Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез и оценка биологической активности новых производных и аналогов глицирризиновой кислоты

На правах рукописи

Балтика Лия Александровна

СИНТЕЗ И ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ И АНАЛОГОВ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ

кислоты

15 00.02 — Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2007

□03060383

003060383

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Институте органической химии Уфимского научного центра Российской Академии наук

Научный руководитель:

академик РАН Толстиков Генрих

Александрович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Михалев Александр Иванович доктор химических наук, профессор Шкляев Юрий Владимирович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Росздрава

Защита диссертации состоится «19» июня 2007 года в 13 00 на заседании диссертационного совета Д 208 068 01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу 614990, г. Пермь, ул Ленина, 48

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии Автореферат разослан « И » мая 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, ¡7} к фарм н,доцент // МетелеваЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема создания новых лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных инфекций и иммунодефицитов различной этиологии, по-прежнему, является одной из важнейших задач медицины, фармации и медицинской химии по причине все более широкого распространения ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов В и С и появлением новых вирусных респираторных инфекций (атипичная пневмония, «куриный» грипп и др) Поэтому среди наиболее интенсивно разрабатываемых в последние годы лекарственных средств противовирусные препараты выдвинулись на одно из первых мест Арсенал эффективных противовирусных препаратов, обладающих этиотропным и/или иммунокоррегирующим эффектом, разрешенных к применению в медицине, пока невелик и их можно разделить на три основные группы по химическому составу, механизму действия, спектру активности и длительности клинического эффекта ингибиторы вирусных ферментов, интерфероны и иммуномодуляторы Новым подходом является поиск противовирусных средств нового поколения, с новым механизмом действия, среди которых особого внимания заслуживают природные соединения, получаемые из доступного растительного сырья, и их модификанты

К числу природных соединений, представляющих большую ценность для медицины в качестве основы для создания новых высокоэффективных противовирусных и иммуностимулирующих препаратов, относится глицирризиновая кислота (ГК) - основной биоактивный тритерпеновый гликозид корней солодки (с ) голой (Glycyrrhiza glabra L) и уральской (Gl uralensis Fisher), являющийся одним из лидирующих природных соединений, пригодных для лечения ВИЧ инфекции на ранних стадиях репликативного цикла вируса В Японии успешно применяется в виде внутривенных вливаний препарат SNMC (Stronger Neo-Mmophagen Со) для лечения хронических вирусных гепатитов В, С и цирроза печени ГК является первым веществом, ингибирующим репликацию новых ко-ронавирусов (CoV), вызывающих атипичную пневмонию (severe acute respiratory syndrome) (SARS) Россия в настоящее время не располагает эффективными противовирусными препаратами, полученными на основе ГК, кроме препарата глицирам (моноаммонийной соли ГК), разрешенного к применению в медицине в качестве противовоспалительного средства

В Институте органической химии Уфимского научного центра (ИОХ УНЦ) РАН синтезирован препарат ниглизин - полусинтетическое производное ГК, активный против мутантных форм ВИЧ, резистентных к действию азидоти-мидина (АЗТ) Таким образом, химическая модификация ГК является перспективным путем для конструирования новых лекарственных средств с улучшенными фармакологическими свойствами, а доступность, низкая токсичность и наличие растительной сырьевой базы делают поиск новых высокоэффективных лекарственных веществ среди производных ГК одним из перспективных направлений в создании средств для лечения и профилактики вирусных заболеваний, в том числе, новых и социально опасных

Настоящая работа является развитием цикла исследований, связанных с синтезом новых биологически активных веществ и разработкой высокоэффективных лекарственных средств на основе ГК

Работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ Башкирского государственного медицинского университета (БГМУ) и ИОХ УНЦ РАН по теме «Химические трансформации и синтез аналогов биологически активных терпеноидов» (№ 0120 0500681), при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) и БНТСа Австрии (грант 03-0320004), Федерального агентства по науке и инновациям (Роснаука) по темам 2005-РИ-12 0/004/088 «Синтез и изучение противовирусной активности новых производных и аналогов глицирризиновой кислоты и родственных соединений» (№ 01 2006 12303), 2005-РИ-112/001/375 «Исследование реакционной способности низкомолекулярных растительных метаболитов — научная основа разработки лекарственных препаратов высокой социальной значимости» (научная школа академика Г А Толстикова)

Цель работы Синтез новых биологически активных веществ на основе ГК и родственных соединений, исследование их физико-химических свойств, поиск новых иммуностимуляторов и противовирусных агентов в ряду производных и аналогов ГК

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи 1) разработать новый способ получения моноаммонийной соли ГК из корней с уральской, 2) разработать методы синтеза новых азотсодержащих производных и аналогов ГК (гликопептидов, тритерпеновых коньюгатов с аминосахарами, азотсодержащих гетероциклов), 3) осуществить синтез новых сложных эфиров тритерпеновых гликозидов - аналогов ГК, 4) разработать новый метод синтеза тритерпеновых З-О-гликозидов, 5) провести первичную оценку иммунотропной и противовирусной активности (анти-ВИЧ-1, ан-ти-SARS CoV) новых соединений.

Научная новизна Предложен новый патентно чистый способ получения фармакопейной моноаммонийной соли ГК из корней с уральской (Gl uralensis Fisher) российского происхождения Методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения 'Н (600 МГц) и 13С (150 МГц) проведено полное отнесение сигналов протонов в спектрах ГК, ее моноаммонийной соли и триметилового эфира

Разработан селективный метод синтеза коньюгатов ГК с аминокислотами и дипептидами (гликопептидов), базирующийся на активации карбоксильных групп углеводной части ГК с помощью N-гидроксисукцинимида - N,N'-дициклогексикарбодиимида Впервые синтезированы гликопептвды ГК, содержащие по два остатка аминокислот, дипептидов и их эфиров в углеводной части молекулы, в том числе, L-цистеин- и L-лизинсодержащие Разработан улучшенный метод синтеза тритерпеновых коньюгатов с D-глюкозамином и лактозами-ном - модифицированных аналогов ГК Впервые синтезированы гетероциклические пиразольные производные ГК и сложные эфиры 18а-ГК и софорозидного аналога ГК Разработан новый метод получения тритерпеновых З-О-гликозидов -аналогов ГК с использованием в качестве активатора монобромида иода

Впервые изучена противовирусная активность новых производных ГК в отношении ¿>,4 ^-ассоциированных коронавирусов, вызывающих атипичную пневмонию

Практическая значимость. Синтезировано и охарактеризовано 80 новых соединений - производных и аналогов ГК, среди которых найдены перспективные стимуляторы гуморального иммунного ответа, анти-ВИЧ-1 и аити-5/)й5 Со К агенты, имеющие ряд преимуществ перед известными фармакологическими аналогами и природным гликозидом Гликопептиды ГК с метиловым эфиром Ь-валина и Ь-пролином рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям в качестве стимуляторов гуморального иммунного ответа Коньюгаты ГК с (5-бензил)-Ь-цистеином, диметиловым эфиром Ь-аспарагиновой кислоты и глицил-Ь-фенилаланином представляют интерес для медицины в качестве высокоактивных анти-ВИЧ-1 агентов, менее токсичных по сравнению с известным анти-ВИЧ препаратом азидотимидином. Выявлен ряд закономерностей зависимости структура — противовирусная (анти-ВИЧ-1, анти-Х^Й!? СоУ) активность в ряду синтезированных соединений

Получены опытные образцы высокоочищенного глицирама и ГК, разработана ипьекционная форма глицирама, обладающая анти-ВИЧ-1 активностью

Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном симпозиуме по фармацевтической химии (Стамбул, Турция, 2003), XVIII Международном симпозиуме по медицинской химии (Коппенгаген, Дания, Мальмо, Швеция, 2004), 2-ой Международной конференции по природным продуктам и физиологически активным веществам (Новосибирск, 2004), 2-м Международном совещании по медицинской и фармацевтической химии (Аиталия, Турция, 2004), Совместном международном Европейском совещании по медицинской химии (Вена, Австрия, 2005), V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), 14-м Европейском симпозиуме по органической химии (Хельсинки, Финляндия, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), Международном симпозиуме по химии, биологии и медицине (Пафос, Кипр, 2006), XIX Международном симпозиуме по медицинской химии (Стамбул, Турция, 2006)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 статей в центральных и международных журналах, 10 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах, получено положительное решение на выдачу патента РФ

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Способ получения моноаммонийной соли ГК из корней с уральской

2 Методы синтеза новых азотсодержащих производных и модифицированных аналогов ГК (гликопептидов, пиразолов, тритерпеновых коньюгатов с аминосахарами)

3 Методы синтеза новых эфиров 18а-ГК и софорозидного аналога ГК

4 Метод синтеза модельных тритерпеновых З-О-моногликозидов - аналогов ГК

5 Структуры впервые синтезированных соединений, установленные на основе спектральных данных

6 Результаты испытаний биологической активности новых производных и аналогов ГК и некоторые закономерности зависимости «структура - противовирусная активность»

Объем и структура и диссертации Диссертационная работа изложена на 192 стр и состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 268 наименований, содержит 33 таблицы и 4 диаграммы В приложение включены акты испытаний, ВЭЖ-хроматограммы и ЯМР спектры

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Выделение глицирризиновой кислоты и ее моноаммонийной соли (глицирама) из корней солодки уральской

Глицирризиновая кислота (ГК) (1) - тритерпеновый гликозид, являющийся основным биоактивным компонентом экстракта корней солодки голой (Gl glaba L) и уральской (Gl uralensis Fisher), представляет большой интерес для медицины вследствие своей высокой и разнообразной фармакологической активности, в том числе противовирусной и иммуномодулирующей

Удобным сырьем для получения ГК является субстанция моноаммонийной соли ГК (глицирам), который применяется в медицинской практике в качестве противовоспалительного и противоаллергического средства Главным источником для получения глицирризина (сырого экстракта) и глицирама являются корни с голой В связи с тем, что естественные плантации этого растения остались за пределами России, мы поставили задачу разработать перспективный для промышленной реализации способ получения глицирама с использованием в качестве сырья корней широко распространенной на территории России с уральской На схеме 1 показана предлагаемая нами последовательность операций, позволивших получить образцы моноаммонийной соли (1 ЫН4-соли) ГК (3), соответ-

ствующие требованиям ВФС 42-419-75, из корней с уральской с содержанием ГК -7,0%, разрешенной к применению в медицине Схема 1

корни солодки

0,5% NH4OH

водно-аммиачный экстракт солодки

концентрат ГК

3 NH4- соль ГК

1% H2S04 в ацетоне „

1 ЛУК. 90-95°у

2 85% EtOH

ацетоновый экстракт

конц H2SO4 --—->.

25% NH4OH

ШН4-соль ГК

1 1%H2S04 ГК

-►

2 СНСЬ

содержание 88,0-88,5%

Схема 2

Глицирам

3 ЫН4-соль ГК

ГК

катиошггы (Н+) 70-75 % EtOH ЛУК 90-95 °С

1 1%H2S04

технический гликозид

содержание 88,5%

1 СНСЬ -►

2 Ацетон

3 25% NH4OH

1 NH4- соль ГК

Перекристаллизация из 85% EtOH

2 СНС13

Чистая

1 NH4- соль ГК

92,2 % (выход 76,9 %) 97,1 % (выход 79,6 %)

90,2% (выход 70,4%) 95,5 % (выход 67 %)

Для получения высокоочищенной ГК предложена схема 2 очистки промышленного глицирама-субстанции (75±2%) (ОАО Химфарм, г Шымкент) Содержание основного вещества в образцах определяли ВЭЖХ в сравнении с эталонным образцом ГК (99,9%), выделенным препаративным методом (по калибровочной кривой стандарта) на колонке с обращенной фазой ц-Bondapak С18 (3,9x300 мм), подвижная фаза - Ме0Н-Н20-СН3С00Н, 60 35 5 (v%), детектор -УФ (X 254 нм)

При обработке очищенной соли (3) 1% H2S04 получали ГК 92,2 % чистоты (выход 76,9 %), которая была охарактеризована в виде триметилового (4) эфира По данной схеме были получены эталонные образцы глицирама с чистотой

95,5% (выход 67%) и кристаллическая ГК с содержанием основного вещества 97,1 % (выход 79,6%)

2. Инъекционные формы глицирама и глицирризиновой кислоты

Разработана новая инъекционная форма очищенной моноаммонийной соли ГК (95%) (ИФГ), представляющая собой 2% раствор глицирама в стерильном изотоническом растворе NaCl, содержащем комплекс биоактивных кислот (ме-тионин и никотиновую кислоту) и ЫаНСОз, в ампулированном виде и в виде стерильных растворов во флаконах по 200 и 400 мл Получены также стерильные растворы ГК (97 %) с рН 6-7, содержащие NH4OH, никотиновую кислоту и ме-тионин в соотношении 1.10 и 2 10

3. Спектры ЯМР ]Н и |3С высокого разрешения глициризиновой

кислоты и ее производных

На ЯМР-спектрометрах высокого разрешения Varían Unity Inova с рабочей частотой 600 МГц ('Н) и 150 МГц (13С) (Австрия) получены спектры ЯМР *Н и 13С высокого разрешения ГК (1), ее моноаммонийной соли (3) и триметилового эфира (4) Впервые проведено полное отнесение сигналов протонов в области сильного поля 0,7-2,3 м д в спектрах ЯМР *Н, а также уточнены сделанные ранее отнесения сигналов атомов углерода в спектрах ЯМР 13С методами ЯМР 1D !Н,13С, а также двумерной (2D) - гомоядерной-НН и гетероядерной -СН спектроскопии в режимах DQF-COSY, HSQC, HSQC-TOCSY и НМВС

В агликоновой части молекулы ГК атомам углерода С19 (41,8 м д) соответствуют резонансы протонов при 2,14 и 1,75 м д, С1 (39,6 м д) - сигналы протонов при 3,04 и 1,06 мд, С 22 (38,5 мд) - 1,71 и 1,45 мд и тд Сильнопольный дублетный сигнал метанового протона Н-5 (0,76 м д) связан с углеродным сигналом 55,6 м д и имеет одну большую вицинальную константу 3JHaHa= 12,6 Гц с аксиальным метиленовым протоном На-6 (1,29 м д), что указывает на диаксиальное расположение взаимодействующих протонов и, следовательно, подтверждается транс-сочленение колец А и В

Образование моноаммонийной соли ГК (3) происходит, вероятно, по одной из карбоксильных групп углеводной части, поскольку в спектре ЯМР 13С высокого разрешения сигналы атома углерода С30 агликоновой части сохраняют свое значение как и в спектре исходной ГК

4. Синтез гликопептидов глицирризиновой кислоты

4.1. Гликопептиды ГК, содержащие алкиловые эфиры аминокислот

Коньюгаты ГК с аминокислотами (гликопептиды) представляют интерес в качестве иммунномодуляторов нового типа и соединений, моделирующих амид-ные связи некоторых природных гликопептидов Нами осуществлен синтез новой группы гликопептидов ГК (5-16), содержащих фрагменты алкиловых эфиров L-аминокислот в углеводной части молекулы

Конденсацию ГК (1) с алкиловыми эфирами аминокислот в виде их гидрохлоридов (аминокомпонент) (АК) провели методом активированных эфиров с помощью Ы-гидроксисукцинимида (Н08и) и Ы,Ы'-дициклогексикарбодиимида (13СС) в среде ТГФ при 0-5 °С в присутствии триэтиламина (Е13М) при мольном соотношении реагентов ГК/НОБи/ЬсС/АК, равном 1/3-4/2-2,5/2,5 Реакция идет с образованием активированного эфира ГК (17) (схема 3)

Схема 3

соон

соон

rtjh2.hqi /etjn

cor'

ch2n2

Q-nh-^-nh-Q

(5) R=H, R1=<ily-OEt,

(6) R=Me, R'=Gly-OEt,

(7) R=H, R^Ala-OMe,

(8) R=Me, R'=Ala-OMe,

(9) R=H, R*=Ala-OBu,

(10) R=Me, R1=Ala-OBu,

(11) R=H, RI=Val-OMc,

(12) R=H, R'=Val-OBu,

(13) R=Me, R'-Val-OBu,

(14) R=H, R'=Arg (NBz)-OEt,

(15) R=Me, R'=Arg (NBz)-OEt,

(16) R=H, R'=Pro-OMe,

HOSu =

о

N—OH О

DCC

■ 0-n=c=n0

Гликопептиды (5,7,9,11,12,14,16) со свободной ЗО-СООН-группой выделены колоночной хроматографией (КХ) на силикагеле (СГ) с выходами 45-55% Структуры полученных соединений подтверждены спектральными методами и метилированием ЗО-СООН группы в агликоне диазометаном В спектрах ЯМР 13С метилированных дигликопептидов (6,8,10,13,15) наблюдается сдвиг сигнала СЗО агликона до 176-177 м д в результате образования сложиоэфирной связи

4.2. Цистеинсодержащие гликопептиды

Цистеинсодержащие гликопептиды ГК представляют интерес как ингибиторы цистеин-протеаз, которые гидролизуют амидные связи полипептидов Синтезированы гликопептиды ГК (18-25), содержащие фрагменты L-цистеина (Cys) Соединения (18) и (19) получены с помощью HOSu и DCC при молярном соотношении реагентов ГК/HOSu/DCC, равном 1/4/2,5-3,5 в присутствии Et3N в среде ТГФ при 0-5 °С с использованием в качестве АК гидрохлоридов метилового и трет - бутилового (Bu') эфиров S-бензил (Bzl)-Cys (выходы 55 и 60 %, соответственно)

(18) R=OH, R'= C6H5O^SCH2CHCOOCBj

Лн-

(19) Я=ОЦ R1" C6II5CI f,SCH2CI ¡COOqCHj)3 tet

(20) R=OH, R1 ^QÂCTbSaizCTCOOCI JjQHs itot-

(21) R=OH, R'^CJIsaijSaMt-COOII liffi-

(22) R=R1 »ctiijabsabaicoociciijb

TÎiH-

(23) R=R' =c6ii5CH2scn2acoo[[

(24) R=ÖH, R1 = QJIsCHjSCftaiCONffCra КСНзЬ

tiiH- ¿оос(сн,)з

(25) R=OH, Rl= CÄOfcSatOi-CONHCHCHiCHjb Ли- ¿хюн

Гликопептид (22) образуется при использовании избытка HOSu и DCC и проведении реакции активации ГК при 20-22 °С (выход 66 %) Гликопептиды (20) и (24) были получены конденсацией ГК с бензиловым эфиром (8-бензил)-Ь-цистеина и трет-бутиловым эфиром (8-бензил)-Ь-цистеин-валина с помощью реагента Вудворда К (R.WK) в диметилформамиде (DMF) в присутствии Et3N (выходы 52 и 57%, соответственно) Трет-бутиловые сложноэфирные группы соединений (19), (22) и (24) удаляли CF3COOH. Соединение (20) деблокировали каталитическим гидрогенолизом в 70% СН3СООН в присутствии 10%Pd/C

4.3. Гликопептиды глицирризиновой кислоты, содержащие

остатки дикарбоновых кислот

Осуществлен синтез гликопептидов ГК (27-41), содержащих остатки L-глутаминовой кислоты (Glu) с использованием приемов селективной защиты и деблокирования СООН групп аминокислотной компоненты

о-

(27) R = R'= C6H5CH2OOCCH2CH2CHCOOCHj I

NH-

(28) R = Rl= HOOCCH2CH2CHCOOCH3 NH-

(29) R = OH, R'= C6H5CH2OOCCH2CH2CHCOOCH3

кн-

(30) R = OH, R'= (CH3)jCOOCCH2CH2CHCOOCH3

tapi)!!^ OH, R - HOOCCH2CH2CHCOOCH3 I

NH-

(32) R - OH, R'= CH3OOCCH2CH2CHCOOH I

nh-

(33) R = OH, R'= (CH3 )3 OOCCH2CH2CHCOOII

Wh-

(26)R = R' = (34) R = OH, R1- HOOCCCH2CH2CHCOOH

/N кн-

N/ (34 R = OH, R'= CH3OOCCH2CH2CHCOOCH3

NH-

(36) r = OMe, r'= с6н5сн2ооссн2сн2снсоосн2сбн5

кн-

(37) R = OMe, R'= HOOCCH2CH2CHCOOH

NH-

(3S) R = OH, R1 = C2 H5OOCCH2CH2CHCOOCH2CH3

кн-

(39) R = OH, R1 = (CH3)3C OOCCH2CHCOOCH3

NH-

(40) R= OH, R1 =HOOCCH2ÇHCOOCH3

NH-

(41) R = OH, R1 = CH3OOCCH2CHCOOCH3

I

NH-

При активации карбоксифупп ГК с помощью N-гидроксибензотриазола (HOBt) и DCC при соотношении ГК-HOBt-DCC 1/4/3 ммоль с последующим взаимодействием образующегося активированного трис-N-

оксибензотриазолъного эфира ГК (26) с гидрохлоридом а-метилового,у-бензилового эфира L-Glu (4 ммоль) в присутствии Et3N (7 ммоль) получили гли-копептид (27) (выход 72%), гидрогенолиз которого в 75% СН3СООН в присутствии 10% Pd/C привел к соединению (28) (выход 62%) Гликопептидная связь образуется в результате анхимерного эффекта при внутримолекулярном каталитическом аминолизе активированного эфира ГК (26) во время атаки нуклеофила (АК)

Активация карбоксигрупп ГК HOSu - DCC при температуре 0-5°С приводила к преимущественному образованию гликопептидов (29,30,32,33,35,38), содержащих остатки эфиров Glu только в углеводной части ГК (выходы 50-55 %)

Селективным деблокированием у-сложноэфирной группы соединений (29) и (30) получен гликопептид (31), содержащий два остатка Glu(OH)-OMe

Коньюгаты ГК и L-аспарагиновой кислоты (Asp) (39,41) синтезированы также с помощью HOSu-DCC в диоксане в присутствии N-этилморфолина или EtîN Деблокирование защищенного гликопептида (39) CF3COOH привело к коньюгату ГК с Asp(OH)-OMe (40) (выход 55%)

4.4. Лизинсодержащие гликопептиды глицирризиновой кислоты

Впервые получены коньюгаты ГК (42-48), содержащие три или два остатка L-лизина (Lys) или его эфиров, связанных с a-NH2 группой Lys CONH- связью.

Ч ^COR

О. J^ J

(42) С6Н3СН2ОСОМНСН2СН2СН2СН2СНСООСНз

ын-

(43) Я=ОН, Я1» С<,Н5СН2ОСОЫНСН2СН2СН2СН2СНСООСН3

I

ын—

(44) Я=ОН, я'= С6Н5СН2ОСОЫНСН2СН2СН2СН2СНСООС(СНз)з

ян—

(45) 11=ОМе, я'= С6Н5СН2ОССЖНСН2СН2СН2СН2СНСООСНз

ын-

(4«) Я=ОМе, С6Н5СН2ОС(ЖНСН2СН2СН2СН2СНСООС(СНз)з

ын-

(47) Я=ОН, я'= С6Н5СН2ОСОШСН2СН2СН2СН2СНСООН

ын-

(48) 11-ОМе, я'= С6Н5СН2ОСОЫНСН2СН2СН2СН2СНСООН

ш-

Си1ггез гликопептида (42) осуществлен путем конденсации ГК с метиловым эфиром кapбoбeнзoкcи-L-Lys в виде трифторацетата с помощью НОВЬ БСС в присутствии Е(:3Ы (выход 52%) Соединения (43) и (44) получены при активации ГК НОБи-ЭСС с выходами, соответственно, 55 и 48%, их структуры подтверждены получением 30-метиловых эфиров (45) и (46) Обработка глико-пептидов (44) и (46) СР3СООН привела к соединениям (47) и (48)

4.5. Другие гликопептиды глицирризиновой кислоты

С целью расширения ряда азотсодержащих производных ГК, содержащих фрагменты свободных аминокислот и дипептидов, был осуществлен синтез гли-копептидов (49-57) с использованием трет-бутиловых эфиров Е-аминокислот при активации ГК с помощью НОЗи-ЭСС при 0-5°С в диоксане

ч

,COOR

ОН I

COR1 О

ОН I о

COR1

(49) R= ОН, Rl= Met OBu (56)R=OH,R1=ProOBut

(50) R= OH, R1= IfeOBu' (57) R= OH, R'=PtoOH

(51)R=Me,R'=MetOH (58)R=OIiR1=G!y-LeuOBd

(52) R= OH, R1=MctOt I (59) R= OH, R'=GIy-LeuOH

(53) R= OH, R1=DeOH (60) R= OH, RI=GIy-PheOBzl

(54) R?= OH, R1 =РЬгОВи' (61) R= OH, R'=Gly-Phe

(55) R= OH, R1=PheOH

OH

Bzl = CH2C6H5 Bu1 = (СНз)зС

Взаимодействие эфира ГК (17) с трет-бутиловыми эфирами L-аминокислот проходило при 20-22°С в присутствии N-этилморфолина Защищенные коньюгаты (49,50) выделены КХ на СГ (выходы 50-52%) Обработкой соединений (49) и (50) CF3COOH получены свободные гликопептиды ГК (52) и (53), содержащие остатки аминокислот в углеводной части

Гликопептиды (58) и (60) синтезированы HOBt-DCC методом с выходами 45 и 44 %, соответственно, из ГК и гидрохлоридов бензиловых эфиров глицил-L-лейцина и глицил-Ь-фенилаланина в присутствии Et3N Бензиловые зфиры соединений (58) и (60) деблокировали гидрогенолизом в 75% СН3СООН, получая дипептидные производные ГК (59) и (61).

5. Синтез пиразольных производных ГК

Осуществлен синтез новых азотсодержащих гетероциклических производных ГК (схема 4) на основе дигидразида (62), реакция которого с ацетилаце-тоном или бензоилацетоном в 5% спиртовом растворе НС1 приводила к образованию пиразольных производных ГК (63) и (64) с выходами 53-55%

В спектре ЯМР 13С пиразола (63) появляются дополнительные интенсивные (двойные) сигналы в области 165 и 155 м д , обусловленные олефиновыми атомами углерода (С=С, C=N), 63 и 26 м д, принадлежащие СН3 группам пиразольных фрагментов, 52-53 м д — C-N

По-видимому, реакция идет с образованием промежуточного гидразона (63а) в результате конденсации дигидразида ГК (62) в енольной форме с ацетил-ацетоном в кислой среде с последующей циклизацией в пиразол (63).

6. Синтез коньюгатов тритерпеновых кислот с аминосахарами — модифицированных аналогов глицирризиновой кислоты

Синтетические аналоги биоактивных природных тритерпеновых гликози-дов представляют интерес для изучения зависимости структура-активность Весьма перспективным подходом для конструирования предшественников лекарств («пролекарств») является модификация природных соединений с введением молекул аминосахаров

Нами синтезированы тритерпеновые коньюгаты «-Б-глюкозамина (71) и (74) (выходы 70 и 75%) (схема 5) и тритерпеновый Ы-гликоконьюг (76) спейсер-ного типа с использованием незащищенного /?-Б-лактозамина (выход 62%) В качестве тритерпеновых кислот были использованы З-О-ацилаты (69), (72) и (75) - аналоги карбеноксолона (66) — известного противоязвенного препарата, полученные из соответствующих метиловых эфиров (65а), (67а) и (68а) по известным методикам

Ацилирование 1,3,4,6-тетра-О-ацетата а-Э-глюкозамина проводили ОСС методом в смеси ОМР-пиридина (Ру) в присутствии НОЕИ, добавление которого позволяет подавить образование побочных продуктов (ТЧ-ацилмочевин) и увеличить выход целевых соединений с амидной связью -на 20% Мягкое деблокирование защищенных коньюгатов (70, 73) 1% раствором КОН в МеОН и последующая обработка катеонитом КУ-2-8 (Н+-форма) привели к тритерпеновым коньюгатам (71, 74), которые являются модифицированными аналогами ГК М-гликоконъюгат (76) охарактеризован в виде пер-О-ацетата (77) (выход 86%)

Схема 5

СООМе

(73) К=Ас, и'=Ме

(74)

ОИ

-ОИН- .

I \| (76) я'=н

(77) К*=Ас

(75) И. = Н

7. Сннтез новых эфиров тритерпсновых гликозндов- аналогов ГК

Синтезированы новые сложные эфиры /?-софорозидного аналога ГК (78) и 18а-ГК (Б/Е-транс-изомер) (81), являющиеся аналогами пента-О-никотината ГК (ниглизина) и пента-О-сульфоната натрия ГК, обладающих высокой анти-ВИЧ активностью Сульфированием гликозидов (78) и (81) в Ру комплексом БОз'Ру при 20-22°С с последующей нейтрализацией 1 М раствором ИаОН и обработки катионитом КУ-2-8 (Н+) в водном МеОН получены водорастворимый гепта-О-сульфонат (79) (выход 54%) (схема 6) и пента-О-сульфонат 18а-ГК в виде динат-риевой соли (82) (выход 56%)

При нагревании гликозида (78) в смеси Ру-Ви3К при 90-100 °С (3 ч) с избытком гидрохлорида хлорангидрида никотиновой кислоты (ГХНК) в присутствии молекулярных сит 4 А получен пента-О-никотинат (80) (выход 64%) Аци-лирование 18я-ГК ГХНК в смеси Ру-ВизЫ при 80-90 °С привело к диникотинату (83) (выход 80 %), избытком ГХНК (1.8 ммоль) при 90-100 °С в течение 8 ч в Ви^ - к пента-О-никотинату (84) (выход 60,7%), хлорангидридом 4-метоксикоричной кислоты (1 8 ммоль) при 60-70 °С - к пента-0-(4-метокси)-циннамату (85) (выход 65,6 %)

Схема 6

сооме

(79) Л = 5<Э3№1

Реагенты I) БОз-Ру, 20-22°С 11) ЫСОС1,90-100°С, 3 ч

(81) И » И1- Н

соо!»1 <

(82) И - вОзМя, И1 = N1, Я2 = II

I

С,

(83) 2

(84)

(85) К

К- (ОТ ;зк-н,к1=к2 = н с

1»= [^Чт^0 .и'-к'-н

N

\

^сн-сн-с=о, Я1 - И2 - II

8. Синтез модельных тритерпеновых З-О-гликозидов

С целью получения аналогов ГК с нейтральной моносахаридной углеводной цепью, связанной с С-3 положением агликона а- или /?- гликозидными связями, нами проведено гликозилирование метилового эфира 18/?-ГЛК (МеГЛК) (65а) гликозильным донором (ГД) - 2,3,4,6-тетра-0-ацетил-а-0-галактопиранозилбромидом в присутствии монобромида иода (1-Вг), который ранее в синтезе тритерпеновых гликозидов не применялся (схема 7) При проведении реакции гликозилирования в смеси СНзСЫ-СНгСЬ (5 1, \%) при -20 ->0 °С и соотношении реагентов ГД/МеГЛК/1-Вг = 212 ммоль образовывалась смесь а- и /?- галактопиранозидов (88) и (89) (6 1) с общим выходом 35,6%, разделен-

ных КХ на силикагеле В качестве побочного продукта реакции выделен З-О-ацетат МеГЛК (90).

Схема 7

At°iСН2ОЛс АсО-Л——Т—Л

ОАс V

9_

OR

1 l-Br/CH3CN-CHiCI; 1 0,1 N-NsOMe

R\-J\H2° О

(88) R - Ас (88a) R = H

(89) R - Ac (89a) R = II

Увеличение количества активатора (1-Вг) в 2-4 раза и проведение реакции при 20-22 °С в присутствии прокаленных молекулярных сит привело к преимущественному образованию /?-гликозида (89) с выходами 38-64% Выход гликози-дов зависит от соотношения реагентов и количества используемого 1-Вг

СООМе

(91) R = Ас (91а) R-II

Гликозилированием метилового эфира 18,19-дегидро-ГЛК (68а) 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозилбромидом получен 2,3,4,6-тетра-О-ацетил ß-D-глюкопиранозид (91) с выходом 60%.

Дезацетилирование полученных тритерпеновых З-О-гликозидов 0,Ш NaOMe в смеси МеОН-СН2С12 при 20-22 °С привело к модельным гликозидам (88а), (89а), (91а) с выходами 78-83% Структуры полученных гликозидов были

подтверждены спектральными методами (ИК, УФ, ЯМР 'Н и L1C) и масс-спектрами EI/MS (молекулярные ионы).

9, Биологическая активность

Биологическая активность и фармакологические свойства новых производных и аналогов ГК были изучены на кафедре фармакологии № 2 БГМУ, в лаборатории новых лекарственных средств ИОХ УНЦ РАН (острая токсичность, иммунотропные свойства), Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») (анти-ВИЧ-I активность), Институте медицинской вирусологии Университета с госпиталем им. И, В. Гёте г. Франкфурта (Германия) (атк-SABS СоУ активность).

Все исследованные производные ГК по параметрам острой токсичности (ГОСТ 12.1.007-76) относятся к Ilt-IV классу малоопасных веществ.

9.1. И м м у нотро п н а я активность

Изучено влияние гликопептидов ГК (6), (8), (9), (11), (21), (37) и (57) на уровень агглютининов и гемолизинов у мышей в дозах 2 мг/кг (14-дневное введение) (внутрь) и 10 мг/кг (7-дневное введение) при сенсибилизации эритроцитами барана (ЭБ).

Илии кис гликоле [пи до в ГК на уровень агглютининов (Л) и гемолизинов (Б) у сенсибилизированных животных

(14-дневнпе введение) ¡О*

6 Я 9 11 21 37 57 контроль

соединения

Все исследованные гликопептиды ГК статистически достоверно повышают уровень агглютининов и гемолизинов при введении в дозе 2 мг/кг в течение 14 дней но сравнению с контролем в 2-4 раза) и по сравнению с группами животных, получавших эти соединении в течение 7 дней. Наиболее актвными ста-

муляторами гуморального иммунного ответа являются гликопептиды (6) и (57) (диаграмма)

При 7-дневном введении в дозе 10 мг/кг наиболее выраженные эффекты проявили гликопептиды (6), (9), (11) и (57), достоверно повышающие уровень агглютининов и гемолизинов по сравнению с контролем. Исследованные производные ГК не оказывают заметного влияния на клеточный иммунитет

При внутрибрюшинном введении в дозе 2 мг/кг гликопептид (11) увеличивает количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей ~ в 2 раза по сравнению с контролем и превосходит по активности референс-препарат N - ацетилмурамоилдипептид (МДП) (табл)

Влияние гликопептида (11) на выработку АОК у беспородных мышей

Соединение Доза, мг/кг Число мышей в группе Число АОК х 10б спленоци-тов Р

11 2 8 1810±132 <0,002

МДП Кон- 2 8 1660±168 <0,01

троль 8 950 ±70

Цистеинсодержащие гликопептиды (21) и (25) также стимулируют выработку АОК у мышей в 3 - 5 раз по сравнению с контролем Оба соединения оказались активнее МДП (10 мкг/кг) в данном тесте Гликопептид (28) стимулирует выработку АОК к ЭБ по сравнению с контролем ~ в 2 раза Таким образом, им-мунотропная активность исследованных производных ГК зависит от структуры АК, связанной с карбоксильными группами углеводной части ГК, способа введения и дозы Соединения (11) и (57) рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям

9.2. Противовирусная активность 9.2.1. Анти-ВИЧ-1 активность

Изучена анти-ВИЧ-1 активность ряда новых гликопептидов ГК в культуре клеток МТ-4 на традиционной модели первично инфицированных ВИЧ лимфо-идных клеток МТ-4 с использованием штамма ВИЧ-1/ЭВК в сравнении с ГК в концентрации 100 мкг/мл и азидотимидином (АЗТ), облегчающим течение заболевания СПИДом Ингибирующий эффект соединений оценивали на 4-е сутки культивирования измерением количества вирусного антигена - вирусоспецифи-ческого белка р24 - иммуноферментным методом

Цитотоксичность исследуемых соединений оценивали на культуре перевиваемых Г-лимфоцитов человека (линия МТ-4) в виде растворов в диметил-сульфоксиде (БМБО) как концентрацию препарата, вызывающего гибель 50% клеток - СО50

Установлено, что ИФГ обладает выраженной анти-ВИЧ-1 активностью в культуре клеток МТ-4 Количественные характеристики для ИФГ следующие ГО50* = 270 мкг/мл по ингибированию накопления вирусспецифического белка р24, IDso =190 мкг/мл по защите клеток от гибели, IS по защите клеток — более 21

Из исследованных производных ГК наиболее высокую анти-ВИЧ-1 активность обнаружили гликопептиды (23), (41), (59) и (61) CD50 гликопептида (23) составляет 270 мкг/мл (198 мкМ) Данное соединение в 50-55 раз менее токсично, чем АЗТ (CDso- 3,5 мкМ) и проявляет выраженную анти-ВИЧ-1 активность, с высокой эффективностью ингибируя накопление вирусоспецифического белка р24 (IDso - 3 мкг/мл или 2,2 мкМ), Шэд-ЮО мкг/мл IS гликопептида (23) = 90, что существенно выше такового для ГК (IS = 10,3)

Гликопептид (41) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 в концентрациях 250 и 500 мкг/мл и защищает клетки от гибели в результате цитопатогенного воздействия вируса, не оказывая на клетки токсического действия

Гликопептиды ГК (59) и (61) обладают высокой анти-ВИЧ-1 активностью и являются менее токсичными, чем АЗТ (в 90 и 70 раз, соответственно), но более цитотоксичны по сравнению с ГК В концентрации 10 мкг/мл ингибирующее действие гликопептида (61) на накопление р24 ВИЧ-1 не уступало АЗТ IS соединения (59) оказался в 110 раз, а гликопептида (61) - в 34 раза выше такового ГК Гликопептиды (23), (41) и (61) рекомендованы для расширенных биологических испытаний в качестве противовирусных (анти-ВИЧ-1) агентов

Замена углеводной цепи ГК на остаток a-D-глюкозамина приводит к существенному повышению анти-ВИЧ активности коньюгата (74), который является малотоксичным для клеток МТ-4 и обладает в 10 раз более высоким IS по сравнению с ГК Галактозид ГЛК (88а) превосходит ГК по IS в 2,9 раза Софоро-зид ГЛК (78) и 18а-ГК (81) оказались неактивны

* ID50 - концентрация соединения, на 50% подавляющая продукцию вируса, ID90 - концентрация соединения, на 90% подавляющая продукцию вируса, IS - индекс селективности - отношение токсичной дозы CD50 к его эффективной дозе IDso

9.2.2 AamSARS-Co V активность

Amii-SARS-CoV активность ряда новых производных ГК была исследована в культуре клеток VERO в сравнении с ГК с использованием штамма SARS CoVFFMl (Университетский госпиталь г Франкфурта, Германия)

Некоторые из испытанных производных ГК ингибировали репликацию SARS CoV при более низких концентрациях, чем ГК Гликозид (78) был активен против SARS CoV в области ЕС50 8 мкм, однако это соединение оказалось более цитотоксичным, чем ГК 18а-ГК (81) и ее сульфат (82) были неактивны Наиболее высокой активностью обладал цистеинсодержащий гликопептид (21), который имел в 10 раз меньшее значение ЕС5о (50% ингибирующая доза) по сравнению с ГК ГЛК не обнаружила анти-SARS CoV эффекта Установлено, что нали-

чие диглюкуронидной цепи, 18/2-конфигурации и свободной ЗО-СООН группы агликона являются необходимым условием для проявления данного вида противовирусной активности Мы предполагаем, что проникновение вирусов в клетки ингибируется путем связывания ГК и ее производных с углеводами S-протеинов коронавирусов

ВЫВОДЫ

1 Осуществлен синтез новых групп биологически активных азотсодержащих производных и аналогов ГК (гликопептидов, пиразолов, коныогатов три-терпеновых кислот с аминосахарами), представляющих интерес для медицины в качестве потенциальных иммуностимуляторов и анти-ВИЧ-1 агентов

2 Разработан селективный метод синтеза гликопептидов ГК, содержащих фрагменты аминокислот и их эфиров в углеводной части молекулы, основанный на активации карбоксильных групп ГК с помощью N-гидроксисукцинимида-Ы,Ы'-дициклогексилкарбодиимида

3 Предложен улучшенный метод синтеза тритерпеновых коныогатов a-D-глюкозамина и /S-D-лактозамина - модифицированных аналогов ГК в присутствии 1Ч,М'-дициклогексилкарбодиимида - N-гидроксибензотриазола Впервые синтезированы азотсодержащие гетероциклы (пиразолы) на основе дигидразида ГК и новые сложные эфиры 18о-ГК и /í-софорозида ГЛК

4 Разработан новый способ получения моноаммонийной соли ГК (глици-рама) из российского растительного сырья — корней с уральской Предложена схема получения высокоочищенного глицирама и ГК из промышленной субстанции глицирама и разработана его новая лекарственная (инъекционная) форма, обладающая анти-ВИЧ-1 активностью Методами ЯМР спектроскопии высокого разрешения 1Н (600 МГц) и ПС (150 МГц) проведено полное отнесение сигналов в спектрах ГК, ее моноаммонийной соли и триметилового эфира

5 Среди синтезированных гликопептидов ГК найдены эффективные стимуляторы гуморального иммунного ответа у мышей Коньюгаты ГК с метиловым эфиром L-валина и L-пролином рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям

6 Показано, что химическая модификация ГК путем введения аминокислот и дипептидов в углеводную часть молекулы является перспективным путем получения новых анти-ВИЧ-1 агентов, превосходящих по противовирусной активности природный гликозид Ряд новых производных ГК обнаружили высокую анти-ВИЧ-1 активность в культуре клеток МТ-4 и более низкую цитотоксич-ность по сравнению с азидотимидином Гликопептиды ГК с L-цистеином, диме-тиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты и глицил-Ь-фенилаланином рекомендованы для расширенных биологических исследований в качестве анти-ВИЧ-1 агентов Найдены соединения, ингибирующие &47?Л'-ассоциированные корона-вирусы в культуре клеток VERO Установлены некоторые закономерности зависимости структура - противовирусная активность в ряду новых производных и аналогов ГК

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

1 Синтез и иммуностимулирующая активность цистеинсодержащих гли-копегггидных производных глицирризиновой кислоты / РМ Кондратенко, JI А Балтина, Е В Васильева, JI А Балтина (млЧ. А Ф Исмагилова, X М Насыров, Н.Ж Басченко, Р М Киреева, С М Фридман, Г А Толстиков // Биоорган химия -2004 -Т.30, №1 -С 61-67

2 Antiviral activity of Glycyrrhizic acid derivatives against SARS-Coronavirus / Gerold Hoever, Lidia Baltina, Martin Michaelis, Rimma Kondratenko, Lia Baltma, Gennkh Tolstikov, Hans W Doerr, Jindrich Cinatl, jr //J Med Chem -2005 - V 48, No 4. - P 1256-1259

3 Спектры ЯМР 'H и 13C высокого разрешения глицирризиновой кислоты и ее эфиров / Л А Балтина, О Kunert, А А Фатыхов, Р М Кондратенко, JIВ Спирихин, Л А Балтина (мл У Ф 3 Галин, Г А Толстиков, Е Haslinger // Химия прир соед -2005 -№4 - С 347-350

4 Синтез N-гликоконьюгатов глицирретовой кислоты / С.Р Мустафина, Л А Балтина (мл V Р М Кондратенко, Л А Балтина, Ф 3 Галин, Г А Толстиков // Химия природ соед - 2006 - № 1 - С 54-56

5 Синтез и иммуномодулирующая активность новых гликопептидов глицирризиновой кислоты, содержащих остатки L-глутаминовой кислоты / Р М Кондратенко, Л А Балтина (мл), Л А Балтина, Н Ж Басченко, Г А Толстиков //Биоорган химия -2006 -Т32,№6 -С 660-666

6 Синтез L-лизинсодержащих коньюгатов глицирризиновой кислоты / Л А Балтина (млР М Кондратенко, Л А Балтина, О А Плясунова, Ф 3 Галин, Г А Толстиков // Химия природ соед - 2006 - № 5 - С 437-441

7 Synthesis of Glyzyrrhizic acid analogs and related compounds for structure-activity relationships studies / R Kondratenko, L Mikchailova, L Baltina (ir"), L Baltina, S Nepogodiev, R Field // Book of Abstr 4th Intern Symp Pharm Chem -Istambul, Turkey, 2003 - P 198-199

8 Design and synthesis of novel Glycyrrhizic acid derivatives and analogues with positive antiviral activity /LA Baltma, R M Kondratenko, L R Mikhailova, L A Baltina. ir, О A Stolyarova, S A Nepogodiev, R A Field, О A Plyasunova, A G Pokrovskyi, H Hover, J Cinatl //Book of Abstr XVIII Intern Symp Med Chem - Copenhagen Denmark & Malmo Sweden, 2004 // In Drugs of the Future - 2004 -V 29, Suppl A - P 86

9 Synthesis of novel Glycyrrhizic and Glycyrrhetic acids derivatives with positive antiviral activity / R M Kondratenko, L A Baltma, L R Mikhailova, L A Baltina. jr, OV Stolyarova, G A Tolstikov, S A Nepogodiev, R A Field, О A Plyasunova, A G Pokrovskyi // Book of Abstr 2nd Intern Conf on natural products and physiologically active substances (ICNPAS-2004) and 3rd EuroAsian Heterocyclic Meeting "Heterocycles in Organic and Combinatorial Chemistry" (EAHM-2004) - Novosibirsk, 2004 - P 24

10 Isolation, transformations and antiviral activity of licorice triterpenoids / Lia A.Baltina (ir.), Olga V.Stolyarova, Lidia A.Baltina, Rimma M Kondratenko, Natalya

"Heterocycles in Organic and Combinatorial Chemistry" (EAHM-2004) - Novosibirsk, 2004 - P 24.

10 Isolation, transformations and antiviral activity of licorice triterpenoids / Lia A Baltina (ir ). Olga V Stolyarova, Lidia A Baltina, Rimma M Kondratenko, Natalya V Kudashkina, Gerold Hover, Jmdrich Cinatl // Abstr 2 Intern Meeting Med Pharm Chem (IMMPC-2) - Antalya, Turkey, 2004 -P81

11. Synthesis of novel Glycyrrhizic acid conjugates with aminoacids possessing immunomodulate and antiviral properties / Lia A Baltina (ir >. Rimma M Kondratenko, Lidia A Baltina, Natalia Zh Baschenko, Olga A Plyasunova, Herold Hover, Jildrich Cmatl // Abstr Joint Meeting Med Chem - Vienna Austria, 2005 // In Scientia Pharm - 2005. - Bd 73, No 2 - S 78

12. Synthesis of novel saponins mimetics / Lidia A Baltina, Rimma M Kondratenko, Lia A Baltina (ir), Olga V Stolyarova, Sergey A Nepogodiev, Robert A Field, OlafKunert, GennkhTolstikov// Book of Abstr 14 Eur Symp Org Chem -Helsinki Finland, 2005 -P403

13 Синтез новых иммунотропных коньюгатов 18/?- и 18а-глицирризиновой кислоты с аминокислотами / Р М Кондратенко, JI А Балтина (мл). Н Ж Басченко, А.Ф Исмагилова, Г А Толстиков // Новые лекарственные средства успехи и перспективы -Уфа Гилем,2005 -С 36-37

14 Синтез и изучение противовирусной активности новых производных и аналогов глицирризиновой кислоты / JIА Балтина, О А Плясунова, Л А Балтина (мл ), Дж Синатл, А Г Покровский / Сб матер XIII Росс Нац конгр «Человек и лекарство». — Москва, 2006 —С 616-617

15. Synthesis of stereoisomeric Glycyrrhizic acid conjugates with aminosugars and aminoacids with immunomodulate and antiviral properties / Lia Baltina (jr Rimma Kondratenko, Lidia Baltina, Natalia Baschenko, Olga Plyasunova, Martin Michaelis, Jildrich Cinatl, Genrikh Tolstikov // Program and Abstr Intern Symp Chemistry, Biology and Medicine - Cyprus, 2006 - P 05

16 Functional design of plant's derived glycosides / Lia Baltina. Olga Stolyarova, Lidia Baltina, Rimma Kondratenko, Genrikh Tolstikov // Abstr XIX Intern Symp Med Chem - Istanbul, Turkey, 2006 //In Drugs of the Future -2006 -V31, Suppl A -P 167

17. Способ получения моноаммонийной соли глицирризиновой кислоты / Заявка № 205113361/15 от 03 05 2005, решение о выдаче патента РФ от 04 10 2006 // Р М Кондратенко, Л А Балтина. О В Столярова, Л А Балтина, Г А Толстиков

Соискатель выражает глубокую благодарность академику Толстикову Г А за постоянное внимание к работе, д м н, проф Покровского за помощь в проведении испытаний анти-ВИЧ-1 активности, проф СинатлуДж (Германия) за изучение анти-&Ш Со V активности новых производных и аналогов ГК

Соискатель

Л А Балтина

БАЛТИНА ЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

СИНТЕЗ И ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ И АНАЛОГОВ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических

наук

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», 5* заказ № 120, тираж 100 шт, печать л 2,0, 450054, пр Октября, 71

Актуальность работы. Проблема создания новых лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных инфекций и иммунодефицитов различной этиологии, по-прежнему, является одной из важнейших задач медицины, фармации и медицинской химии по причине все более широкого распространения ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов В и С, герпетических инфекций и появлением новых вирусных респираторных инфекций, таких как атипичная пневмония (SARS), «куриный» грипп и др. Поэтому среди наиболее интенсивно разрабатываемых в последние годы лекарственных средств противовирусные препараты выдвинулись на одно из первых мест.

Арсенал эффективных противовирусных препаратов, обладающих этиотропным и/или иммунокоррегирующим эффектом, разрешенных, к применению в медицине, пока невелик и их можно разделить на три основные группы по химическому составу, механизму действия, спектру активности и длительности клинического эффекта: ингибиторы вирусных ферментов, интерфероны и их индукторы и иммуномодуляторы. Для лечения вирусных гепатитов в течение последних 20 лет базовыми препаратами являются интерфероны, причем интерфероновая терапия эффективна в 30-40% случаев [38,39]. Для лечения ВИЧ-инфекции применяются в основном ингибиторы протеазы и обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ, такие как азидотимидин (зидовудин), ламивудин, ставудин, апренавир, индинавир, ритонавир и др. ингибиторы репликации ВИЧ нуклеозидной структуры [60,100,163]. Основной проблемой при монотерапии аналогами нуклеозидов является развитие резистентности к этим препаратам, лечение ВИЧ-инфекции азидотимидином приводит к появлению мутантных форм вируса [163].

Новым подходом является поиск противовирусных средств нового поколения, с новым механизмом, действия среди природных соединений, получаемых из доступного растительного сырья, и их модификантов.

С природными веществами в настоящее время связано около 30% мирового фармацевтического рынка с ежегодным оборотом 50 млрд. долларов

154]. Стоимость этих препаратов намного ниже, чем у известных нуклеозидных противовирусных препаратов, а значит, доступность для широких масс населения выше. Все большее распространение в качестве лекарственных средств получают различные модификанты и аналоги природных соединений, обладающие более высокой активностью по сравнению с нативными веществами.

К числу природных соединений, представляющих большую ценность для медицины в качестве основы для создания новых высокоэффективных препаратов для лечения и/или профилактики вирусных инфекций и иммунодефицитов различной этиологии можно отнести глицирризиновую кислоту (ГК) - основной тритерпеновый сапонин экстракта корней солодки голой (Glycyrrhyza glabra L.) и уральской (Gl. uralensis Fisher), распространенных на территории Западной Сибири, Южного Урала, Средней Азии, Афганистана, Восточного Китая, Монголии, Испании и др. стран. ГК и ее моноаммонийная соль - глицирам полностью ингибируют in vitro репродукцию ряда ДНК и РНК-вирусов (Vaccinia, New Castle, Vesicular stomatitus, Herpes simplex, Herpes В, Varicella zoster) [23]. ГК является одним из лидирующих природных соединений, пригодных для терапии ВИЧ-инфекции. Уникальным свойством ГК является новый механизм действия на ВИЧ: гликозид солодки действует уже на ранних этапах репликационного цикла вируса, препятствуя стадии адсорбции вируса клеткой. ГК является первым природным соединением, наиболее эффективно ингибирующим репликацию новых коронавирусов, вызывающих атипичную пневмонию (SARS). ГК является объектом многочисленных исследований зарубежных фармацевтических компаний и научно-исследовательских центров в Китае, Японии, Корее, Италии, Испании, Германии, США, Польши и других стран. На основе ГК в Японии разработан и успешно применяется в виде внутривенных вливаний препарат SNMC (Stronger Neo-Minophagen Со.) для лечения хронических вирусных гепатитов В и С и цирроза печени. Россия в настоящее время не располагает высокоэффективными отечественными противовирусными препаратами, полученными на основе ГК, кроме препарата глицирам, разрешенного к применению в качестве противовоспалительного средства. Однако, инъекционные формы глицирама, подобные препарату SNMC, еще не разработаны.

В Институте органической химии Уфимского научного центра РАН на основе ГК синтезирован новый препарат - ниглизин, полусинтетическое производное ГК, эффективный в отношении АЗТ-резистентного мутанта ВИЧ. Ниглизин является в настоящее время первым кандидатом, полученным на основе модификанта природного гликозида, который рекомендован в качестве ингибитора ВИЧ в комплексной терапии СПИДа. Препарат проходит расширенные предклинические исследования в Государственном Научном Центре Вирусологии и Биотехнологии «Вектор».

Молекулярные механизмы большинства видов биологической активности ГК и ее модификантов еще не полностью изучены и исследования зависимости структура - иммунотропная или противовирусная активность в мире практически не проводились. Для таких исследований предпочтительны синтетические подходы, позволяющие получать структурно близкие соединения. Поэтому поиск новых высокоэффективных противовирусных и иммунотропных агентов среди производных и модифицированных аналогов доступных природных гликозидов является одной из актуальных задач в области создания новых лекарственных препаратов.

Настоящая работа является развитием цикла исследований, связанных с синтезом новых биологически активных веществ и разработкой высокоэффективных лекарственных средств на основе ГК и родственных соединений.

Цель работы. Синтез новых биологически активных веществ на основе ГК и родственных соединений, исследование их физико-химических свойств, поиск новых иммуностимуляторов и противовирусных агентов в ряду производных и аналогов ГК.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: 1) разработать новый способ получения моноаммонийной соли ГК из корней солодки уральской; 2) разработать методы синтеза новых азотсодержащих производных и аналогов ГК (гликопептидов, тритерпеновых коньюгатов с аминосахарами, азотсодержащих гетероциклов); 3) осуществить синтез новых сложных эфиров тритерпеновых гликозидов - аналогов ГК; 4) разработать новый метод синтеза тритерпеновых З-О-гликозидов; 5) провести первичную оценку иммунотропной и противовирусной активности (анти-ВИЧ-1, a.wm-SARS CoV) новых соединений.

Научная новизна работы. Предложен новый патентно чистый способ получения моноаммонийной соли ГК (глицирама) и ГК из корней солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fisher) российского происхождения.

1 13

Методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения Н (600 МГц) и С (150 МГц) проведено полное отнесение сигналов протонов в спектрах ГК, ее моноаммонийной соли и триметилового эфира.

Разработан селективный метод синтеза коньюгатов ГК с аминокислотами и дипептидами (гликопептидов), базирующийся на активации карбоксильных групп ГК с помощью Л^'-дициклогексилкарбодиимида-ТУ-гидроксисукцинимида. Впервые синтезированы гликопептиды ГК, содержащие по два остатка аминокислот, дипептидов и их эфиров в углеводной части молекулы ГК, в том числе L-цистеин и -лизинсодержащие. Разработан улучшенный способ синтеза тритерпеновых коньюгатов с D-глюкозамином и лактозамином - модифицированных аналогов ГК. Впервые синтезированы гетероциклические пиразольные производные ГК и эфиры 18а-ГК и софорозидного аналога ГК. Разработан новый метод получения тритерпеновых З-О-гликозидов — аналогов ГК с использованием в качестве активатора монобромида иода.

Впервые изучена противовирусная активность новых производных ГК в отношении ЗЛДО-ассоциированных коронавирусов (SARS CoV), вызывающих атипичную пневмонию.

Практическая значимость. Синтезировано и охарактеризовано 80 новых соединений - производных и аналогов ГК, среди которых найдены перспективные стимуляторы гуморального иммунного ответа, анти-ВИЧ-1 и анти-SARS-CoV агенты, имеющие ряд преимуществ перед известными фармакологическими аналогами и природным гликозидом. Гликопептиды ГК с метиловым эфиром L-валина и L-пролином рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям в качестве стимуляторов гуморального иммунного ответа. Коньюгаты ГК с (8-бензил)-Ь-цистеином, диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты и глицил-Ь-фенилаланином представляют интерес для медицины в качестве высокоактивных анти-ВИЧ-1 агентов, менее токсичных по сравнению с известным анти-ВИЧ препаратом азидотимидином. Выявлен ряд закономерностей зависимости структура-противовирусная (анти-ВИЧ- 1, анти-З^Л? Со V) активность в ряду синтезированных соединений.

Получены опытные образцы высокоочищенного глицирама и ГК, разработана инъекционная форма глицирама, обладающая анти-ВИЧ-1 активностью.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном симпозиуме по фармацевтической химии (Стамбул, Турция, 2003); XVIII Международном симпозиуме по медицинской химии (Коппенгаген, Дания; Мальмо, Швеция, 2004); 2-ой Международной конференции по природным продуктам и физиологически активным веществам (Новосибирск, 2004); 2-й Международном совещании по медицинской и фармацевтической химии (Анталия, Турция, 2004); Совместном международном Европейском совещании по медицинской химии (Вена, Австрия, 2005); V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005); 14-м Европейском симпозиуме по органической химии (Хельсинки, Финляндия, 2005); XIII

Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006); Международном симпозиуме по химии, биологии и медицине (Пафос, Кипр, 2006); XIX Международном симпозиуме по медицинской химии (Стамбул, Турция, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 статей в центральных и международных журналах, 10 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах, получено положительное решение на выдачу патента РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения моноаммонийной соли ГК из корней солодки уральской.

2. Методы синтеза новых азотсодержащих производных и модифицированных аналогов ГК (гликопептидов, пиразолов, тритерпеновых коньюгатов с аминосахарами).

3. Методы синтеза новых эфиров 18а-ГК и софорозидного аналога ГК.

4. Метод синтеза модельных тритерпеновых З-О-моногликозидов -аналогов ГК.

5. Структуры впервые синтезированных соединений, установленные на основе спектральных данных.

6. Результаты испытаний биологической активности синтезированных соединений и некоторые закономерности зависимости «структура-противовирусная активность».

Объем и структура и диссертации. Диссертационная работа изложена на 192 стр. и состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 268 наименований. В приложение включены акты испытаний, ВЭЖ-хроматограммы и ЯМР спектры.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез новых групп биологически активных азотсодержащих производных и аналогов ГК (гликопептидов, пиразолов, коньюгатов тритерпеновых кислот с аминосахарами), представляющих интерес для медицины в качестве потенциальных иммуностимуляторов и анти-ВИЧ-1 агентов.

2. Разработан селективный метод синтеза гликопептидов ГК, содержащих фрагменты аминокислот и их эфиров в углеводной части молекулы, основанный на активации карбоксильных групп ГК с помощью N-гидроксисукцинимида-Ы,Ы'-дициклогексилкарбодиимида.

3. Предложен улучшенный метод синтеза тритерпеновых конъюгатов а-D-глюкозамина и /WD-лактозамина - модифицированных аналогов ГК в присутствии М,1чР-дициклогексилкарбодиимида - N-гидроксибензотриазола. Впервые синтезированы азотсодержащие гетероциклы (пиразолы) на основе дигидразида ГК и новые сложные эфиры 18сс-ГК и /?-софорозида ГЛК.

4. Разработан новый способ получения моноаммонийной соли ГК (глицирама) из российского растительного сырья - корней солодки уральской. Предложена схема получения высокоочищенного глицирама и ГК из промышленной субстанции глицирама и разработана его новая лекарственная (иньекционная) форма, обладающая анти-ВИЧ-1 активностью. Методами

1 т т

ЯМР спектроскопии высокого разрешения Н (600 МГц) и С (150 МГц) проведено полное отнесение сигналов в спектрах ГК, ее моноаммонийной соли и триметилового эфира.

5. Среди синтезированных гликопептидов ГК найдены эффективные стимуляторы гуморального иммунного ответа у мышей. Коньюгаты ГК с метиловым эфиром L-валина и L-пролином рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям.

6. Показано, что химическая модификация ГК путем введения аминокислот и дипептидов в углеводную часть молекулы является перспективным путем получения новых анти-ВИЧ-1 агентов, превосходящих по противовирусной активности природный гликозид. Ряд новых производных ГК обнаружили высокую анти-ВИЧ-1 активность в культуре клеток МТ-4 и более низкую цитотоксичность по сравнению с азидотимидином. Гликопептиды ГК с L-цистеином, диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты и глицил-Ь-фенилаланином рекомендованы для расширенных биологических исследований в качестве анти-ВИЧ-1 агентов. Найдены соединения, ингибирующие ^/^-ассоциированные коронавирусы в культуре клеток' VERO. Установлены некоторые закономерности зависимости структура-противовирусная активность в ряду новых производных и аналогов ГК.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю - академику Толстикову Г.А. за постоянное внимание к данной работе; д.м.н., проф. Покровскому (ГНЦ ВБ Вектор) за проведение испытаний анти-ВИЧ активности и проф. Синатлу Дж. (Германия) за изучение анти-SARS CoV активности синтезированных соединений.

дегидроглицирретовой кислоты (96). Выход 80,5%> (аморф.). [a]D + 125 ° (с 0,08; МеОН). УФ-спектр, Ятах (МеОН): 280 нм (lg s 4,1). Молекулярный ион [M+NH4+] 646,4. С37Н57О9. М.в. 645,8. Спектр ЯМР 13С приведен в табл. 12. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработан новый способ получения моноаммонийной соли ГК (глицирама) из корней солодки уральской российского происхождения. Предложен селективный метод получения новых гликопептидов ГК с использованием N-гидроксисукцинимида - ТЧ^'-дициклогексилкарбодиимида, позволивший синтезировать новые конъюгаты ГК с аминокислотами и дипептидами. Разработан улучшенный метод синтеза коньюгатов тритерпеновых кислот с аминосахарами - модифицированных аналогов ГК. Синтезированы новые гетероциклические (пиразольные) производные ГК. Впервые синтезированы биоактивные эфиры 18а-ГК и софорозида ГЛК. Разработан новый способ гликозилирования тритерпеноидов солодкового корня в присутствии монобромида иода и осуществлен синтез модельных З-О-моногликозидов.

Среди новых гликопептидов ГК найдены эффективные стимуляторы гуморального иммунного ответа у мышей. Установлено, что иммунотропная активность синтезированных производных ГК зависит от структуры аминокомпонента, связанного с углеводной частью ГК, способа введения и дозы. Соединения (11) и (57) представляют интерес для расширенных фармакологических исследований в качестве стимуляторов гуморального иммунного ответа и рекомендованы к углубленным фармакологическим исследованиям.

Показано, что химическая модификация ГК путем селективного введения CONH-связей по СООН группам углеводной цепи и конъюгирования ГК с аминокислотами или дипептидами является перспективным путем получения новых анти-ВИЧ-1 агентов со сниженной цитотоксичностью, превосходящих по индексу селективности и противовирусной активности нативный гликозид. Анти-ВИЧ-1 активность гликопептидов (23), (41) и (61) не уступает активности известного анти-ВИЧ препарата АЗТ по ингибированию вирусспецифического белка р24, в отличие от последнего соединения они менее токсичны для культуры клеток МТ-4. Соединения (23) и (61) превосходят ГК по индексу селективности. Данные производные ГК рекомендованы для расширенных биологических исследований в качестве анти-ВИЧ-1 агентов.

Замена диглюкуронидной цепи ГК на остаток a-D-глюкозамина снижает цитотоксичность и повышает индекс селективности аналогов ГК (коньюгат 74). Замена углеводной цепи ГК на остаток нейтрального дисахарида (гликозид 80) усиливает цитотоксичность тритерпеновых гликозидов. Изменение конфигурации С18 агликона (18а-ГК) приводит к исчезновению анти-ВИЧ-1 активности.

Впервые изучена противовирусная активность производных ГК в отношении ^^-ассоциированных коронавирусов, вызывающих атипичную пневмонию. Выявлены некоторые закономерности наблюдаемого противовирусного эффекта от химической структуры соединений. Установлено, что необходимым условием для проявления данного вида активности является наличие диглюкуронидной цепи, 18/?-конфигурации агликона и свободной ЗО-СООН.