Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии острой респираторной вирусной инфекции при использовании иммуномодуляторов

На правах рукописи

Шишкина Лариса Николаевна

Роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии острой респираторной вирусной инфекции при использовании иммуномодуляторов

14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

- 1 (:!др 1Ш

Новосибирск - 2012

005010991

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Сергеев Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Архипов Сергей Алексеевич

Орловская Ирина Анатольевна Усынин Иван Федорович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ (г. Томск)

Защита диссертации состоится 10 апреля 2012 г. в 10-00 ч. на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при Учреждении РАМН Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117.

Тел/факс: 8(383) 333-64-56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Автореферат диссертации разослан Л- 2012 і

Ученый секретарь

диссертационного совета, пОл'Ьб-К

доктор биологических наук Пальчикова H.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Легкие, помимо своей основной функции газообмена между кровью и воздухом, выполняют в организме многообразные и сложные, так называемые «нереспираторные» функции, которые играют роль в экзо-и эндогенной защите организма в норме и при развитии различных патологических процессов (Зайко H.H., 1996; Максумова З.Х., 2006). Легкие обеспечивают очистку воздуха и крови от вредных примесей, осуществляют детоксикацию, ингибирование и депонирование многих биологически активных веществ, выполняют фибринолитическую, антикоагулянтную, выделительную функции, являются основным органом образования тромбоцитов (помимо красного костного мозга) и секвестрации нейтрофилов, а также биологическим фильтром, выполняющим функции защиты от респираторных инфекционных агентов (Сыромятникова Н.В., 1987; Седов A.A., 2011; Gebb S.A., 1995; Hogg J.C., 1995; Baskaran H., 2000; ZuckerFranklin D., 2000; Doerschuk C.M., 2001; Bums A.R., 2003; Pascual J.L., 2003; Campbell I., 2005; Fuentes R. et al., 2010; Reems J.A., 2010; Rohan K.A., 2011).

В формировании резистентности организма к вирусам, в том числе вирусу гриппа А, большую роль играют факторы врожденного, или антиген-неспецифического, иммунитета в органах дыхания: внеклеточные (термолабильные ß-липопротеины, компоненты слизи и сурфактанта) и клеточные, к которым относятся макрофаги (Мф*), нейтрофилы (Нф) и естественные киллеры (ЕК) (Медуницын Н.В., 2004; Пак С.Г., 2008; Kamps B.S., 2006; Mayer G., 2006). При этом Мф и Нф представляют собой первую линию противовирусной защиты, препятствуя размножению вируса гриппа (ВГ) в клетках-мишенях, тогда как ЕК распознают и уничтожают уже вирус-продуцирующие клетки (Медуницын Н.В., 2004; Мейл Д., 2007; Hawgood S., 2004; Mayer G., 2006). Позже, по мере развития инфекционного процесса подключаются антиген-специфические факторы иммунитета - лимфоциты (Лф) и антитела (АТ) (Абатуров А.Е., 2006; Мейл Д., 2007; Mayer G., 2006).

Резистентность организма к вирусам зависит от функционального состояния его основных физиологических систем, в регуляции которого принимают участие глюкокортикоидные гормоны. Известно, что глюкокортикоиды являются необходимым действующим началом при возникновении стрессовых ситуаций, требующих мобилизации адаптационных возможностей организма (Килесса В.В., 2010; Chrousos G.P., 2005; Grbovic L., 2005; Löwenberg M., 2008).

*Список сокращений - на обороте автореферата.

Однако на фоне стресса в организме человека и животных наблюдается подавление первичного и вторичного иммунного ответа, активизация латентных вирусных инфекций и более тяжелое течение инфекционных заболеваний, в том числе гриппа (Фролов Б.А., 1991; Похилько A.B., 1995; Машковский М.Д., 2010; Villard J., 2006). Полагают, что все эти эффекты могут быть обусловлены повышением уровня циркулирующих глюкокортикоидных гормонов, но при значительном дефиците этих гормонов в организме гуморальный иммунный ответ ингибируется или вообще не развивается (Воробьев А.И., 2005; Насонов Е.Л., 2011; Sheridan J.F., 2000; Frustaci A., 2003).

Глюкокортикоиды широко используются в клинической практике в качестве средств неотложной терапии, для коррекции ряда гипериммунных состояний, а также в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся агранулоцитозом (Воробьев

А.И., 2005; Машковский М.Д., 2010; van der Velden V.H., 1998; Ozkiris A., 2005; Barczyk K., 2010). В отличие от цитостатиков иммуносупрессивные свойства глюкокортикоидов не связаны с митостатическим действием (Дейл М.М., 1998; Машковский М.Д., 2010; Barnes P.J., 1998; Barczyk K., 2010).

Их эффект является результатом подавления разных этапов иммуногенеза: миграции стволовых клеток, взаимодействия Т и В Лф, торможения высвобождения цитокинов из Лф и Мф и других реакций иммунной системы (Фрейдлин И.С., 1998; Машковский М.Д., 2010; Насонов Е.Л., 2011). При этом глюкокортикоиды в высоких дозах могут вызывать ряд побочных эффектов, в том числе понижение сопротивляемости организма различным инфекциям (Машковский М.Д., 2010; Borghetti Р., 2009; Kumar D., 2010).

Вместе с тем, известные иммунодепрессивные и противовоспалительные эффекты глюкокортикоидов не дают однозначного и полного ответа, почему они понижают резистентность организма к инфекционным агентам, в том числе к ВГ, и вызывают осложнения инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно в органах дыхания. Считают, что восприимчивость клеток-мишеней респираторных органов к ВГ определяет развитие инфекционного процесса (Wijburg O.L., 1997; Herold S., 2006, 2008). Однако неизвестно, каким образом повышенный уровень глюкокортикоидов влияет на течение гриппозной инфекции, в целом, и на восприимчивость клеток-мишеней в органах дыхания к ВГ, в частности.

Показано, что количество альвеолярных макрофагов (АМф) и Нф в легких увеличивается в ответ на размножение ВГ в клетках-мишенях (Пак С.Г., 2008; Fujisawa H., 2001; Wareing M.D., 2007; Teske S., 2008). Однако остаются практически

4

не изученными роль АМф и Нф в развитии осложнений, часто возникающих на фоне повышенного уровня глюкокортикоидов в организме, в том числе в понижении резистентности организма к ВГ. Вместе с тем, давно установлено, хотя и остается без должного внимания исследователей, что глюкокортикоиды вызывают ускорение созревания и выход Нф из синусов костного мозга, способствуя возникновению нейтрофилеза в крови (Машковский М.Д., 2010; Страчунский Л.С., 2011; Fukakusa М., 2005). При этом есть доказательства, что избыточное количество циркулирующих Нф удаляется из организма, главным образом, через легкие, которые являются одним из мест их секвестрации и метаболизации (Cohen A.B., 1983; Suwa T. et al., 2001; Burns

A.R., 2003; Pascual J.L., 2003; Rohan K.A., 2011).

Что касается роли Нф в защите организма от ВГ и в развитии инфекционного процесса в легких, то до сих пор она считается спорной и неоднозначной (Пак С.Г., 2008; Fujisawa H., 2001; Tumpey Т.М., 2005; Wareing M.D., 2007; Wang J.P., 2008; Silva M.T., 2010). Кроме того, остается неясным, как изменяется под влиянием глюкокортикоидов численность и функциональная активность АМф и Нф в легких, особенно при последующем заражении ВГ. Важной проблемой является также возможность коррекции с помощью иммуностимуляторов пониженной после введения глюкокортикоидов резистентности организма к ВГ. Также неизвестно, какую роль играет изменение численности и функциональной активности АМф и Нф после введения иммуномодуляторов в разных схемах и дозах до момента инфицирования на формирование резистентности организма к ВГ. В связи с этим, в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Цель исследования. Изучить патогенетическую роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии гриппозной инфекции после предварительного введения экспериментальным животным иммунодепрессантов или иммуностимуляторов.

Задачи исследования:

1. Изучить изменение функциональной активности макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства и перитонеальной полости у крыс под влиянием глюкокортикоидов (на примере преднизолона и кеналога).

2. Определить основные патогенетические параметры осложненного развития инфекционно-воспалительного процесса в модели пониженной резистентности организма к вирусу гриппа, воспроизводимой посредством предварительного введения мышам глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога.

3. Исследовать функциональную активность альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, восприимчивость легких и трахеи (in vivo), а также клеток легких и трахеи (in vitro) к штамму вируса гриппа A/Aich¡/2/68 (H3N2) при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа после введения кеналога.

4. Исследовать возможности коррекции функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов и пониженной резистентности мышей к вирусу гриппа, возникающей после введения кеналога, с помощью иммуностимулятора хитокарбоксиметилгликана.

5. Изучить резистентность мышей к вирусу гриппа и изменение численности и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов при аэрогенном введении препаратов полипренолов, обладающих иммуномодулирующей активностью.

Научная новизна работы

Впервые исследованы и проанализированы особенности популяционного состава клеток, численности и функциональной активности макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства крыс при введении глюкокортикоидов. Доказано, что глюкокортикоиды в высоких дозах усиливают миграцию нейтрофилов в легкие способствуя накоплению в них нейтрофилов, обладающих высоким провоспалительным потенциалом.

Впервые обнаружено разнонаправленное действие глюкокортикоидов на макрофаги и нейтрофилы в разных компартментах организма: усиленное

рекрутирование нейтрофилов в легкие, создающее их численное и функциональное преимущество над альвеолярными макрофагами, и уменьшение численности макрофагов и нейтрофилов в перитонеальной полости, что происходит на фоне глюкокортикоид-индуцированного нейтрофилеза в крови.

Впервые обнаружено, что предварительное введение мышам кеналога не повышает восприимчивость легких и трахеи (in vivó) и первичной суспензионной культуры клеток легких и трахеи (in vitro) к вирусу гриппа, то есть не понижает соответствующие 50%-е инфицирующие дозы вируса гриппа. Установлено, что продукция вируса гриппа в легких у животных, предварительно получавших кеналог, на ранних стадиях гриппозной инфекции повышена, но на более поздних и к моменту гибели понижена относительно контроля из-за ускоренного истощения пула клеток-мишеней для вируса гриппа в начале инфекционного процесса.

Впервые разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа (штамм A/Aichi/2/68 H3N2), с помощью которой

6

продемонстрировано, что понижение резистентности к вирусу гриппа у мышей, предварительно получавших кеналог, обусловлено более сильными, чем в контроле, повреждениями легких, связанными с увеличением количества и биоцидной активности нейтрофилов, при понижении доли и функциональной активности альвеолярных макрофагов. Доказано, что именно резкий дисбаланс между популяциями альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, наблюдаемый после введения кеналога и последующего заражения вирусом гриппа, является одной из основных причин более тяжелых патоморфологических изменений в легких, что лежит в основе повышенной гибели животных.

Впервые продемонстрирована возможность восстановления баланса между показателями количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, а также коррекции пониженной кеналогом резистентности мышей к вирусу гриппа с помощью стимулятора макрофагальной активности хитокарбоксиметилгликана.

Впервые показано, что полипренолы пихты сибирской (Abies sibirica) обладают профилактической эффективностью в отношении вируса гриппа в том случае, если инфицирование происходит через 3 суток после их двукратного аэрогенного введения. Однако после двукратного введения полипренолов за 2 суток до инфицирования резистентность организма к вирусу гриппа не изменяется или понижается, что связано с недостаточной стимуляцией функциональной активности популяции альвеолярных макрофагов по сравнению с популяцией нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическое значение работы заключается в открытии феномена направленной миграции нейтрофилов в легкие, возникающей после введения глюкокортикоидов в высоких дозах. При этом на фоне нейтрофилеза и депрессии функций альвеолярных макрофагов в результате действия глюкокортикоидов в бронхоальвеолярном пространстве скапливается огромная масса функционально активных нейтрофилов. Это создаёт угрозу развития острого респираторного дистресс синдрома (ОРДС) или других нейтрофил-зависимых повреждений лёгочной ткани. Настороженность практикующих врачей по поводу возможности возникновения в легких патологических процессов, обусловленных аккумуляцией нейтрофилов, может способствовать более оправданой тактике интенсивной глюкокортикоидной терапии и проведению дополнительных исследований бронхоальвеолярных клеток.

Доказано, что соотношение количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при введении мышам глкжокортикоида кеналога с последующим заражением вирусом гриппа соответствует более выраженным патоморфологическим изменениям легочной ткани. Это отражает тяжесть воспалительного процесса и может иметь диагностическую и прогностическую значимость в пульмонологии для принятия правильной тактики и стратегии в процессе лечения заболеваний легких, в том числе для предотвращения развития ОРДС или других нейтрофил-зависимых повреждений легочной ткани.

Своевременное применение стимуляторов функциональной активности альвеолярных макрофагов на фоне действия глюкокортикоидов в высоких дозах снижает численность нейтрофилов в альвеолах и бронхах и может способствовать уменьшению риска возникновения нейтрофил-зависимых осложнений в легких, а также предотвращению снижения резистентности организма к вирусу гриппа. В связи с этим стимуляторы макрофагов могут быть рекомендованы для профилактики воспалительно-деструктивных процессов в лёгких, ассоциированных с интенсивной глюкокортикоидной терапией, гиперсекрецией коры надпочечников или последствиями хронического стресса.

В данной работе была разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к вирусу гриппа (штамм А/А1СЫ/2/68 НЗШ), которая воспроизводится при однократном подкожном введении глкжокортикоида пролонгированного действия кеналога с последующим заражением вирусом гриппа и может быть рекомендована для тестирования иммуномодулирующей, антипротеазной или противовирусной активности препаратов, перспективных для применения в качестве средств патогенетической или этиотропной терапии гриппа.

По результатам обнаруженной нами профилактической эффективности полипренолов пихты сибирской в отношении вируса гриппа получен Патент |Щ (11) 2189231 (13) С1 от 20.09.2002 «Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций». Вместе с тем, при применении полипренолов или других препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью, обязательно следует учитывать то, что резистентность организма к вирусу гриппа может понижаться, если инфицирование происходит в период преимущественной стимуляции в бронхоальвеолярном пространстве функциональной активности популяции нейтрофилов по сравнению с популяцией альвеолярных макрофагов.

Материалы исследования функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов при введении глюкокортикоидов нашли отражение в монографии «Лекции по клинической патологии: Руководство для врачей» (1997) Д.Н. Маянского и И.Г. Урсова.

Положения, выносимые на защиту:

1. После применения глюкокортикоидов в высоких дозах усиливается направленная миграция циркулирующих нейтрофилов в легкие, что приводит к повышению численности и биоцидного потенциала популяции нейтрофилов и создает угрозу нейтрофил-зависимой деструкции легочной ткани.

2. Предварительное введение глюкокортикоидов в высоких дозах приводит к снижению резистентности организма к вирусу гриппа, о чем свидетельствует увеличение летальности мышей, обусловленное усугублением нейтрофил-зависимых повреждений легких после заражения вирусом гриппа, а не повышенной восприимчивостью клеток-мишеней к вирусу гриппа. С помощью стимуляторов функциональной активности макрофагов возможна коррекция пониженной резистентности организма к вирусу гриппа за счет уменьшения дисбаланса между популяциями альвеолярных макрофагов и нейтрофилов.

3. Повышение или понижение резистентности организма к вирусу гриппа после применения иммуномодуляторов в разных дозах и в разные сроки до момента инфицирования детерминировано соотношением функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов. При этом для пониженной резистентности к вирусу гриппа характерно доминирование стимуляции функциональной активности популяции нейтрофилов, тогда как повышенная резистентность к вирусу гриппа достигается при преимущественном увеличении биоцидного и фагоцитарного потенциала популяции альвеолярных макрофагов.

Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены на 35 отечественных и международных конференциях: All Union Symposium with the participation foreign scientists, 1990, Novosibirsk, Russia; Constituent Congress Int. Soc. Pathol., 1991, Moscow, Russia; Международный симпозиум «Патогенез хронического воспаления», 1991, Новосибирск, Россия; Joint Meeting Soc. Leuk. Biol. «The phagocyte molecular and clinic aspects», 1996, Verona, Itali; XIII Российская научная конференция «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», 1997, Челябинск, Россия; XXX Всеросс. Научно-практическая конференция «Проблемы терапевтической и

хирургической пульмонологии», 1997, Санкт-Петербург, Россия; 7 Научно-практическая конференция врачей «Актуальные вопросы современной медицины», 1997, Новосибирск, Россия; Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера», 1998, Новосибирск, Россия; Вторая научная конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс», 1998, Саратов, Россия; 18th Annual AAAR' 99 Conference, 1999, Tacoma, Washington, USA; 1999 European Aerosol conference, Praque, Czech republic; Advanced research workshop «Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium», 1999, Novosibirsk, Russia; VI Рабочая группа «Аэрозоли Сибири», 1999, Томск, Россия; International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors, 2000, Smolenice, Slovakia; 19th Annual AAAR Conference, 2000, Adam’s Mark Hotel, St. Louis, Missouri, USA; XIV Российская научная конференция «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», 2000, Челябинск, Россия; II Всероссийский симпозиум «Хроническое воспаление», посвященный памяти засл. Деятеля науки РФ, проф. Д.Н. Маянского «Фундаментальные и клинические аспекты хронического воспаления», 2000, Новосибирск, Россия; 3-rd International Conference on Emerging Zoonoses, 2001, Noordwijkerhout, Holland; 2-я научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2002, Новосибирск, Россия; X Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине экологии», 2002, Ялта-Гурзуф, Крым, Украина; Всероссийская конференция «Компенсаторно-приспособительные процессы: Фундаментальные и клинические

аспекты», 2002, Новосибирск, Россия; Biological Medical Conference «Prophylaxis and treatment of BW health disorders», 2003, Munich, Germany; Biological Medical Defense Conference, 2004, Munich, Germany; Всероссийской конференции «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические

аспекты», 2004, Новосибирск, Россия; V Сибирский физиологический съезд, 2005, Томск, Россия; 2-я Международная конференция «Наука-Бшнес-Образование Биотехиология-Биомедицина-Окружающая среда», 2005, Пущино, Россия; 2-я Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2005, Москва, Россия; XIII International Congress of Virology, 2005, San Francisco, California, USA; Biological Medical Defense Conference, 2005, Munich, Germany; Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 2006, Ульяновск, Россия; III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2006, Новосибирск, Россия; 3-я Всероссийская

научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2007, Новосибирск, Россия; Международная научно-практическая конференция «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития», 2008, Алматы, Казахстан; 4-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2009, Новосибирск, Россия; 5-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов», 2011, Новосибирск, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 научных статьи, из них 30 — в отечественных журналах из списка ВАК и 4 - в зарубежных изданиях, а также 48 тезисов в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях. По результатам диссертации получено 2 патента Российской Федерации.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 36 рисунков и 61 таблицу. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 110 отечественных и 490 зарубежных источников.

Вклад автора в диссертационную работу. Материал диссертации получен и проанализирован лично автором при консультативной помощи д.м.н., профессора Сергеева А.Н. При получении и анализе результатов данной работы на разных ее этапах автору оказывали помощь следующие сотрудники: д.б.н. Жуков В.А., д.ф-м.н. Сафатов A.C., к.б.н. Пьянков О.В., д.б.н. Колесникова Л.В., профессор Селятицкая В.Г., д.б.н. Макарова О.П., профессор Короленко Т.А., н.с. Игнатьева М.И., н.с. Богомолова М.В., профессор Цырендоржиев Д.Д., профессор Зубахин A.A., д.б.н. Воронина Н.П., профессор Рябчикова Е.И., д.м.н. Малкова Е.М., к.б.н. Омигов В.В., к.б.н. Булычев Л.Е., к.м.н. Сметанникова М.А., к.м.н. Сергеев A.A., н.с. Таранов О.С., н.с. Фанкин И.В., н.с. Петрищенко В.А., ст. лаборанты Окулова Л.М., Копылова Е.О., Кириченко Т.Б., Генералова Т.И., Прудникова Н.В., Соловей И.М., Филиппова Ю.С.

Автор выражает огромную и искреннюю благодарность всем коллегам и сотрудникам за помощь и поддержку при выполнении и обсуждении данной работы.

Работа была выполнена в рамках научно-исследовательских тем ГНЦ ВБ «Вектор» и при поддержке грантов МНТЦ№ 459-98 и № 450-р.

Автор сохранила признательность и благодарность своему учителю и первому руководителю д.м.н., профессору Маянскому Дмитрию Николаевичу, памяти которого посвящается данная работа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 450 крысах Wistar массой 190-250 г и на 970 аутбредных мышах ICR массой от 13 до 20 г. При работе с лабораторными животными соблюдали «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

В работе использовали глюкокортикоиды: преднизолона натрия фосфат (Пр) и триамцинолона ацетонид - Кеналог (Кн). Для стимуляции СМФ применяли: хитокарбоксиметилгликан (ХКМГ) - водорастворимое производное клеточной стенки грибов Aspergillus rtiger и водно-эмульсионные препараты полипренолов (1111), полученные из хвои пихты сибирской (Abies sibirica). Дозы вводимых препаратов указаны в таблице 1.

Мышей инфицировали интраназально (и/н) под эфирным наркозом или аэрогенно (а/г) в малой динамической камере адаптированным к ним штаммом вируса гриппа (ВГ) A/Aichi/2/68 (H3N2). При инфицировании ВГ определяли 50 %-е летальные (ЛД50) дозы ВГ для мышей и аэрогенные инфицирующие дозы ВГ (АИД50) для легких и трахеи мышей. Рассчитывали вдыхаемую дозу ВГ на 1 мышь = ОТ* W, где С - концентрация ВГ в аэрозоле в lg ЭИД50/Л аэрозоля, Т — время экспозиции, W -объемная скорость дыхания мыши (Guyton А.С., 1947); апплицированную дозу ВГ в органах дыхания = CxTxWxph где pi - коэффициент осаждения частиц аэрозоля в дыхательном тракте; апплицированную дозу ВГ в трахее = OTxWxp2 где р2 -коэффициент осаждения частиц трахее; апплицированную дозу ВГ в легких = СхТxWxp3, где р5 — коэффициент осаждения частиц в легких (Сергеев А.Н., 2001).

Восприимчивость к ВГ клеток трахеи и легких in vitro оценивали по 50 %-м клеточным инициирующим дозам (КИД50). Титры ВГ в легких (ТВЛ) и в образцах клеток и органов мышей определяли стандартным методом титрования при инфицировании 9-11-ти суточных РКЭ и выражали в lg ЭИД50/МЛ.

Концентрацию ИФН-а/р в супернатантах гомогенатов легочной ткани определяли титрованием на культуре перевиваемых клеток мышей L-929 с использованием микрометода на 96-луночных планшетах (Булычев Л.Е., 1998).

Проводили микроскопические исследования срезов легких и препаратов клеток бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) и перитонеальной лаважной жидкости (ГШЖ). В срезах легких, окрашенных гематоксилин-эозином, оценивали

процент площади среза респираторной области, занятой клеточными элементами, с помощью окулярной сетки.

Изучали миграцию Нф, меченых хромом-51 (51Сг), в органы и ткани при в/б или в/в введении крысам, получавшим Кн, и в контроле. Через I час после в/б или в/в введения 51Сг-меченых клеток крыс декапитировали и брали образцы крови, ткани легких, печени, селезенки, почки, тонкого кишечника и бедренной мышцы. Взятые образцы помещали в пробирки для y-счета и взвешивали. Подсчет количества импульсов в образцах производили в течение 10 секунд в автоматическом счетчике у-излучения Tesla (Чехия). По результатам измерения рассчитывали процент поглощения радиоактивности (% R) на 1 г ткани органа относительно вводимой дозы по формуле: % R = Ropr. : Кдюь1 х 100, где Ropr. - число импульсов 1 г ткани органа; Кдозы — число импульсов вводимой дозы.

Оценивали почечные индексы (ПИ) тимуса, селезенки, надпочечника, печени и легких, численность клеток БАЛЖ и ПЛЖ; количество альвеолярных макрофагов (АМф) и нейтрофилов - Нф(а); количество перитонеальных макрофагов (ПМф) и нейтрофилов — Нф(п). Фагоцитарную способность Мф и Нф БАЛЖ или ПЛЖ оценивали при инкубировании монослоя этих клеток с метакрилатными гранулами (МГ), зимозановыми гранулами (ЗГ) или стафилококками (St) из расчета 50-100 частиц на 1 клетку. Определение спонтанной или ЗГ-индуцированной супероксид-анион-продуцирующей способности Мф и Нф БАЛЖ или ПЛЖ осуществляли при инкубировании монослоя этих клеток в течение 30 мин с нитросиним терразолием (НСТ) в концентрации 0,02 %.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютерных программ анализа данных Microsoft Excel и «Statistica 6,0». Сравнение доли выживших животных в группах, инфицированных вирусом гриппа, проводили по критерию X2- При расчетах ЛД50, АИД50, КИД50 и ТВЛ использовали метод Спирмана-Кербера. Нормальность распределения показателей клеток, ПИ органов, титров ВГ и ИФН-а/р, распределения радиоактивности в тканях, площади, занимаемой клетками, в срезах легких, подтверждали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова для вероятности ошибки р>0,10. Значения в таблицах представлены как М ± т, где М - среднее, т - ошибка среднего, показатели на рисунках представлены как М ± 195, где I9j - 95 %-й доверительный интервал. Достоверность отличий между средними значениями оценивали по двустороннему t-критерию Стьюдента для вероятности ошибки р<0,05 и р<0,01.

Каждой из групп животных присвоено краткое обозначение, использованное при описании и анализе результатов (табл. 1).

Таблица 1. Обозначения групп и схемы введения препаратов и проведения исследований в 8 группах животных

Группы животных Сокращенные обозначения групп и последовательность введения препаратов

Опыт Контроль и группы сравнения

1 2 3

1 группа (крысы) Опыт-1:Пр - ежедневно в течение 7 сут п/к 30 мг/кг преднизолона. Контроль-1:ФР - ежедневно в течение 7 сут п/к 1 мл 0,9 % раствора №01.

Для оценки влияния Пр на численность Мф и Нф в БАЛЖ и ПЛЖ.

2 группа (крысы) Опыт-2:Кн - однократно п/к 2 мг/кг кеналога. Контроль-2:ФР - однократно п/к 1 мл 0,9 % раствора NaCl.

Для оценки влияния Кн на численность и функциональную активность АМф и Нф(а), а также ПМф и Нф(п). Для изучения миграции Нф, меченых 5|Сг, в органы крыс.

3 группа (мыши) Опыт-3:Кн(1,25, 2,5, 5, 10) - однократно п/к 1,25; 2,5; 5 и 10 мкг/г Кн. Контроль-3:РХ - однократно п/к РХ в объеме 0,1 мл.

Для выбора дозы Кн и времени исследования после введения Кн на основании показателей крови и иммунокомпетентных органов.

4 группа (мыши) Опыт-4:Кн(1,25, 2,5, 5, 10)+ВГ(1-5)и/н - однократно п/к 1,25; 2,5; 5 и 10 мкг/г Кн за 4 сут до и/н инфицирования с 1 по 5 разведениями ВАЖ. Контроль-4:РХ+ВГ(1-5)и/н -однократно п/к РХ в объеме 0,1 мл за 4 сут до и/н инфицирования с 1 по 5 разведениями ВАЖ.

Для выбора оптимальной для исследования дозы Кн на основании ЛД50 ВГ при и/н заражении ВГ и определения ТВЛ у павших мышей.

Опыт-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н - однократно п/к 5 мкг/г Кн за 4 сут до и/н инфицирования 2-м разведением ВАЖ. Контроль-4:РХ+ВГ(2)и/н - однократно п/к 0,1 мл РХ за 4 сут до и/н инфицирования 2-м разведением ВАЖ.

Для определения динамики ТВЛ и ИФН, функциональной активности АМф и Нф(а), атакже степени повреждения легких при и/н заражении ВГ.

5 группа (мыши) Опыт-5:Кн(5)+ВГ(1-5)а/г - однократно п/к 5 мкг/г Кн за 4 сут до а/г инфицирования с 1 по 5 концентрациями ВГ в 1 л аэрозоля. Опыт-5:Кн(5)+ВГ(1-5) in vitro -однократно и/к 5 мкг/г Кн за 4 сут до инфицирования клеток трахеи и легких с 1 по 5 разведениями ВАЖ in vitro. Конгроль-5:РХ+ВГ(1-5)а/г - однократно п/к РХ в объеме 0,1 мл за 4 сут до а/г инфицирования с 1 по 5 концентрациями ВГ в 1 л аэрозоля. Контроль-5:РХ+ВГ(1-5) in vitro -однократно п/к РХ в объеме 0,1 мл за 4 сут до инфицирования клеток трахеи и легких с 1 по 5 разведениями ВАЖ in vitro.

Для определения восприимчивости легких и трахеи к ВГ у мышей по АИДч, in vivo и по КИД50 in vitro.

Опыт-5:Кн(5)+ВГ(2)а/г - однократно п/к 5 мкг/г Кн за 4 сут до а/г инфицирования 2-й концентрацией ВГ в 1 л аэрозоля. Контроль-5:РХ+ВГ(2)а/г - однократно п/к РХ в объеме 0,1 мл за 4 сут до а/г инфицирования 2-й концентрацией ВГ в 1 л аэрозоля. 3 группа (мыши).

Для изучения функциональной активности АМф и Нф в легких у мышей при а/г заражении ВГ.

Продолжение таблицы 1

1 2 3

6 группа (мыши) Опыт-6:Кя(5)+ХКМГ+ВГ(1-5)и/н - однократно п/к 5 мкг/г Кн за 4 сут и однократно в/б 25 мкг/г ХКМГ за 2 сут до и/н инфицирования с 1 по 5 разведениями ВАЖ. Контроль-6:РХ+ХКМГ+ВГ(1-5)и/н -однократно п/к РХ в объеме 0,1 мл за 4 сут и однократно в/б 25 мкг/г ХКМГ за 2 сут до и/н инфицирования с 1 по 5 разведениями ВАЖ. 6 группа (мыши).

Для изучения возможности коррекции пониженной Кн резистентности мышей к ВГ с помощью ХКМГ на основании ЛД50 ВГ при и/н заражении ВГ.

Опыт-6:Кп(5)+ХКМГ+ВГ(2)п/п - однократно н/к 5 мкг/г Кн за 4 суг и однократно в/б 25 мкг/г ХКМГ за 2 сут до и/н инфицирования 2-м разведением ВАЖ. Контроль-6:РХ+ХКМГ+ВГ(2)и/н -однократно п/к 0,1 мл РХ за 4 сут и однократно в/б 25 мкг/г ХКМГ за 2 сут до и/н инфицирования вторым (2) разведением ВАЖ. 3 группа (мыши), 4 группа (мыши).

Для изучения возможности коррекции пониженной Кн резистентности мышей к ВГ с помощью ХКМГ на основании определения влияния Кн и ХКМГ на показатели глюкокортикоид-чувствительных и иммунокомпетентных органов, динамику ТВЛ и степень повреждения Б легких, а также для изучения функциональной активности АМф и Нф(а) при и/н заражении ВГ.

7 группа (мыши) Опыт-7:ПП(а) - двукратно через 48 ч а/г 4,56 и 6 мкг/мышь препарата полипренолов (ПП); 3 сут после введения ПП. Опыт-7:ПП(Ь) - двукратно через 48 ч а/г 6 и 6 мкг/мышь ПП; 3 сут после введения ПП. Опыт-7:ПП(с) - двукратно через 48 ч а/г 7,08 и 6 мкг/мышь ПП; 3 сут после введения ПП. Опыт-7:ПП((1) - двукратно через 48 ч а/г 9,6 и 6 мкг/мышь ПП; 3 сут после введения ПП. Опыт-7:ПП(е) - двукратно через 48 ч а/г 10,86 и 6 мкг/мышь ПП; 2 сут после введения ПП. Опыт-7:ПП(Ь2) - двукратно через 48 ч а/г 6 и 6 мкг/мышь ПП; 2 сут после введения ПП. Опыт-7:ПП(Ь1) - двукратно через 48 ч а/г 6 и 6 мкг/мышь ПП; 1 сут после введения ПП. Контроль-7:РХ(а/г) - двукратно через 48 ч а/г раствор Хенкса; 1, 2, 3 сут после введения РХ.

Для оценки влияния двукратного а/г введения ПП на иммунокомпетентные органы и функциональную активность АМф и Нф(а) до заражения мышей ВГ.

8 группа (мыши) Опыт-8:ПП(а)+ВГ 3 сут - двукратно через 48 ч а/г 4,56 и 6 мкг/мышь ПП за 3 сут до заражения 1 АЛД» ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Опыт-8:ПП(Ь)+ВГ 3 сут -двукратно через 48 ч а/г 6 и 6 мкг/мышь ПП за 3 сут до заражения 1 АЛД.™ ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ - двукратно через 48 ч а/г раствор Хенкса за 3 сут до заражения 1 АЛД™ ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ.

Продолжение таблицы 1

1 2 3

8 группа (мыши) Опыт-8:ПП(с)+ВГ 3 сут - двукратно через 48 ч а/г 7,08 и 6 мкг/мышь ПП за 3 сут до заражения 1 АЛД™ ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Опыт-8:ПП((1)+ВГ 3 сут -двукратно через 48 ч а/г 9,6 и 6 мкг/мышь ПП за 3 сут до заражения I АЛД50 ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Опыт-8:ПП(е)+ВГ 2 сут -двукратно через 48 ч а/г 10,86 и 6 мкг/мышь ПП за 2 сут до заражения 1 АЛДо ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Опыт-8:ПП(Ь2)+ВГ 2 сут -двукратно через 48 ч а/г 6 и 6 мкг/мышь ПП за 2 сут до заражения 1 АЛД,0 ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Опыт-8:ПП(Ь1)+ВГ 1 сут -двукратно через 48 ч а/г 6 и 6 мкг/мышь ПП за 2 сут до заражения 1 АЛДя> ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ - двукратно через 48 ч а/г раствор Хенкса за 2 сут до заражения 1 АЛД50 ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ - двукратно через 48 ч а/г раствор Хенкса за 1 сут до заражения 1 АЛД50 ВГ; 2 и 14 сут п/з ВГ. 7 группа (мыши).

Для оценки влияния двукратного а/г введения ПП в разных дозах на резистетность мышей к ВГ, показатели иммунокомпетентных органов и функциональную активность АМф и Нф(а) при а/г заражении мышей ВГ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Лёгкие гораздо более, чем другие органы, подвержены прямому воздействию агрессивных факторов внешней среды, в том числе инфекционных агентов. Существенную роль в поддержании гомеостаза и осуществлении нереспираторных функций легких играют клетки, находящиеся в бронхоальвеолярном пространстве. Среди них АМф являются самой многочисленной (до 90 %) и быстро реагирующей на чужеродные агенты популяцией клеток, остальные лейкоцитарные элементы в норме составляют весьма малую часть от всей популяции клеток данной локализации (Маянский Д.Н., 1989; Фрейдлин И.С., 1998; Hashimoto Y., 2007; Tate M.D., 2010).

Вместе с тем, под влиянием экзогенных и эндогенных факторов, обладающих иммуностимулирующими или иммунодепрессивными эффектами, популяционный состав брохоальвеолярных иммунокомпетентных клеток может претерпевать существенные изменения, связанные, прежде всего, с увеличением численности Нф в легких (Похилько А.В., 1995; Zhang Р., 2000; Löwenberg М., 2008; Borghetti Р., 2009). В данной работе поэтапно представлены результаты, касающиеся изменения численности и функциональной активности Нф и Мф в легких под влиянием иммуномодуляторов и связанных с ними воспалительных процессов на примере экспериментальной гриппозной инфекции у лабораторных животных.

1. Изменение показателей глюкокортикоид-чувствительных органов и Фагоцитов легких и перитонеальной полости у крыс после введения преднизолона

Существует мнение, что одним из главных механизмов подавления ответа организма на инфекционные возбудители является уменьшение миграции Нф и моноцитов (Мц) в очаг воспаления и их фагоцитарной активности под влиянием глюкокортикоидов (Сигидин Я.А., 1994; Чучалин А.Г., 2004; Килесса В.В., 2010; Страчунский Л.С., 2011; Pitzalis С., 2002; Balk R.A., 2004; Weber P.S., 2004). Так, введение метиллреднизолона при ревматоидном артрите приводит к снижению поступления Нф в полость суставов при увеличении их числа в периферической крови (Насонов Е.Л., 2011; Youssef Р., 1995; Youssef Р., 1996). Однако внутримышечное введение дексаметазона за 1 сут до инфузии рекомбинантного человеческого IL-8 не способствовало уменьшению численности Нф в матке у коров (König Т., 2006). Вместе с тем, предварительное введение дексаметазона или преднизолона лабораторным животным значительно подавляло ЛПС-индуцированное поступление Нф в брызжеечные посткапилярные венулы и перитонеальную полость (Davenpeck K.L., 1998; Li L., 2009).

Ранее нами были получены результаты, которые продемонстрировали, что после подкожного введения крысам в течение 7 сут ацетата гидрокортизона в дозе 125 мг/кг в бронхоальвеолярном пространстве увеличивалась численность Нф(а), а относительное содержание АМф существенно уменьшалось (Шишкина Л.Н., 1987, 1989). В продолжение этих исследований на данном этапе работы был проведен эксперимент на крысах, которым вместо ацетата гидрокортизона в эквивалентной дозе (30 мг/кг) вводили преднизолон (Пр).

При анализе показателей почечных индексов (ПИ) органов было обнаружено, что через 1 сут после заключительного введения Пр масса надпочечников уменьшалась почти в 2 раза, тимуса - в 7 раз, селезёнки - в 1,5 раза. ПИ легких и печени не изменялись под влиянием Пр, вводимого в выбранной нами дозе.

Кроме того, общая численность клеток БАЛЖ у крыс, получавших преднизолон, была в 3 раза больше, чем в контроле, а абсолютное количество Нф(а) -в 20 раз (табл. 2). При этом на 100 АМф приходилось в 26 раз больше Нф(а), чем в контроле (см. табл. 2).

Одновременно с увеличением числа клеток в БАЛЖ в ПЛЖ общее количество клеток стало в 4,6 раза ниже, чем в контроле, при снижении количества не только ПМф, но и Нф(п) (табл. 3). Более того, отношение числа Нф(п) к числу ПМф тоже снижалось относительно контроля (см. табл. 3).

Таблица 2. Абсолютные числа (N) АМф и Нф(а) и их соотношение в БАЛЖ у крыс у крыс через 1 сут после отмены п/к инъекций 30 мг/кг преднизолона (Пр) и контроле (М±т)

Группы крыс N АМф (х10б/г лёгких) N Нф(а) (х10б/г лёгких) N Нф(а) на 100 АМф

Опыт-1:Пр, п=8 5,65 ± 0,39 14,51 ± 0,97** * 259 ±11*

Контроль-1 :ФР, п=8 6,62 ±0,96 0,67 ± 0,17 $ 10± 2

Примечание: * - отличие от Контроля-1:ФР при р<0,05, ** - при р<0,01; 4 - отличие от

соответствующего показателя АМф при р<0,05.

Таблица 3. Абсолютные числа (1чт) ПМф и Нф(п) и их соотношение в ПЛЖ у крыс у крыс через 1 сут после отмены п/к инъекций 30 мг/кг преднизолона (Пр) и контроле (М±т)

Группы крыс ІМПМф (х104/г массы тела) N Нф(п) (х104/г массы тела) N Нф(п) на 100 ПМф

Опыт-1 :Пр, п=8 0,81 ±0,07** 0,36 ±0,02** 47 ±5*

Контроль-1:ФР, п=8 4,99 ± 0,40 3,85 ±0,31 80 ±7

Примечание: * - отличие от Контроля-1 :ФР при р<0,05, ** - при р<0,01.

Итак, после подкожного введения крысам Пр в дозе 30 мг/кг в течение 7 сут в легких накапливалось большое количество Нф(а), а относительное количество АМф существенно уменьшалось. В то же время в перитонеальной полости общее число клеток, а также численность ПМф и Нф(п) уменьшались.

2. Влияние глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога на Фагоциты легких и перитонеальной полости у крыс. Миграция 5|Сг-меченых нейтрофилов в легкие и другие органы крыс после введения кеналога

С целью установления универсальности индуцируемого под влиянием глюкокортикоидов притока Нф в бронхоальвеолярное пространство провели более глубокое сравнительное изучение изменения численности и функциональной активности Мф и Нф в легких и в перитонеальной полости крысам под влиянием глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога (Кн).

Через 6 ч после введения Кн общее число клеток БАЛЖ крыс снижалось в 4,7 раза, прежде всего за счет АМф, а затем вплоть до 16 сут увеличивалось относительно Контроля-2:ФР (рис. 1 А, Б и В). Общее число клеток БАЛЖ возрастало максимально (> 100 раз) через 5 сут после введения Кн, главным образом за счет Нф(а) (см. рис. 1

А, Б и В).

Рис. 1. Общая численность клеток БАЛЖ (А), число АМф (Б) и Нф(а) (В) и их соотношение (Г) у крыс в разные сроки (по оси абсцисс) после подкожной инъекции кеналога (2 мг/кг) (Опыт-2:Кн - И) и в Контроле-2:ФР (СП).

* - отличие от контроля при р<0,05.

Рис. 2. Общая численность клеток ПЛЖ (А), число ПМф (Б) и Нф(п) (В) и их соотношение (Г) у крыс в разные сроки (по оси абсцисс) после подкожной инъекции кеналога (2 мг/кг) (Опыт-2:Кн - в) и в Контроле-2:ФР (П).

* - отличие от контроля при р<0,05.

Доля АМф в БАЛЖ крыс через 5 сут после введения Кн уменьшалась в 3,2 раза (27,5+9,4 %) относительно Контроля-2:ФР (89,0±3,9 %), но их абсолютное число увеличивалось в 30 раз (см. рис. 1 Б). Процентное содержание Нф(а) (70,6±9,5 %) в Опыте-2:Кн увеличилось в 12 раз по сравнению с Контролем-2:ФР (5,8+2,6 %), а их абсолютное число увеличилось в 1920 раз (см. рис. 1 В). К 55 суткам общая численность клеток, процентное содержание и абсолютное содержание АМф и Нф(а) в БАЛЖ в группе Опыт-2:Кн приближались к показателям Контроля-2:ФР (см. рис. 1

А, Б и В). Важно то, что через 5 сут после введения Кн происходит резкий сдвиг в соотношении между абсолютными числами АМф и Нф(а), т.е. на каждые 100 АМф приходится в 75 раз больше Нф(а), чем в Контроле-2:ФР (см. рис. 1 Г). Через 55 сут после введения Кн это соотношение приближалось к контрольным показателям (см. рис. 1 Г).

Параллельно уменьшению численности клеток в БАЛЖ через 6 ч после введения Кн в ПЛЖ общее число клеток уменьшалось в 1,8 раза (рис. 2 А), прежде всего, за счет снижения доли Нф(п) (Опыт-2:Кн 4,8±1,4 %; Контроль-2:ФР 20,8+4,4). В последующее время в Опыте-2:Кн, когда число клеток в БАЛЖ возрастало, в ПЛЖ наоборот число клеток уменьшалась относительно Контроля-2:ФР (рис. 2 А, Б и В).

Через 5 сут после введения Кн процент Нф(п) в группе Опыт-2:Кн (14,6±1,9) был в 2,5 раза ниже, чем в Контроле-2:ФР (35,8±4,8), а абсолютное число Нф(п) уменьшалось в 21,2 раза (см. рис. 2 В). В дальнейшем общее количество клеток ПЛЖ в опыте постепенно возрастало и полностью нормализовалось к 55 сут (см. рис. 2 А).

Отношение числа Нф(п) к числу ПМф отличалось от Контроля-2:ФР только через 6 ч после введения Кн и изменялось в пользу ПМф, в последующие сроки соотношение между ПМф и Нф(п) было сравнимо с соответствующим Контролем-2:ФР (рис. 2 Г).

Сравнительное изучение фагоцитарной и супероксид-анион-продуцирующей активности фагоцитов БАЛЖ и ПЛЖ было проведено через 5 сут после введения Кн, так как именно в это время происходили максимально выраженные изменения численности и соотношения популяций АМф и Нф(а), ПМф и Нф(п). Было показано, что абсолютное число Нф(а), фагоцитирующих Э!, в Опыте-2:Кн (30,87±8,81 х10е/г массы лёгких) было в 15 раз выше аналогичного значения для АМф (2,05±0,57 х106/г массы лёгких), а число Д+Нф(а) в Опыте-2:Кн (7,95±1,78 х106/г массы лёгких) было в 5 раз больше числа д АМф (1,58+0,27 х106/г массы лёгких). Это свидетельствует о резком дисбалансе, произошедшем между популяциями АМф и Нф(а), не только по показателям их численности, но и по показателям их фагоцитарной и потенциальной биоцидной (супероксид-анион-продуцирующей) способности в легких.

В то же время в ПЛЖ абсолютное число ПМф, фагоцитирующих Б!, стало меньше в 25 раз, а число д+ПМф - в 35 раз, чем в Контроле-2:ФР. Кроме того, абсолютное число Нф(п), фагоцитирующих 51, в Опыте-2:Кн уменьшалось в 38 раз, а число д*Нф(п) - в 32 раза относительно показателей в Контроле-2:ФР. В результате, соотношение функционально активных ПМф и Нф(п) и по фагоцитарной, и но супероксид-анион-продуцирующей способности не изменялось.

Таким образом, в бронхоальвеолярном пространстве через 5 сут после введения Кн общее количество клеток увеличивалась с максимальным накоплением Нф(а) и их значительным преобладанием над АМф и по численности, и по фагоцитарной, и по супероксид-анион-продуцирующей активности. В это же время в брюшной полости число клеток уменьшалось при значительном снижении фагоцитарной и супероксид-анион-продуцируюшей способности и Нф(п), и ПМф. Это является доказательством разнонаправленного действия глюкокортикоидов на Мф и Нф в разных компартментах организма и рекрутирования в легкие большого количества Нф, продукция которых увеличивается под влиянием глюкококортикоидов (Машковский М.Д., 2010; Страчунский Л.С., 2011; Рикакиза М., 2005; ОгктБ А., 2005).

Мы предположили, что введение глюкокортикоидов вызывает перераспределение Мф и Нф в организме в сторону преимущественного накопления Нф в легких. Для подтверждения этого феномена мы изучили миграцию вводимых в/б или в/в меченых 51Сг клеток БАЛЖ, состоящих более чем иа 70 % из Нф(а), выделенных от крыс через 5 сут после введения Кн, оценив распределение доли радиоактивности в органах крыс, получавших Кн, и в контрольной группе.

Через 1 ч после в/б введения меченых 51Сг Нф(а) у мышей контрольной группы не было обнаружено преимущества по '/-излучению исследуемых образцов легких, печени, селезенки, почки, мышцы и кишечника, причем самый высокий процент поглощения радиоактивности от вводимой дозы регистрировали в 1 г тонкой кишки (0,86±0,15 %), а в циркулирующей крови вообще не было выявлено 7-излучения. Также не было отличий между соответствующими показателями в Контроле-2:ФР и в Олыте-2:Кн, что свидетельствовало об отсутствии увеличения миграции Нф под влиянием Кн из перитонеальной полости в другие органы, в том числе в легкие.

При а/в введении меченых 5]Сг клеток БАЛЖ, преимущественно Нф(а), было обнаружено, что даже у крыс в контрольной группе в 1 г легочной ткани концентрировалась большая их доля, чем в 1 г ткани других исследованных органов (табл. 4). Учитывая то, что масса легких у крыс группы Контроля-2:ФР, составляла 1,45±0,26 г (п=6), в целом на легкие приходилось 36,83±5,17 % от вводимой дозы.

Таблица 4. Процент (%) поглощения радиоактивности на 1 г ткани органа через 1 ч после в/в введения меченых 51Сг клеток БАЛЖ у крыс через 5 сут после п/к введения кеналога в дозе 2 мг/кг и в контроле (М±т).

Группы крыс, п=6 Кровь Легкие Печень Селезенка Почка Кишка Мышца

Опыт- 0,07 45,59 5,17 3,99 0,66 0,12 0,06

2:Кн ±0,03 ±3,79* ±0,48 ±0,46* ±0,05 ±0,07 ±0,02

Контроль 0,63 25,55 4,35 2,15 0,43 0,06 0,58

-2:ФР ±0,31 ±3,24 ±0,27 +0,21 ±0,10 ±0,03 ±0,33

Примечание: * - отличие от Контроля-2:ФР при р<0,05.

При в/в введении меченых 5|Сг клеток БАЛЖ крысам, получившим Кн за 5 сут до исследования, наблюдали подавляющее накопление радиоактивности также в легочной ткани. Более того, процент поглощения '/-радиоактивности 1 г ткани легких у крыс в Опыте-2:Кн увеличивался по сравнению с Контролем-2:ФР почти в 2 раза (см. табл. 4). Несмотря на то, что масса легких у крыс в Опыте-2:Кн немного уменьшалась и составляла 1,33±0,23 г, в них концентрировалось 60,11±5,03 % от вводимой дозы 5'Сг-меченых клеток, что достоверно выше показателя в контроле.

Полученные результаты свидетельствуют о накоплении Нф именно в легких по сравнению с другими органами, особенно на фоне действия глюкокортикоидов, растормаживающих гранулоцитопоэз в красном костном мозге и повышающих численность Нф в крови (Чучалин А.Г., 2004; Машковский М.Д., 2010; König Т., 2006: Cavalcanti D.M., 2007). В этом случае основными детерминантами могут быть уникальные анатомические особенности альвеоло-капиллярного барьера, пригодные для удаления излишков циркулирующих Нф (Седов A.A., 2011; Doerschuk С.М., 2001; Burns A.R., 2003), подавление функций АМф, призванных осуществлять клиренс лёгких от чужеродных агентов и ряда клеток собственного организма, в том числе Нф (Черношей Д.А., 2010; Liu G., 2008; Zhang X., 2008; Duffín R., 2010; Park Y.J., 2009), a также повышенное содержание в легких хемоаттрактантов, связанное с окислением липидов, эндотоксемией, активизацией симбиотической флоры и усиленным образованием тромбоцитов из мегакариоцитов (Маянский Д.Н., 2008; Чучалин А.Г., 2004; Машковский М.Д., 2010; Седов A.A., 2011; Страчунский Л.С., 2011; Kosaki G., 2008; Li L., 2009; Fuentes R., 2010; Reems J.A., 2010; Su X., 2010).

Особенно важно, что увеличение численности Нф(а) после введения глюкокортикоидов сопровождалось усилением их деструктивного потенциала на фоне снижения функциональной активности АМф. Для решения вопроса, может ли повышение численности и функциональной активности Нф в легких играть роль в снижении резистентности организма к вирусу гриппа (ВГ) на фоне повышенного

22

уровня глюкокортикоидов, была разработана модель и изучены механизмы пониженной резистентности мышей к ВГ при предварительном введении Кн.

3. Изучение влияния кензлога на резистентность мышей к ВГ А/А{с11с/2/68 (НЗЫ2)

Сначала было изучено влияние разных доз Кн (1,25; 2,5; 5 и 10 мкг/г массы мыши) на показатели клеток крови и ПИ органов: надпочечника, тимуса, селезенки, которые атрофируются, и печени, которая гипертрофируется, при введении глюкокортикоидов (Машковский М.Д., 2010). Было показано, что через 4 сут после введения Кн в дозе 5 мкг/г мышам массой 15-1? г. наблюдались наиболее демонстративные глюкокортикоидные эффекты. При этом в Опыте-3:Кн(5) снижались (р<0,05) ПИ надпочечника в 7 раз (0,007±0,001), тимуса - в 2 раза (0,21±0,01) и селезенки в 1,2 раза (0Д7±0,01), а общее количество лейкоцитов в периферической крови увеличивалось (9,54±0,48 х103/мм3) в 1,2 раза преимущественно из-за увеличения в 1,3 раза относительного (29,9±0,86 %) н в 1,5 раза - абсолютного (2,87±0,08 х 103/мм3) содержания Нф.

Далее проводили оценку показателей ДД30 ВГ в группах мышей, предварительно (за 4 сут до заражения) подучавших п/к инъекции Кн в дозах 1,25; 2,5; 5 и 10 мкг/г массы. Установлено, что ЛД50 ВГ (в ^ ЭИД5о/гол., ±195) достоверно понижались относительно Контроля-4:РХ+ВГ(1-5) (4,8+0,6) при введении Кн в дозах

5 мкг/г массы мыши (3,6±0,4) и 10 мкг/г массы мыши (ЗД±0,4), что свидетельствовало о снижении резистентности мышей к ВГ.

Для выяснения предположения, что пониженная резистентность к ВГ и повышенная летальность мышей могли быть следствием более высокой продукции ВГ к моменту гибели, были определены титры вируса в легких (ТВЛ) у павших мышей при использовании дня заражения 5ЛД50 ВГ (5,5 ЭИД50 ВГ на мышь, взятых из 2-го разведения ВАЖ) после предварительного введения Кн в дозах 1,25; 2,5; 5 и 10 мкг/г массы мыши и в контроле. Обнаружено, что ТВЛ (в 1§ ЭИД5о/мл, ±195) в Контроле-4:РХ+ВГ(2)и/н у мышей, павших через 5 сут п/з ВГ (7,3±0,5), были достоверно выше, чем у мышей, предварительно получавших Кн в любой из использованных доз: Опыт-4:Кн(1,25)+ВГ(2)и/н 4,7±1,0; Опыт-4:Кн(2,5)+ВГ(2)н/н 6,0±0,1; Опыт-4;Кн(5)+ВГ(2)и/н 6,0±0,1; Опыт-4:Кн(Ю)+ВГ(2)и/н 6,1±0,4.

Полученные данные не дали объяснения, почему летальность в группах мышей, получавших Кн в дозах 5 и 10 мкг/г массы, была выше, чем в контроле. По-видимому, увеличение смертности при инфицировании ВГ после предварительного введения Кн

в высоких дозах происходило из-за вовлечения других патологических процессов, исследование которых будет описано ниже.

Итак, было показано, что доза Кн 5 мкг/г массы мыши может быть использована при моделировании состояния пониженной резистентности к ВГ, поскольку она является достаточной для индукции характерных глюкокортикоидных эффектов в организме, тогда как Кн в дозе 10 мкг/г массы мыши вызывал нежелательные побочные эффекты (кахексию и гипертрофию печени). В связи с этим в дальнейших экспериментах для моделирования и исследования механизмов пониженной резистентности к ВГ мышам массой 15-17 г подкожно однократно вводили Кн в дозе 5 мкг/г массы мыши за 4 сут до заражения ВГ.

Далее было обнаружено, что через 1 и 2 сут после заражения 5,5 lg ЭИД50 ВГ и у контрольных мышей, и у мышей, предварительно получавших Кн, ТВЛ были одинаковыми (рис. 2). Однако через 3 сут п/з ВГ у мышей в Опыте-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н они достоверно повышались, а с 4-х сут и до 6-х сут ТВЛ, были существенно ниже относительно Контроля-4:РХ+ВГ(2)и/и (см. рис. 2).

По-видимому, снижение ТВЛ в поздние сроки у зараженных ВГ мышей, предварительно получавших Кн, обусловлено ускоренным разрушением клеток-мишеней для ВГ при его повышенной репродукции на ранних этапах (3 сут п/з ВГ) инфекционного процесса.

Рис. 2. Изменение титров ВГ в легких у мышей, зараженных ВГ через 4 сут после п/к инъекции Кн в дозе 5 мкг/г, и в инфицированном контроле.

Igs (95 %о-й доверительный интервал) рассчитан по методу Спирмана-Кербера.

* - отличие от контроля при р<0,05 для объединенных образцов в каждой точке от 6 тки both ых.

—О— Контроль-4: РХ+ВГ(2)и/н ■ Опыт-4:

Кн(5)+ВГ(2)и/н

Для выяснения одной из возможных причин повышения продукции ВГ на ранних этапах и ее снижения с 4-х сут инфекции в легких у мышей, получавших Кн,

по сравнению с легкими мышей в контроле были оценены титры суммарного ИФН-а/р, как фактора неспецифической противовирусной защиты (табл. 5).

Таблица 5. Динамика накопления ИФН-а/р в легких мышей, зараженных ВГ через 4 сут после введения кеналога (Кн) в дозе 5 мкг/г или раствора Хенкса (РХ) (М±т)

Группы мышей, п=3 Титры ИФН-а/р в легких (log2EД/мл) через 0,5-6 сут после заражения ВГ

0,5 1 2 3 4 5 6

Опыт-4: Кн(5)+ВГ(2)и/н 8,б±0,0 11,6±0,0 9,6±0,0 9,6±0,0 8,0±0,3* 6,6±0,0 5,6±0,0

Контроль-4: РХ+ВГ(2)и/н 8,6±0,0 11,6±0,0 9,6±0,0 10,3±0,3 10,3±0,3 6,6±0,0 5,6±0,0

Примечание: * - отличие от Контроля-4:РХ+ВГ(2)и/н при р=0,05.

При анализе полученных данных была выявлена не совсем обычная взаимосвязь между ТВЛ и титрами ИФН-а/р у инфицированных мышей, предварительно получавших Кн: через 3 сут п/з ВГ титры ИФН-а/р в легких начинали снижаться относительно контроля, а ТВЛ в это же время были достоверно выше по сравнению с контролем (см. рис. 2, табл. 5).

Значимое уменьшение концентрации ИФН-а/р в легких у мышей Опыта-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н наблюдалось через 4 сут п/з ВГ, но ТВЛ у них в это время были ниже, чем в контрольной группе (см. табл. 5, рис. 2), хотя на фоне ослабленного действия ИФН-а/р можно было ожидать повышение ТВЛ. Возможно, снижение уровня ИФН-а/р связано с уменьшением количества клеток, его продуцирующих, в том числе АМф, или с их функциональной супрессией у мышей в Опыте-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н через 3 и 4 сут п/з ВГ. Но это могло способствовать только повышению ТВЛ через 3 сут п/з ВГ на фоне действия Кн, тогда как снижение ТВЛ в последующие 4-6 сут, а также у павших мышей (5 сут) п/з ВГ нельзя связать с пониженным уровнем ИФН-а/р в легких в группе мышей, получавших Кн.

Возможно, что в легких у инфицированных ВГ мышей, предварительно получавших Кн, развиваются более ранние и более серьезные повреждения, приводящие к повышению летальности, по сравнению с контрольной инфицированной группой мышей. Для выяснения этого исследовали полутонкие срезы легких, что позволило выявить ряд патоморфологических отличий в реакции легочной ткани в ответ на заражение ВГ между контрольными мышами и предварительно получавшими Кн. Через 4 сут п/з ВГ у мышей, предварительно получавших Кн, воспалительная экссудация в легких была значительно более

выражена, чем у контрольных мышей через 5 сут п/з ВГ. Особенно существенным было то, что более обильный воспалительно-клеточный экссудат в полости альвеол у мышей опытной Группы состоял преимущественно из Нф(а) в отличие от мышей из группы контроля. Введение Кн перед инфицированием ВГ вызывало также увеличение абсолютного и относительного количества Нф(а) в БАЛЖ мышей. Можно предполагать, что развитие более сильного повреждения легких у мышей, инфицированных ВГ после предварительного введения Кн, было обусловлено, во-первых, увеличением количества Нф(а), обладающих высоким биоцидным потенциалом, а во-вторых, повышением восприимчивости органов дыхания к ВГ.

4. Исследование восприимчивости клеток-мишеней и активности фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к ВГ после введения кеналога

Восприимчивость легких и трахеи к ВГ оценивали после аэрогенного заражения ВГ мышей, получавших Кн в группе Опыт-5:Кн(5)+ВГ(1-5)а/г, и в Контроле-5:РХ+ВГ(1-5)а/г. АИД50 ВГ рассчитывали четырьмя способами в зависимости от значений С (в lg ЭИД50Л1 аэрозоля), CyT*W (в lg ЭИ До/го л.), OTxWxp, (в lg ЭИДзо/гол.), OTxWxp2 и OT*W*p3 (в lg ЭЩЫорган). При всех способах расчета АИД50 ВГ не было обнаружено повышения восприимчивости к ВГ мышей, предварительно получавших Кн. Определение 50 % клеточных инфицирующих доз (КИД50Н) ВГ для суспензий клеток легких и трахеи мышей также не выявило никаких различий между группами Опыт-5:Кн(5)+ВГ(1-5) in vitro и Контроль-5 :РХ+ВГ(1 -5) in vitro. Следовательно, предварительное подкожное введение мышам Кн не влияло на восприимчивость клеток-мишеней легких и трахеи к ВГ in vitro и не повышало восприимчивость легких и трахеи к ВГ in vivo.

Мы предположили, что пониженная резистентность мышей к ВГ на фоне действия Кн обусловлена изменением числа и функциональной активности АМф и Нф(а), как клеток противовирусной защиты и эффекторов воспаления. Для а/г заражения мышей была использована концентрация ВГ 2,75 lg ЭИД50/Л аэрозоля, при которой вдыхаемая доза ВГ по показателю CTW составляла 2,15 lg ЭИД50/ГОЛ., вызывала 100 % инфицирование легких и до 10 % летальности у мышей.

Было показано, что при инфицировании ВГ на фоне действия Кн происходит повышение количества (табл. 6), фагоцитарной (табл. 7) и супероксид-анион-продуцирующей (табл. 8) активности Нф(а) со значительным их преобладанием над количеством и функциональной активностью АМф.

Таблица 6. Соотношение абсолютных чисел (К) АМф и Нф(а) в БАЛЖ через 2 сут после а/г заражения ВГ у мышей, предварительно получавших кеналог (Кн) в дозе 5 мкг/г, и в группах сравнения (М±ш)

Группы мышей Абсолютные числа клеток и их соотношения

N АМф (х105/легкие) N Нф(а) (х105/легкие) N Нф(а) на 100 АМф

Опыт-3:Кн(5), 6 сут, п=4 0,86±0,03** 0,57±0,07* т 66±12** **

Опыт-5:Кн(5)+ВГ(2)а/г, 6 сут, п=5 3,11±0,97 6,48±0,91** 209±24** ®®

Контроль-5:РХ+ВГ(2)а/г, 6 сут, п=5 1,68±0,2 0,89±0,24* 53+6**

Контроль-3 :РХ, 6 сут, п=5 1,34+0,05 0,24±0,08 15+1

Примечание: * - отличие от Контроля-3:РХ при р<0,05, ** - при р<0,01; ®® - отличие от Контроля-5:РХ+ВГ(2)а/г при р<0,01; т - отличие от Контроля-З.'РХ и Опыта-5:Кн(5)+ВГ(2)а/г при р<0,01.

Таблица 7. Соотношение фагоцитарных потенциалов АМф и Нф(а) в БАЛЖ через 2 сут после а/г заражения ВГ у мышей, предварительно получавших кеналог (Кн) в дозе 5 мкг/г, и в группах сравнения (М+т)

Группы мышей Удельные фагої Не датарные активности (УФА) АМф и >(а) и их соотношения

УФА АМф (ХІ03 ЗГ) УФА Нф(а) (>=103ЗГ) N ЗГ на Нф(а) к 100 ЗГ на АМф

Опыт-3:Кн(5), 6 сут, п=4 49,3±6,1 199,1±21,9** 404±45**

Опыт-5:Кн(5)+ВГ(2)а/г, 6 сут, п=5 1483±12,1* 820,9±69,8** 555±44** ®®

Контроль-5:РХ+ВГ(2)а/г, 6 сут, п=5 89,7±11,6 45,2+5,8** 51±6**

Контроль-3:РХ, 6 сут, п=4 69,4+9,1 5,0±0,5 7+1

Примечание: * - отличие от Контроля-3:РХ при р<0,05, ** - при р<0,01; ®® - отличие от Контроля-5:РХ+ВГ(2)а/г при р<0,01.

Полученные результаты доказывают, что именно резкий дисбаланс между популяциями АМф и Нф(а) в легких и недостаточное осуществление АМф своей клиринговой функции, наблюдаемые после введения Кн и последующего заражения ВГ, являются основными причинами более сильных повреждений легких, а, следовательно, пониженной резистентности и повышенной гибели животных, инфицированных ВГ.

Таблица 8. Соотношение показателей удельной продукции супероксид анион-радикалов АМф и Нф(а) в БАЛЖ через 2 сут после а/г заражения ВГ у мышей, предварительно получавших кеналог (Кн) в дозе 5 мкг/г, и в группах сравнения (М±т)

Группы мышей Удельные продукции анион-радикалов (УПАР) АМф и Нф(а) и их соотношения

УПАРАМф (хЮ3 уел. ед.) УПАР Нф(а) (х 103 уел. ед.) N уел. ед. в Нф(а) к 100 уел. ед. в АМф

Опыт-3:Кн(5), 6 сут, п=4 15,37±2,45* 20,48±3,27** 135+21**

Опыт-5:Кн(5)+ВГ(2)а/г, 6 сут, п=5 181,3±30,7® 370,43±62,05** 206±46** ®®

Контроль-5:РХ+ВГ(2)а/г, 6 сут, п=5 39,44+9,07 14,63±3,50 35+8*

Контроль-3 :РХ, 6 сут, п=4 51,6719,8 5,14±0,87 8±2

Примечание: * - отличие от Контроля-З'.РХ при р<0,05, ** - при р<0,01; - отличие от

Контроля-5:РХ+ВГ(2)а/г при р<0,05,т - при р<0,01.

Далее был произведен поиск способа коррекции пониженной резистешности организма к ВГ, развившейся после предварительного введения Кн, посредством введения иммуностимулятора, способного увеличить численность и функциональную активность АМф, с целью уменьшения чрезмерных деструктивных процессов в легких.

5. Исследование возможности коррекции пониженной резистентности к ВГ, возникающей после введения кеналога. с помощью хитокарбоксиметилглихана

На основании литературных данных для стимуляции функциональной активности АМф был выбран представитель нового поколения иммуномодуляторов (l-3)-p-D гликанов - хитокарбоксиметилгликан (ХКМГ), являющийся производным клеточной стенки Aspergillus niger (Дергунова М.А., 2007; Young S-H., 2001; Kataoka К., 2002; Suram S., 2006). Мы полагали, что благодаря действию ХКМГ может быть достигнуто повышение количества и функциональной активности АМф, пониженной на фоне действия Кн, и, следовательно, это сможет предотвратить снижение резистентности организма к ВГ.

При сравнении с ЛД50 ВГ в Контроле-4:РХ+ВГ(1-5)и/н (4,8±0,4 lg ЭИДм/шл.) оказалось, что предварительное введение только одного ХКМГ мышам в группе Контроль-6:РХ+ХКМГ+ВГ(1-5)и/н не приводило к изменению ЛД50 ВГ (4,9±0,3 lg ЭИД50/ГОЛ.). Тогда как его применение на фоне действия Кн способствовало восстановлению резистентности мышей к ВГ до контрольного уровня, судя по

увеличению ЛД5„ ВГ в группе Опыт-6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(1-5)и/н (4,3±0,6 18 ЭИД50/ГОЛ.) относительно группы Опыт-4:Кн(5)+ВГ(1'5)и/н (3,6±0,5 ^ ЭИЛо/гол.).

Введение только одного ХКМГ до заражения ВГ не приводило к изменению ТВЛ у животных в группе Контроль-6:РХ+ХКМГ+ВГ(2)и/н (7,00±0,5 % ЭИД„/мл) по сравнению с Контролем-4:РХ+ВГ(2)и/н (6,85±0,4 1ё ЭИДц/мл) через 2 сут п/з ВГ. Однако, введение ХКМГ на фоне действия Кн способствовало достоверному, снижению ТВЛ (7,17±0,4 ^ЭИДо/мл) через 2 сут п/з ВГ у мышей этой группы относительно Опыта-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н (8,34±0,6 1ё ЭИД50/мл) до уровня контрольной инфицированной группы.

С учетом данных о достоверном повышении ТВЛ через 2 (8,34±0,6 ^ ЭИДц/мл) и 3 (8,5±0,6 1£ ЭИД50/МЛ) сут п/з ВГ и достоверном их понижении через 4 сут п/з ВГ у эвтаназированых мышей Опыта-4:Кн(5)+ВГ(2)н/н в двух экспериментах (4,5±0,4 и 5,67±0,7 ^ ЭИДц/мл) относительно Контроля-4:РХ+ВГ(2)и/н (8,1+0,6 и 6,68±0,3 1§ ЭИДг/мл) можно полагать, что в более ранние сроки п/з ВГ на фоне действия Кн происходило более сильное, связанное с повышенным размножением ВГ разрушение клеток-мишеней, а затем через 4 сут п/з ВГ из-за уменьшения количества вирус-продуцирующих клеток ТВЛ становились ниже, чем в группах без Кн.

Очевидно, на фоне пониженной резистентности к ВГ у мышей, получавших Кн, ХКМГ индуцировал процессы, ограничивающие усиленное размножение ВГ на начальных стадиях инфекции, что могло способствовать сохранению эпителиальных клеток-мишеней для ВГ и уменьшению повреждения легочной ткани при дальнейшем развитии гриппозного воспаления.

Для количественной оценки выраженности воспалительной реакции в легких при гриппозной инфекции на фоне действия Кн и ХКМГ было проведено морфометрическое исследование гистологических срезов легких в исследуемых группах. Показано, что уже через 2 сут п/з ВГ отмечались достоверные отличия по проценту площади среза респираторной области легких, занятой клеточными элементами, во всех инфицированных ВГ группах: Контроль-4:РХ+ВГ(2)и/н 49,38±1,08%; Контроль-6:РХ+ХКМГ+ВГ(2)и/н 46,25±1,57%; Опыт-6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/н 48,96±2,32 %; Опыт-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н 66,46±4,30 %; в отличие от неинфицированных групп: Контроль-3:РХ 21,10±1,43 %; Опыт-3:Кн(5) 22,51±1,57 %.

В разгар заболевания, то есть через 4 сут п/з ВГ, процент площади среза респираторной области, занятой клеточными элементами в группе Опыт-

4:Кн(5)+ВГ(2)и/п (80,25±4,11 %) бьш достоверно выше по сравнению с этим показателем в группах Контроль-4:РХ+ВГ(2)и/н (45,25±1,20 %) и Опыт-

6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/н (54,38±2,19 %). Это свидетельствовало о том, что введение Кн до инфицирования ВГ приводило к развитию более выраженной воспалительной реакции в легких за счет утолщения межальвеолярных перегородок вследствие отека и инфильтрации клеточными элементами, а введение ХКМГ на фоне действия Кн и последующего инфицирования ВГ приводило к ее снижению.

С целью более полного изучения гриппозного воспаления при и/н заражении 5 ЛД50 ВГ после введения Кн и ХКМГ были оценены изменения количества, фагоцитарной и супероксид-анион-продуцирующей активностей АМф и Нф(а) (табл. 9,10,11).

Инфицирование ВГ на фоне действия Кн сопровождалось существенным увеличением числа Нф(а) и их преобладанием над АМф, тогда как при введении ХКМГ на фоне действия Кн с последующим заражением ВГ происходило приближение этих показателей к уровням других групп сравнения (см. табл. 9).

Таблица 9. Соотношение абсолютных чисел (N) АМф и Нф(а) в БАЛЖ у мышей через 2 сут после инфицирования ВГ на фоне действия кеналога (Кн) и/или хитокарбоксиметилгликана (ХКМГ) и в группах сравнения (М±т)

Группы мышей N АМф и Нф(а) и их соотношения в БАЛЖ

ИАМф (х105/легкие) N Нф(а) (х105/легкие) N Нф(а) на 100 АМф

Опыт- 6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/н, п=4 1,64±0,09 1,14±0,13* 71±12*

Контроль- 6:РХ+ХКМГ+ВГ(2)и/н, п=4 2,30±0,33 1,92±0,19* 89±17*

Опыт-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н, п=4 2,33±0,73 4,87±0,97* 240±46** ш

Контроль-4:РХ+ВГ(2)и/, п=4 2,92±0,63 1,91 ±0,44* 66±6*

Опыт-3:Кн(5), б сут, п=4 1,21±0,04 0,53±0,04* m 49±1** m

Контроль-3 :РХ, 6 сут, п=5 1,34+0,05 1 0,24+0,08 15±1

Примечание: * - отличие от Контроля-3:РХ при р<0,05, **- при р<0,01; ® - отличие от Контроля-4:РХ+ВГ(2)и/н при р<0,05; ** - отличие от Опыта-4:Кн(5)+ВГ(2)и/н при р<0,01.

Введение ХКМГ на фоне действия Кн приводило к уменьшению дисбаланса между фагоцитарными потенциалами Нф(а) и АМф в группе Опыт-6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/и до уровня инфицированного контроля (см. табл. 10).

Введение ХКМГ способствовало сглаживанию дисбаланса между биоцидными потенциалами АМф и Нф(а) и восстановлению преобладания супероксид-анион-

продуцирующей активности АМф над таковой у Нф(а), что могло быть следствием стимулирующего действия ХКМГ на способность АМф вырабатывать такой мощный биоцидный фактор, как супероксид анион-радикалы (табл. 11).

Таблица 10. Соотношение фагоцитарных потенциалов АМф и Нф(а) в БАЛЖ у мышей через 2 сут после инфицирования ВГ на фоне действия кеналога (Кн) и/или хитокарбоксиметилгликана (ХКМГ) и в группах сравнения (М±т)

Группы мышей Удельные фагоцитарные активности (УФА) АМф и Нф(а) и их соотношения

УФА АМф (*103 ЗГ) УФА Нф(а) (хЮ3 ЗГ) N ЗГ на Нф(а) к 100 ЗГ на АМф

Опыт- 6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/и, п=4 84,2±9,4 75,3±5,6** 94±16*

Контроль- 6:РХ+ХКМГ+ВГ(2)и/н, п=4 124,9±26,8 78,5±16,3* 75±26

Опыт-4:Кн(5)+ВП2)и/н. п=4 1П,8±33,2 455,7±73,4**®# 456±69**®#

Контроль-4:РХ+ВГ(2)и/н, п=4 144,5+39,0 69,7±8,1** 57±11*

Опыт-3:Кн(5), 6 сут, п=4 49,3±6,1 199,1±21,9** Г 404145**

Контроль-3:РХ, 6 сут, п=4 69,4+9,1 5,0±0,5 7+1

Примечание: * - отличие от Контроля-3:РХ при р<0,05, ** - при р<0,01; ® - отличие от Контроля-4:РХ+ВГ(2)и/н при р<0,05; * - отличие от Опыта-6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/н при р<0,05.

Таблица 11. Соотношение супероксцд-анион-продуцирующих потенциалов АМф и Нф(а) в БАЛЖ у мышей через 2 сут после инфицирования 5 ЛД50 ВГ на фоне действия кеналога (Кн) и/или хитокарбоксиметилгликана (ХКМГ) и в группах сравнения (М±т)

Группы мышей Удельные продукции анион-радикалов (УПАР) АМф и Нф(а) и их соотношения

УЛАРАМф (хЮ3 уел. ед.) УЛАР Нф(а) (хЮ3 уел. ед.) N уел. ед. в Нф(а) к 100 уел. ед. в АМф

Опыт- 6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/н, п=4 81,50±9,84 52,30±7,33* 66±12*

Контроль- 6:РХ+ХКМГ+ВГ(2)и/н, п=4 163,75±53,31 63,60±8,82** 52±16

Опыт-4:Кн(5)+ВГГ2)и/н. п=4 106,85±21,60 238,70±47,59* 228±22** и а *

Контроль-4:РХ+ВГ(2)и/н, п=4 88,50±20,65 29,43±7,08 34±4*

Опыт-3:Кн(5), 6 сут, п=4 15,3712,45* 20,4813,27** 135121**

Контроль-3:РХ, 6 сут, п=4 51,67+9.8 5,1410,87 812

Примечание: * - отличие от Контроля-3:РХ при р<0,05, ** - при р<0,01; ® - отличие от Контроля-4;РХ+ВГ(2)и/н при р<0,05, — при р<0,01; - отличие от Опыта-

6:Кн(5)+ХКМГ+ВГ(2)и/н при р<0,05.

Полученные результаты подкреплены работами по применению биологических иммуностимуляторов при экспериментальном гриппе. Так, и/н введение Corynebacterium partum до заражения ВГ уменьшало продукцию ВГ, повреждение легких и гибель мышей, а также увеличивало титры ИФН и численность АМф в БАЛЖ (Мак N.K., 1983). Экстракты гликопротеинов Klebsiella pneumoniae оказывали защитный эффект у мышей, инфицированных ВГ, увеличивая количество АМф, Лф(а) и Нф(а), а также люминол-зависимую хемилюминесценцию АМф (Rudent A., 1987; Ounis I., 1992). Применение Лентинана (полисахарида базидиального гриба Lentinus edodes) до летальной инфекции ВГ уменьшало ТВЛ, увеличивало выживаемость мышей, число и хемилюминесценцию АМф (Irinoda K., 1992).

Таким образом, предварительное введение стимулятора макрофагальной активности ХКМГ на фоне действия Кн способствовало восстановлению резистентности мышей к ВГ до уровня инфицированного контроля (судя по лд» ВГ и степени повреждения легочной ткани). По-видимому, это было следствием стимуляции СМФ и восстановления количества и функциональной активности АМф, в результате чего в легких устранялось численное и биоцидное преимущество Нф(а) над АМф, и устанавливалось соотношение между популяциями этих фагоцитов, характерное для контрольной инфицированной группы.

Вместе с тем, известно, что иммуномодуляторы могут оказывать действие на разные звенья иммунитета, а их эффективность зависит от доз и сроков их введения до начала развития инфекционного процесса (Воробьев A.A., 2002; Хаитов P.M., 2009; Кирилличева Г.Б., 2011). В связи с этим, на следующем этапе работы исследовали влияние препаратов, созданных на основе полипренолов пихты сибирской Abies sibirica, обладающих иммуномодулирующей активностью, на резистентность мышей к ВГ в зависимости от доз и времени их введения.

6. Опенка влияния аэпогенного введения препаратов полипренолов _на резистентность мышей к ВГ и функциональную активность фагоцитов.легких

На основании результатов предварительных экспериментов для аэрозольного применения был выбран высокодисперсный препарат полипренолов (ПП) -стабильная наноэмульсия с мицеллами диаметром менее 0,1 мкм, содержащая в качестве эмульгатора 50-70 мг/мл Твина-80. С целью поиска оптимальных схем применения было проведено 70 экспериментов при однократном или двукратном а/г введении этого препарата в разных дозах от 1,4 до 10,86 мкг/мышь с последующим а/г заражением мышей разными дозами ВГ (0,5, 1, 5 и 50 АЛД(/гол.) через 1-7 сут после одной или двух аэрозольных обработок.

32

Для более детального изучения показателей иммунокомпетентных органов и клеток бронхоальвеолярного пространства были выбраны группы с наиболее демонстративными изменениями показателей выживаемости мышей при заражении 1 АЛД50 ВГ через I, 2 или 3 сут после предварительного введения ПП. В таблице 12 приведены доли выживших мышей в 7-ми группах при инфицировании 1 АЛД50 ВГ после введения аэрозоля ПП.

При двукратном введении ПП и инфицировании 1 АЛД;« ВГ через 3 сут после 2-й обработки в группах Опыт-8:ПП(а, Ь, с, (1)+ВГ зарегистрировано достоверное превышение доли выживших мышей по сравнению с контролем (табл. 12). В Опыте-8:ПП(е)+ВГ, при заражении ВГ через 2 сут после 2-й обработки ПП, процент выживаемости был достоверно ниже, чем в контроле. В группах мышей Опыт-8:ПП(Ы, Ь2)+ВГ, инфицированных ВГ через 1 и 2 сут после введения ПП, выживаемость мышей не отличалась от значений в контрольных группах (см. табл. 12).

Таблица 12. Доля (%) выживших мышей, инфицированных 1 АЛД50 ВГ через 1, 2 или 3 сут после 2-го аэрогенного введения препарата полипренолов (ПП), и в контроле

Доза и время заражения ВГ после введения ПП Группы мышей Доза ПП (мкг/мышь) при 2-кратном а/г введениил % выживших мышей

1 АЛДзо, 3 сут Опыт-8:ПП(а)+ВГ, п=12 4,56 и 6 (а) 83,3*

Опыт-8: ПП(Ь)+ВГ, п=8 6 и б (Ь) 100*

Опыт-8:ПП(с)+ВГ, п=12 7,08 и 6 (с) 83,3*

Опыт-8:ПП((1)+ВГ, п=12 9,6 и 6 ((1) 100*

Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ, п=22 РХиРХ 50,0

1 АЛД50, 2 сут Опыт-8:ПП(Ь2)+ВГ, п=10 6 и 6 (Ь2) 50,0*

Опыт-8:ПП(е)+ВГ, п=8 10,86 и 6 (е) 12,5* *

Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ, п=17 РХиРХ 52,9

1 АЛДзо, 1 сут Опыт-8:ПП(Ь1)+ВГ, п=10 6 и 6 (Ы) 40,0"

Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ, п=12 РХиРХ 50,0

Примечание: * - отличие от соответствующего Контроля-8:РХ(а/г)+ВГ по критерию )С при р<0,05;# - отличие от групп Опыт-8:ПП(а, Ь, с, с!)+ВГ по критерию х2 при р<0,05; л -интервал времени между 1-й и 2-й обработкой ПП составлял 48 ч; а, Ь, с, (1, е, Ы, Ь2 -вводимые дозы ПП.

Достоверное повышение ПИ тимуса и селезенки на всех сроках исследования было обнаружено только в группах Опыт-7:ПП(а) и Опыт-8:ПП(а)+ВГ, по сравнению с показателями в соответствующем контроле.

На момент заражения ВГ число клеток БАЛЖ во всех группах после введения ПП было достоверно выше Контроля-7:РХ(а/г) (3,79+0,27 х105/легкие). При этом процентное содержание АМф уменьшалось в 1,4-1,8 раза относительно Контроля-7:РХ(а/г) (65,4+4,1 %), а Нф(а) - увеличивалось, причем больше всего (в 3,7 раза) в Опыте-7:ПП(е) по сравнению с Контролем-7:РХ(а/г) (5,7+0,8 %). Доля Лф(а) была значимо повышена только в группах Опыт-7:ПП(а, Ь, с, сі) относительно Контроля-7:РХ(а/г) (28,9±2,3 %), с 3-кратным увеличением процентного содержания больших гранулярных Лф (ЫК клеток) по сравнению с Контролем-7:РХ(а/г) (7,4±0,8 %). Отмечено, что в Опыте-7:ПП(е) через 2 сут после введения ПП число Нф(а) увеличивалось наиболее значительно и превышало число Нф(а) в группах Опыт-7:ПП(а, Ь, с, «1, М, Ь2) перед заражением ВГ (табл. 13).

Через 2 сут п/з ВГ его титры в БАЛЖ были в группе Опыт-8:ПП(е)+ВГ с пониженной резистентностью к ВГ достоверно выше (6,83±0,55 ^ ЭЩЬо/мл) относительно Контроля-8:РХ(а/г)+ВГ (6,00±0,53 % ЭИДзо/мл), а в группах Опыт-8:ПП(а, Ь, с, (1)+ВГ - ниже, чем в соответствующих контрольных группах.

Через 2 сут после заражения ВГ во всех группах обнаружено увеличение общего числа клеток БАЛЖ и процентного содержания Нф(а). Также увеличивались численность АМф, Нф(а) и отношение Нф(а) к АМф по сравнению с показателями Контроля-7:РХ(а/г) (см. табл. 13). В группе Опыт-8:ПП(е)+ВГ, в которой наблюдалась повышенная летальность, число Нф(а) было самым высоким, а отношение числа Нф(а) к числу АМф повышалось, не только относительно соответствующего Контроля-8:РХ(а/г)+ВГ, но и относительно шести групп Опыт-8:ПП(Ы, Ь2, а, Ь, с, с1)+ВГ (см. табл. 13). Абсолютное число Лф(а), в том числе Ъ1К клеток, только в группах с повышенной резистентностью к ВГ становилось выше, чем до заражения.

Через 14 сут после заражения ВГ численность АМф была повышенной по сравнению с Контролем-7:РХ(а/г) абсолютно во всех группах (см. табл. 13). При этом во всех группах абсолютное число Нф(а) по-прежнему оставалось больше, чем в Контроле-7:РХ(а/г), а в группах с повышенной резистентностью к ВГ Опыт-8:ПП(а,

Ь, с, (1)+ВГ оно становилось больше, чем через 2 сут п/з ВГ, и было выше, чем в соответствующем Контроле-8:РХ(а/г)+ВГ (см. табл. 13).

Отмечено, что через 14 сут п/з ВГ абсолютно во всех группах мышей численность Лф(а) и отношение числа Лф(а) к числу АМф уменьшались относительно тех показателей, которые наблюдались через 2 сут развития инфекции.

Таблица 13. Абсолютные числа (N) АМф и Нф(а) и их соотношения в БАЛЖ до и после заражения ВГ у мышей, двукратно обработанных аэрозолем препарата полипренолов (ПП) в разных дозах, и в контроле (М±ш)

Группы мышей Показатели клеток БАЛЖ Время после заражения вирусом гриппа

До заражения 2 сут 14 сут

Опыт-8:ПП(а)+ВГ 3 сут, п=5,4,5 N АМф х 103/легкие 2,9±0,2 7,610,7*м 8,3±0,4*

N Нф(а) х105/легкие 0,6±0,1* 3,б±0,2*4 5,4±0,5**т

N Нф(а) на 100 АМф 2112* 47±3**4 66±7*#

Опыт-8:ПП(Ь)+ВГ 3 сут, п=5,4,5 N АМф х105/легкие 3,310,2* 8,9±0,9** 9,5±0,9*

N Нф(а) х105/легкие 0,6±0,1* 4,6±0,4*4 6,2±0,5**т

N Нф(а) на 100 АМф 18±1* 51±3*#А 67±7**

Опыт-8:ПП(с)+ВГ 3 сут, п=5,4,5 N АМф х 105/легкие 3,810,2* 8,7±0,9*#л 8,9±0,5*

N Нф(а) х105/легкие 0,б±0,1* 4,7±0,4*л 6,4±0,5*"т

N Нф(а) на 100 АМф 15±1* 54±4*#л 70±7**

Опыт-8:ПП(<1)+ВГ 3 сут, п=5,4,5 N АМф х 10’/легкие 3,6±0,2* 8,0±0,7**л 9,2±0,7*

N Нф(а) х105/легкне 1,2±0,1* 4,7±0,4*л 6,1±0,5*#т

N Нф(а) на 100 АМф 33±2* 59±4*#л 67±5*"

Контролі,-8:РХ(а/г)+ВГ 3 сут, п=5,4, 5 N АМф х105/легкие 2,4+0,1 4,5±0,4* 6,0±0,5*т

N Нф(а) х105/легкие 0,2±0,02 3,6+0,2* 1,5±0,4*т

N Нф(а) на 100 АМф 9+1 73+4* 27+4*т

Опыт- 8:ПП(Ь2)+ВГ 2 сут, п=5,4,5 N АМф х103/легкие 4,010,6* 7,1±0,5**л 7,210,4*

N Нф(а) х 105/легкие 0,9±0,1* 4,8±0,5*#л 4,510,3*

N Нф(а) на 100 АМф 1911* 67±4*л 6214**

Опыт-8:ПП(е)+ВГ 2 сут, п=5,4,1 N АМф х105/легкие 3,710,2* 6,9±0,4*м 5,36

N Нф(а) х 105/легкие 1,810,1** 6,2±0,4**ЛА 3,89

N Нф(а) на 100 АМф 5014** 90±4**а" 73

Контроль- N АМф х 103/легкие 2,4+0,1 4,7±0,3* 6,510,4* т

2 сут, п=5,4, 5 N Нф(а) х105/легкие 0,2+0,02 3,4+0,2* 1,610,1*т

N Нф(а) на 100 АМф 9±1 71±3* 24±3*т

Опыт- 8:ПП(Ы)+ВГ 1 сут, п=5,4,4 N АМф х105/легкие 4,4±0,2* 5,4±0,3*л 5,910,5*

N Нф(а) х 105/легкие 0,710,1* 3,5+0,2*4 2,610,2* т

N Нф(а) на 100 АМф 17±1* 62±4*л 4413**т

Контроль- N АМф х105/легкие 2,4±0,1 4,8±0,2* 6,310,4* т

1 сут, п=5,4, 5 N Нф(а) х 105/легкие 0,2+0,02 3,5±0,2* 1,9Ю,1*Т

МНф(а) на 100 АМф 9±1 70±4* 20+2*т

Контроль- N АМф х105/легкие 2,4+0,1

1, 2, 3 сут, п=8 N Нф(а) х 105/леткие 0,2+0,02

N Нф(а) на 100 АМф 9+1

Примечание к таблице 13: До заражения представлены показатели соответствующих групп Опыт-7:ПП(Ы, Ь2, е, а, Ь, с, d); * - отличие от Ко1ТП>оля-7:РХ(а/г) при р<0,05; - отличие

от групп Опыт-7:ПП(Ы, Ь2, а, Ь, с, d) при р<0,05; - отличие от соответствующих групп Контроль-8 : РХ(а/г)+ВГ при р<0,05; 4 - отличие от групп Опыт-8:ПП(Ы, a, b, с, d)+Br при р<0,05; " - отличие от групп Опыт-8:ПП(Ы, Ь2, а, Ь, с, d)+Br при р<0,05;4 - отличие от показателя до заражения ВГ при р5:0,05\ - отличие от показателя через 2 сут после

заражения ВГ при р<0,05; а, Ь, с, d, с, Ы, Ь2 - вводимые дозы ПП.

Далее было показано, что удельные фагоцитарные активности (УФА) АМф и Нф(а) повышались во всех группах мышей, обработанных аэрозолем ПП, до и после инфицирования ВГ относительно К о иг р ол я - 7 ; Р X (¡у г). Отношение УФА Нф(а) к УФА АМф в группах Опыт-7:ПП(Ь2, е, a, b, d) было выше, чем в Контроле-7:РХ(а/г), в группе Опыт-7:ПП(е) - выше, чем в других группах после введения ПП (рис. 3).

Через 2 сут п/з ВГ отношение УФА Нф(а) к УФА АМф в группах Опыт-8:ПП(Ы, Ь2, а, Ь, с, dJ+ВГ было ниже соответствующего Контроля-8:РХ(а/г)+ВГ, тогда как в Опыте-8:ПП(е)+ВГ с пониженной резистентностью к ВГ от инфицированного контроля не отличалось. Более того, в группе Опыт-8: ПП(е)+ВГ это отношение было достоверно выше, чем в Опыте-8:ПП(Ы, Ь2)+ВГ и в группах с повышенной резистентностью к ВГ Опыт-8:ПП(а, Ь, с, d)+Br (см. рис. 3).

Через 14 сут п/з ВГ во всех группах отношение УФА Нф(а) к УФА АМф оставалось выше, чем в неинфицированном контроле не менее чем в 4,5 раза (см. рис. 3).

После введения ПП в соответствующих дозах УПАР АМф и Нф(а) повышались во всех группах Опыт-7:ПП(Ы, Ь2, е, а, Ь, с, d) и Опыт-8:ПП(Ы, Ь2, е, а, Ь, с, d)+Br относительно Контроля-7:РХ(а/г). Отношение УПАР Нф(а) к УПАР АМф в Опыте-7:ПП(е) было выше, чем после введения ПП в других группах (рис. 4).

Через 2 сут п/з ВГ в контрольных инфицированных группах, а также в Опыте-8:ПП(Ы, Ь2)+ВГ и в Опыте-8:ПП(е)+ВГ с более низкой выживаемостью мышей, чем в группах Опыт-8:ПП(а, Ь, с, d)+Br, отношение УПАР Нф(а) к УПАР АМф было выше, чем в последних группах (см. рис. 4).

Через 14 сут п/з ВГ во всех группах соотношения УПАР Нф(а) и АМф оставались на более высоком уровне относительно Контроля-7:РХ(а/г) (см. рис. 4).

Таким образом, после применения ПП, обладающих иммуномодулирующим эффектом, численность и функциональная активность АМф в случаях повышенной резистентности мышей к ВГ была выше, чем при пониженной резистентности к ВГ. Напротив, при пониженной резистентности мышей к ВГ численность и функциональная активность Нф(а) была более высокой, чем при повышенной резистентности к ВГ, что может быть связано с более мощными провоспалительными, чем противовирусными, эффектами Нф(а) при гриппозной инфекции (Silva М.Т., 2010; Tumpey Т.М., 2005; Wareing M.D., 2007; Wang J.P., 2008).

со н

11 < 1_

< 01 € §

*

4 +

• 1

*11 £г* * 1

.: X ■ ¡1*1 : 1

до заражения ВГ

2 сут 14 сут

время после заражения ВГ

Рис. 3. Соотношения удельных фагоцитарных активностей (УФА) Нф(а) и АМф в БАЛЖ у мышей, инфицированных ВГ через 1, 2 или 3 суг после введения препарата

полипренолов (ПП) в разных дозах (а, Ь,

с, <1, е, Ы, Ь2), и в контроле.___________

! Е "<

-9- I

5 « < с

О- !: <;

?! 6

Т1

до заражения ВГ

2сут 14 сут

время после заражения ВГ

Рис. 4. Соотношения удельных продукций анион-радикалов (УПАР) Нф(а) и АМф в БАЛЖ у мышей,

инфицированных ВГ через 1, 2 или 3 сут после введения препарата

полипренолов (ПП) в разных дозах (а, Ь, с, б, е, Ы, Ь2), и в контроле.___________

Обозначения на рис. 3 и 4:

до заражения ВГ Контроль-7;РХ(а/г) 1, 2, 3 сут, п=8; Контроль~7:РХ(а/г) 1, 2, 3 сут, п=8; Опыт-7:ПП(Ы) 1 сут, п=5;

Контроль-7:РХ(а/г) I, 2, 3 сут, п=8; Опыт-7:ПП(Ъ2) 2 сут, п=5; Опыт-7;ПП(е) 2 сут, п=5; Контроль-7:РХ(а/г) 1, 2, 3 сут, п=8; Опыт-7:ПП(а) 3 сут, п=5; Опыт-7:ПП(Ь) 3 сут, п=5; Опыт-7:ПП(с) 3 сут, п=5; Опыт-7:ПП((1) 3 сут, п-5;

□

О

■

□

□

2 и 14 сут после заражения ВГ Контроль-7:РХ(а/г) 1, 2,3 сут, п=8; Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ 1 сут, п=4 и п=5; Опыт-8:ПП(Ы)+ВГ 1 сут, п=4 и п=4; Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ 2 сут, п=4 и п=5; Опыт-8:ПП(Ь2)+ВГ 2 сут, п=4 и п=5; Опыт-8: ПП(е)+ВГ 2 сут, п=4 и п=1; Контроль-8:РХ(а/г)+ВГ 3 сут, п=4 и п=5; Опыт-8:ПП(а)+ВГ 3 сут, п=4 и п=5; Опыт-8:ПП(Ь)+ВГ 3 сут, п=4 и п=5; Опыт-8:ПП(с)+ВГ 3 сут, п=4 и п=5; Опыт-8:ПП(с1)+ВГ 3 сут, п=4 и п=5;

* - отличие от Контроля-7:РХ(а/г) при р<0,05;

+ - отличие от соответствующего Контроля-8:РХ(а/г)+ВГ при р<0,05;

• - отличие от групп Опыт-7:ПП(Ы, Ь2, а, Ь, с, (1) при р<0,05;

•Ж - отличие от групп Опыт-8:ПП(а, Ь, с, (1)+ВГ при р<0,05;

4 - отличие от показателя до заражения ВГ при р<0,05;

г - отличне от показателя через 2 сут после заражения ВГ при р<0,05.

В целом, по результатам работы можно сделать заключение, что если заражение ВГ происходит в тот период, когда после применения иммуномодуляторов различной природы и направленности действия наблюдается преимущественная стимуляция Нф(а), а не АМф, то развитие гриппозного воспаления приобретает более неблагоприятный характер. Это обусловлено повышенной провоспалительной и деструктивной активностью Нф(а), которая не сбалансирована противовирусной и клиринговой активностью АМф, что приводит к увеличению нейтрофил-зависимых и вирус-ассоциированных повреждений легких и, как следствие, к повышению летальности животных, свидетельствующему о понижении их резистентности к ВГ (рис. 5).

Приток Нф в альвеолы

Размножение ВГ. Секреция вМ-ОТ, 1Ы5, іиб, МСР-1. МТР-ф. Некроз клеток И выброс МІР

Увеличение

разрушения

легких.

Повышение

гибели животных. Понижение резистентности отанизма к ВГ.

Кровеносный сосуд

Продукция 11.-8, ІЬ-ір, МІР-1а, М1Р-1Р

\ щ

Альвеола Выброс эластазы.

сидазы, 02\

Продукция О-Г, N0 и др.

1РЫ-а, ТЫ}“-а

Рис. 5. Схема влияния повышенной численности и функциональной активности Нф(а) по сравнению аналогичными показателями АМф после применения иммуномодуляторов до заражения ВГ на развитие гриппозного воспаления, повреждение легких и резистентность организма к ВГ.

#- ВГ; - Нф, в том^исле Нф(а); АМф; - эпителиальная клетка;

- разрушенная эпителиальная клетка.

выводы

1. Развитие гранулоцитоза в крови и подавление клиринговой активности альвеолярных макрофагов при использовании глюкокортикоидов в высоких фармакологических дозах сопровождается увеличением численности и биоцидных возможностей популяции нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве, что создает угрозу нейтрофил-зависимых повреждений легких.

2. Повышение численности нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве на фоне индуцированного глюкокортикоидами гранулоцитоза обусловлено направленной миграцией циркулирующих нейтрофилов в легкие и сопряжено с перераспределением нейтрофилов между компартментами организма. Об этом свидетельствует увеличение численности и функциональной активности популяции нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве и уменьшение этих параметров популяции нейтрофилов в перитонеальной полости.

3. Увеличение летальности животных и степени повреждения легочной ткани при пониженной резистентности к вирусу гриппа, обусловленной высоким уровнем глюкокортикоидов в организме, связано не с повышением восприимчивости клеток-мишеней к вирусу гриппа, а с усилением в легких деструктивного потенциала популяции нейтрофилов на фоне снижения биоцидных и фагоцитарных возможностей популяции альвеолярных макрофагов.

4. Стимуляция системы мононуклеарных фагоцитов

хитокарбоксиметилгликаном предотвращает снижение резистентности организма к вирусу гриппа под влиянием кеналога. При этом степень деструкции легочной ткани уменьшается, что ассоциируется со снижением в легких провоспалительного потенциала нейтрофилов и восстановлением количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов, устраняющих численное преимущество нейтрофилов в легких и сохраняющих такой же баланс между популяциями этих фагоцитов, как инфицированной контрольной группе.

5. Изменение функционального статуса макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства после применения препаратов полипренолов в различных схемах и дозах детерминирует повышение или понижение резистентности организма к вирусу гриппа. При этом повышение резистентности организма к вирусу гриппа достигается при преимущественном увеличении численности лимфоцитов и альвеолярных макрофагов, а не нейтрофилов.

6. Пониженная резистентность организма к вирусу гриппа после применения препаратов полипренолов обусловлена повышенной провоспалительной, деструктивной активностью нейтрофилов в легких. В этом случае развитие гриппозного воспаления, приводящее к увеличению летальности животных, сопряжено с доминирующей стимуляцией функциональной активности популяции нейтрофилов и относительно более слабой стимуляцией биоцидной и фагоцитарной активности популяции альвеолярных макрофагов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в отечественных научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов докторских диссертационных работ

1. Глюкокортикоид-зависимое возрастание в легких фагоцитирующего пула / М.И. Игнатьева, О.П. Макарова, Л.Н. Шишкина, Е.В. Клец, Д.Н. Маянский И Бюл. СО РАМН-1992,-№4,-С. 117-121.

2. Перестройка фагоцитарного пула легких под влиянием глюкокортикоидов / М.И. Игнатьева, О.П. Макарова, Л.Н. Шишкина, Е.В. Клец, Д.Н. Маянский // Паггол. Физиология и эксперим. терапия.- 1993.-№3 -С. 33-36.

3. Некоторые патогенетические характеристики гриппозной инфекции у белых мышей / О.Г. Пьянкова, Л.Е. Булычев, А.Н. Сергеев, В.А. Петрищенко, О.В. Пьянков, В.А. Жуков, А.Б. Рыжиков, Н.Г. Колесникова, Н.К. Евтин, Л.Н. Шишкина // Вопр. Вирусол.-

1997.-№5.-С. 216-218.

4. Сравнительная оценка генерации анион-радикалов альвеолярными макрофагами при фагоцитозе зимозановых гранул / Л.Н. Шишкина, Д.Д. Цырендоржиев, A.B. Шишкин, Д.Н. Маянский // Иммунология,- 1998,- № 2.- С. 36-39.

5. Провоспалительная активность бронхоальвеолярной лаважной жидкости при обострении хронических заболеваний легких / Д.Н. Маянский, О.П. Макарова, Л.Н. Шишкина, Н.П. Воронина, А.П. Огиренко, С.М. Егунова, С.Г. Чувакин II Пульмонологня,-

1998.- №4,- С. 44-50.

6. Некоторые аспекты интерферонообразования в организме белых мышей / Л.Е. Булычев, Е.П. Гончарова, О.Г. Пьянкова, А.Н. Сергеев, А.Б. Рыжиков, О.В. Пьянков, Л.Н. Шишкина, В.А. Петрищенко // Вестник РАМН,- 1998,- № 4.- С. 34-37.

7. Чувствительность белых мышей к вирусу гриппа (А/АИЧИ/2/68) при аэрогенном заражении / А.Н. Сергеев, О.Г. Пьянкова, Л.Е. Булычев, В.А. Петрищенко, О.В. Пьянков,

В.А. Жуков, А.Б. Рыжиков, Л.Н. Шишкина, Л.А. Котляров, В.Д. Порываев // Вопр. Вирусол.- 1999,- Т. 44, № 2.- С. 69-71.

8. Влияние глюкокортикоидного иммунодепрессанта кеналога на устойчивость мышей к вирусу гриппа (A/Aichi/2/68) / Л.Н. Шишкина, А.Н. Сергеев, О.Г. Пьянкова, Л.Г. Булычев, В.А. Петрищенко, A.B. Шишкин, Г.А. Буряк, Бочаров Е.Ф., Жуков В.А. // ЖМЭИ -

1999.-№4,-С. 88-89.

9. Изменение устойчивости мышей к вирусу гриппа (A/Aichi/2/68) под влиянием глюкокортикоидного иммунодепрессанта кеналога / JI.H. Шишкина, А.Н. Сергеев, О.Г. Пьянкова, Л.Г. Булычев, В.А. Петрищенко, A.B. Шишкин, Г А. Буряк, Е.Ф. Бочаров, В.А. Жуков // Вопр. Вирусол.- 1999 - Т. 44, № 6.-С. 272-275.

10. Механизмы резистентности мышей к вирусу гриппа А/Аичи/2/68 при профилактическом введении полипренолов / Л.Н. Шишкина, A.C. Сафатов, А.Н. Сергеев,

0.В. Пьянков, В.Д. Порываев, Л.Е. Булычев, В.А. Петрищенко, О.Г. Пьянкова, В.А. Жуков, А.Б. Рыжиков, А.Н. Болдырев, Г А. Буряк, В.А. Ралдугин, Т.П. Кукина // Вопр. Вирусол.-2001.-Т. 46,№3,-С. 34-38.

11. Профилактическая эффективность аэрозолей препаратов на основе полипренолов пихты сибирской при экспериментальной гриппозной инфекции / А.Н. Сергеев, A.C. Сафатов, О.В. Пьянков, Л.Е. Булычев, В.А. Жуков, А.Г. Алексеева, В.А. Петрищенко, Л.Н. Шишкина, В.Д. Порываев, А.Г. Глотов // Вопр. Вирусол,-2001.-№ 6,-С. 24-28.

12. Механизмы действия аэрозолей препаратов на основе полипренолов пихты сибирской при экспериментальной гриппозной инфекции / Л.Н. Шишкина, A.C. Сафатов,

A.Н. Сергеев, В.А. Жуков, Л.Е. Булычев, О.В. Пьянков, В.Д. Порываев, О.Г. Пьянкова, Г.А. Буряк, Е.П. Гончарова// Вопр. Вирусол.- 2001.-Ns 6 -С. 28-33.

13. Клеточные реакции в легких при обострении хронических заболеваний органов дыхания / О.П. Макарова, Л.Н. Шишкина, А.П. Огиренко, С.М. Насонова, С.Г. Чувакин // Пульмонология.- 2001.- № 2,- С. 63-68.

14. Простой метод прямой оценки инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно зараженных вирусом гриппа / А.Н. Сергеев, В.А. Жуков, В.Д. Порываев, О.В. Пьянков, Л.Н. Шишкина, В.А. Петрищенко, О.Г. Пьянкова, Л.Е. Булычев, A.C. Сафатов // Вопр. Вирусол,- 2002 - № 4 - С. 44-46.

15. Функциональная активность альвеолярных макрофагов при обострении туберкулеза легких / О.П. Макарова, Л.Н. Шишкина, А.П. Огиренко, С.М. Егунова, С.Г. Чувакин // Проблемы туберкулеза и болезней легких - 2003,- № 11,- С. 29-32.

16. Восприимчивость клеток легких у мышей и крыс к вирусу гриппа при инфицировании in vitro и in vivo / A.A. Сергеев, Л.Н. Шишкина, В.А. Жуков, А.Н. Сергеев,

B.А. Петрищенко, И.В. Фанкин, О.В. Пьянков, Е.И. Рябчикова, Е.М. Малкова, A.A. Воробьев // Вестник РАМН - 2004. - № 8 - С. 15-18.

17. Новый комплекс для получения и изучения монодисперсных микробиологических аэрозолей в медико-биологических исследованиях У В.А. Жуков, A.C. Сафатов, О.В. Пьянков, B.C. Топорков, A.A. Сергеев, С.А. Киселев, В.А. Яшин, Н.М. Беляев, Е.И. Рябчикова, A.B. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.A. Медведев, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев,

A.A. Воробьев // Вестник РАМН,- 2004,- № 8 - С. 11-15.

18. Получение и культивирование первичных культур клеток легкого экспериментальных животных для изучения продуктивных свойств вируса гриппа / А.А. Сергеев, Л.Н. Шишкина, В.А. Жуков, А.Н. Сергеев, О.В. Пьянков, В.А. Петрищенко, Е.М. Малкова, М.Н. Смоленцев // Успехи современного естествознания,- 2004,- № 6.- Приложение

1,-Т. 1.-С. 137-138.

19. Функциональная активность альвеолярных макрофагов и нейтрофилов после введения синтетического глюкокортикоида кеналога / М.А. Сметанникова, Л.Н. Шишкина,

B.А. Жуков, И.В. Фанкин, О.В. Пьянков, А.А. Сергеев, В.А. Петрищенко, Л.В. Колесникова,

В.В. Омигов, А.Н. Сергеев // Бюллетень сибирской медицины. Научно-практический журнал,-2005.-Т. 4,-Приложение 1.-С. 100.

20. Влияние глюкокортикоидной иммуносупрессии на течение экспериментальной гриппозной инфекции / МА. Сметанникова, JI.H. Шишкина, A.A. Сергеев, И.В. Фанкин, JI.E. Булычев, Л.В. Колесникова, В.В. Омигов, Е.М. Малкова, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев, В.А. Жуков // Вестник РАМН - 2006.- № 6,- С. 22-27.

21. Проверка возможности прогнозирования восприимчивости хозяина к инфекции гриппа, используя данные экспериментов с первичными клетками / В.А. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.A. Сергеев, И.В. Фанкин, М.А. Сметанникова, О.В. Пьянков, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев, A.A. Воробьев // Российский биомедицинский журнал, Medline.ru.- июль 2006,- Т. 7.- Ст. 16,- С. 195-204. URL: http.7/www.medline.ru/public/last/ (цит. 11.07.2011).

22. Изучение восприимчивости и продуктивности реснитчатых клеток и альвеолоцитов 1-го и 2-го типов мышей при заражении вирусом гриппа in vitro / В.А. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.A. Сергеев, Е.М. Малкова, Е.И. Рябчикова, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев,

Н.В. Устюжанина, A.A. Воробьев // Российский биомедицинский журнал, Medline.ru- июль 2006.- Т. 7.- Ст. 17.- С. 205-213. URL: http://www.medline.ru/public/last/ (цит. 11.07.2011).

23. Восприимчивость клеток-мишеней и активность фагоцитов легких при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа на фоне глюкокортикоидной иммуносупрессии / М.А. Сметанникова, Л.Н. Шишкина, В.А. Жуков, И.В. Фанкин, A.A. Сергеев, М.О. Скарнович, О.В. Пьянков, В.А. Петрищенко, В.Н. Бондаренко, А.Н. Сергеев // Вестник РАМН,-2007,-№1,- С. 3-8.

24. Изучение возможности прогнозирования чувствительности к гриппу различных отделов респираторного тракта хозяина / В.А. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.A. Сергеев, И.В. Фанкин, М.А. Сметанникова, О.В. Пьянков, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев, А.А Воробьев // Вестник РАМН,- 2007,- № 5,- С. 32-37.

25. Провоспалительная активность бронхоальвеолярной лаважной жидкости больных при обострении туберкулеза легких / О.П. Макарова, Д.Д. Цырендоржиев, Л.Н. Шишкина, А.П. Огиренко, С.Г. Чувакин // Проблемы туберкулеза и болезней легких,- 2007.- № 3.- С. 2833.

26. Сравнительный анализ восприимчивости и продуктивности клеток-мишеней респираторного тракта мышей и крыс при заражении вирусом гриппа in vitro / В.А. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.A. Сергеев, Е.М. Малкова, Е.И. Рябчикова, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев, Н.В. Устюжанина, Ю.В, Несвижский, A.A. Воробьев // Вестник РАМН,- 2008,- №

2,-С. 12-16.

27. Количественная оценка in vitro вирус-гриппа нейтрализующей активности секреторных факторов легких крыс / В.А. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.A. Сергеев, И.В. Плясунов, О.В. Пьянков, В.А. Петрищенко, А.Н. Сергеев, Б.Н. Зайцев, Ю.В. Несвижский, A.A. Воробьев // Вестник РАМН.- 2009.- №11.- С. 46-49.

28. Валидация модифицированного алгоритма прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусам с учетом параметров восприимчивости первичных культур клеток-мишеней и факторов врожденного иммунитета / В.А. Жуков, Л.Н. Шишкина, A.C. Сафатов, A.A. Сергеев, О.В. Пьянков, В.А. Петрищенко, Б.Н. Зайцев, B.C. Топорков, А.Н. Сергеев, Ю.В. Несвижский, A.A. Воробьев//ВестникРАМН.-2010.-№5.-С.24-29.

29. Шишкина Л.Н. Влияние глюкокортикоида кеналога на функциональную активность макрофагов и нейтрофилов легких и першонеальной полости / Л.Н. Шишкина, Е.М. Малкова // Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 2011.- № 1,- С. 31-37.

30. Шишкина Л.Н. Миграция 51Сг-меченых нейтрофилов в легкие после введения крысам глюкокортикоида кеналога / Л.Н. Шишкина, Е.М. Малкова // Вестник РАМН,-2011.-N2 8.-C. 6-11.

Статьи в зарубежных рецензируемых научных изданиях

1. Effect of intramusculary injected poyprenols on influenza virus infection in mice / A.S. Safatov, A.N. Sergeev, L.N. Shishkina, O.V. Pyankov, V.D. Poryvaev, L.E. Bulychev, V.A. Petrishchenko, O.G. Pyankova, V.A. Zhukov, A.B. Ryzhikov, A.N. Boldyrev, G.A. Buryak, V.A. Raldugin, T.P. Kukina, G.A. Tolstikov // Antiviral Chem. & Chemotherapy.- 2000 - Vol 11 №3-P. 239-247.

2. The display or realization of virulence of Influenza A/Aichi/2/68 virus in mice after influence of immunomodulators / L.N. Shishkina, A.N. Sergeev, A.S. Safatov, L.V. Kolesnikova, L.E. Bulychev, V.A. Petrishenko, O.G. Piankova, V.D. Poryvaev, O.V. Piankov, V.A. Zhukov // IDR, The Infectious Disease Review.- 2001, Suppl. № 3,- P. 127-136.

3. A prototype prophylactic anti-influenza preparation in aerosol form on the basis of Abies sibirica polyprenols / A.S. Safatov, A.N. Boldyrev, L.E. Bulychev, G.A. Buryak, T.P. Kukina, V.D. Poryvaev, O.V. P'yankov, V.A. Raldugin, A.B. Ryzhikov, A.N. Sergeev, L.N. Shishkina, G.A. Tolstikov, V.A. Zhukov // J. of Aerosol Medicine.- 2005 - Vol. 18, № 1- P. 55-62.

4. Neutrophil Responsiveness and Proinflammatory Activity of Bronchoalveolar Lavage Fluid in Patients on Exacerbation of Pulmonary Tuberculosis / O.P. Makarova, L.N. Shishkina, A.P. Ogirenko, V.A. Shkurupiy // Neutrophils: Lifespan, Functions and Roles in Disease / Eds. J.E DeFranco.-N.Y.: “NOVA Publishers”.- 2010,- P. 325-336.

Патенты

1. Шишкина Л.Н. Способ оценки прооксидантной и антиоксидантной активности биохимических и физических факторов / Л.Н. Шишкина // Патент РФ на изобретение № 2130181 от 10.05.99.

2. Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций / А.С. Сафатов, Л.Н. Шишкина, В.Д. Порываев, А.Н. Болдырев, Л.Е. Булычев, А.Н. Сергеев, О.В. Пьянков, В.А. Жуков, А.Б. Рыжиков, Г.А. Буряк, Т.П. Кукина, В.А. Ралдугин, Г А, Толстиков //Патент RU (И) 2189231 (13)С1 от 20.09.2002.

Материалы конференций и тезисы докладов

По результатам диссертации опубликовано 48 тезисов в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях.

Соискатель

Шишкина Л.Н.

Шишкина Лариса Николаевна -

Роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии острой респираторной вирусной инфекции при использовании иммуномодуляторов

Автореф. дисс. на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 23.01.2012.

Уел. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз.

Типография Института катализа им. Т.К. Борескова СО РАН

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а/г - аэрогенный, аэрогенно

АИД50 - 50 % аэрогенная инфицирующая доза вируса

АМф - альвеолярные макрофаги

БАЛЖ - бронхоальвеолярная лаважная жидкость

ВАЖ - вирусаллангоисная жидкость

в/б - внутрибрюшинный, внутрибрюшинно

в/в - внутривенный, внутривенно

ВГ - вирус гриппа

+ д - диформазан-положительные, с отложениями диформазана

ЕК — естественные киллеры (натуральные киллерные клетки — ЫК-клетки)

ЗГ -зимозановые гранулы, зимозан

и/н - шпраназальный, интраназально

ИПАР - индекс продукции анион-радикалов

ИФН - интерферон

КИДзоН - 50 % клеточная инфицирующая доза вируса на 1 млн. клеток

Кн - кеналог

ЛД50 - 50 % летальная доза вируса

Лф - лимфоциты

Лф(а) - лимфоциты в бронхоальвеолярной лаважной жидкости

Мф - макрофаги

нет - нигросиний тетразолий

Нф - нейтрофилы

Нф(а) - нейтрофилы в бронхоальвеолярной лаважной жидкости

Нф(п) - нейтрофилы в перитонеальной лаважной жидкости

п/з - после заражения

ПИ - почечные индексы органов (тимуса, селезенки, надпочечника и др.)

п/к - подкожный, подкожно

ПМф - перитонеальные макрофаги

ПП - препараты полипренолов

Пр - преднизолон

РХ - раствор Хенкса

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

твл - титры вируса в легких

УПАР - удельная продукция анион-радикалов

УФА - удельная фагоцитарная активность

ФР - физиологический раствор

ХКМГ - хитокарбоксиметилгликан

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза вируса

Эф - эозинофилы

с - концентрация вируса гриппа в аэрозоле

І95 - 95%-й доверительный интервал

- десятичный логарифм

м - среднее значение

ш - ошибка среднего

N — число клеток в крови, БАЛЖ или препаратах

п — количество наблюдений/образцов, количество животных

Рь р2, Рз — коэффициенты осаждения аэрозоля во всех органах дызания, в трахее, в легких

БІ - стафилококки, вакцина стафилококковая

Т - время экспозиции в аэрозоле

\У - объемная скорость дыхания

Актуальность исследования. Легкие, помимо своей основной функции газообмена между кровью и воздухом, выполняют в организме многообразные и сложные, так называемые «нереспираторные» функции, которые играют роль в экзо-и эндогенной защите организма и при развитии различных патологических процессов [29, 35, 50]. Легкие обеспечивают очистку воздуха и крови от вредных примесей, осуществляют детоксикацию, ингибирование и депонирование многих биологически активных веществ, выполняют фибринолитическую, антикоагулянтную, выделительную функции, являются основным органом образования тромбоцитов (помимо красного костного мозга) и секвестрации нейтрофилов, а также биологическим фильтром, выполняющим функции защиты от респираторных инфекционных агентов [83, 93, 129, 159, 161, 203, 230, 240, 286, 433, 455, 460, 600].

В формировании резистентности организма к вирусам, в том числе вирусу гриппа А, большую роль играют факторы врожденного, или антиген-неспецифического, иммунитета в органах дыхания: внеклеточные (термолабильные |3-липопротеины, компоненты слизи и сурфактанта) и клеточные, к которым относятся макрофаги (Мф), нейтрофилы (Нф) и естественные киллеры (ЕК) [53, 62, 69, 314, 386]. При этом Мф и Нф представляют собой первую линию противовирусной защиты, препятствуя размножению вируса гриппа (ВГ) в клетках-мишенях, тогда как ЕК распознают и уничтожают уже вирус-продуцирующие клетки [52, 53, 54, 81, 274, 360, 386]. Позже, по мере развития инфекционного процесса подключаются антиген-специфические факторы иммунитета - лимфоциты (Лф) и антитела (АТ) [1, 54, 62, 69, 386].

Резистентность организма к вирусам зависит от функционального состояния его основных физиологических систем, в регуляции которого принимают участие глюкокортикоидные гормоны. Известно, что глюкокортикоиды являются необходимым действующим началом при возникновении стрессовых ситуаций, требующих мобилизации адаптационных возможностей организма [38, 44, 57, 65, 177, 252, 374]. Однако на фоне стресса в организме человека и животных наблюдается подавление первичного и вторичного иммунного ответа, активизация латентных вирусных инфекций и более тяжелое течение инфекционных заболеваний, в том числе гриппа [46, 57, 61, 65, 100, 101, 560]. Полагают, что все эти эффекты могут быть обусловлены повышением уровня циркулирующих глюкокортикоидных гормонов, но при значительном дефиците этих гормонов в организме гуморальный иммунный ответ ингибируется или вообще не развивается [57, 77, 78, 229, 489].

Глюкокортикоиды широко используются в клинической практике в качестве средств неотложной терапии, для коррекции ряда гипериммунных состояний, а также в комплексном лечении заболеваний, сопровождающихся агранулоцитозом [46, 77, 78, 88, 126, 127, 389, 429, 551]. В отличие от цитостатиков иммуносупрессивные свойства глюкокортикоидов не связаны с митостатическим действием. Их эффект является результатом подавления разных этапов иммуногенеза: миграции стволовых клеток, взаимодействия Т и В Лф, торможения высвобождения цитокинов из Лф и Мф и других реакций иммунной системы [46, 57, 90, 100]. При этом глюкокортикоиды в высоких дозах могут вызывать ряд побочных эффектов, в том числе понижение сопротивляемости организма различным инфекциям [46, 90, 142, 344].

Вместе с тем, известные иммунодепрессивные и противовоспалительные эффекты глюкокортикоидов не дают однозначного и полного ответа, почему они понижают резистентность организма к инфекционным агентам, в том числе к ВГ, и вызывают осложнения инфекционно-воспалительных заболеваний, особенно в органах дыхания. Считают, что восприимчивость клеток-мишеней респираторных органов к ВГ определяет развитие инфекционного процесса [159, 282, 283, 582]. Однако неизвестно, каким образом повышенный уровень глюкокортикоидов влияет на течение гриппозной инфекции, в целом, и на восприимчивость клеток-мишеней в органах дыхания к ВГ, в частности.

Показано, что количество альвеолярных макрофагов (АМф) и Нф в легких увеличивается в ответ на размножение ВГ в клетках-мишенях [62, 231, 538, 573]. Однако остаются практически не изученными роль АМф и Нф в развитии осложнений, часто возникающих на фоне повышенного уровня глюкокортикоидов в организме, в том числе в понижении резистентности организма к ВГ. Вместе с тем, давно установлено, хотя и остается без должного внимания исследователей, что глюкокортикоиды вызывают ускорение созревания и выход Нф из синусов костного мозга, способствуя возникновению нейтрофилеза в крови [46, 90, 91, 234]. При этом есть доказательства, что избыточное количество циркулирующих Нф удаляется из организма, главным образом, через легкие, которые являются одним из мест их секвестрации и метаболизации [58, 179, 155, 422, 433, 460, 519].

Что касается роли Нф в защите организма от ВГ и в развитии инфекционного процесса в легких, то до сих пор она считается спорной и неоднозначной [62, 231, 494, 546, 567, 573]. Кроме того, остается неясным, как изменяется под влиянием глюкокортикоидов численность и функциональная активность АМф и Нф в легких, особенно при последующем заражении ВГ. Важной проблемой является также возможность коррекции с помощью иммуностимуляторов пониженной после введения глюкокортикоидов резистентности организма к ВГ. Также неизвестно, какую роль играет изменение численности и функциональной активности АМф и Нф после введения иммуномодуляторов в разных схемах и дозах до момента инфицирования на формирование резистентности организма к ВГ. В связи с этим, в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Цель исследования. Изучить патогенетическую роль альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в развитии гриппозной инфекции после предварительного введения экспериментальным животным иммунодепрессантов или иммуностимуляторов.

Задачи исследования:

1. Изучить изменение функциональной активности макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства и перитонеальной полости у крыс под влиянием глюкокортикоидов (на примере преднизолона и кеналога).

2. Определить основные патогенетические параметры осложненного развития инфекционно-воспалительного процесса в модели пониженной резистентности организма к вирусу гриппа, воспроизводимой посредством предварительного введения мышам глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога.

3. Исследовать функциональную активность альвеолярных макрофагов и нейтрофилов, восприимчивость легких и трахеи (in vivo), а также клеток легких и трахеи (in vitro) к штамму вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) при снижении резистентности мышей к вирусу гриппа после введения кеналога.

4. Исследовать возможности коррекции функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов и пониженной резистентности мышей к ВГ, возникающей после введения кеналога, с помощью иммуностимулятора хитокарбоксиметилгликана.

5. Изучить резистентность мышей к вирусу гриппа и изменение численности и функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов при аэрогенном введении препаратов полипренолов, обладающих иммуномодулирующей активностью.

Научная новизна работы

Впервые исследованы и проанализированы особенности популяционного состава клеток, численности и функциональной активности Мф и Нф бронхоальвеолярного пространства крыс при введении глюкокортикоидов. Доказано, что глюкокортикоиды в высоких дозах усиливают миграцию Нф в легкие способствуя накоплению в них Нф, обладающих высоким провоспалительным потенциалом.

Впервые обнаружено разнонаправленное действие глюкокортикоидов на Мф и Нф в разных компартментах организма: усиленное рекрутирование Нф в легкие, создающее их численное и функциональное преимущество над АМф, и уменьшение численности Мф и Нф в перитонеальной полости, что происходит на фоне глюкокортикоид-индуцированного нейтрофилеза в крови.

Впервые обнаружено, что предварительное введение мышам кеналога не повышает восприимчивость легких и трахеи (in vivo) и первичной суспензионной культуры клеток легких и трахеи (in vitro) к ВГ, то есть не понижает соответствующие 50 %-е инфицирующие дозы ВГ. Установлено, что продукция ВГ в легких у животных, предварительно получавших кеналог, на ранних стадиях гриппозной инфекции повышена, но на более поздних и к моменту гибели понижена относительно контроля из-за ускоренного истощения пула клеток-мишеней для ВГ в начале инфекционного процесса.

Впервые разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к ВГ (штамм A/Aichi/2/68 H3N2), с помощью которой продемонстрировано, что понижение резистентности к ВГ у мышей, предварительно получавших кеналог, обусловлено более сильными, чем в контроле, повреждениями легких, связанными с увеличением количества и биоцидной активности Нф, при понижении доли и функциональной активности АМф. Доказано, что именно резкий дисбаланс между популяциями АМф и Нф, наблюдаемый после введения кеналога и последующего заражения ВГ, является одной из основных причин более тяжелых патоморфологических изменений в легких, что лежит в основе повышенной гибели животных.

Впервые продемонстрирована возможность восстановления баланса между показателями количества и функциональной активности АМф и Нф, а также коррекции пониженной кеналогом резистентности мышей к ВГ с помощью стимулятора макрофагальной активности хитокарбоксиметилгликана.

Впервые показано, что полипренолы пихты сибирской {Abies sibirica) обладают профилактической эффективностью в отношении ВГ в том случае, если инфицирование происходит через 3 сут после их двукратного аэрогенного введения. Однако после двукратного введения полипренолов за 2 сут до инфицирования резистентность организма к ВГ не изменяется или понижается, что связано с недостаточной стимуляцией функциональной активности популяции АМф по сравнению с популяцией Нф в бронхоальвеолярном пространстве.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическое значение работы заключается в открытии феномена направленной миграции Нф в легкие, возникающей после введения глюкокортикоидов в высоких дозах. При этом на фоне нейтрофилеза и депрессии функций АМф в результате действия глюкокортикоидов в бронхоальвеолярном пространстве скапливается огромная масса функционально активных Нф. Это создаёт угрозу развития острого респираторного дистресс синдрома (ОРДС) или других нейтрофил-зависимых повреждений лёгочной ткани. Настороженность практикующих врачей по поводу возможности возникновения в легких патологических процессов, обусловленных аккумуляцией Нф, может способствовать более оправданой тактике интенсивной глюкокортикоидной терапии и проведению дополнительных исследований бронхоальвеолярных клеток.

Доказано, что соотношение количества и функциональной активности АМф и Нф в бронхоальвеолярной лаважной жидкости при введении мышам глюкокортикоида кеналога с последующим заражением ВГ соответствует более выраженным патоморфологическим изменениям легочной ткани. Это отражает тяжесть воспалительного процесса и может иметь диагностическую и прогностическую значимость в пульмонологии для принятия правильной тактики и стратегии в процессе лечения заболеваний легких, в том числе для предотвращения развития ОРДС или других нейтрофил-зависимых повреждений легочной ткани.

Своевременное применение стимуляторов функциональной активности АМф на фоне действия глюкокортикоидов в высоких дозах снижает численность Нф в альвеолах и бронхах и может способствовать уменьшению риска возникновения нейтрофил-зависимых осложнений в легких, а также предотвращению снижения резистентности организма к ВГ. В связи с этим стимуляторы Мф могут быть рекомендованы для профилактики воспалительно-деструктивных процессов в лёгких, ассоциированных с интенсивной глюкокортикоидной терапией, гиперсекрецией коры надпочечников или последствиями хронического стресса.

В данной работе была разработана лабораторная модель пониженной резистентности организма к ВГ (штамм А/АюЫ/2/68 НЗШ), которая воспроизводится при однократном подкожном введении глюкокортикоида пролонгированного действия кеналога с последующим заражением ВГ и может быть рекомендована для тестирования иммуномодулирующей, антипротеазной или противовирусной активности препаратов, перспективных для применения в качестве средств патогенетической или этиотропной терапии гриппа.

По результатам обнаруженной нами профилактической эффективности полипренолов пихты сибирской в отношении ВГ получен Патент ЬШ (11) 2189231 (13) С1 от 20.09.2002 «Эмульсионный препарат для профилактики респираторных вирусных инфекций». Вместе с тем, при применении полипренолов или других препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью, обязательно следует учитывать то, что резистентность организма к ВГ может понижаться, если инфицирование проиходит в период преимущественной стимуляции в бронхоальвеолярном пространстве функциональной активности популяции Нф по сравнению с популяцией АМф.

Материалы исследования функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов при введении глюкокортикоидов нашли отражение в монографии «Лекции по клинической патологии: Руководство для врачей» (1997) Д.Н. Маянского и И.Г. Урсова.

Положения, выносимые на защиту:

1. После применения глюкокортикоидов в высоких дозах усиливается направленная миграция циркулирующих нейтрофилов в легкие, что приводит к повышению численности и биоцидного потенциала популяции нейтрофилов и создает угрозу нейтрофил-зависимой деструкции легочной ткани.

2. Предварительное введение глюкокортикоидов в высоких дозах приводит к снижению резистентности организма к вирусу гриппа, о чем свидетельствует увеличение летальности мышей, обусловленное усугублением нейтрофил-зависимых повреждений легких после заражения вирусом гриппа, а не повышенной восприимчивостью клеток-мишеней к вирусу гриппа. С помощью стимуляторов функциональной активности макрофагов возможна коррекция пониженной резистентности организма к вирусу гриппа за счет уменьшения дисбаланса между популяциями альвеолярных макрофагов и нейтрофилов.

3. Повышение или понижение резистентности организма к вирусу гриппа после применения иммуномодуляторов в разных дозах и в разные сроки до момента инфицирования детерминировано соотношением функциональной активности альвеолярных макрофагов и нейтрофилов. При этом для пониженной резистентности к вирусу гриппа характерно доминирование стимуляции функциональной активности популяции нейтрофилов, тогда как повышенная резистентность к вирусу гриппа достигается при преимущественном увеличении биоцидного и фагоцитарного потенциала популяции альвеолярных макрофагов.

Апробация материалов диссертации. Результаты основных разделов диссертации были представлены на 35 отечественных и международных конференциях: All Union Symposium with the participation foreign scientists, 1990, Novosibirsk, Russia; Constituent Congress Int. Soc. Pathol., 1991, Moscow, Russia; Международный симпозиум «Патогенез хронического воспаления», 1991, Новосибирск, Россия; Joint Meeting Soc. Leuk. Biol. «The phagocyte molecular and clinic aspects», 1996, Verona, Itali; XIII Российская научная конференция «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», 1997, Челябинск, Россия; XXX Всеросс. научно-практическая конференция «Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии», 1997, Санкт-Петербург, Россия; 7 Научно-практическая конференция врачей «Актуальные вопросы современной медицины», 1997, Новосибирск, Россия; Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и крайнего севера», 1998, Новосибирск, Россия; Вторая научная конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс», 1998, Саратов, Россия; 18th Annual AAAR' 99 Conference, 1999, Tacoma, Washington, USA; 1999 European Aerosol conference, Praque, Czech republic; Advanced research workshop «Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium», 1999, Novosibirsk, Russia; VI Рабочая группа «Аэрозоли Сибири», 1999, Томск, Россия; International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors, 2000, Smolenice, Slovakia; 19th Annual AAAR Conference, 2000, Adam's Mark Hotel, St. Louis, Missouri, USA; XIV Российская научная конференция «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», 2000, Челябинск, Россия; II Всероссийский симпозиум «Хроническое воспаление», посвященный памяти засл. деятеля науки РФ, проф. Д.Н. Маянского «Фундаментальные и клинические аспекты хронического воспаления», 2000, Новосибирск, Россия; 3-rd International Conference on Emerging Zoonoses, 2001, Noordwijkerhout, Holland; 2-я научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2002, Новосибирск, Россия; X Юбилейная международная конференция и дискуссионный научный клуб «Новые информационные технологии в медицине экологии», 2002, Ялта-Гурзуф, Крым, Украина; Всероссийская конференция «Компенсаторно-приспособительные процессы: Фундаментальные и клинические аспекты», 2002, Новосибирск, Россия; Biological Medical Conference «Prophylaxis and treatment of BW health disorders», 2003, Munich, Germany; Biological Medical Defense Conference, 2004, Munich, Germany; Всероссийской' конференции «Компенсаторные приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты», 2004, Новосибирск, Россия; V Сибирский физиологический съезд, 2005, Томск, Россия; 2-я Международная конференция «Наука-Бизнес-Образование Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда», 2005, Пущино, Россия; 2-я Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2005, Москва, Россия; XIII International Congress of Virology, 2005, San Francisco, California, USA; Biological Medical Defense Conference, 2005, Munich, Germany; Международная конференция «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 2006, Ульяновск, Россия; III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», 2006, Новосибирск, Россия; 3-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2007, Новосибирск, Россия; Международная научно-практическая конференция «Биотехнология в Казахстане: Проблемы и перспективы инновационного развития», 2008, Алматы, Казахстан; 4-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2009, Новосибирск, Россия; 5-я Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», 2011, Новосибирск, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 34 научных статьи, из них 30 - в отечественных журналах из списка ВАК и 4 - в зарубежных изданиях, а также 48 тезисов в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях. По результатам диссертации получено 2 патента Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 36 рисунков и 61 таблицу. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 110 отечественных и 490 зарубежных источников.

ВЫВОДЫ

1. Развитие гранулоцитоза в крови и подавление клиринговой активности альвеолярных макрофагов при использовании глюкокортикоидов в высоких фармакологических дозах сопровождается увеличением численности и биоцидных возможностей популяции нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве, что создает угрозу нейтрофил-зависимых повреждений легких.

2. Повышение численности нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве на фоне индуцированного глюкокортикоидами гранулоцитоза обусловлено направленной миграцией циркулирующих нейтрофилов в легкие и сопряжено с перераспределением нейтрофилов между компартментами организма. Об этом свидетельствует увеличение численности и функциональной активности популяции нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве и уменьшение этих параметров популяции нейтрофилов в перитонеальной полости.

3. Увеличение летальности животных и степени повреждения легочной ткани при пониженной резистентности к вирусу гриппа, обусловленной высоким уровнем глюкокортикоидов в организме, связаны не с повышением восприимчивости клеток-мишеней к вирусу гриппа, а с усилением в легких деструктивного потенциала популяции нейтрофилов на фоне снижения биоцидных и фагоцитарных возможностей популяции альвеолярных макрофагов.

4. Стимуляция системы мононуклеарных фагоцитов хитокарбоксиметилгликаном предотвращает снижение резистентности организма к вирусу гриппа под влиянием кеналога. При этом степень деструкции легочной ткани уменьшается, что ассоциируется со снижением в легких провоспалительного потенциала нейтрофилов и восстановлением количества и функциональной активности альвеолярных макрофагов, устраняющих численное преимущество нейтрофилов в легких и сохраняющих такой же баланс между популяциями этих фагоцитов, как инфицированной контрольной группе.

5. Изменение функционального статуса макрофагов и нейтрофилов бронхоальвеолярного пространства после применения препаратов полипренолов в различных схемах и дозах детерминирует повышение или понижение резистентности организма к вирусу гриппа. При этом повышение резистентности организма к вирусу гриппа достигается при преимущественном увеличении численности лимфоцитов и альвеолярных макрофагов, а не нейтрофилов.

6. Пониженная резистентность организма к вирусу гриппа после применения препаратов полипренолов обусловлена повышенной провоспалительной, деструктивной активностью нейтрофилов в легких. В этом случае развитие гриппозного воспаления, приводящее к увеличению летальности животных, сопряжено с доминирующей стимуляцией функциональной активности популяции нейтрофилов и относительно более слабой стимуляцией биоцидной и фагоцитарной активности популяции альвеолярных макрофагов.