Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое изучение герани сибирской (Geranium sibiricum L.)

На правах рукописи

ПОЗДНЯКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГЕРАНИ СИБИРСКОЙ (GERANIUM SIBIRICUM L.)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск —2015

005569939

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук

Бубенчиков Роман Александрович

Официальные оппоненты: Лякина Марина Николаевна, доктор

фармацевтических наук, старший научный

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздрава России

Защита состоится «03» июля 2015 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России и на сайте http://www.pmedpharm.ru

Автореферат разослан « '/Л » У^Яд? 2015 г. Ученый секретарь

сотрудник, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, управление экспертизы № 3 готовых лекарственных средств, заместитель начальника

Браславский Валерий Борисович, доктор фармацевтических наук, доцент, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, доцент кафедры

диссертационного совета

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

В настоящее время, несмотря на огромный ассортимент лекарственных средств, применение лекарственных растений и препаратов из них значительно возросло. По данным Всемирной организации здравоохранения, 80% населения Земли для лечения и профилактики различных заболеваний используют фитопрепараты. Это обусловлено целым рядом их преимуществ: терапевтический эффект при приеме растительных препаратов развивается постепенно, без проявления побочного действия и токсических реакций на организм. Фитопрепараты можно использовать в педиатрии и гериатрии, а содержащиеся в них биологически активные вещества оказывают комплексное и взаимодополняющее действие. В связи с этим по-прежнему актуален поиск новых источников лекарственного растительного сырья. Новыми источниками растительного сырья могут быть растения рода герань, в том числе герань сибирская, широко распространенная в областях средней полосы европейской части России. Герань сибирская применяется в народной медицине в качестве вяжущего, гемостатического, противовоспалительного средства для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, гинекологических и кожных заболеваний. Растения рода герань характеризуются наличием фенольных соединений, однако для герани сибирской они изучены недостаточно. Все вышесказанное говорит о перспективности изучения герани сибирской с целью дальнейшего внедрения в научную медицину и подчеркивает актуальность ее фармакогностического исследования.

Степень разработанности темы

Из литературных источников, в основном зарубежных, известно, что в надземной части герани сибирской выделены углеводы (спирторастворимые моносахариды, водорастворимый полисахаридный комплекс, пектиновые вещества, гемицеллюлоза А и Б, сциллоинозит и гликопротеин), изучены фенольные соединения: корилагин, бревифолин, этилбревифолинкарбоксилат, гераниин, фенолкарбоновые кислоты (протокатеховая, галловая, эллаговая, кофейная), флавоноиды (кверцетин, рутин, апигенин, кемпферол, 7-а-Ь-дирамнозид кемпферола), дубильные вещества; аминокислоты. Из надземной части герани сибирской выделено эфирное масло, содержание которого

достигает 0,3%, однако данные о его химическом составе отсутствуют. Несмотря на это герань сибирская остается малоизученным растением. Фенольные соединения ее изучены фрагментарно. Другие классы биологически активных веществ изучены недостаточно. Не проводился комплексный фармакогностический анализ травы герани сибирской. Отсутствуют методики количественного определения биологически активных веществ, характеристики подлинности сырья.

Цель и задачи исследования

Цель работы - фармакогностическое изучение травы герани сибирской, произрастающей на территории средней полосы европейской части России, диагностика сырья и его стандартизация.

Для выполнения цели исследования были поставлены задачи:

1. Фитохимическое изучение герани сибирской.

2. Изучение фенольных соединений.

3. Выделение эфирного масла и изучение его компонентного состава.

4. Выделение и изучение полисахаридного комплекса.

5. Выявление морфолого-анатомических особенностей травы герани сибирской с целью установления диагностических признаков сырья.

6. Для стандартизации сырья разработка методик количественного определения флавоноидов и дубильных веществ.

7. Установление норм качества сырья.

8. С целью оптимизации сроков заготовки сырья изучение динамики накопления основных групп биологически активных веществ по фазам вегетации.

9. Проведение фармакологического скрининга. Научная новизна

В результате проведенных исследований нами впервые изучен качественный состав и количественное содержание основных групп биологически активных веществ травы герани сибирской флоры средней полосы европейской части России. Установлено наличие фенольных соединений, представленных флавоноидами, кумаринами, фенолкарбоновыми кислотами, дубильными веществами, а также азотсодержащих соединений,

углеводов, органических кислот, тритерпеновых соединений, каротиноидов, жирных кислот, эфирного масла, минеральных соединений.

Впервые изучен минеральный состав травы герани сибирской. Установлено, что содержание токсичных элементов не превышает ПДК, установленных для продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Различными методами хроматографии (бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ, газожидкостной хромато-масс-спектрометрии) изучены фенольные соединения герани сибирской. Идентифицированы 22 вещества фенольной природы: 7-0-метоксикумарин, кумарин, дикумарин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, дигидрокверцетин, рутин, катехин, эпикатехин, эпикатехин галлат, кислоты: галловая, феруловая, коричная, неохлорогеновая, салициловая, ванилиновая, сиреневая, пара-гидроксибензойная, гентизиновая, бензойная, фенилуксусная, пара-кумаровая. Из них впервые в траве герани сибирской было установлено наличие 20 фенольных соединений.

Впервые методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии изучены органические и жирные кислоты травы герани сибирской, при этом идентифицированы 6 органических и 19 жирных кислот. Среди органических кислот преобладающими являются щавелевая, лимонная и яблочная, среди жирных - левулиновая, линоленовая и пальмитиновая кислоты.

Из травы герани сибирской выделено эфирное масло. Впервые методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии изучен его компонентный состав. В эфирном масле идентифицировано 47 соединений, среди которых преобладающими являются монотерпен гераниол, углеводород гексакозан и одноненасыщенный дитерпен фитол.

Впервые проведены исследования морфологических и микродиагностических признаков травы герани сибирской, установлены их диагностические особенности, позволяющие определить подлинность сырья.

Показана целесообразность стандартизации травы герани сибирской по содержанию флавоноидов и дубильных веществ. Определены оптимальные условия количественной экстракции из сырья флавоноидов и дубильных веществ, а также модифицированы методики спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на доминирующий флавоноид -цинарозид, суммы дубильных веществ в пересчете на танин. Методики

вапидированы по показателям линейности, правильности, воспроизводимости и повторяемости.

Результаты скрининговых фармакологических исследований настоев и полисахаридного комплекса травы герани сибирской показали наличие антиоксидантной, противовоспалительной и антимикробной активностей.

Теоретическая и практическая значимость работы

В результате проведенных исследований были получены новые данные о морфолого-анатомических признаках, химическом составе травы герани сибирской.

Данные, полученные при изучении фармакологической активности травы герани сибирской, позволяют рекомендовать данное растение для дальнейшего углубленного изучения с целью его внедрения в научную медицину.

Предложены методики количественного определения флавоноидов в пересчете на цинарозид и дубильных веществ в пересчете на танин. Установлены сроки заготовки сырья. Определены показатели подлинности и доброкачественности сырья.

Результаты диссертационных исследований используются в учебном процессе и научных исследованиях: методика количественного определения суммы флавоноидов в траве герани сибирской - в работе кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и фармацевтического факультета ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет им. К.Л. Хетагурова» Министерства образования и науки Российской Федерации; методика количественного определения суммы дубильных веществ в работе кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и кафедры общей, биологической, фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВПО «Орловский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации; микродиагностический анализ травы герани сибирской в работе кафедры обшей, биологической, фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ

ВПО «Орловский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия «Герани сибирской трава» (согласовано с ЗАО Фирма «Здоровье»).

Результаты фармакогностического изучения травы герани сибирской могут быть использованы для обоснования возможности применения нового вида отечественного лекарственного растительного сырья.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационной работы является выбор объекта исследования по принципу использования филогенетического родства, а также системный подход, включающий информационно-исследовательский, фотохимический, стандартизационный, морфолого-анатомический и фармакологический блоки. В процессе выполнения диссертационной работы при проведении фармакогностического исследования использованы химические, физико-химические методы (УФ-спектроскопия, бумажная, тонкослойная, высокоэффективная жидкостная хроматографии, газожидкостная хромато-масс-спектрометрия, элементный спектральный анализ, спектрофотометр™, фотоэлектроколориметрия, денситометрия),

макроскопический, микроскопический, фармакологический и статистические методы анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

• результаты исследования химического состава травы герани сибирской;

• результаты исследования фенольных соединений;

• результаты исследования компонентного состава эфирного масла герани сибирской;

• результаты исследования полисахаридного комплекса;

• результаты морфолого-анатомических исследований травы герани сибирской;

• разработка методик количественного анализа показателей качества сырья герани сибирской;

• установленные нормативы качества сырья;

• результаты изучения динамики накопления биологически активных веществ (флавоноидов, дубильных веществ) в зависимости от фазы вегетации;

• результаты фармакологического скрининга водных извлечений и водорастворимого полисахаридного комплекса из травы герани сибирской.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов обусловлена большим объемом проведенных экспериментальных исследований и использованием современных физико-химических, химических, морфолого-анатомических и фармакологических методов исследования, что позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты. Проведенные исследования отражены в виде таблиц, графиков и рисунков. Достоверность разработанных методик количественного определения изучаемых веществ подтверждается путем их валидации и статистической обработки в соответствии с требованиями ГФ XI с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 20)3».

Основные положения диссертационной работы освещены на научных конференциях: II международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2012 г.), международной конференции «Актуальные проблемы образования» (Греция, 2013 г.), IV международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2013 г.), международной научно-практической конференции «Проблемы современной медицины: актуальные вопросы» (Красноярск, 2014 г.).

По материалам диссертации опубликовано 23 работы, из них 9 в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией РФ. Личный вклад автора

Автор принимал участие в постановке цели и задач исследования, определении путей их реализации. Соискателем изучена и проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме работы, выполнены фитохимические, морфолого-анатомические исследования и

фармакологический скрининг. Анализ полученных экспериментальных данных, статистическая обработка результатов и выводы сделаны под руководством

научного руководителя. Автором подготовлены тезисы, доклады, статьи, оформлены диссертация и автореферат.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), главы с описанием объекта и методов исследования, экспериментальной части (3, 4, 5 главы), заключения, списка литературы, приложения. В диссертации содержится 43 таблицы и 48 рисунков. Библиографический список состоит из 257 источников, в том числе 28 - на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом нашего исследования явилась трава герани сибирской (Geranium sibiricum L.), заготовленная на территории Курской, Орловской и Белгородской областей в 2011-2014 гг. в различные фазы вегетации растения.

Изучение качественного и количественного состава биологически активных веществ травы герани сибирской

Фитохимическим анализом было установлено, что трава герани сибирской содержит углеводы, азотсодержащие соединения, органические кислоты, тритерпеновые соединения, жирные кислоты, эфирное масло, каротиноиды, дубильные вещества, кумарины, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, минеральные элементы.

При проведении количественного анализа биологически активных веществ исследуемого сырья определено содержание: азотистых оснований 0,170±0,005%, в том числе холина 0,130±0,004%; дубильных веществ 17,590±0,380%; органических кислот 10,050±0,400%; тритерпеновых соединений 0,090±0,002%; каротиноидов 2,590±0,120 мг%.

Исследован аминокислотный состав травы герани сибирской с использованием аминокислотного анализатора ААА-339М. Компонентный состав аминокислот представлен аспарагиновой кислотой, треонином, серином, цистеином, глицином, аланином, валином, метионином, изолейцином, лейцином, тирозином, фенилаланином, гистидином, лизином, аргинином. Доминирующей аминокислотой травы герани сибирской является аланин.

Суммарное содержание свободных аминокислот составляет 0,12-0,14 мг/100 мг, связанных аминокислот - 1,25-1,30 мг/100 мг.

Методом эмиссионного спектрального анализа изучен минеральный состав травы герани сибирской. Установлено наличие 15 минеральных элементов, преобладающими среди которых являются железо, фосфор, магний, калий. При этом содержание токсичных элементов в траве герани сибирской не превышает ПДК, установленных для продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии изучены карбоновые кислоты травы герани сибирской, при этом идентифицировано 6 органических и 19 жирных кислот. Установлено, что среди органических кислот преобладающими являются щавелевая, лимонная и яблочная, среди жирных - левулиновая, линоленовая и пальмитиновая кислоты.

Из травы герани сибирской выделено эфирное масло, выход которого составил 0,060±0,001%. Методом газожидкостной хромато-масс-спектрометрии изучен его компонентный состав, который представлен 47 соединениями. Преобладающим монотерпеном эфирного масла является гераниол (38,38 мг/кг).

Таблица 1 - Результаты исследования фенольных веществ травы герани сибирской методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Идентифицированные вещества Содержание, % от суммы фенольных соединений в извлечении

Эпикатехин галлат* 7,12

Эпикатехин* 23,73

Катехин* 4,99

7-0-метоксикумарип* 1,01

Дикумарин* 3,83

Кумарин* 0,51

Дигидрокверцетин* 5,04

Рутин 1,26

Лютеолии* 18,17

Лютеолин-7-глюкозид* 9,55

Галловая кислота 12,10

Неохлорогеновая кислота* 3,65

Феруловая кислота* 1,61

Коричная кислота* 0,44

Примечание: * отмечены соединения, идентифицированные в траве герани сибирской впервые.

Методами бумажной, тонкослойной, газожидкостной хромато-масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии изучены фенольные соединения исследуемого растения. Идентифицировано 22 вещества фенольной природы, представленные кумаринами, флавоноидами, фенолкарбоновыми кислотами и дубильными веществами. Впервые в траве герани сибирской было идентифицировано 20 соединений: 7-0-метоксикумарин, кумарин, дикумарин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, дигидрокверцетин, катехин, эпикатехин, эпикатехин галлат; кислоты: феруловая, коричная, неохлорогеновая, салициловая, ванилиновая, сиреневая, пара-гидроксибензойная, гентизиновая, бензойная, фенилуксусная, пара-кумаровая.

Из травы герани сибирской выделены полисахариды путем фракционирования водой очищенной, смесью растворов щавелевой кислоты и аммония оксалата 0,5% и раствором натрия гидроксида 10%. Выход фракций составил: водорастворимый полисахаридный комплекс (6,89-7,12%), пектиновые вещества (10,95-11,18%), гемицеллюлоза А (0,65-0,68%) и Б (4,404,52%) (таблица 2).

Таблица 2 - Характеристика полисахаридных комплексов травы герани сибирской

Группа углеводов Содержание, % Моносахаридный состав

наименование содержание, %

Водорастворимый полисах аридный комплекс 6,89-7,12 Арабиноза 11,60±0,44

Галактоза 14,10±0,44

Глюкоза 5,80±0,22

Рамноза 1,20±0,04

Галактуроновая кислота 4,30±0,17

Пектиновые вещества 10,95-11,18 Арабиноза 2,30±0,11

Галактоза 3,20±0,11

Глюкоза 2,50±0,11

Рамноза 0,90±0,04

Галактуроновая кислота 87,50*3,11

Гемицеллюлоза А 0,65-0,68 Арабиноза 1,30±0,06

Галактоза 1,90±0,08

Глюкоза 2,40±0,09

Ксилоза 8,10±0,35

Рамноза 1,30± 0,06

Гемицеллюлоза Б 4,40-4,52 Арабиноза 1,50±0,04

Галактоза 2,10±0,07

Глюкоза 2,60±0,11

Ксилоза 8,70±0,38

Рамноза 0,90±0,04

Для исследования выделенных полисахаридных комплексов проводили их гидролиз раствором серной кислоты 2н, идентификацию продуктов гидролиза проводили методом бумажной хроматографии. Денситометрически после хроматографии гидролизатов в тонких слоях сорбента в системе растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода очищенная (3:1:1) определили количественное содержание моносахаридов. Результаты исследований представлены в таблице 2. Для качественной характеристики выделенных пектиновых веществ проводили количественное определение функциональных групп титриметрическим методом. Содержание свободных карбоксильных групп в исследуемых пектиновых веществах составляет 5,46±0,12%, метоксилированных карбоксильных групп - 0,56±0,05%, метоксильных групп - 0,38±0,03%. Исследуемые пектиновые вещества характеризуются невысокой (Х< 50%) степенью этерификации.

Установление подлинности и показателей качества травы герани сибирской

Для определения подлинности сырья герани сибирской проведено макроскопическое исследование и установлены основные морфологические признаки сырья.

В результате микроскопического анализа было установлено строение стебля, листьев, черешка, чашечки и венчика. Стебель пучкового типа строения (рисунок 1). Эпидермис стебля (с поверхности) состоит из узких тангентально вытянутых клеток с заостренными или скошенными концами и покрыт кутикулой с продольной морщинистостью. Устьица аномоцитного типа. На поверхности стебля встречаются волоски: простые остроконечные толстостенные одно-трехклеточные с гладкой или слегка бородавчатой кутикулой, заполненные зернистым содержимым, часто прижатые к поверхности стебля; головчатые на одно-двухклеточной ножке, с вытянутой пузыревидной одноклеточной головкой; головчатые на одноклеточной ножке с одноклеточной округлой головкой (рисунок 2).

Клетки верхнего эпидермиса листа прямостенные, многоугольные (рисунок 4), нижнего - сильно извилистые. Устьичный аппарат аномоцитного типа. В мезофилле листа встречаются многочисленные друзы оксалата кальция (рисунок 3). Лист с обеих сторон опушен простыми одноклеточными толстостенными волосками разной длины с вытянутыми заостренными концами, по краю часто прижатыми к поверхности листа, и многоклеточными волосками с длинной базапьной клеткой и небольшой верхушечной остроугольной клеткой, которая в сырье часто обламывается (рисунок 4).

Черешок листа округлой формы; проводящая система состоит из четырех коллатеральных проводящих пучков, расположенных по кругу. Клетки эпидермиса прозенхимные, прямостенные, с прямыми или скошенными концами.

Рисунок 1 - Поперечный срез стебля (Увел.х52,5). 1 -эпидермис; 2 - первичная кора; 3 - перициклическая склеренхима; 4 - паренхима сердцевины; 5 - клетки с бурым содержимым; 6 - биколлатсральный проводящий пучок; 7 - коллатеральный пучок.

Рисунок 3 - Фрагмент мезофилла листа (Увел.х200). 1 - друзы оксалата кальция.

Рисунок 5 - Поперечный срез черешка (Увел.х200). 1 -эпидермис; 2 - колленхима; 3 - склеренхима; 4 - флоэма; 5 - ксилема; 6 - паренхима сердцевины черешка

Фрагмент эпидермиса по краю венчика

Рисунок 2 - Фрагмент эпидермиса стебля (Увел. х200). 1 -простой толстостенный одноклеточный волосок с зернистым содержимым; 2 - клетки эпидермиса с поверхности.

эпидермиса листа (Увел.х200). 1 - простой толстостенный одноклеточный волосок; 2 - головчатый волосок с одноклеточной ножкой и пузыревидной головкой.

'"4*1

Рисунок 6 - Фрагмент эпидермиса внутреннего края чашечки (Увел.х200). 1 - простой волосок с верхушечной остроугольной (треугольной) клеткой; 2 - друзы оксалата

Рисунок 8 - Фрагмент эпидермиса по краю венчика (Увел. х200) 1 - головчатый волосок; 2 - сосочковидные клетки эпидермиса; 3 - простой двухклеточный волосок.

Черешок опушен простыми одноклеточными толстостенными волосками (рисунок 5).

Чашечка опушена по всей поверхности, но в большем количестве - по зубцам и жилкам наружной поверхности, волосками, характерными для листа. В основной паренхиме просматриваются друзы оксалата кальция, особенно многочисленные на внутренней поверхности чашечки (рисунок 6).

Для эпидермиса венчика характерны изодиаметрические прямостенные клетки, по краю эпидермис сосочковидный. Венчик опушен простыми одно-трехклеточными, остроконечными волосками (рисунки 7, 8).

Для определения качества травы герани сибирской установлены числовые показатели: содержание общей золы не более 14%, золы нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10% не более 1%, влажность не более 13%. Установлена норма содержания экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50% - не менее 30%.

Для стандартизации сырья герани сибирской были разработаны методики количественного определения основных групп действующих веществ (флавоноидов и дубильных веществ) и установлены нормы их содержания.

Для оценки содержания флавоноидов в сырье был использован метод дифференциальной спектрофотометрии с применением реакции комплексообразования с алюминия хлоридом в среде спирта этилового 40%. Образующийся окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при 395 нм. Расчет содержания суммы флавоноидов вели по доминирующему флавоноидному соединению - цинарозиду с использованием удельного показателя поглощения его комплекса с алюминия хлоридом. Согласно полученным результатам наиболее полное извлечение суммы флавоноидов достигается при использовании спирта этилового 40%, степени измельченности сырья 1 мм, соотношении сырья и экстрагента 1:100; экстракцию вели до наступления равновесия, которое наступает через 45 минут. Содержание суммы флавоноидов в траве герани сибирской, заготовленной в фазу цветения растения, колеблется от 2,69% до 3,50%. На основании этих данных установлена норма содержания флавоноидов не менее 2,00%.

При разработке методики количественного определения суммы дубильных веществ в траве герани сибирской нами было проведено сравнительное определение суммы дубильных веществ тремя методами:

перманганатометрическим, спектрофотометрическим и комплексо-нометрическим.

В результате проведенных исследований было установлено, что перманганатометрический метод дает завышенные результаты, он недостаточно точен и не позволяет объективно оценить содержание дубильных веществ. Комплексонометрический метод отличается трудоемкостью и необходимостью использовать большое количество реактивов. Поэтому для дальнейших исследований нами был выбран метод прямой спектрофотометрии спиртового извлечения, как достаточно точный и наиболее легко выполнимый. Расчет содержания суммы дубильных веществ вели по удельному показателю

поглощения танина в области максимума поглощения (X = 280 нм). Изучены условия извлечения дубильных веществ из травы герани сибирской: степень измельченности 1 мм, экстрагирование спиртом этиловым 50% в течение 45 минут, соотношение сырья и экстрагента 1:125. Содержание дубильных веществ, определенное спектрофотометрическим методом, колеблется от 4,90% до 7,08%, что позволило предложить норму содержания дубильных веществ в траве герани сибирской не менее 4,00%.

Проведена валидация методик количественного определения флавоноидов и дубильных веществ по показателям линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности, в результате чего они были признаны прецизионными в данных условиях.

Для оптимизации сроков заготовки травы герани сибирской проведено изучение динамики накопления флавоноидов и дубильных веществ по фазам вегетации (таблица 3).

Таблица 3 - Содержание основных групп действующих веществ в траве герани сибирской в зависимости от фазы вегетации

Фаза вегетации Содержание суммы Содержание суммы дубильных веществ, %

флавонондов, % комплексонометрия спектрофотометрия

Бутонизация 2,76±0,13 11,93±0,25 4,73±0,11

Начало цветения 3,42±0,11 12,89±0,25 5,91±0,27

Массовое цветение 2,92±0,14 15,34±0,42 7,02±0,19

Плодоношение 2,42±0,11 9,14±0,36 4,41±0,17

В результате установлено, что максимальное количество флавоноидов в траве герани сибирской накапливается в фазу начала цветения и сохраняется на достаточно высоком уровне в течение всего периода цветения. Максимальное содержание дубильных веществ наблюдается в фазу массового цветения. Поэтому заготавливать траву герани сибирской рекомендуем в период цветения растения.

Изучение фармакологической активности герани сибирской

Принимая во внимание литературные данные и результаты проведенного нами фитохимического анализа травы герани сибирской, были определены основные направления фармакологических исследований: изучение острой токсичности, антиоксидантной, противовоспалительной и антибактериальной активностей.

Изучена острая токсичность настоя и водорастворимого полисахаридного комплекса травы герани сибирской по методике Б.М. Штабского, в результате чего установлено, что настой и водорастворимый полисахаридный комплекс по классификации К. К. Сидорова относятся к классу практически нетоксичных.

Оценку антиоксидантной активности водных и водно-спиртовых извлечений из травы герани сибирской проводили по методике, основанной на химической реакции между калия перманганатом и биологически активными веществами восстанавливающего характера, содержащимися в извлечениях из исследуемого растения. В качестве препаратов сравнения использовали растворы кверцетина и рутина, известные своими антиоксидантными свойствами. Установлено, что наибольшая антиоксидантная активность извлечений из травы герани сибирской наблюдается при использовании в качестве экстрагента спирта этилового 50%.

Противовоспалительную активность настоя и водорастворимого полисахаридного комплекса травы герани сибирской оценивали по общепринятой схеме с учетом влияния на процессы экссудации, пролиферации и укрепление сосудистой стенки. В результате установлено, что выраженную противовоспалительную активность проявил водорастворимый

полисахаридный комплекс, противовоспалительный эффект которого при антиэкссудативной активности составил 27,03%, антипролиферативной активности - 59,78%, а при изучении антифлогистической активности наблюдалось достоверное увеличение времени появления пятен окрашивания (8,22±0,57 мин) и уменьшение их диаметра (1,09±0,04 см) по сравнению с контролем.

Антибактериальную активность устанавливали в опытах in vitro посредством культивирования тест-штаммов микроорганизмов на питательной среде с добавлением исследуемого настоя. Установлено, что настой травы герани сибирской проявляет выраженную антимикробную активность в отношении грибов рода Candida, а также тест-культуры Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Pseudomonasa eruginosa, Bacillus cereus во всех исследуемых разведениях. Для культуры Esherichia coli отмечен слабый рост в разведении 1:2 и 1:4, в разведении 1:10 — отсутствие антибактериальной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги проделанной нами работы позволили сделать следующие выводы:

1. Проведено фитохимическое исследование травы герани сибирской. Установлен качественный и количественный состав биологически активных веществ. В изучаемом растительном сырье содержатся углеводы: водорастворимый полисахаридный комплекс (6,89-7,12%), пектиновые вещества (10,95-11,18%), гемицеллюлоза А (0,65-0,68%) и гемицеллюлоза Б (4,40-4,52%), азотистые основания (0,170±0,005%), в том числе холин (0,130±0,004%), аминокислоты (свободные 0,11-0,14 мг/100 мг, связанные -1,25-1,30 мг/100 мг), органические кислоты (10,05±0,400%), тритерпеновые соединения (0,090±0,002%), фенольные соединения: дубильные вещества (17,590±0,380%), фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды, кумарины, жирные кислоты, эфирное масло (0,060±0,001%), каротиноиды (2,590±0,120 мг%), минеральные элементы.

2. В результате изучения фенольных соединений методами бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ и газожидкостной хромато-масс-спектрометрии в траве

герани сибирской идентифицировано 22 вещества фенольной природы: 7-0-метоксикумарин, кумарин, дикумарин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, дигидрокверцетин, рутин, катехин, эпикатехин, эпикатехин галлат; кислоты: галловая, феруловая, коричная, неохлорогеновая, салициловая, ванилиновая, сиреневая, пара-гидроксибензойная, гентизиновая, бензойная, фенилуксусная, пара-кумаровая; из них идентифицировано впервые 20 соединений.

3. Впервые изучен компонентный состав эфирного масла травы герани сибирской, в нем идентифицировано 47 соединений. Установлено, что преобладающими компонентами эфирного масла являются: гераниол (38,38 мг/кг), гексакозан (76,52 мг/кг), фитол (101,36 мг/кг).

4. Выделены полисахариды по фракциям, их выход составил: водорастворимый полисахаридный комплекс — 6,89-7,12%, пектиновые вещества - 10,95-11,18%, гемицеллюлозы А и Б - 0,65-0,68% и 4,40-4,52% соответственно. Изучен качественный и количественный моносахаридный состав полисахаридных комплексов. Впервые установлена степень этерификации пектиновых веществ травы герани сибирской.

5. Проведено морфолого-анатомическое изучение травы герани сибирской. Установлены микродиагностические признаки: стебель в поперечном сечении округлый, ребристый, пучкового типа строения; черешок округлый, с 4 пучками коллатерального типа, расположенными по кругу; устьица аномоцитного типа; клетки эпидермиса нижней стороны листа сильноизвилистые, верхней — прямостенные; наличие сосочковидного эпидермиса по краю венчика. Наиболее значимым микродиагностическим признаком является опушение стебля, листа, чашечки и венчика различными простыми и головчатыми волосками.

6. Предложены спектрофотометрические методики определения суммы флавоноидов с использованием в качестве вещества стандарта цинарозида и суммы дубильных веществ в пересчете на танин. На основании полученных данных установлены: норма содержания суммы флавоноидов не менее 2,0%, суммы дубильных веществ не менее 4,0%. Проведенная валидация методик

показала, что разработанные методики соответствуют критериям линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

7. Установлены следующие числовые показатели, характеризующие качество сырья: содержание общей золы не более 14%, золы нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10% не более 1%, влажность не более 13%, содержание экстрактивных веществ, извлекаемых спиртом этиловым 50% - не менее 35%.

8. Для оптимизации сроков заготовки травы герани сибирской проведено изучение динамики накопления основных групп действующих веществ (флавоноидов и дубильных веществ) по фазам вегетации. Установлено, что максимальное накопление флавоноидов (3,42±0,11%) и дубильных веществ (7,02±0,19%) наблюдается в фазу цветения, что и послужило основанием рекомендовать заготовку сырья герани сибирской в период цветения.

9. Проведены скрининговые фармакологические исследования водорастворимого полисахаридного комплекса, водных и водно-спиртовых извлечений из травы герани сибирской. В результате установлена антиоксидантная, противовоспалительная, антимикробная активность водных, водно-спиртовых извлечений и противовоспалительная активность водорастворимого полисахаридного комплекса.

В результате проведенных исследований экспериментально подтверждена возможность использования травы герани сибирской в качестве источника биологически активных соединений, а также перспективность ее дальнейшего изучения с целью применения в научной медицине в качестве антиоксидантного, противовоспалительного и антимикробного средства. Разработанные методики определения подлинности и стандартизации «Герани сибирской травы» вошли в проект фармакопейной статьи предприятия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бубенчиков, P.A. Исследование полисахаридного комплекса травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / P.A. Бубенчиков, T.A. Позднякова // Научные ведомости БелГУ. - 2012. - вып. 20/1, № 22 (141).-С. 140-141.

2. Бубенчиков, P.A. Фитохимическое изучение травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / P.A. Бубенчиков, T.A. Позднякова // Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области : материалы II Междунар. науч.-практ. конф. (Пенза, 9-10 нояб. 2012 г.): электронное научн. издание. - Пенза, 2012. -С. 328-331.

3. Бубенчиков, P.A. Аминокислотный и минеральный состав травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / P.A. Бубенчиков, T.A. Позднякова // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки : материалы IV междунар. науч.-практ. конф. - Владикавказ, 2013. - С. 199-201.

4. Бубенчиков, P.A. Изучение азотсодержащих соединений травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / P.A. Бубенчиков, T.A. Позднякова // Вопросы обеспечения качества лекарственных средств. — 2013. — № 1. — С. 27-28.

5. Бубенчиков, P.A. Изучение каротиноидов травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / P.A. Бубенчиков, T.A. Позднякова, О.Д. Герасимова // Молодежная наука и современность : материалы 78-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения чл.-корр. РАМН, проф. A.B. Завьялова (17-18 апр. 2013 г.). - Курск, 2013. - Ч. 2. - С. 214.

6. Бубенчикова, В.Н. Исследование дубильных веществ герани сибирской и кульбабы шершавоволосистой / В.Н. Бубенчикова, Т.А. Позднякова, H.H. Гончаров // Человек и лекарство : материалы юбилейного XX рос. нац. конгр. (Москва, 15-19 апр. 2013 г.). - М., 2013. -С. 304.

7. Позднякова, Т.А. Изучение пектиновых веществ травы герани сибирской / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков, О.Д. Герасимова // Человек и лекарство : материалы юбилейного XX рос. нац. конгр. (Москва, 15-19 апр. 2013 г.).-М., 2013.-С. 410.

8. Позднякова, Т.А. Морфолого-анатомическое изучение травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бу-

бенчиков, JI.II. Прокошева // Ученые записки Орлов, гос. ун-та. - 2013. -№ 6 (56). - С. 232-237.

9. Позднякова, Т.А. Стандартизация сырья герани сибирской (Geranium sibiricum L.) по содержанию флавоноидов / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Ученые записки Орлов, гос. ун-та. - 2013. - № 3 (53). -С. 288-291.

10. Позднякова, Т.А. Трнтерпеновые соединения герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова // Медицина, фармация и общественное здоровье: материалы Евразийского конгр. с междунар. Участием. — Екатеринбург, 2013. - С. 113-117.

11. Бубенчиков, P.A. Изучение веществ первичного биосинтеза травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / P.A. Бубенчиков, Т.А. Позднякова // Медична наука та практика: актуальш питаня взаэмоди: зб1рник тез. наукових po6iT учасниюв мЬкнароднсм науково-практичжм конференцп (Кшв, 16-17 серпня, 2013 р.). - Кит, 2013. - С. 77-80.

12. Бубенчиков, P.A. Антиоксидантная активность травы герани сибирской / P.A. Бубенчиков, Т.А. Позднякова // Вопросы обеспечения качества лекарственных средств. — 2014. —№ 5. — С. 33-35.

13. Бубенчиков, P.A. Изучение состава фенольных соединений герани сибирской методом ВЭЖХ / P.A. Бубенчиков, Т.А. Позднякова // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы XII междунар. конф. (Минск, 11-12апр. 2014 г.).-Минск, 2014.-С. 13-15.

14. Печенин, О.Д. Изучение антибактериальной активности настоя травы герани сибирской / О.Д. Печенин, P.A. Бубенчиков, Т.А. Позднякова // Человек и лекарство : материалы XXI рос. нац. конгр. (Москва, 7-14 апр. 2014 г.). - М., 2014. - С. 306-307.

15. Позднякова, Т.А. Валидация методики количественного определения суммы дубильных веществ в траве герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2014. - № 11. — С. 15-19.

16. Позднякова, Т.А. Валидация методики количественного определения флавоноидов в траве герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Ученые записки Орлов, гос. ун-та. - 2014. - № 3 (59). - С. 250-253.

17. Позднякова, Т.А. Герань сибирская: содержание жирных и органических кислот / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Фармация. — 2014. - № 8. - С. 13-15.

18. Позднякова, Т.А. Изучение антиэкссудативной активности травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Проблемы современной медицины: актуальные вопросы: материалы междунар. науч.-практ. конф. (6 нояб. 2014 г.). - Красноярск, 2014. - С. 194-196.

19. Позднякова, Т.А. Исследование эфирного масла герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 3, ч. 3. - С. 539-542.

20. Позднякова, Т.А. Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Фундаментальные исследования. — 2014. — № 11, ч. 1. — С. 110-113.

21. Позднякова, Т.А. Разработка показателей качества травы герани сибирской (Geranium sibiricum L.) / Т.А. Позднякова, P.A. Бубенчиков // Ученые записки Орлов, гос. ун-та. - 2014. - № 6 (62). -С. 139-140.

22. Бубенчиков, P.A. Фенолкарбоновые кислоты травы герани сибирской / P.A. Бубенчиков, Т.А. Позднякова // Теоритичш та практичш аспекта дослщження лкарських рослин: матер1али I М!жнародно1 науково-npaKTHMHoi internet-конференцн (Харюв, Украша, 20-21 березня 2014 р.). -Харив, 2014.-С. 50-51.

23. Pozdnyakova, Т.А. Development of methodology for the quantitative determination of tannins in the Geranium sibiricum L. herb / T.A. Pozdnyakova, R.A. Bubenchikov // Int. J. Exp. Educ. - 2014. - N 2. - P. 40-42.

ПОЗДНЯКОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГЕРАНИ СИБИРСКОЙ (GERANIUM SIBIRICUM L.)

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 24.04.2015 г. Подписано в печать 29.04.2015 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 294(A). Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.