Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Особенности обмена глутатиона у больных раком яичника

Z7 у / /?/? _ . Sf

мет .................... ^

Российская Академия Медицинских Наук Онкологический научный центр им. H.H. Блохина

на правах рукописи

КОРОЛЕВА Елена Юрьевна

Особенности обмена глутатиона у больных раком яичника

(14.00.14 - онкология)

Научные руководители: член-корреспондент РАМН,

профессор Н.Е. Кушлинский доктор медицинских наук В.Б. Ларионова

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Список сокращений......................................................................4

Введение..........................................................................................5

Глава I. Глутатион и ферменты его обмена в норме и при

патологии (обзор данных литературы.................................11

1.1. Антиоксидантная система организма. Ее значение

в метаболизме......................................................................... 11

1.2. Глутатион и ферменты его обмена......................................13

1.2.1. Синтез глутатиона....................................................... 14

1.2.2. Межорганный транспорт глутатиона......................16

1.2.3. Распад глутатиона....................................................... 17

1.2.4. Ферменты метаболизма глутатиона.........................18

1.2.5. Биологическая роль системы глутатиона...............24

1.3. Значение системы глутатиона в развитии различных патологий ..................................................................................... 26

1.4. Ферментная система глутатиона и проблема злокачественного роста......................................................................................... 31

Глава И. Материалы и методы исследования.................................. 36

2.1. Общая клиническая характеристика больных.............. 36

2.2. Методы исследования....................................................... 45

Глава III. Активность системы глутатиона в доброкачественных и

злокачественных опухолях яичников.................................. 51

3.1.Содержание глутатиона и активность глутатионредуктазы в опухолях яичников в зависимости от клинико-морфологических параметров заболевания............................................................... 51

3.2. Активность глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы в опухолях яичников в зависимости от клинико-морфологических особенностей рака яичников.......................................................... 56

3.3.Содержание МДА-А и МДА-Р в опухолях яичников в зависимости от клинико-морфологических параметров........................................................................................... 61

3.4.Активность системы глутатиона в непораженном миометрии больных раком яичников ................................................................. 65

3.5.Динамика показателей системы глутатиона у больных распространенным раком яичников, получавших антиоксидантный комплекс.......................................................... 73

Глава IV. Обсуяодение полученных результатов...................................... 79

Выводы.......................................................................................................... 88

Список цитируемой литературы.................................................... 90

Список сокращений

МДА - малоновый диальдегид АОС - антиоксидантная система АО - антиоксидант ПОЛ - перекисное окисление липидов ТХУ - трихлоруксусная кислота ввТ - у-глутамилтрансфераза ввН - восстановленный глутатион в88С - окисленный глутатион вЯ - глутатионредуктаза вР - глутатионпероксидаза вТ - глутатионтрансфереза

ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Неослабевающий интерес исследователей к проблеме рака яичников обусловлен малоутешительными результатами лечения, отсутствием удовлетворительных результатов, наихудшим прогнозом и высокой летальностью (Berek J.S. и соавт.,1990; Heijt J.P.,1992; К.И. Жорданиа,1992; С.А. Тюляндин, 1996).

Рак яичников является наиболее частой формой новообразований женских половых органов. Так, в 1995 году в России было зарегистрировано 11635 новых случаев заболевания, и 9186 больных умерло от прогрессирования опухоли. Рак яичников занимает 7 место по частоте заболевания (5,4% или 10 на 100 ООО женского населения) и 5 место среди причин смерти от всех опухолей у женщин в России (H.H. Трапезников и соавт.,1997). Бессимптомное течение на ранних стадиях приводит к тому, что в 60-80% случаев болезнь диагностируется в III-IV стадии (И.Д. Нечаева, 1987).

Многочисленными клиническими испытаниями различных вариантов лечения, в настоящее время доказана необходимость применения комплексного лечебного воздействия. Общепринятая операция выбора -экстирпация матки с придатками, резекция большого сальника, которая выполняется при распространенном раке яичников, является, как правило, циторедуктивной. Противоопухолевые средства, используемые для проведения послеоперационной химиотерапии, не обладают абсолютной специфичностью к клеткам опухоли и вызывают целый ряд побочных эффектов, которые носят кумулятивный характер (A.M. Гарин и соавт.,1995; А.Б. Сыркин,1996). Выраженные изменения наблюдаются в биохимических

и гематологических показателях, что указывает на нарушения в функционировании органов и систем.

В современном представлении о системном влиянии опухоли на организм одно из ведущих мест отводится нарушению механизма антиоксидантной защиты клетки (Т.С. Морозкина,1989; Ю.А. Владимиров и соавт.,1989). При злокачественном росте окислительные свободно-радикальные процессы легко инициируются в фосфолипидах клеточных мембран, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты. Интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) сопровождается накоплением токсических продуктов, что приводит к понижению резистентности организма, ухудшает результаты лечения (В.Б. Ларионова, 1990; Gorodzanskaya Е. и соавт.,1995; Mikchaevitch О. и соавт.,1995). В то же время буферная ёмкость антиоксидантной системы (АОС) достаточно велика и обеспечивается различными составляющими. Важное место среди природных антиоксидантов занимает ферментная редокс-система глутатиона, компоненты которой принимают участие как в ферментативных (глутатионредуктаза, глутатионпероксидаза, глутатионтрансфераза), так и в неферментативных (глутатион) реакциях АОС (И.А. Зборовская и соавт.,1995).

Отсутствие эффекта химиотерапии у 20-25% больных (С.А. Тюляндин, 1996; A.M. Гарин и соавт.,1995; А.Б. Сыркин, 1996), низкая чувствительность опухоли к химиотерапии второй линии, привлекли внимание исследователей к проблеме лекарственной устойчивости. Среди возможных биохимических механизмов возникновения резистентности при лечении рака яичников широко обсуждается роль глутатиона. Глутатион принимает участие в защите клеток от повреждающего действия противоопухолевых препаратов (Ф.В.Доненко и соавт.,1991; Hedley D. и

соавт.,1994), в частности комплексных соединений платины (А.Г. Блюменберг и соавт.,1996).

Кроме того, показано (НоБкп^ Ь. и соавт.,1990), что от уровня внутриклеточных тиолов, в том числе и глутатиона, зависит радиологическая чувствительность клеток.

Несмотря на то, что составляющие системы глутатиона являются объектом многих исследований, в литературе нет единого мнения об их роли в развитии патологических состояний, в том числе при злокачественном росте. В связи с этим анализ функционального состояния системы глутатиона в злокачественных и доброкачественных опухолях яичников и сравнение этих данных с результатами, полученными при исследовании нормальных яичников, позволит выявить их роль в патогенезе, клиническом течении и прогнозе заболевания.

Цель исследования. Выявить особенности активности системы глутатиона и его ферментов в первичной опухоли больных раком яичников с учетом основных клинико-морф о логических характеристик заболевания на разных этапах заболевания, а также оценить влияние витаминов-антиоксидантов на функциональное состояние глутатиона и ферментов его обмена.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи.

Задачи исследования.

1. Определить уровень глутатиона и активность глутатионзависимых ферментов (глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы,

глутатионтрансферазы) в злокачественных опухолях яичников.

2. Сопоставить активность системы глутатиона в доброкачественных и злокачественных опухолях яичников.

3. Провести сравнительный анализ состояния системы глутатиона в опухолях яичника и тканях яичника практически здоровых людей.

4. Провести сравнительную оценку активности антиоксидантной системы глутатиона в опухолевых и непораженных опухолью тканях.

5. Выявить изменения в системе глутатиона при применении витаминов-антиоксидантов и определить клиническое значение выявленных показателей.

Научная новизна исследования.

Впервые проведено сравнительное исследование активности системы глутатиона в тканях яичников и миометрии здоровых людей, в злокачественных и доброкачественных опухолях яичников и непораженном миометрии больных раком яичников. Показано, что активизация процесса ПОЛ сопровождается компенсаторным повышением активности системы глутатиона в доброкачественных и срывом АО глутатионовой защиты в злокачественных опухолях яичников. В непораженном миометрии больных раком яичников выявлены изменения активности системы глутатиона аналогичные наблюдаемым в злокачественных опухолях, но выраженные в меньшей степени, что подтверждает системное действие опухоли на организм. Установлено снижение уровня вБН и активности ОТ в опухолях яичников после приема антиоксидантов.

Научно-практическая значимость исследования.

Полученные данные о снижении активности защитной глутатионовой системы в опухолях яичников под действием витаминов-актиоксидантов

позволяют рекомендовать прием антиоксидантного комплекса больным распространенным раком яичников в предоперационном периоде с целью повышения эффективности адъювантной химиотерапии.

Апробация работы.

Основные результаты диссертации изложены на I съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), Белорусско-Российском симпозиуме «Биохимические механизмы эндогенной интоксикации» (Гродно, 1997), Международном симпозиуме «Биоантиоксидант» (Тюмень, 1997), на V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998), X Международной конференции по химии органических и элементорганических пероксидов (Москва, 1998).

Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции лаборатории клинической биохимии, хирургического отделения гинекологии, хирургического отделения женской репродуктивной системы, отделения трансплантации костного мозга, интенсивной химиотерапии и реанимации, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ОНЦ им. H.H. Блохина РАМН и кафедры онкологии Московской медицинской академии им. М.И. Сеченова М 1998 года.

Публикации результатов исследования.

По теме диссертации опубликованы 7 научных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация включает введение, обзор литературы, собственные данные, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы (180 наименований). Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 13 рисунков.

ГЛАВА I. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

и

1Л.Антиоксидантная система организма. Её значение в метаболизме.

Окислительно-восстановительные процессы в организме составляют важную часть любого звена метаболизма и необходимы как для обеспечения энергетических потребностей, так и для доставки и утилизации кислорода в тканях (Л.Д. Лукьянова и соавт.,1982).

Помимо четырехэлектронного восстановления кислорода в окислительно-восстановительной реакции

02 + Н2—2Н20 , происходит одно- и двухэлектронное его восстановление, в результате чего образуются активные формы кислорода (АФК): супероксидный радикал 0'2; перекись водорода Н202; гидроксильный радикал ОН'; синглетный кислород 02 (В.А. Гусев и соавт.,1980). АФК вырабатываются во многих ферментативных и неферментативных реакциях. Кислородные радикалы могут генерироваться при одноэлектронном восстановлении ферментами в процессе транспорта электронов по дыхательной цепи митохондрий, при аутоокислении оксигемоглобина, НАДФН, флавинов (М.И. Турков,1976), цитохрома С (Л. Д. Лукьянова и соавт.,1982), аскорбиновой кислоты, адреналина и других катехоламинов (У.М. Франциянц и соавт.,1995), гемоглобина, тиолов (Misra Н. и соавт.,1974), при биосинтезе простагландинов и лейкотриенов из арахидоновой кислоты, при аутоокислении полиненасыщенных жирных кислот (Baker М. и соавт.,1988). Свободные радикалы кислорода являются промежуточными продуктами в реакциях, катализируемых НАДФН-цитохром-Р-450-редуктазой,

ксантиноксидазой, миелопероксидазой, некоторыми диоксигеназами и др.(Клс!о Т. и соавт.,1976; С.М. Носков и соавт.,1988). Наконец, супероксиды продуцируются нейтрофилами (Green М.,1979) и макрофагами (Hume D. и соавт.,1983).

При нарушении стационарного равновесия кислородные радикалы оказывают негативное действие. Эти частицы, имеющие непарный электрон, легко вступают во взаимодействие с биомолекулами, нарушая их структуру и, следовательно, функцию (Ю.А. Владимиров и соавт.,1972; Minotti G. и соавт.,1987; Д.Н. Маянский,1991; Е.М. Франциянц и соавт., 1995). АФК воздействуют на некоторые аминокислоты, нарушая функции тех биологических образований, в структуру которых входят белки. В связи с такими изменениями может нарушаться структура всех 4 уровней организации белковых молекул и, следовательно, нарушаются функции гликопротеинов, ферментов (В.А. Гусев и соавт.,1980; Kono Y. и соавт., 1982), металлопротеинов. Кроме того, могут повреждаться молекулы ДНК и РНК, что ведет к хромосомным аберрациям, повреждениям ядерного матрикса с появлением и накоплением мутаций, нарушением синтеза белка и т.д. (Л.Д. Лукьянова и соавт., 1982). АФК отрицательно воздействуют на биологические структуры и посредством инициации и поддержания реакций неконтролируемого ПОЛ. Активация ПОЛ приводит к изменению структурной и функциональной организации клеточных мембран, их проницаемости, ионному дисбалансу (Routh Е. и соавт., 1985); искажается информация, передаваемая от внеклеточных регуляторов к внутренним эффекторным системам, следствием чего может быть нарушение адаптационных возможностей клетки (Н.Е. Сыромятникова и соавт.,1987). Нарушение равновесия между процессами ПОЛ и антиоксидантной системой приводит к лавинообразной реакции переокисления,

заканчивающейся гибелью клетки (Ю.А. Владимиров и соавт.,1972; Е.Б. Бурлакова и соавт.,1985; В.А. Михельсон и соавт.,1988).

В нормально функционирующих клетках содержание продуктов свободнорадикального окисления находится на крайне низком уровне, несмотря на обилие субстратов ПОЛ. Это свидетельствует о достаточно мощной антиоксидантной защитной системе (И.А. Зборовская и соавт., 1995).

Различают три «линии защиты» клетки от активных кислородных соединений с помощью:

1. супероксиддисмутазы (СОД), которая осуществляет рекомбинацию супероксид-анион-радикалов (02'") с образованием перекиси водорода и кислорода;

2. каталазы и глутатионпероксидазы, утилизирующих Н202;

3. глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы, которые последовательно восстанавливают супероксид, Н202 и органические гидроперекиси.

Кроме того, некоторые авторы считают (В.И. Кулинский и соавт., 1990), что имеется еще четвертая «линия защиты» - «обезвреживание» вторичных продуктов окисления, в которой участвуют

глутатионтрансфераза и формальдегиддегидрогеназа. Очевидно, что ферментная система глутатиона участвует в трех линиях защиты из четырех, и, следовательно, вносит основной вклад в функционирование антиоксидантной системы.

1.2.Глутатион и ферменты его обмена.

Впервые глутатион был выделен английским биохимиком F. Hopkins в 1921 году (Hopkins F., 1929). Он представляет собой трипептид,

образованный глутаминовой кислотой, цистеином и глицином (y-L-глутамил-Ь-цистеинилглицин).

Н NH

'ООС

соон

Особенность этого трипептида состоит в том, что остаток глутаминовой кислоты связан с остатком цистеина пептидной связью через у- карбоксил, удаленный по отношению к аминогруппе. Такое строение глутатиона делает его неуязвимым против действия внутриклеточных пептид-гидролаз.

Глутатион обычно отсутствует у анаэробных микроорганизмов и некоторых эукариот (Entamoeba histolytica), но есть почти у всех аэробных видов.

Глутатион является наиболее богатым небелковым тиолом, обнаруженным в клетке. В клетках человеческого организма глутатион присутствует в миллимолярных концентрациях. Субклеточные частицы, такие как ядро и митохондрии, также содержат глутатион, но в меньших количествах.

1.2.1.Синтез глутатиона

Синтез глутатиона проходит в цитозоле каждой клетки, хотя главным местом биосинтеза является печень. Биосинтез включает 2 реакции, в

которых принимают участие глутаминовая кислота, цистеин и глицин, два фермента, ионы М§2+ и К+, а также источник энергии в виде АТФ. В первой реакции при участии у-глутамилцистеинсинтетазы, АТФ, ионов и К+,

глутаминовой кислоты и цистеина образуется у-глутамилцистеин:

соон

щы - сн

сн2 сн2 соон

соон н2ы - сн сн2

БН

АТФ

Mg2+, К+

у-глутамин-цистеинсинтетаза

СООН H2N - СН СН2

СН2 СООН О = С - Ш - СН СН2 БН

Глутаминовая кислота

цистеи н

у-глутамилцистеин

Вторая реакция протекает при участии фермента глутатионсинтетазы, глицина, ионов М§2+ и АТФ:

соон н2ы - сн сн2

сн2 соон о = с - ш - сн сн2

БН

у-глутамилцист�