Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Новые подходы к оценке фармакологической активности полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты сибирской

На правах рукописи

Карпова Евгения Михайловна

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИПРЕНОЛОВ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ХВОИ ПИХТЫ СИБИРСКОЙ

(экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3480239

Томск-2009

003480239

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Учреждение Российской академии наук Институт химии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, доцент

Мазина

Надежда Константиновна

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Кучин

Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Суслов

Николай Иннокентьевич

Новожеева Татьяна Петровна

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Защита диссертации состоится » Ууф^ТОМ 2009 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д 001.031 .и 1 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «0^ » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Не смотря на разнообразие современных принципов создания лекарственных средств, поиск перспективных соединений среди веществ растительного происхождения, продолжает оставаться одним из основополагающих при разработке высокоэффективных и безопасных лечебно-профилактических препаратов [Душенков В.М., 2008; Кукес В.Г., 2006; Маш-ковский М.Д., 1998; Харкевич Д.А., 2005].

Пихта сибирская (Abies sibirica) относится к уникальному источнику соединений, влияющих на процессы, протекающие в живых организмах. Экстрактивные компоненты из хвои пихты обладают биологической активностью, которая давно известна в народной медицине [Гончарова Т.А., 2001; Муравьева Д.А., 1978; Чиков П.С., 1989] и научно доказана в отношении многих видов микроорганизмов, растений, животных [Васильев С.Н. и др., 1991; Кинтя П.К. и др., 1990; Ларионов Г.И., 2004; Рощин В.И. и др., 1991; Рощин В.И., 1995; Том-чук Р.И., Томчук Г.Н., 1966; Чернышева Н.К. и др., 1970; Ягодин В.И., 1981; Hostettmann К. et al., 1999; Levinson H.L., 1972; Pengelly A., Bone К., 2004].

В литературе последних лет среди экстрактивных веществ хвои пихты большое внимание уделяется сумме полипренолов, для которых известны такие виды фармакологической активности, как противовирусная, иммуномодули-рующая, противоязвенная, противоопухолевая, гипотензивная, гепатопротек-торная, кардиопротекторная, антирадикальная и другие [Григорьева Н.Я., Мои-сеенков A.M., 1989; Деева A.B. и др., 1998; 2004; Карпицкий В.И., Карпицкая Л.Г., 2009; Кучин A.B. и др., 2000; Лаптева E.H. и др., 2007; Маймескулова Л.А. и др., 2003; Рощин В.И., 1999; Рощин В.И., Султанов B.C., 2005; Рощин В.И., 2008; Санин A.B. и др., 1991; Серебряков Э.П., Нигматов А.Г., 1990; Хидырова Н.К., Шахидоятов Х.М., 2002; Danilov L.L. et al., 1997; Janas Т. et al., 2000; Mishima Y. et al., 1995; Pronin A.V. et al., 2000; Sanin A.V. et al., 1998]. В большинстве работ изучался только один из специфических видов фармакологической активности полипренолов. Хотя из установленных позитивных эффектов полипренолов при различных типах патологических процессов следует высокая вероятность одновременного проявления уже известных и еще не описанных видов их фармакологической активности. Это может стать основанием для разработки принципиально новых мультифункциональных лекарственных средств.

Наряду с полипренолами, перспективным компонентом хвои пихты является сумма тритерпеновых кислот ланостанового ряда, содержащаяся в достаточно большом количестве (около 3% от веса сухого сырья) и не встречающаяся у других хвойных растений (сосна, ель, лиственница), принадлежащих к тому же ботаническому семейству (Pinaceae) [Кинтя П.К. и др., 1990; Ралдугин В.А., 2005; Хуршкайнен Т.В., 2006; Hasegawa S. et al., 1985; Hasegawa S. et al., 1987]. Тритерпеновые кислоты имеют структуру, подобную стероидным гормонам, а стереохимия их молекул сходна с таковой у физиологически активных ланостаноидов - метаболитов морских организмов [Кинтя П.К. и др., 1990; Племенков В.В., 2001]. Можно предположить, что данные соединения также будут обладать различными видами фармакологической активности. Но сведения об их биологической активности весьма ограничены, а влияние на организм животных в норме и при патологии еще не изучалось. В связи с этим, изучение полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты с целью создания на их

основе эффективных и безопасных препаратов, весьма актуально.

Природные вещества обладают широким спектром фармакологической активности [Гончарова Т.А., 2001; Hostettmann К. et al., 1999; Pengelly A., Bone К., 2004]. Поэтому для изучения действия на организм препаратов природного происхождения необходим системный подход, обеспечивающий анализ совокупности изменений разнокачественных физиологических показателей. В последние годы для решения подобных задач стала активно внедряться в медицину и, в частности, в фармакологию [Григорьев С.Г., 2003; Мазина Н.К., 2007; Хафизьянова Р.Х., 2007] системная методология научных исследований в виде алгоритмов многомерного математико-статистического анализа и моделирования, успешно зарекомендовавшая себя в экономике, социологии, политологии и психологии [Гудвин Д., 2004; Дубров А.М.и др., 2000; Жуковская В.М., Мучник И.Б., 1976; Кругов В.Н. и др., 1989; Миркин Б.Г., 1985].

Цель работы состояла в изучении множественных проявлений фармакологической активности суммы полипренолов и суммы тритерпеновых кислот из хвои пихты в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Определить диапазон адаптогенных доз полипренолов и тритерпеновых кислот по способности повышать устойчивость организма к комбинации неблагоприятных факторов (холода и предельной физической нагрузки).

2. Изучить антиоксидантное действие полипренолов и тритерпеновых кислот в условиях комбинации неблагоприятных и патогенного факторов.

3. Исследовать влияние полипренолов и тритерпеновых кислот на активность процессов энергопродукции в митохондриях лимфоцитов и тканей внутренних органов в норме и при комбинации неблагоприятных и патогенного факторов.

4. Изучить механизмы реализации адаптогенного действия полипренолов и тритерпеновых кислот в сравнении с эталонным препаратом.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые:

- в экспериментах на лабораторных животных изучены проявления фармакологической активности суммы тритерпеновых кислот из хвои пихты;

- обнаружен широкий спектр адаптогенного действия тритерпеновых кислот в виде актопротекторного и хладопротскторного эффектов на фоне острого токсического поражения печени;

- выявлено антиоксидантное действие тритерпеновых кислот и их способность регулировать энергетический обмен в условиях действия неблагоприятных факторов;

- изучено адаптогенное действие полипренолов из хвои пихты в отношении комбинации неблагоприятных факторов (физической и химической природы) и установлены их хладопротекторные и актопротекторные свойства при остром токсическом поражении печени;

- исследовано влияние полипренолов на прооксидантно-антиоксидантный статус организма и установлено наличие антиоксидантных свойств;

- изучено влияние полипренолов на системы энергопродукции печени, сердца, почек и лимфоцитов и показано его вовлечение в реализацию уже известного иммуномодулирующего, кардиопротекторного и гепатопротекторного эффектов этих веществ.

Научно-практическая значимость.

На основании полученных результатов обоснована перспективность использования полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты в качестве фармакологических субстанций для разработки новых лекарственных средств, сочетающих адаптогенный эффект с антиоксидантными свойствами и способностью регулировать энергетический обмен в условиях действия неблагоприятных и патогенного факторов на организм.

Использование комбинации неблагоприятных воздействий (физической и химической природы) позволяет выявлять соединения с широким спектром адаптогенного действия при скрининге фармакологически перспективных веществ.

Применение факторной схемы эксперимента, методов группировки исходных данных и многофакторного анализа методом главных компонент к совокупности разнородных показателей предоставляет возможность выявлять эффективные адаптогенные дозы, а также изучать разнообразные виды фармакологической активности новых соединений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Полипренолы и тритерпеновые кислоты из хвои пихты обладают широким спектром адаптогенного действия (актопротекторным и хладопротектор-ным, в том числе, и на фоне острой патологии печени);

2. Адаптогенный эффект полипренолов и тритепеновых кислот реализуется с вовлечением процессов энергопродукции в лимфоцитах и тканях внутренних органов (сердца, печени, почки), а также прооксйдантно-антиоксидантной системы.

3. Новый подход к изучению фармакологической активности полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты с использованием факторной схемы эксперимента, методов группировки исходных данных и многофакторного анализа позволил обосновать их перспективность как адаптогенов, антиоксидантов и средств фармакологической регуляции энергетического обмена.

Реализация результатов исследования. Результаты работы используются при выполнении научных исследований в рамках приоритетного направления «Живые системы» Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Государственные контракты № 02.512.11.2025, № 02.512.12.0011, № 02.512.11.2229).

Алгоритмы планирования эксперимента и математико-статистического моделирования, разработанные в диссертационном исследовании, используются на кафедре физики и информатики ГОУ ВПО Кировская ГМА в научно-исследовательской работе и при чтении курса медицинской статистики.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений» (Казань, 2007); II Международной конференции "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives" (Алма-Ата, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2007); 63 Научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и

маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); XIII Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2008), I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); расширенном заседании кафедр фармакологии; медицинской биологии и генетики; физики и информатики; биохимии; патологической анатомии с секционным курсом; микробиологии с курсом иммунологии и патологической физиологии ГОУ ВПО Кировская государственная медицинская академия Росздрава (Киров, 2009).

Участие автора в получении научных результатов. Автором лично получены экстрактивные вещества из древесной зелени пихты, осуществлялись работы с экспериментальными животными, проводились исследования фармакологической активности веществ in vitro. Автор самостоятельно изучил литературу, провел статистическую обработку результатов, сделал обобщения, научно обосновал выводы, разработал практические рекомендации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, основных выводов работы и списка литературы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 45 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 306 наименований, в том числе 92 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 75 беспородных половозрелых мышах-самцах (весом 25±2 г) и 65 крысах-самцах весом (200±15 г) по 5 животных в группе сравнения. Лабораторных мышей получали из вивария ГОУ ВПО Кировская ГМА, крыс - из питомника РАМН в пос. Рапполово Ленинградской обл. Все животные были сертифицированы. Работу с биологическими моделями проводили с соблюдением правил, принятых Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) [Западнюк И.П., 1983; Каркищенко H.H., 2004]. Эвтаназию животных проводили с помощью декапитации.

Сумму полипренолов (ПП) и сумму тритепеновых кислот (ТТК) выделяли методом адсорбционной колоночной хроматографии соответственно из нейтральной и кислой части эмульсионного экстракта хвои пихты [Кучин A.B. и др., 2000]. Состав выделенных фракций идентифицировали при помощи методов инфракрасной и протонной магнитно-резонансной спектроскопии [Накани-си К., 1965; Сергеев Н.М., 1981].

В качестве препарата сравнения использовали регулятор энергетического обмена, обладающий доказанной системной фармакодинамикой по типу полиорганной энергопротекции [Мазина Н.К., 2007], состоящий из комбинации ян-

тарной и глутаминовой кислот (ЯК+Глу) в дозировке 50 и 80 мг/кг [Васильев К.Ю., Хазанов В.А., 2004].

Диапазон эффективных доз исследуемых веществ определяли в эксперименте на мышах, для этого растворы ПП и ТТК в вазелиновом масле с дозировками: 1, 10 и 100 мг/кг веса животного вводили внутрипищеводно в количестве 1% от массы тела ежедневно в утренние часы на протяжении 5 суток. На 6-е сутки последовательно моделировали острое охлаждение и предельную физическую нагрузку. Выявленные дозы ПП и ТТК, оказывающие максимальное адап-тогенное действие, использовали для дальнейшего исследования на крысах с учетом коэффициента равноэффективных доз [Волчегорский И.А., 2000].

Комбинацию неблагоприятных факторов физической природы имитировали путем острого охлаждения с ограничением подвижности при температуре -15°С в течение 60 минут (крысы) или 30 минут (мыши) [Иванов К.П., 2001] с последующей предельной физической нагрузкой в тесте принудительного плавания с грузом, составляющим 10% от массы тела животного, при температуре воды 18°С (ХП) [Волчегорский И.А., 2000]. В качестве патогенного фактора моделировали токсическое поражение печени по типу острого гепатита. Ежедневно подкожно вводили 66%-й раствор ССЦ в масле по 0,2 мл/100 г веса в течение 5 дней [Косых A.A., 1992], на 6-е сутки животных подвергали последовательно охлаждению и принудительному плаванию (ТХП).

Для коррекции негативных последствий неблагоприятных и патогенного факторов ежедневно за 5 суток до воздействия крысам внутрипищеводно вводили ПП и ТТК, а также эталонный препарат ЯК+Глу. На 6-е сутки животных подвергали комбинациям ХП и ТХП.

Вовлечение прооксидантно-антиоксидантной системы в реализацию адаптогенного действия ПП и ТТК оценивали по интенсивности свободно радикальных (СР) процессов в плазме крови крыс (1Ш11 - максимальной вспышке хемилюминесценции и светосумме свечения за 30 секунд (Езо), отражающих, соответственно, общую интенсивность СР-процессов и содержание радикалов в конце цепи СР-реакций) [Цапок П.И., Галкин A.A., 1998], ее антирадикальной активности (АРА = 1т,х/ £30) [Клебанов Г.И. и др., 1999; Цапок П.И., Галкин A.A., 1998], содержанию конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА) и активности катал азы - ключевого фермента антиоксидантной защиты организма от повреждающего действия перекиси водорода, образующейся в результате СР-окисления. Интенсивность Ре2+-индуцированной хемилюминесценции определяли в плазме крови крыс на хемилюминометре Emilite El 1105. Содержание МДА оценивали в плазме крови крыс с помощью тиобарбитуровой кислоты [Андреева Л.И. и др., 1988; Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977]. Катал аз ную активность крови (К,,,), тканей сердца (Кс), печени (Кп) и почки (Кпчк) исследовали полярографически [Lessler М.А., 1980] при помощи закрытого кислородного датчика гальванического типа [Коваленко Е.А., 1975] в момент взаимодействия фермента с субстратом - Н202 по скорости выделения 02, которую относили к содержанию белка, измеренного модифицированным микробиуретовым экспресс-методом [Волчегорский И.А., 2000].

Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) лимфоцитов периферической крови крыс изучали цитохимически [Нарциссов Р.П. и др., 2000] с использованием готовых наборов реактивов (производитель ООО НПФ «Либрус», г. Мо-

сква). Энергетический статус лимфоцитов оценивали по суммарной СДГ-активности (Q) в 50 клетках [Василев С.Ц. и др., 2001] и средней площади депозитов СДГ-реакции (S), характеризующих структурно-функциональную организацию систем энергопродукции лимфоцитов в виде митохондриального ретикулума [Жукоцкий А.В. и др., 1998], которые определяли методом количественной морфометрии с помощью комплекса аппаратно-программной визуализации гистологических препаратов «ВидеоТесТ».

Процессы окисления энергетических субстратов в тканях внутренних органов крыс изучали с помощью закрытого кислородного датчика гальванического типа [Коваленко Е.А. и др., 1976] в ячейке объемом 1 мл с солевой средой инкубации при температуре 37°С по скорости поглощения 02 в разных метаболических состояниях митохондрий (MX), градации которых имитировали в виде цикла «эндогенное дыхание —* максимальная активность СДГ» [Кондра-шова М.Н., 1973], который запускали последовательным добавлением порции гомогената по 200 мкл, затем - янтарной кислоты (ЯК) до концентрации 5 мМ. Содержание белка в гомогенатах тканей измеряли модифицированным микро-биуретовым экспресс-методом [Волчегорский И.А., 2000].

Статистическую обработку данных проводили с помощью методов, реализованных в программе STATISTICA 6.0 в модулях Basic Statistics/Tables, Nonparametric Statistics, Breakdown & one-way ANOVA [Реброва О.Ю., 2002]. Вид распределения данных оценивали по критериям Kolmogorov-Smirnov&Lilliefors и Shapiro-Wilk's. Достоверность межгрупповых различий, в зависимости от задач исследования, определяли по t-критерию Student, критериям Wald-Wolfowits, Mann-Whitney и Kruskal-Wallis. За порог статистической значимости различий принимали уровень 0,05.

Комплексный подход к выявлению фармакологической активности ПП и ТТК осуществляли с использованием факторной схемы эксперимента [Готтс-данкер Р., 1982; Гудвин Д. 2004], метода многомерных группировок данных [Миркин Б.Г., 1985] и многофакторного анализа методом главных компонент (ГК) [Айвазян С.А., 1989; Жуковская В.М., Мучник И.Б., 1976; Харман Г., 1972], реализованного в модуле Principal components & Classification Analysis программы STATISTICA 6.0 [Боровиков В.П., 2003; Реброва О.Ю., 2002].

Данные формировали в массивы с группирующими факторами «Воздействие» и «Защита», формализовано характеризующих влияние неблагоприятных факторов и фармакологическую защиту исследуемыми веществами. При факторизации матриц множественных корреляций выделяли ГК (F„), поглощающие 100% дисперсии массива, а также их минимальное количество, описывающее более 70% дисперсии (как правило, не более 3), по требованиям адекватности статистической модели [Григорьев С.Г., 2003]. Информативные показатели определяли по величинам их факторных нагрузок на ГК равных 0,5 и более [Жуковская В.М., Мучник И.Б., 1976; Бессокирная Г.П., 2000]. По значениям факторных нагрузок на ГК судили о направлении и силе взаимодействия группирующих факторов и их ассоциации (ковариации) с информативными показателями. В координатах ведущих ГК - Fi и F2 формализовано представляли экспериментальных животных, описанных по совокупности показателей, что позволяло дифференцировать группы сравнения и классифицировать их в соответствии с «силой» и направлением группирующих факторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптогенные дозы ПП и ТТК по данным комплексного теста т vivo «охлаждение-плавание» составили соответственно 10 мг/кг и 1 мг/кг. Это следует из формализованного представления животных-биомоделей, охарактеризованных по совокупности показателей: температуры тела в различных точках (tny -правое ухо, 1:лу - левое ухо, t„ - нос, txe - у хвоста) и времени удержания на плаву (Т„л) в координатах F, и F2 (рис. 1).

При этом группы сравнения, получавшие различные дозы ПП и ТТК дифференцировались в зависимости от эффекта. Группа интактных животных (Инт), состояние которых принято за норму, размещалась в положительной области по оси F).

Группа после введения ПП в дозе 100 мг/кг занимала промежуточное положение между контрольной (ХП) и Инт, что отражало максимальный адапто-генный эффект этого соединения (в условиях нашего эксперимента). Поскольку адаптогенное действие ПП в дозе 10 мг/ кг при формализованном представлении «поглощало» две другие дозы нами была выбрана меньшая доза -10 мг/кг.

10 мг/кг

~ - У

- к

I „ 100 мг/кг

/ •*'Л У' •

V

F,: 56 %

Рис. 1. Выявление адаптогенных доз ПП (а) и ТТК (б) по результатам многофакторного анализа совокупности показателей in vivo. Обозначения: Fu - ГК, точками представлены объекты групп сравнения

В случае ТТК все группы, получавшие дозировки 1, 10 и 100 мг/кг, по местоположению в координатах ГК не совпадали с контролем (группа ХП). За наиболее эффективную адаптогенную дозу данного вещества была принята 1 мг/кг, исходя из максимальной приближенности локализации группы ТТК 1 мг/кг к состоянию нормы (Инт). В дальнейших исследованиях на крысах применяли дозировку 5 мг/кг для ПП и 0,5 мг/кг для ТТК, с учетом коэффициента пересчета равноэффективных доз, равного 0,5 [Волчегорский И.А., 2000].

С целью подтверждения адаптогенного действия установленных доз ПП и ТТК в сопоставлении с препаратом сравнения, в эксперименте на крысах моделировали комбинации неблагоприятных и патогенного факторов (ХП и ТХП). Сообщества точек, формализовано представляющих животных по совокупности показателей tny, t^, tH, txo, Тпл в группах сравнения, располагались на плоскости координат F, и F2 (рис. 2) в соответствии со спецификой взаимодействия факторов «Защита» и «Воздействие», которые были ориентированы вдоль оси ведущей Fb

При этом вектор «Защита» противодействовал вектору «Воздействие», возвращая группы с введением Ж+Глу, ПП и ТТК в состояние близкое к условной «норме» (приближая к локализации интактной группы), что свидетельствует о повышении резистентности организма к неблагоприятным условиям и доказывает наличие адаптогенных свойств исследуемых веществ.

В результате взаимодействия факторов фармакологической защиты (ЯК+Глу, ПП и ТТК) с фактором неблагоприятного воздействия проявляется новое состояние животных-биомоделей - «состояние резистентности», которое не идентично ни интактному, ни у контрольных групп (ХП и ТХП).

в)

Защита

, ' хп пгъ

тхгГ^^Г-—Л^тхппп"^,

F, : 70 %

Воздействие

F, : 64%

F,: 6В %

Рис. 2. Проявление адаптогенного эффекта ЯК+Глу (а), ПП (б) и ТТК (в) по результатам многофакторного анализа совокупности значений показателей in vivo. Обозначения: Fu - ПС, точки представляют животных в группах сравнения; стрелками указаны векторы группирующих факторов; маркировка групп сравнения (здесь и на рис. 3-5, в таблицах 1-3): Инг - интактные животные; ХП - контроль (группа охлаждение-плавание); ТХП - контроль (группа токсикант-холод-плавание); группы с фармакологической защитой - первые буквы (ХП, ТХП) указывают вид неблагоприятного воздействия, а последующие - тип фармакологической защиты

Адаптогенный эффект ПП и ТТК сопровождается перестройками в анти-оксидантой системе (АОС) и восстановлением баланса прооксидантно-антиок-сидантного статуса организма крыс, что следует из результатов сравнительного анализа интенсивности CP-процессов, накопления вторичных продуктов ПОЛ, каталазной и антирадикальной активности при действии комбинаций неблагоприятных и патогенного факторов, вызывающих гиперпродукцию CP (табл. 1).

Под влиянием неблагоприятных и патогенного факторов наблюдалась активизация СР-реакций (достоверное увеличение на 29% - при ХП; ImlI на 33% и £эо на 68% - при ТХП) и процессов ПОЛ (повышение МДА на 19% - при ХП; на 77% при - ТХП). Гиперпродукция СР сопровождалась снижением Кс (на 19% -при ХП и на 24% - при ТХП), тенденцией к уменьшению К„ на 25% при ТХП и снижению АРА (на 14% - при ХП и на 20% - при ТХП), что свидетельствует о сдвиге динамического равновесия в прооксидантно-антиокси-дантном статусе организма крыс в сторону прооксидантов с ослаблением антиоксидантной защиты не только на уровне целостного организма, но и в тканях сердца и печени.

Препарат сравнения ЯК+Глу способствовал активизации антиоксидантной защиты у здоровых животных (увеличение Кс на 32% и АРА на 10%) и при сочетаниях неблагоприятных воздействий (повышение Кс на 19% и АРА на 14% - при ХП; Кс на 24% - при ТХП), что указывает на участие каталазы сердца при реализации кардиопротекторного действия, установленного ранее другими авторами в эксперименте и клинике [Брюшинина О.С. и др., 2006; Киселева A.A., 2008; Савиных Е.А., 2004; Слобожанинова Е.В., 2004; Трифонова О.Ю., Хазанов В.А., 2006]. При этом не отмечено интенсификации СР-процессов и накопления МДА, не смотря на действие неблагоприятных факторов. Активизация каталазы миокарда, на наш взгляд, является элементом адаптогенного эффекта ЯК+Глу в условиях повышенной нагрузки на сердечно-сосудистую систему и гиперпродукции СР.

ПП и ТТК в условиях «нормы» способствовали снижению Ккр, как интегрального показателя эффективности антиоксидантной защиты (на 25% - в случае ПП и на 21% - ТТК), наряду с увеличением каталазной активности печени и почки (К„ на 45% и Кпчк на 55% при введении ПП; К„ на 53% и К„,к на 43% -ТТК), что расценивалось нами как отклик АОС в органах, ответственных за биотрансформацию и элиминацию.

Следовательно, незначительная активизация СР-процессов, установленная у животных этих групп (увеличение Imu на 21% и тенденция к повышению Изо на 11% при введении ПП; увеличение Imal на 21% и тенденция к повышению Езо на 13% - при введении ТТК), не носит негативный характер и не вызывает дисбаланс в прооксидантно-антиоксидантной системе.

При остром охлаждении и предельной физической нагрузке ПП и ТТК оказывают антиоксидантное действие, заключающееся в сохранении АРА плазмы крови крыс на уровне «нормы», увеличении К„ (на 32% при введении ПП и на 53% - при введении ТТК) с предотвращением чрезмерной интенсификации СР-процессов и накопления вторичных продуктов ПОЛ.

В условиях действия токсиканта, являющегося инициатором цепи СР-реакций, антиоксидантный эффект ПП и ТТК состоял в устранении гиперактивации прооксидантной системы (снижение Im„ на 13%, £3о на 32% и МДА на 27 % - под влиянием ПП; 1ти на 19%, на 31% и МДА на 46 %- под влиянием ТТК), и восстановлении динамического равновесия между Отдельными звеньями прооксидантно-антиоксидантной гомеостатической системы (снижение интенсивности продукции СР-радикалов, содержания МДА и уменьшения каталазной активности печени (тенденция к уменьшению К„ на 25% под влиянием ПП

Таблица 1

Влияние исследуемых веществ на проксидантно-антиоксидантный статус экспериментальных животных в условиях действия неблагоприятных и патогенного факторов

Группы сравнения (п=5) Показатели (М±95%ДИ)

МДА, нмоль/мл 1шах, 103имп/с 103имп/с АРА, отн. ед. Ккр, нг-атом Охмин"'хмг белка"1 К« нг-атом Охмин"'хмг белка"1 К„чк-, нг-атом Охмин'хмг белка"1 К„, нг-атом Охмин'хмг белка"1

Инт 4,4±0,2 136111 26951253 0,051+0,005 323165 10381140 25761491 12671299

ХП 5,210,7* 152±22 34711590* 0,04410,007 3491138 8371201* 25741737 1136+381

ТХП 7,811,7* 181135* 454311304* 0,04110,008* 335164 7891278* 31131358* 12371260

ИПП 5,010,4 164±11* 29811337 0,055+0,004 242132* 11271182 400011016* 18311229*

ХППП 4,410,1# 14 619 29731580 0,05110,009 3101140 10081390 28891667 1495+390#

тхппп 5,711,1л 157±19л 31111551л 0,05110,003л 325137 10211247 30271656 926+367

иттк 5,1 ±0,4 165+13* 30431423 0,05410,004 254150* 8771184 36921657* 13241356

хпттк 4,2±0,4# 149±28 29341513 0,05110,003# 252151 9161374 32161723 1742±191#

тхпттк 4,2±0,7Л 14б±11л 31241501л 0,04710,003л 3911161 9001356 34311954 8621391Л

И ЯК+Глу 4,910,4 130±9 23201127* 0,05610,003* 264165 1367168* 28111603 14051312

ХП ЯК+Глу 5,8±0,5 140116 28051430# 0,05010,002# 3561168 13191119# 27591189 14321575

ТХП ЯК+Глу 5,6Ю,8Л 146115л 32561481л 0,04510,002 313119 10951333Л 28921491 12711153

Примечания (здесь и в таблицах 2 и 3): М - среднее арифметическое; ДИ - доверительный интервал; *- р<0,05 по сравнению со значениями у животных интактной группы, # - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы ХП, Л - - р<0,05 по сравнению со значениями у животных контрольной группы ТХП.

и достоверное снижение на 30% - под влиянием ТТК) с приближением антирадикальной активности плазмы крови к уровню «нормы»).

Следовательно, антиоксидантное действие ПП и ТТК реализуется с участием антирадикального эффекта при гиперпродукции кислородных форм CP и активизации компонентов АОС, не уступая по эффективности антиоксидант-ным свойствам эталонного препарата ЯК+Глу.

Влияние ПП и ТТК на систему окисления ЯК, играющей ведущую роль при энергообеспечении адаптации организма животных и человека к условиям окружающей среды [Ивницкий Ю.Ю., 1998; Кондрашова М.Н., 1987; Лукьянова Л.Д., 2001; Мазина Н.К., 2007] в лимфоцитах и тканях внутренних органов, свидетельствует об их полиорганном энергопротекторном действии.

Согласно данным цитохимического анализа, регулирующее действие ПП и ТТК на процессы энергопродукции в лимфоцитах реализуется посредством структурно-функциональных преобразований МХ-ретикулума (табл. 2) в условиях «нормы», при комбинациях неблагоприятных факторов физической природы и в условиях патологии печени (острого СС14-гепатита).

Неблагоприятные воздействия вызывали гиперактивацию СДГ в лимфоцитах, и, возможно, набухание МХ, согласно тенденции к увеличению S на 8%, - при ХП и достоверному повышению S на 18% - при ТХП без изменения Q от уровня интактной группы, что, по-видимому, является экстренным механизмом активизации иммунокомпетентных клеток при состоянии организма, сопряженном с повышенной потребностью в энергии.

Таблица 2

Влияние исследуемых веществ на показатели СДГ-активности лимфоцитов периферической крови экспериментальных животных в зависимости от неблагоприятных и патогенного факторов

Группы сравнения (п=5) Показатели активности (М+95%ДИ)

Q, депозитов в 50 лимфоцитах S, мкм2

Инт 212±110 0,19±0,01

ХП 228+68 0,21+0,01

ТХП 288+81 0,22±0,04*

ИПП 798+96* 0,18+0,01

хппп 398±99# 0,18±0,01#

ТХП ПП 240+25 0,18±0,01А

И ТТК 220+36 0,21 ±0,01*

ХПТТК 218+81 0,18±0,03#

ТХП ТТК 220+83 0,19±0,01А

И ЯК+Глу 424±175* 0,18±0,01

ХП ЯК+Глу 181±60 0,20±0,02

ТХП ЯК+Глу 251+98 • 0,18±0,01л

ПП, аналогично ЯК+Глу, активизируют процессы энергетического обмена иммунокомпетентных клеток в условиях «нормы» (увеличение <2 на 276% и на 89%, соответственно, без изменения в) и препятствуют гиперактивации СДГ при действии неблагоприятных факторов, согласно приближению значений показателей и Б к уровню таковых у интактных крыс.

Специфика энергопротекторного действия ТТК проявляется в активизации биогенеза МХ лимфоцитов у здоровых животных (увеличение 8 на 9% с сохранением значения <3 на уровне «нормы») и ограничении гиперактивации СДГ при неблагоприятных воздействиях (снижение Б на 14% - при ХП и на 15% - при ТХП с сохранением структурно-функциональной организации МХ-ретикулума).

Наряду с этим, ПП и ТТК оказывали существенное влияние на сукцина-токсидазную активность тканей внутренних органов. Скорости окисления эндогенных субстратов (V,) и экзогенной ЯК (УЯ1С), а также показатель регулирующего действия экзогенного субстрата на функциональную активность МХ сердца, печени и почки (СД) изменялись в интактном состоянии и при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов (табл. 3).

Препарат сравнения ЯК+Глу в интактном состоянии снижает интенсивность окисления эндогенных субстратов (уменьшает V, на 19%) и активизирует систему окисления ЯК в МХ сердца (увеличение Уяк на 71% и СД на 113%), что при неблагоприятных факторах способствует повышению регулирующего влияния экзогенной ЯК на СДГ ткани сердца (повышению СД на 69% - при ТХП) с сохранением пула эндогенных субстратов. Данный эффект, по нашему мнению, является элементом реорганизации системы окисления ЯК в МХ сердца при реализации энергопротекторного и кардиопротекторного свойств ЯК+Глу, описанных другими авторами.

В печени ЯК+Глу вызывает активизацию системы окисления ЯК в условиях «нормы» (увеличение V« на 49% и СД на 59%) и при неблагоприятных факторах физической природы (увеличение У,к на 47% и СД на 29%).

В почке препарат сравнения снижает регулирующее действие экзогенного сукцината на СДГ при постоянстве пула эндогенных субстратов у здоровых животных (уменьшение V.« на 24% и СД на 51%), которое сохраняется при комбинациях неблагоприятных факторов (снижение \ж на 34% и СД на 42% -при ХП; уменьшение У,* на 29% и СД на 39% - при ТХП), то есть оказывает оптимизирующее влияние, заключающееся в более экономном расходовании энергетических ресурсов, что подтверждает нефропротекторное действие ЯК+Глу, установленное в эксперименте [Захарова С.Г., 2008].

ПП в условиях «нормы» в сердце активизируют окисление эндогенных субстратов и экзогенной Ж (повышение V, на 31% и У„к на 62%), а при обеих комбинациях неблагоприятных факторов способствует увеличению регулирующего действия экзогенной ЯК на СДГ (повышение Уяк на 29% и СД на 68% - при ХП; возрастание У„к на 82% - при ТХП), аналогично ЯК+Глу, и преодолению энергодефицитного состояния, вызванного неблагоприятными воздействиями.

В печени активизирующее влияние ПП на процессы тканевого окисления и у здоровых крыс (увеличение V, на 32%, Уяк на 62% и СД на 22%), и при действии неблагоприятных факторов (повышение V, на 23%, У„к на 48% и СД на 21% - при ХП; V, на 25%, У,к на 82% и СД на 37% - при ТХП) превосходило аналогичный эффект ЯК+Глу.

На уровне МХ почки ПП уступали препарату сравнения, снижая регулирующее действие ЯК на СДГ при сохранении пула эндогенных субстратов только в «норме» (повышение Уэ на 106% и Уяк на 46%, р=0,005 с уменьшением СД на 30%) и при действии токсиканта (тенденция к повышению V, на 15%, р=0,06 и снижение СД на 32%).

Таблица 3

Влияние исследуемых веществ на тканевое окисление энергетических субстратов (эндогенных и экзогенной ЯК) в условиях действия неблагоприятных и патогенного факторов на организм экспериментальных животных

Группы сравнения (п=5) Показатели сукцинатоксидазной активности (М±95%ДИ)

ткани печени ткани почки ткани сердца

V,, нг-атом Охмин"1 хмг белка"1 Уяк, нг-атом Охмин"1 хмг белка"1 сд, отн.ед. нг-атом Охмин'1 хмг белка"1 Уяк, нг-атом Охмин"'хмг белка"' сд, отн.ед. нг-атом Охмин'1 ХМГ белка"' \',к, нг-атом Охмин"'хмг белка"' сд, отн.ед.

Инт 36,2+2,0 83,219,3 2,310,2 39,2110,9 80,7116,2 2,110,4 45,114,4 95,2112,3 2,1+0,2

ХП 45,4+3,2* 117,7125,3* 2,610,4 55,016,7* 92,1111,9 1,710,2* 35,212,7* 110,1+25,8 3,2±0,8*

тхп 39,513,8 119,5117,3* 2,810,5 65,1116,0* 94,8138,4 1,410,3* 40,514,9 104,2118,2 2,610,7

ипп 48,014,7* 134,6119,6* 2,810,3* 80,917,2* 117,817,8* 1,510,1* 59,2111,6* 120,5143,8* 2,010,5

хппп 55,913,0# 174,0+5,8# 3,110,2# 55,6+5,6 95,5120,1 1,210,2 29,315,2# 141,9119, Ы 5,3+0,5#

ТХП ГШ 33,911,3Л 131,6128,9 3,910,8Л 68,4111,5 74,9115,4Л 1,110,2Л 50,6+5,8Л 189,6+9,2Л 3,9±0,4Л

иттк 55,614,0* 143,3118,6* 2,610,5 79,515,3* 138,917,1* 1,810,1* 44,0112,4 138,8120,5* 3,210,7*

ХПТТК 44,315,0 153,3126,4# 3,510,5# 63,3±4,9# 93,6114,7 1,510,3# 39,119,3 134,9115,2# 3,6±0,9

тхпттк 38,418,6 136,8114,2Л 3,610,5Л 75,0117,9Л 83,9121,6 1,1+0,1л 36,417,0 140,4+26,9Л 4,0±1,1л

И ЯК+Глу 34,314,0 124,0122,5* 2,610,6* 60,515,1* 61,514,9* 1,010,1* 36,7±5,4* 163,0112,9* 4,5±0,6*

ХП ЯК+Глу 51,619,9« 173,4125,4# 3,3+0,9# 63,5+11,1 60,818,3# 1,010,2# 38,6+3,7 129,018,7 3,4+0,3

ТХП ЯК+Глу 38,4+4,3 119,2135,7 3,110,7 76,715,3Л 67,7+12,1л 0,910,1л 42,614,0 188,4110,8Л 4,4±0,5Л

В MX сердца ТТК повышают регулирующее влияние экзогенного сукци-ната и в интактном состоянии (увеличение Уяк на 46% и СД на 53%), и на фоне комбинаций неблагоприятных факторов (рост У„к на 39% - при ХП; увеличение УЯ1С на 35% и СД на 51 % - при ТХП).

В печени ТТК активизируют окисление энергетических субстратов (эндогенных и экзогенной ЯК) - увеличение Уэ на 53% и VnK - на 72% в интактном состоянии, а также повышают регулирующее действие ЯК при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов (повышение V„K на 30% и СД на 34% - при ХП; увеличение СД на 27% - при ТХП).

В почке ТТК вызывают снижение регуляции активности СДГ, сопровождающееся активизацией процессов окисления энергетических субстратов в условиях «нормы» (увеличение V, на 102% и Уяк - на 72% при снижении СД на 16%), которое сохраняется в условиях комбинаций неблагоприятных и патогенного факторов (увеличение V, на 15% и снижение СД на 14% - при ХП; уменьшение СД на 22% - при ТХП).

Таким образом, ПП корректируют окисление энергетических субстратов в печени и энергодефицитное состояние в сердце при неблагоприятных воздействиях подобно ЯК+Глу, для которого установлено (в клинике и эксперименте) кардиопротекторное действие как неотъемлемый компонент системного полиорганного энергопротекторного действия [Мазина Н.К., 2007].

Введение ТТК здоровым животным, при неблагоприятных воздействиях и в условиях острого гепатита усиливает регуляцию сукцинатоксидазной фракции тканевого дыхания в сердце и печени. Однако по выраженности регулирующего влияния на окислительные процессы в почке ПП и ТТК уступают эталонному препарату ЯК+Глу.

Поскольку наряду с адаптогенным действием ПП и ТТК проявляются и другие позитивные эффекты (антиоксидантный и энергопротекгорный), как на уровне целостного организма (в капиллярной крови), так и на тканевом уровне биологической интеграции (в гомогенатах тканей), для выявления множественных проявлений фармакологической активности исследуемых веществ и обоснования их перспективы в качестве средств с мультифункциональным типом действия понадобился многофакторный анализ единого массива всех полученных нами экспериментальных данных. С этой целью совокупность показателей in vivo и in vitro (tny, t.ly, tH, tIB, Тдл> Ima*» АРА, МДА, Ккр, Kc, К а» ^пчк» Qí

V„c, СДс, V3nJ V„n5 СДи, V3|J4K* ^ЯПЧК1 и СДПЧК), характеризующую влияние ПП, ТТК и ЯК+Глу, исследовали поэтапно методом ГК.

Для выделения ведущих ГК, максимально поглощающих изменчивость экспериментальных данных, матрицы множественных корреляций, полученные для каждого вещества, подвергали пошаговой факторизации [Айвазян С.А. и др., 1989; Дубров A.M. и др., 2000], которая состояла в исключении показателей, оказывающих слабые (<0,5) факторные нагрузки на ГК.

При «сжатии» факторного пространства количество информативных показателей, описывающих свойства исследуемых веществ, сокращалось до 14-17 (58-71% от исходного числа). Их множественные корреляции свидетельствовали о значимом вкладе прооксидантно-антиоксидантной системы, а также процессов энергопродукции в иммунокомпетентных клетках и тканях внутренних

органов в формирование ответной реакции организма на неблагоприятные воздействия и факторы фармакологической защиты.

После факторизации массива данных, отражающих фармакологическую активность ЯК+Глу, количество показателей сократилось до 16 (рис. 3). При этом три первые ГК поглощали 78% дисперсии, что соответствовало критерию адекватности математико-статистической модели [Григорьев С.Г., 2003].

Реципрокные взаимоотношения факторов «Защита» и «Воздействие» (рис. За) и высокие значения их факторных нагрузок на Fi (-0,65 и +0,61 соответственно) с преобладанием величины проекции вектора «Защита» над проекцией вектора «Воздействие» (на 7%) свидетельствовали о способности препарата ЯК+Глу создавать «резерв адаптации» с привлечением устойчивости к действию низкой температуры, антиоксидантной защиты, процессов окисления энергетических субстратов в тканях сердца, печени и почки. Перестройка систем энергопродукции под действием ЯК+Глу в интактном состоянии, установленная in vitro, на наш взгляд, неизменно обеспечивает повышение резистентности организма крыс к экспериментальным контролируемым факторам (неблагоприятным и их комбинации с патогенным), согласно показателям in vivo.

Pyjny / \ > \ ' \ i Уяпчк у ' x's \ С - - • Imaá

\ -Vv* NíJcCflc t floie^DCmec/e * J Л / / эрчк

И ЯК+Глу

-1.0 -O.S 0.0 0,3 1.0 -5-5-4-3-2-101234

F,: 43 % Fi: 43 %

Рис. 3. Проявление адаптогенных свойств ЯК+Глу по результатам многофакторного анализа совокупности информативных показателей, характеризующих разные функциональные системы in vivo и in vitro. Обозначения: Fi-г - ГК, а) факторные нагрузки параметров-откликов и входящих факторов на ГК, • - параметры-отклики, в - входящие факторы; 6) дифференциация групп сравнения в координатах Fi и F2, остальные обозначения - как на рис. 2

При представлении экспериментальных животных в виде сгущений точек в координатах ГК наблюдали четкую дифференциацию групп сравнения в зависимости от типа внешнего воздействия на организм (рис. 36). Контрольные группы ХП и ТХП, животные которых были подвергнуты соответствующим комбинациям неблагоприятных воздействий, продвигались в отрицательную область вдоль Fi. Введение препарата сравнения ЯК+Глу обеспечивало «сдвиг» сообществ точек, представляющих группы И ЯК+Глу, ХП ЯК+Глу, ТХП ЯК+Глу по оси F2 в положительную область к проекциям интактной группы, что свидетельствует об активном и одновременном вовлечении энергетических процессов в клетках иммунной системы и внутренних органах, а также прооксидантно-антиоксидантной системы в обеспечение адаптивного ресурса, достаточного для устойчивости ор-

ганизма, что согласуется с литературными данными о системных проявлениях фармакодинамики ЯК+Глу [Мазина Н.К., 2007].

Аналогичный поэтапный многофакторный анализ совокупности показателей, отражающих адаптогенные свойства ПП, позволил обосновать их фармакологическую перспективу (рис. 4). При «сжатии» факторного пространства массива данных оставалось 17 информативных показателей (рис. 4а), а выделенные первые три ГК поглощали 72% дисперсии.

Способность ПП фармакологически нивелировать негативные последствия тестирующих воздействий проявлялась аналогично ЯК+Глу - «сила» ответной реакции на введение ПП (-0,60 - вектор «Защита») превышала «силу» отклика на неблагоприятные воздействия (+0,56 - вектор «Воздействие») на 7%, согласно соотношению значений проекций группирующих факторов на р1.

В соответствии с ассоциацией информативных показателей с вектором «Защита», введение ПП при неблагоприятных воздействиях активизировало ан-тиоксидантную защиту на уровне целостного организма и в тканях внутренних органов, процессы энергопродукции в МХ лимфоцитов, окисление энергетических субстратов в тканях печени и почки, а также сохраняло терморегуляцию.

а) 6)

-1,0 -0,3 0,0 0,5 1,0 4444-101134EI

F|: 39 % F,: 39 %

Рис. 4. Проявление адаптогенных свойств ПП по результатам многофакторного анализа совокупности информативных показателей, характеризующих разные функциональные системы in vivo и in vitro.. Обозначения - как на рис. 4

При представлении крыс в координатах ГК наблюдали четкую дифференциацию групп сравнения (рис. 46). Продвижение сообщества точек И ПП вдоль оси Fi от интактной группы в направлении, противоположном вектору «Воздействие», свидетельствовало о позитивном действии ПП на организм крыс, осуществляемое с вовлечением терморегуляции и АОС, MX лимфоцитов, печени и почки, которое способствует реализации адаптогенного эффекта. Адаптогенные свойства ПП проявлялись неспецифично при обеих комбинациях неблагоприятных факторов, поскольку скопления точек, представляющие группы ХП ПП и ТХП ПП, частично совпадали и «приближались» к интактной.

Анализ матрицы множественных корреляций информативных показателей in vivo и in vitro, полученных при введении ТТК в качестве фармакологической защиты (рис. 5), показал, что первые три из выделенных ГК поглощали 75% дисперсии массива данных. При этом адаптогенное действие ТТК по «си-

ле» эффекта превосходило аналогичное у ЯК+Глу и ПП, поскольку значение проекции вектора «Защита» на Р| (+0,53) превышало значение проекции вектора «Воздействие» на Р2 (-0,48) на 10% (рис. 5а).

При формализованном представлении экспериментальных животных условными точками в системе координат Р| и Р2 группы сравнения дифференцировались в зависимости от влияния неблагоприятных факторов и ТТК (рис. 56). Значительное отдаление сообщества точек И ТТК от расположения интактной группы в положительную область по оси Р2 свидетельствует о позитивном влиянии ТТК на организм крыс в условиях «нормы», заключающемся в активизации АОС, энергопродукции в МХ тканей печени и почки.

'jto3dejjcmeu^ Тпл \ т \ 1 \ 1 \ и \ f V i \ tnv 1

\Ht—rj? \ Imax \ i,,Vn'fAPA/ к У"п / •

-1,0 .0.S 0,0 0,5 1,0 F,: 41 %

Рис. 5. Проявление адаптогенных свойств ТТК по результатам многофакторного анализа совокупности информативных показателей, характеризующих разные функциональные системы in vivo и in vitro. Обозначения - как на рис. 4

Введение ТТК, не смотря на последующие неблагоприятные воздействия, вызывало формирование устойчивого состояния резистентности организма крыс, о чем свидетельствовало совпадение расположения «групп» ХП ТТК, ТХП ТТК и интактной, полностью дифференцированных от контрольных групп ХП и ТХП. Следовательно, адаптогенное действие ТТК, также как и у ПП, проявлялось неснецифично при обеих комбинациях неблагоприятных факторов.

Таким образом, адаптогенное действие ПП и ТТК в виде одновременной реализации их антиоксидантных и энергопротекторных свойств сопоставимо с аналогичным эффектом препарата сравнения ЯК+Глу, для которого подробно описаны системные проявления фармакодинамики и их механизмы [Брюшини-на О.С. и др., 2006; Васильев К.Ю., 2005; Воробьева В.В., 2006; Захарова С.Г. и др., 2006; Киселева A.A. и др., 2006; Маевский Е.И. и др., 2001; Мазила Н.К. и др., 2005; Мазина Н.К., 2007; Тимофеев М.С. и др., 2006; Трифонова О.Ю., Ха-занов В.А. и др., 2004; Хазанов В.А., 2006]. Множественные проявления фармакологической активности ПП и ТТК являются основанием для рекомендации их дальнейшей разработки в качестве полифукциональных лечебно-профилактических средств, сочетающих адаптогенное действие с антиоксидантными свойствами и способностью регулировать энергетический обмен в разных системах организма при воздействии неблагоприятных и патогенного факторов.

ВЫВОДЫ

1. Полипренолы и тритерпеновые кислоты из хвои пихты обладают широким спектром адаптогенного действия, заключающегося в их способности повышать устойчивость организма экспериментальных животных к холоду, физической нагрузке и действию гепатотоксического вещества - четыреххлори-стого углерода.

2. Установлено, что для мышей в условиях комбинации острого охлаждения и предельной физической нагрузки максимально эффективная адаптоген-ная доза полипренолов составляет 10 мг/кг, тритерпеновых кислот -1 мг/кг.

3. Полипренолы и тритерпеновые кислоты в дозах, проявляющих адапто-генные свойства, обладают антиоксидантным действием, которое обусловлено их способностью активизировать антиоксидантную защиту (антирадикальную активность плазмы и катапазу крови, тканей внутренних органов) и устранять избыточную интенсификацию прооксидантной системы (свободно радикальные процессы и накопление малонового диальдегида в плазме крови) при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов. По эффективности антиокси-дантного действия при сопоставлении с эталонным препаратом они располагаются в следующем порядке: ТТК > ПП >ЯК+Глу.

4. Полипренолы и тритерпеновые кислоты оказывают протективное действие на системы энергопродукции лимфоцитов, тканей сердца, печени и почки в условиях комбинаций неблагоприятных факторов и острого токсического гепатита. Этот эффект реализуется на уровне сукцинатзависимого окисления в митохондриях лимфоцитов и тканей внутренних органов.

5. По выраженности адаптогенного действия, в реализацию которого вовлекаются антиоксидантный эффект и способность регулировать энергетические процессы, связанные с сукцинатзависимым окислением, полипренолы и тритерпеновые кислоты в сравнении с эталонным препаратом располагаются следующим образом: ТТК > ПП = ЯК+Глу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленное в эксперименте адаптогенное действие полипренолов с одновременной реализацией антиоксидантных и энергопротекторных свойств позволяют рекомендовать сумму полипренолов и сумму тритерпеновых кислот из хвои пихты в качестве фармацевтических субстанций для разработки препаратов, корректирующих патологические состояния, сопровождающиеся дизре-гуляцией энергетического обмена и окислительным стрессом.

2. При изучении фармакологической активности новых соединений и извлечений из растительного сырья, а также веществ с уже известными свойствами целесообразным является применение многофакторного анализа к совокупности показателей, отражающих функциональное состояние различных систем организма, что позволяет формализованно оценивать «силу» каждого из внешних воздействий (неблагоприятного, патогенного и фармакологической защиты), а также эффекты их взаимодействий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние терпеноидов пихты на организм животных / Т.В. Хуршкайнсн, Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.B. Кучин // И International Conference "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives". - Алма-ата, 2007. -C.I36.

2. Исследование адаптогенных свойств экстрактивных веществ древесной зелени пихты в опытах на животных/ Т.В. Хуршкайнен, Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.B. Кучин // Материалы региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений». - Казань, 2007. - С. 57-59.

3. Скрининг фармакологически активных веществ по протективному воздействию на разных уровнях биологической интеграции при сочетании стресси-рующих факторов / Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.B. Кучин // Химия и медицина: Тезисы докладов VI Всероссийского научного семинара с Молодежной научной школой. - Уфа: Гилем, 2007. - С. 54.

4. Скрининг фармакологически активных соединений по состоянию энергетических и свободнорадикальных процессов в организме / Н.К. Мазина, Е.М.Карпова, П.И. Цапок, A.A. Косых, Е.В. Новичков, В.Г. Хоробрых, С.А. Караваев, A.B. Караваева, A.C. Чигарских, Н.В. Мазин, О.Г. Новоселова, Т.В. Хуршкайнен, И.Ю. Чукичева, A.B. Кучин, И.В. Шешунов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии». - Киров, 2007. - С. 124-125.

5. Необходимость фармакологической регуляции энергетического обмена в критических состояниях / Н.К. Мазина, В.П. Сухорукое, Т.В. Абрамова, Е.М. Карпова, Н.В. Жуйков // Материалы I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине». - Курск, 2008.-С. 158-160.

6. Оценка адаптивных свойств экстрактивных веществ древесной зелени пихты по параметрам функциональной активности гомеостатических систем in vivo и in vitro / Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, О.Г. Новоселова, A.C. Чигарских, A.B. Кучин, И.В. Шешунов // Вятский медицинский вестник, 2008. - №1. - С 35-41.

7. Оценка адаптивных свойств экстрактивных веществ древесной зелени пихты. 2 Влияние на энергетические процессы ш vivo и in vitro / Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.A. Косых, О.Г. Новоселова, A.C. Чигарских, Н.В. Мазин, Е.В. Новичков, В.Г. Хоробрых, A.B. Кучин, И.В. Шешунов // Вятский медицинский вестник, 2008. - №2. - С. 18 - 27.

8. Разработка препаратов, обладающих антиоксидантным действием и гемореоло-гической активностью на основе полусинтетических терпенофенолов и их производных / A.B. Кучин, Е.В. Буравлёв, И.А. Дворникова, A.A. Коро-лева, Ю.С. Матвеев, H.H. Скрипова, И.В. Федорова, Т.В. Хуршкайнен, И.Ю. Чукичева, Н.К. Мазина, И.В. Шешунов, Е.М. Карпова, М.Б. Плотников // Сборник тезисов Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развитая научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». - Москва, 2008. - С. 121.

9. Синтез хиральных и полифункциональных производных природных изопре-ноидов и порфиринов с целью получения новых физиологически активных веществ на основе комплексной переработки растительного сырья / A.B. Кучин, Д.В. Белых, Е.В. Буравлёв, И.А. Дворникова, A.A. Королева, М.В. Маль-

шакова, Ю.С. Матвеев, H.H. Скрипова, И.С. Тарабукина, И.В. Фе-дорова, Л.Л. Фролова, Т.В. Хуршкайнен, И.Ю. Чукичева, С.А. Рубцова, И.В. Логинова, Е.В. Ашихмина, A.B. Тимшина, Д.В. Судариков, Ю.В. Крымская, Н.К. Мазина, И.В. Шешунов, Е.М. Карпова // Сборник тезисов Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». - Москва, 2008. - С. 171 - 172. 10.Системный подход к выявлению фармакологической активности новых соединений на разных уровнях биологической интеграции организма / Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.B. Кучин // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. I Под ред. М.В. Гаврилина / Пятигорская ГФА. - Пятигорск, 2008. - Вып. 63. - С. 425-426. 11 .Биологическая активность терпеноидов, полученных эмульсионной экстракцией из древесной зелени ели, пихты и березы / И.Г.Широких, С.Ю. Огород-никова, A.A. Широких, Е.М. Карпова, Т.В. Хуршкайнен // Агрохимия, 2008. -№10.-С. 1-8.

12.0ценка фармакологических свойств и механизмов действия полипренолов из древесной зелени пихты по результатам многофакторного анализа / Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.B. Кучин, И.В. Шешунов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2008. - Специальный выпуск «XIII Конгресс «Экология и здоровье человека». - Т. 2. - С. 222 - 226. 13.Тритерпеновые кислоты из древесной зелени пихты - перспективное профилактическое средство коррекции экологического неблагополучия / Е.М. Карпова, Н.К. Мазина, A.B. Кучин, И.В. Шешунов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2008. - Специальный выпуск «XIII

Конгресс «Экология и здоровье человека». - Т. 2. - С. 227 - 232.

♦ * *

Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю д.м.н. Н.К. Мазиной за неоценимую помощь в организации исследований, содействие в обработке, интерпретации и публикации полученных результатов, а также постоянную и всестороннюю поддержку при выполнении диссертационной работы.

Выражаю глубокую признательность своему научному консультанту чл.-корр. РАН, д.х.н. A.B. Кучину за помощь в организации данной работы и ценные рекомендации при выборе объектов исследования.

Искренне благодарю зав. кафедрой патологической анатомии с секционным курсом ГОУ ВПО Кировская ГМА, к.м.н., Е.В. Новичкова и ассистента В.Г. Хоробрых за морфометрию цитохимических препаратов.

Также выражаю благодарность зав. кафедрой медицинской биохимии ГОУ ВПО Кировская ГМА, д.м.н. П. И. Цапоку за проведение исследований интенсивности Fe2*-индуцированной хемилюминесценции и содержания МДА в плазме крови.

Выражаю искреннюю признательность О.Г. Новоселовой и A.C. Чигарских за участие и неоценимую помощь при работе с экспериментальными животными и го-могенатами тканей их внутренних органов.

Искренне благодарю сотрудников лаборатории лесохимии Института химии Коми НЦ УрО РАН к.х.н. Т.В. Хуршкайнен, к.х.н. A.A. Королеву, и к.х.н. И.Ю. Чукичеву за ценные рекомендации и всестороннее содействие при выделении и идентификации исследуемых веществ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОС антиоксидантная система

АРА антирадикальная активность

ГК главная компонента

Инт интактная группа животных, организм которых не подвергался

действию неблагоприятных факторов и исследуемых веществ

Ккр каталазная активность крови

к„ каталазнал активность ткани печени

Кпчк каталазная активность ткани почки

Кс каталазная активность ткани сердца

МДА малоновый диальдегид

мх Митохондрии

пп сумма полипренолов из хвои пихты

ПОЛ перекисное окисление липидов

сд коэффициент стимуляции дыхания гомогената ткани

сдг Сукцинатдегидрогеназа

СР свободные радикалы

ТТК сумма тритерпеновых кислот из хвои пихты

ТХП группа животных подвергнутых комбинации острого охлаждения и

предельной физической нагрузки на фоне острого ССЦ-гепатита

ХП группа животных с последовательным моделированием острого

охлаждения и предельной физической нагрузки

як янтарная кислота

ЯК+Глу комбинация янтарной и глутаминовой кислот

1тах максимальная интенсивность свечения индуцированной

хемилюминесиенггии

суммарное количество гранул формазана в 50 лимфоцитах

8 площадь гранул формазана

^лу температура в левой ушной раковине

1„ температура носа

^пу температура в правой ушной раковине

температура под хвостом у анального отверстия

V, скорость эндогенного дыхания

V у як скорость дыхания при окислении экзогенного субстрата

1зо светосумма свечения индуцированной хемшиоминесцелции за

30 секунд

Отпечатано в типографии Кировской ГМА, г. Киров, ул. К. Маркса, 112. Тираж 100. Заказ 597.

Не смотря на разнообразие современных принципов создания лекарственных средств, поиск перспективных соединений среди веществ растительного происхождения, продолжает оставаться одним из основополагающих при разработке высокоэффективных и безопасных лечебно-профилактических препаратов [57, 77, 115, 198].

Пихта сибирская (Abies sibiricci) относится к уникальному источнику соединений, влияющих на процессы, протекающие в живых организмах. Экстрактивные компоненты из хвои пихты обладают биологической активностью, которая давно известна в народной медицине [41, 121, 209] и научно доказана в отношении многих видов микроорганизмов, растений, животных [24, 73, 100, 147, 150, 185, 208, 213, 256, 272, 280].

В литературе последних лет среди экстрактивных веществ хвои пихты большое внимание уделяется сумме полипренолов, для которых известны такие виды фармакологической активности, как противовирусная, иммуномодули-рующая, противоязвенная, противоопухолевая, гипотензивная, гепатопротек-торная, кардиопротекторная и другие [45, 48, 49, 70, 97, 99, 112, 148, 149, 151, 159, 166, 200, 234, 260, 275, 282, 285]. В большинстве работ изучался только один из специфических видов фармакологической активности полипренолов. Хотя из установленных позитивных эффектов полипренолов при различных типах патологических процессов следует высокая вероятность одновременного проявления уже известных и еще не описанных видов их фармакологической активности. Это может стать основанием для разработки принципиально новых мультифункциональных лекарственных средств.

Наряду с полипренолами, перспективным компонентом хвои пихты является сумма тритерпеновых кислот ланостанового ряда, содержащаяся в достаточно большом количестве (около 3% от веса сухого сырья) и не встречающаяся у других хвойных растений (сосна, ель, лиственница), принадлежащих к тому же ботаническому семейству (Pinaceae) [73, 193, 202, 250, 251]. Тритерпеновые кислоты имеют структуру, подобную стероидным гормонам, а стереохимия их молекул сходна с таковой у физиологически активных ланостаноидов - метаболитов морских организмов [73, 135]. Можно предположить, что данные соединения также будут обладать различными видами фармакологической активности. Но сведения об их биологической активности весьма ограничены, а влияние на организм животных в норме и при патологии еще не изучалось. В связи с этим, изучение полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты с целью создания на их основе эффективных и безопасных препаратов, весьма актуально.

Природные вещества обладают широким спектром фармакологической активности [41, 256, 280]. Поэтому для изучения действия на организм препаратов природного происхождения необходим системный подход, обеспечивающий анализ совокупности изменений разнокачественных физиологических показателей. В последние годы для решения подобных задач стала активно внедряться в медицину и, в частности, в фармакологию [44, 110, 199] системная методология научных исследований в виде алгоритмов многомерного матема-тико-статистического анализа и моделирования, успешно зарекомендовавшая себя в экономике, социологии, политологии и психологии [46, 56, 60, 95, 119].

Цель нашей работы состояла в изучении множественных проявлений фармакологической активности суммы полипренолов и суммы тритерпеновых кислот из хвои пихты в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Определить диапазон адаптогенных доз полипренолов и тритерпеновых кислот по способности повышать устойчивость организма к комбинации неблагоприятных факторов (холода и предельной физической нагрузки).

2. Изучить антиоксидантное действие полипренолов и тритерпеновых кислот в условиях комбинации неблагоприятных и патогенного факторов.

3. Исследовать влияние полипренолов и тритерпеновых кислот на активность процессов энергопродукции в митохондриях лимфоцитов и тканей внутренних органов в норме и при комбинации неблагоприятных и патогенного факторов.

4. Изучить механизмы реализации адаптогенного действия полипренолов и тритерпеновых кислот в сравнении с эталонным препаратом.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые:

- в экспериментах на лабораторных животных изучены проявления фармакологической активности суммы тритерпеновых кислот из хвои пихты;

- обнаружен широкий спектр адаптогенного действия тритерпеновых кислот в виде актопротекторного и хладопротекторного эффектов на фоне острого токсического поражения печени;

- выявлено антиоксидантное действие тритерпеновых кислот и их способность регулировать энергетический обмен в условиях действия неблагоприятных факторов;

- изучено адаптогенное действие полипренолов из хвои пихты в отношении комбинации неблагоприятных факторов (физической и химической природы) и установлены их хладопротекторные и актопротекторные свойства при остром токсическом поражении печени;

- исследовано влияние полипренолов на прооксидантно-антиоксидантный статус организма и установлено наличие антиоксидантных свойств;

- изучено влияние полипренолов на системы энергопродукции печени, сердца, почек и лимфоцитов и показано его вовлечение в реализацию уже известного иммуномодулирующего, кардиопротекторного и гепатопротекторного эффектов этих веществ.

Научно-практическая значимость.

На основании полученных результатов обоснована перспективность использования полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты в качестве фармакологических субстанций для разработки новых лекарственных средств, сочетающих адаптогенный эффект с антиоксидантными свойствами и способностью регулировать энергетический обмен в условиях действия неблагоприятных и патогенного факторов на организм.

Использование комбинации неблагоприятных воздействий (физической и химической природы) позволяет выявлять соединения с широким спектром адап-тогенного действия при скрининге фармакологически перспективных веществ.

Применение факторной схемы эксперимента, методов группировки исходных данных и многофакторного анализа методом главных компонент к совокупности разнородных показателей предоставляет возможность выявлять эффективные адаптогенные дозы, а также изучать разнообразные виды фармакологической активности новых соединений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Полипренолы и тритерпеновые кислоты из хвои пихты обладают широким спектром адаптогенного действия (актопротекторным и хладопротектор-ным, в том числе, и на фоне острой патологии печени);

2. Адаптогенный эффект полипренолов и тритепеновых кислот реализуется с вовлечением процессов энергопродукции в лимфоцитах и тканях внутренних органов (сердца, печени, почки), а также прооксидантно-антиоксидантной системы.

3. Новый подход к изучению фармакологической активности полипренолов и тритерпеновых кислот из хвои пихты с использованием факторной схемы эксперимента, методов группировки исходных данных и многофакторного анализа позволил обосновать их перспективность как адаптогенов, антиоксидантов и средств фармакологической регуляции энергетического обмена.

Реализация результатов исследования. Результаты работы используются при выполнении научных исследований в рамках приоритетного направления «Живые системы» Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Государственные контракты № 02.512.11.2025, № 02.512.12.0011, № 02.512.11.2229).

Алгоритмы планирования эксперимента и математико-статистического моделирования, разработанные в диссертационном исследовании, используются на кафедре физики и информатики ГОУ ВПО Кировская ГМА в научно-исследовательской работе и при чтении курса медицинской статистики.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы доложены на региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений» (Казань, 2007); II Международной конференции "Natural Products: Chemistry, Technology & Medicinal Perspectives" (Алма-Ата, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2007); 63 Научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2008); XIII Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2008), I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008), Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» (Москва, 2008); расширенном заседании кафедр фармакологии; медицинской биологии и генетики; физики, информатики и медицинской техники; биохимии; патологической анатомии с секционным курсом; микробиологии с курсом иммунологии и патологической физиологии ГОУ ВПО Кировская государственная медицинская академия Росздрава (Киров, 2009).

Участие автора в получении научных результатов. Автором лично получены экстрактивные вещества из древесной зелени пихты, осуществлялись работы с экспериментальными животными, проводились исследования фармакологической активности веществ in vitro. Автор самостоятельно изучил литературу, провел статистическую обработку результатов, сделал обобщения, научно обосновал выводы, разработал практические рекомендации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, основных выводов работы и

ВЫВОДЫ

1. Полипренолы и тритерпеновые кислоты из хвои пихты обладают широким спектром адаптогенного действия, заключающегося в их способности повышать устойчивость организма экспериментальных животных к холоду, физической нагрузке и действию гепатотоксического вещества - четыреххлори-стого углерода.

2. Установлено, что для мышей в условиях комбинации острого охлаждения и предельной физической нагрузки максимально эффективная адаптоген-ная доза полипренолов составляет 10 мг/кг, тритерпеновых кислот - 1 мг/кг.

3. Полипренолы и тритерпеновые кислоты в дозах, проявляющих адапто-генные свойства, обладают антиоксидантным действием, которое обусловлено их способностью активизировать антиоксидантную защиту (антирадикальную-активность плазмы и каталазу крови, тканей внутренних органов) и устранять избыточную интенсификацию прооксидантной системы (свободно радикальные процессы и накопление малонового диальдегида в плазме крови) при комбинациях неблагоприятных и патогенного факторов. По эффективности антиокси-дантного действия при сопоставлении с эталонным препаратом они располагаются в следующем порядке: ТТК > 1111 >ЯК+Глу.

4. Полипренолы и тритерпеновые кислоты оказывают протективное действие на системы энергопродукции лимфоцитов, тканей сердца, печени и почки в условиях комбинаций неблагоприятных факторов и острого токсического гепатита. Этот эффект реализуется на уровне сукцинатзависимого окисления в митохондриях лимфоцитов и тканей внутренних органов.

5. По выраженности адаптогенного действия, в реализацию которого вовлекаются антиоксидантный эффект и способность регулировать энергетические процессы, связанные с сукцинатзависимым окислением, полипренолы и тритерпеновые кислоты в сравнении с эталонным препаратом располагаются следующим образом: ТТК > ПП = ЯК+Глу.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Установленное в эксперименте адаптогенное действие полипренолов с одновременной реализацией антиоксидантных и энергопротекторных свойств позволяют рекомендовать сумму полипренолов и сумму тритерпеновых кислот из хвои пихты в качестве фармацевтических субстанций для разработки препаратов, корректирующих патологические состояния, сопровождающиеся дизре-гуляцией энергетического обмена и окислительным стрессом.

2. При изучении фармакологической активности новых соединений и извлечений из растительного сырья, а также веществ с уже известными свойствами целесообразным является применение многофакторного анализа к совокупности показателей, отражающих функциональное состояние различных систем организма, что позволяет формализованно оценивать «силу» каждого из внешних воздействий (неблагоприятного, патогенного и фармакологической защиты), а также эффекты их взаимодействий.