новизна. Проведена комплексная оценка обмена глутатиона в тканях лабораторных животных и эритроцитах пациентов при введении различных рентгеноконтрастных препаратов. Экспериментально обоснована возможность использования показателей системы обмена глутатиона в клетках крови в качестве лабораторных тестов для оценки тяжести поражения почек и эффективности лечения рентгеноконтрастных нефропатий.

Реализация результатов исследования. Рекомендации, разработанные на основании полученных в ходе диссертационного исследования данных, используются в научной работе и учебном процессе на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии.

Диссертационное исследование выполнено по плану НИР, шифр «Цитотоксичность».

Апробация работы. Результаты работы доложены на итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов 1-го факультета Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 115-летию кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2008), Российской и всеармейской научно-практической конференции «Вопросы нефрологии в практике терапевта и эндокринолога» (Санкт-Петербург, 2008), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 26 печатных работ.

выводы

1. Основными изменениями обмена глутатиона в тканях животных при введении рентгеноконтрастных препаратов в дозе 0,5 LD50 являются достоверное снижение ГР и каталазной активности на 25 — 30% в почках, а также увеличение ГР (на 65%) и ГП (на 18%) активности, снижение каталазной активности (на 40%) и концентрации СГ (в 2,0 раза) в эритроцитах на фоне отсутствия достоверных сдвигов со стороны лабораторных маркеров нарушения функции почек (концентрация креатинина и мочевины).

2. После введенния рентгеноконтрастных препаратов в среднесмертельных дозах на фоне необратимых морфологических изменений в тканях почек (некроз почечной паренхимы) и существенных нарушений их функции (увеличение концентрации мочевины в 1,81 раза и креатинина в 1,5 раза) отмечается достоверное снижение активности Г-6-ФДГ, ГР, каталазы, ГП и ГТ (в 1,8 - 2,6 раза) в тканях почек, а также повышение (р<0,05) концентрации СГ на 23,4% и снижение активности Г-6-ФДГ на 18% в эритроцитах.

3. Введение омнипака-350 животным с экспериментальным сахарным диабетом приводило к возникновению выраженных нарушений обмена глутатиона в тканях почек в виде снижения (р<0,05) активности ГР и Г-6-ФДГ в 1,8 раза по сравнению с показателями контрольной группы.

4. Эффективность фармакологической коррекции проявилась в частичном восстановлении обмена глутатиона в тканях животных, наиболее ярко при использовании препарата антигипоксантного действия — трисана. Его применение приводило к снижению концентрации СГ до уровня физиологической нормы, достоверному увеличению активности ферментов обмена глутатиона в тканях почек: Г-6-ФДГ, ГР, ГТ, ГП (в 1,9 — 2,7) раза, а также к увеличению активности ГП, ГТ, Г-6-ФДГ (в 1,63 - 2,1 раза) в эритроцитах.

5. Между изменениями обмена глутатиона в эритроцитах и тканях почек экспериментальных животных на фоне введения рентгеноконтрастных препаратов существует положительная корреляция: для омнипака-350 в дозе LD50 г = 0,53 (Г-6-ФДГ) и г = 0,69 (ГП), и для гипака-76 в эквивалентной дозе г = 0,52 (Г-6-ФДГ) и г = 0,49 (ГП). Получена математическая модель (уровень значимости р=0,026) позволяющая прогнозировать риск развития РКН у лабораторных животных основанная на определении концентрации СГ и активности Г-6-ФДГ и ГП в эритроцитах.

6. После проведения изолированного рентгеноконтрастного исследования пациентов, не имеющих признаков формирования рентгеноконтрастной нефропатии, основными биохимическими изменениями со стороны обмена глутатиона в эритроцитах явилось уменьшение активности Г-6-ФДГ и ГП (на 46,5% и 35,7%) по сравнению с показателями до введения РКС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве лабораторных тестов оценки риска развития и степени тяжести рентгеноконтрастных нефропатий у пациентов, подвергающихся диагностическим и лечебным процедурам с использованием контрастных средств, рекомендуется определение в эритроцитах активности Г-6-ФДГ и ГП.

2. Дополнительным методом оценки нефропротекторных свойств фармакологических препаратов для профилактики и лечения РКН является определение показателей обмена глутатиона в тканях экспериментальных животных и в эритроцитах пациентов.

162