Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Новое раневое покрытие с антибактериальной полиферментной активностью в лечении гнойных ран

РГ Б ОД О 2 ШОН Ш7

На правах рукописи

ТОПЧИАШВИПИ HATA ЗАХАРОВНА

НОВОЕ РАНЕВОЕ ПОКРЫТИЕ С АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПОЛИФЕРМЕНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙШХ РАН

(Экспериментальное исследование) • 14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в Государственном научном Центре лазерной медицины (директор-член-корр. РАМН,лауреат Государственной премии, д.м.н., профессор О.К.Скобелкта) и НИИ текстильных материалов (директор-Академик. МИА, лауреат Государственной и Совета Министров СССР премий, доктор технических наук, профессор В.Н.Филатов).

Научный руководитель- Заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор П.И.ТОЛСТЫХ

Научный консультант - Академик МИА, лаурет Государственной премии и премии Совета

нии диссертационного ученого совета К 074.35.01 Государственного научного центра лазерной медицины Министерства Здравоохранения Российской федерации.

Адрес: 121156, Москва, ул.Студенческая, дом 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра лазерной медицины МЗ РФ.

Автореферат разослан " 7Х " 987 г.

Министров СССР, доктор технических наук, профессор В.Н.ФИЛАТОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор И.Д.КАНСРСКИЙ

доктор медицинских наук, профессор В.И.КОРЕПАНОВ

Ведущее учреждение - Московский медицинский стоматологический институт

Защита состоится 1997 года в /У час на заседа-

Ученый секретарь диссертационного ученого совета П1ЦЛМ, доктор медицинских наук

В.А.Дербенев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Анализ специальной литературы и патентной информации за последние 15-20 лет показывает, что проблема заживления ран остается одной из актуальных в современной хирургии (Э.В.Луцевич и соаат.1996 и др.). Для её решения на протяжении десятилетий широко использовались протеиназн животного и микробного происхождения, посколько энзимотерапйя по сути является имитацией естественных-механизмов очищения гнойных и ожоговых ран (В.К.Гостищев,1970; П.И.Толстых 1970,1976;А.М.Гончар и др.1986 и т.д.). В тоже время, как бы заманчивыми не казались результаты экспериментально-клинических испытаний нативных протеиназ, последние широкого применения в гнойной хирургии из-за присущих им недостатков (подверженность к инактивации, температурным колебаниям и изменениям рН среды, дороговизны и т.д.) не получили. Поэтому весь период развития сравнительно молодой отрасли науки -клинической энзимологии сопровождался поиском путей повышения эффективности и преодоления недостатков нативных протеолитических ферментов,усовершенствования методов их использования (А.И.Дада-шев,1994). Результатом исследований в этой области явилась возможность сведения к минимуму негативных моментов и повышения эффективности локальной энзимотерапии ран различного генеза путем иммобилизации ферментов на природных и синтетических полимерных носителях (Г.Е.Афиногенов и др.,1989; И.В.Березин,1976; Т.С.Васильева, 1989; А.Е.Васильев,1981; А.Д.Вирник,1973,1981; Л.Г.Зласов, [980; Л.Г.Власов и соавт.1980,1986,1989 и др.).Лучшим кандидатом 1Яя иммобилизации на перевязочных материалах, по-видимоглу, явля-гтся лизоамидаза. Лизоамидаза в отличие от трипсина, коллитина и герролитина является сложным препаратом с антибактериальной и по-

лиферментной активностью, а следовательно, воздействие ее на гной ную рану нужно полагать будет более физиологически и патогенетически обоснованным. В ее состав входит 6 ферментов: три фермента, обладающих бактериолитической активностью, две протеиназы и нейтральная фосфатаза. Лигическая фракция лизоамидаза состоит из ферментов трех типов: пептидазы, гидрализующей пептидоглюкановые мое тики: амидазы, отщепляющей гликановые цепи от пептидазной части пептидогликана: муралидазы, гидрализующей связь между мурановой кислотой и гликозамином. Благодаря присутствию комплекса бактерис литических ферментов, лизоамидаза эффективно лизирует многие устс чивые к антибиотикам штаммы стафилококков и других грамотрицателз ных и грамположительных бактерий. Специфичность лизоамцдазы по оч ношению к микроорганизмам разных классов значительно выше, чем у лизоцима, который представляет собой один фермент - мурамидазу. Наличие протеиназ в этом препарате обусловит его неполитическую активность.

При изучении состава компонентов, входящих в состав лизоами-дазы била выявлена очень важная особенность - наличие в препарат! не только ферментов, но также полисахарида, который усиливает стабильность всего ферментного комплекса. Существование полисахарида в лизоамидазе очень важно для выполнения его биологической функции и имеет также большое значение для использования препара' та в лечебной практике. Благодаря присутствию полисахарида лизоами :аза обладает иммуностимулирующим действием.

Лизоамидаза как лекарственное средство широко апробировано для лечения ран, ожогов, ряда стоматологических заболеваний (Ива нян А.Н.,1956). Наличие в лизоамидазе трех важных лечебных свойств - бактериолитического, неполитического и иммуностимулирующего действия делает данный препарат перспективным для созда-

аия на его основе иммобилизированных форм для лечения многих гнойных инфекций, что должно снизить стоимость данного препарата и повысить его эффективность, поскольку лекарственные средства, обладающие пролонгированным протеолитическим действием препятствуют адгезии и колонизации микроорганизмов в ране (Афиногенов Г.Е. и др.,1990), а широкий спектр ферментов, входящих в "лизоамидазу", будет оказывать более благоприятное воздействие на гнойную рану в первую фазу воспаления, чем дальцекс-трипсин, ПАК-трипсин и ДАЦ-коллитин. Для доказательства данного положения необходимо провести физические, медикобиологические, токсикологические и другие методы исследования.

Учитывая отсутствие какой-либо информации по данному вопросу мы поставили перед собой цель:

провести физические, Медикобиологические и токсикологические исследования нового раневого покрытия, обладающего неполитическим, бактериолитическим и иммуностимулирующим действием и дать экспериментальное обоснование о целесообразности его использования в клинической практике.

Задачи исследования

1. Экспериментально изучить влияние нового перевязочного материала с антибактериальной полиферментной активностью на скорость очищения ран от гнойно-некротических масс и их заживления.

2. Экспериментально изучить влияние перевязочных материалов с антибактериальной полиферментной активностью на течение раневого процесса.

3. Дать сравнительную оценку эффективности воздействия нового перевязочного материала с антибактериальной полиферментной активностью с ДАЦ-трипсином и ДАЦ-коллитин см на течение раневого процесса и скорость заживления ран по планиметрическим, цитологи-

- 4 -

ческим и гистологическим исследованиям.

4. Изучить физические, биохимические и токсикологические свойства нового перевязочного материала с антибактериальной и ферментной активностью.

5. Изучить целесообразность применения нового перевязочного материала с антибактериальной полиферментной активностью в лечении гнойных ран мягких тканей.

Научная новизна настоящего исследования состоит в том, что:

1. Впервые на основании экспериментальных, цитологических, цитомикробиологических, гистологических и гистохимических исследований изучено влияние нового антибактериального полиферментного раневого покрытия на течение раневого процесса у крыс.

2. Впервые на основании комплексной оценки клинических, морфологических и цитобактериологических исследований дана сравнительная оценка эффективности нового по сравнению с другими современными апробированными в эксперименте и в клинике раневыми покрытиями: диальдегидцеллюлозой-трипсином и диальдегидцеллюлозой-коллитином.

3. Впервые изучены бактериолитические, химические, физические и токсикологические свойства нового раневого покрытия с антибактериальными и полиферментными свойствами..

Практическая значимость работы

В работе доказана целесообразность применения для лечения гнойных ран мягких тканей нового раневого покрытия, обладающего полифункциональным (бактериолитическим, неполитическим и иммуностимулирующим) действием.

¿непрение. По результатам экспериментальных исследований подготовлена документация в Министерство здравоохранения РФ и получено разрешение Комитета по новой медицинской технике (Протокол I от 16 января 1996 г.) на клиническую апробацию нового перевя-

зочного материала - диальдегидцеллюлоза-лизоамидаза (ДАЦ-лизоами-даза).

Апробация работы. Основные положения работы доложены на научно-практической конференции "Актуальные вопросы совершенствования лечебно-диагностического процесса на поликлиническом этапе Министерства обороны РФ 21 ноября 1996 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 научных работы и методические рекомендации "Комбинированный способ лечения гнойных ран и трофических язв с использованием лазерного аппарата "Узор" в сочетания с биологически активными препаратами (трипсин-лизоцимом, коллитином и лизоамидазой).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и трех глав собственных исследований, общего заключения, выводов. Иллюстрирована 10 таблицами, 22 рисунками. Указатель литературы включает 286 источников литературы.

Содержание работы. В основу работы положены результаты медико-биологических, физических, а также санитарно-токсикологических исследований нового перевязочного материала - диальдегидцеллюлозы-лизоамидазы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная работа по обоснованию целесообразности применения иммобилизованной лизоамидазы в лечении гнойных ран проведена на 120 крысах-самцах линии "Вистер" массой 180^10 г. Все животные содержались в индивидуальных клетках, В помещении поддерживалась температура в пределах 18-20° по С. Режим содержания и питания был одинаковым во всех группах животных. Крыс забивали де-

капитацией на 3,5,7,10,14 и 21 сутки.

В зависимости от способа лечения животные были распределены

на 6 групп, в каждой из групп было по 20 крыс. Распределение :.и-

вотных по группам в зависимости от метода лечения и изучаемых образцов раневых покрытий представлено в таблице I, из которой видно, что в первой груше животных заживление ран шло спонтанно, т.е. без лечения. Эта группа служила контролем ко всем остальным пяти. Во второй группе животных раны покрывались диальдегидцеллю-лозой (контроль 2, для группы животных, леченных ДАЦ-лизоамидазой), третья груша животных лечилась нативной лизоамидазой (контроль 3 для животных, раны которых покрывались ДАЦ-лизоамидазой). В четвертой и пятой группах лечение животных проводилось новыми, но уже хорошо апробированными в клинике, ДАЦ-трипсином и ДАЦ-коллитином. Шестая группа - основная, лечение крыс проводилось ДАЦ-лизоамидазой.

Таблица I

Распределение животных по грушам в зависимости от метода лечения и изучаемых образцов раневых покрытий

№ п/п Методы лечения и изучаемые образцы раневых покрытий Кол-во животных

I. Животные без лечения (спонтанное заживление ран, контроль I) 20

2. Диальдегидцеллюлоза (контроль 2 для'покрытия ран ДАЦ-лизоамидазой) 20

3. Нативная лизоамидаза (контроль 3 для животных, раны которых покрывались ДАЦ-лизоамидазой) 20

4. Диальдегидцеллголоза-трипсин (контроль для ди-альдегидцеллюлоза-лизоамидаза в сравнительном аспекте с ДАЦ-трипсином) 20

5. Диальдегидцеллюлоза-коллитин (контроль 5 для сравнения с ДАЦ-трипсином и ДАЦ-лизоамидазой) 20

6. Диальдегидцеллюлоза-лизоамидаза 20

Модель получения плоскостной гнойной раны Попользована плоскостная кожно-мышечная модель эксперимента -ьпой гнойной раны, получаемая следующим образом: после пред-

верительной обработки кожи, под гексеналовым наркозом, иссекали полнослойный кожно-фасциальный лоскут размером 2 х 2 см. Мышечное дно раны раздавливали зажимом Кохера, после чего рану инфицировали путем орошения I мл суточной взвеси культуры золотистого стафилококка - штамма 209, содержащего I млрд. микробных тел. Через 48 часов развивается классическая картина гнойного воспаления. Раны покрывались биологически активными препаратами, за исключением первой группы, где заживление шло под струпом.

Цитологическое и цитобактериологическое исследование раневого экссудата

Для изучения динамики раневого процесса под влиянием раневых покрытий было использовано цитологическое изучение мазков-отпечатков по методу Н.П.Покровской и М.С.Макарова. Морфологическое исследование проводили после выведения из опыта животных на 3,5,7,10,15 и 21 и-у части на 30 ;сутки после, начала эксперимента.(Цитологические и морфологические исследования проведены совместно с д.м.н. профессором А.Б.Шехтером). В каждой группе на каждый срок изучались ткани от 'трех животных: по 18 животных из каждых шести групп

опыта (всего 118 животных).

. Полоска ткани вырезалась от края до середины раны до подлежащих мышц. Тканевой материал фиксировался в жидкости Карнуа в течение 2-х часов и заливался в парафин^ Срезы толщиной 5-7 микрон окрашивались-гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону на коллагеновые волокна, фукселином на эластические волокна, импре-гнировались серебром по Гомори для выявления аргирофильных структур. Использовали также гистохимические методы: окраску голуидино-вым синим для выявления кислых гликозаминогликанов (ГАГ) и их комплексов с'белками (протеогликанов). ПАС-реакция для выявления гликогена и гликопротеинов, реакция Браше для выявления РНК и реакция Фельгена для выявления ДНК в клетках. В некоторых случаях ис-

пользовали реакцию Шуенинова на фибрин. Скорость заживления экспе риментальных гнойных ран изучалась по общепринятой методике Л.П. Поповой (1942).

Для определения водопоглощения нового раневого покрытия -ДАЦ-лизоамвдазы использовалась следующая методика: из подготовлен ных образцов текстильных материалов вырезали элементарные пробы размером 3x3 см^ и взвешивали их на торсионных весах. Затем взвешенные образцы погружали в емкость с дистиллированной водой. Время погружения для хлопчатобумажного материала составляло I мин После выдерживания в воде пробу вынимали, помещали на фильтровал! ную бумагу, сложенную в три слоя, покрывали тремя слоями фильтровальной бумаги и отжимали валиком. Затем пробу взвешивали. Водопоглощения определяли по формуле:

Вп со - 100 ( ™ь - т-с ) .

где - масса влажной пробы в г,

тс - масса пробы до увлажнения, в г. Помимо водопоглощения нами оценивалась также капиллярность текстильных перевязочных материалов по .высоте подъема жидкости, смачивающей нижний конец вертикально подвешенной прямоугольной ш лоски из исследуемого раневого покрытия размером 50 х 300 мм. Эи полоски материала накалывали на горизонтальную планку. К нижнему концу испытуемой полоски ткани подвешивали груз в ваде стеклянны: палочек, масса которого меняется в зависимости от поверхностной шгтеости материала. Нижний конец полости ткани опускали в сосуд с раствором бихромата калия в таком количестве, чтобы он покрыл стеклянные палочки. В момент опускания пробы в раствор включали секундомер. Показателем капиллярности является высота подъема хлдкости по образцу за 60 мин.

Жесткость текстильных перевязочных материалов определялась по метолу консоли на гибкомере ПТ-2.

Протеолитическую активность определяли по ФС 42-3008-93.

Бактериолитическую активность определяли спектрофотометри-ческим методом по лизису клетокM<-cbOcaccus lyz-odeckticus , как описано в BSC на лизоамидазу, сразу после изготовления материала и после обработки гамма-облучением, а затем через 3,5 и 8 месяцев хранения.

Гамма-облучению подвергались препараты лизоамидазы, иммобилизованные на диальдегидцеллюлозе из ОД% и 0,05$ растворов ферментов в фосфатном буфере с рН 6,0. Доза облучения от 10 до 25 кГрей.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Нами были впервые' изучены физические, а также физико-химические свойства нового раневого покрытия - диальдегидцеллюлозы-лизоамидазы. В результате этих исследований было установлено,что модификация целлюлозного носителя в процессе периодантного окисления, а также химическое связывание лизоамидазы с носителем существенно не изменяет тех физико-механических свойств, которые были присущи матрице-диальдегидцеллюлозе (Р -^0,1) и не оказывается на впитывающей способности, что делает его пригодным для применения в лечении-гнойных ран в первую фазу их заживления.

Анализ результатов изучения влияния факторов инактивации (рН, гамма-облучения в процессе стерилизации, сроков хранения) показал,' что' биологическая активность диальдегидцеллюлозы-лизоами-дазы зависит от условий иммобилизации: рН раствора для иммобилизации, концентрации фермента, характере связи белка с носителем. В процессе гамма-облучения происходит снижение биологической активности иммобилизованной лизоамидазы, протеолитическая фракция фермента более устойчива к инактивирующему воздействию стерилизаций: Хранение снижает бактериолитическую активность иммобилизованной

лизоамвдазы, однако стерильные препараты менее подвергаются инактивации, ферментативная активность протеолитической фракции более стабильна в процессе хранения.

Использование иммобилизованной и нативной лизоамвдазы в лечении экспериментальных гнойных ран в сравнительном аспекте с ди-альдегидцеллюлозой-трипсином и диальдегадцеллюлозой-коллитином показало, что через 48 часов после нанесения'раны в межлопаточной области развивалась классическая картина воспаления: припухлость и гипернмия кожи вокруг раны, появление на её поверхности гнойно-некротических масс. У животных, раны которых покрывались раневыми ферментными покрытиями значительно уменьшались или вообще исчезали вокруг рани припухлость и гиперимия, наступало очищение ран от гнойно-пекротических масс; а именно: в случае покрытия раны иммобилизованной лизоамидазой средние сроки очищения раны по сравнению с нелеченными животными наступало на 10 дней быстрее,(в контроле на 14*0,47, в опыте на 4,0^0,3; Р■¿О,001), а сроки заживления сокращались в два раза (В контроле, где раны закивали спонтанно 29,1*1,6;в опыте 15,3*0,8; Р-^ 0,001). Результаты лечения гнойных ран раневыми покрытиями, содержащими ферменты протеолиза представлены в таблице 2. Нативная лизоамидаза также способствовала убыстрению очищения ран от гнойных и некротических масс, а заживлению ран соответственно в 2,4 и 1,2 раза. В случае применения уже внедренного в клиническую практику ДАЦ-трипсина скорость очищения ран по сравнению с контролем один наступало на 4,5 быстрее, а заживление на 0 дней при сравнении с коллитином и ДАЦ-лизоамидазой очищение ран наступало в два раза медленнее. (В случае применения ДАЦ-трипсина эти сроки равнялись 10,5*0,7, ДАЦ-коллитином 4,5*0,7 и ДЛЦ-лизоамидазы 4,0*0,3).

При изучении цитологических и цитобактериологических показа-

Таблица 2

Результаты лечения гнойных ран в эксперименте

№ серии

Способ лече- Кол-во - Средние сроки опосоо лече- ЖИБ0Т_ ~ ускоре-

ния.. ных ние

в сутках Ускорение

-чяживле-"* заживления заживле- по отноше_

ние

нию к контролю {%)

1. Заживление ран под 20 струпом (контроль I)

2. Диальдегидцеллюлоза (контроль 2 для по- 20 крытия для ДАЦ-лизо-амидазы)

3 Нативная лизоамидаза ?0 (контроль 3 для животных, леченных ДАЦ-лизоамидазой)

14*0,47 ' - 29,1*1,6

12-0,8 27,2*1,5 6,5

.3*0,5 57,1 18,3*0,8 37,1

Р<0,01 Р<0,01

4. ДАЦ-трипсин (контроль ол ТГ) 7 94 ч 4 для животных, леченных ДАЦ-лизоамидазой Р <0,05

5 ДАЦ-коллитин (контроль 9П » с±п г, яг

5, для животных, лечен- ' ос.х

ных ДАЦ-трипсином и Р.<0,001 ДАЦ-лизоамидазой

ДАЦ-лизоамидаза 20 4,0*0,3 70,1

5.

21,1*0,5 24,1 Р <0,01

15,6*0,5 46,5 Р <0,001

15,3*0,8 48,2 Р<0,001 Р <0,001

телей раневого экссудата гнойных ран, леченных раневыми покрытиями с иммобилизованными на них ферментами, на 3,5,7,10,15 и 21 сутки получены.следующие результаты.

В 1-й контрольной группе, у животных которой гнойные раны закивали спонтанно без лечения по цитологическим показателям прослеживали вяло текущий раневой процесс с растянутым периодом очищения ран от микрофлоры и чужеродных частиц вследствие ингибиции фагоцитоза нейтрофилами и макрофагами как кокковой микрофлоры, так и фибрина и некротического детрита. Постоянно высокое содержание нейтрофилов и их дистрофически измененных форм свидетельствуем о пролонгации воспалительного процесса. Одновременно нарушена динамика поступления в экссудат зрелых макрофагов, что говорит о ела-

бости макрофагальной реакции. Сравнительно низкое содержание мо-нонуклеарных элементов, среди которых присутствуют как предшественники макрофагов (моноцитоидные клетки), так и предшественники фибробластов (недифференцированные бластные формы последних) свидетельствует о замедлении репаративного процесса. Особенно показа-

Г

тельно в этом смысле очень низкая динамика роста и дифференциров-ки клеток фибробластического ряда: юных и зрелых фибробластов, фиброцитов.

При использовании раневого покрытия из модифицированной ди-альдегидцеллшозной (ДАЦ) марли (контроль II) цитологическая картина принципиально не отличалась от нелеченных ран. Там также отмечалась картина затяжного воспалительного процесса и задержкй динамики репаративного процесса: длительное наличие обильной свобод-нолежащей микрофлоры с угнетенным и незавершенным фагоцитозом, достаточно высокого процента дистрофически измененных лейкоцитов в начальные дни наблюдения, а также сниженного содержания монону-клеарных незрелых клеток, зрелых макрофагов в первые дни наблюдения. Динамика роста и созревания фибробластов также отличается от контроля I непринципиально. Можно отметить только, что покрытие на рану уменьшает несколько количество распадающихся нейтрофилов, возможно из-за снижения воздействия факторов внешней среды, а также некоторое ускорение очищения раны от микрофлоры и детрита к 7-м суткам.

Иммобилизация протеолитического фермента трипсина на ДАЦ-по-крнтии (4 группа) оказывает заметное положительное влияние на динамику цитологических показателей.

Анализ цитограмм в этой группе свидетельствует о неполитическом действии раневого покрытия (более быстрое очищение экссудата от тканевого детрита и фибрина), а также о антибактериальном и

антивоспалительном эффекте, что цитологически характеризуется уменьшением кокковой флоры к 7-10 суткам, общем уменьшении содержания нейтрофилов и особенно дистрофически измененных их форм, что является признаком защиты от действия свободных радикалов и других цитотоксическях веществ, возникающих при гнойном воспалении. Одновременно усиливается макрофагальная и Тэибробластическая реакция, являющиеся признаками репаративного процесса.

Еще больший ранозаживающий эффект по цитологическим показателям раневого экссудата выявляется в группе 5, где использовалось раневое покрытие ДАЦ с иммобилизованным ферментом коллитином. Так как в этот ферментный препарат входят фракции с коллагенолитичес-ким и трипсиноподобннм действием, то очищение раневой поверхности от детрита, в который входят разрушенные коллагеновые волокна, и от других инородных веществ, а также от микрофлоры идет быстрее по сравнению с предыдущей группой, что связано также со стимуляцией фагоцитоза нейтрофилами и макрофагами: меньше выражен незавершенный фагоцитоз бактерий, быстрее увеличивается число мононуклеарных элементов и зрелых активных макрофагов (на 5 сутки соответственно 8,2 и 4,8$). Уже к 5-7 суткам значительно увеличивается число фибробластов разной степени зрелости, а к 10 суткам они достигают 16,6$, причем зрелых фибробластов из них - 8,9%, в то время когда в контроле П (ДАЦ без ферментов) в этот срок общее количество фибробластов составляло 7,2%, а зрелых -3,1$.

Иммобилизованная на ДАЦ-покрытии лизоамидаза (группа 6) благодаря полиферментному действию по данным цитологии является наиболее эффективным для очищения ран препаратом. Цитологически в этой группе выявляется весьма раннее очищение раневого экссудата: уже с 5 суток в мазках-отпечятках не выявлялось микрофлоры и детрита, что свидетельствует о выраженной стимуляции фагоцитоза. Рано

( с 3 суток) активизируется макрсйагальная реакция и усиливается . реакция фибробластическая, которая постепенно нарастает: уже к 5 суткам в мазках - 11,65? фибробластов (в контроле П - 0,8$). На 10-15 сутки в мазках уже появляются эпителиальные клетки.

Следует отметить, что иммобилизованная на ДАЦ- лизоамидаза оказывает значительно более активное воздействие, чем нативная лизоамидаза (группа 3). В этой группе по цитологическим показателям имелось ускорение процесса очищения раневой поверхности от микро-.флоры и детрита, а также стимуляция фагоцитоза и макрофагальной реакции с нарастанием элементов репарации по сравнению с нелечен-ной раной (контроль I), но эти процессы протекали значительно медленнее и менее активно, чем у животных группы 6, что свидетельствует о значении иммобилизации фермента для его пролонгированного воздействия.

Таким образом, введение в раневое покрытие иммобилизованных ферментов, особенно комбинированного действия - коллитина и лизо-амидазы, способствует быстрому очищению раны от инфекции, купированию воспалительных процессов, обусловливает наиболее быстрый и ак-. тивный рост фибробластов и эпителизацию. Наиболее четко и демонст- ' ративно этот вывод подкрепляется данными гистологического изучения.

Проведенное нами гистологическое и-гистохимическое изучение гнойных ран в эксперименте в динамике от 3 суток до месяца свидетельствует о различной эффективности и механизмах действия использованных нами раневых покрытий.

В первой группе опытов (контроль I) гнойные раны, заживающие спонтанно (под струпом) по динамике раневого процесса значительно отставали от обычных асептических кожных ран, что связано с инфицированием стафилококком.

Известно, что ответной местной реакцией организма на травму,

в том числе рану коки, является травматическое воспаление, которое при развитии раневой инфекции значительно усиливается. Токсические продукты микроорганизмов (гемолизин, лейкоцидин, некротск-син и др.) повреждают окружающие клеточные и тканевые структуры.

Нейтрофильная реакция, необходимая для борьбы с инфекцией и очищения раны, в случае гнойного воспаления принимает повреждакь-щяе черты. Мигрирующие в рану нейтрофилы, фагоцитируя микробы и погибая, выделяют физиологически активные вещества (кислые и нейтральные гидролазы, протеазы, в том числе коллагеназу (простаглан-дины, лейкотриены, тромбоксаны, перекиси и свободные радикалы и др.), разрушающие различные компоненты межклеточного матрикса (коллаген 1,Ш,1У и У типоб), протеогликаны, гликопротеины, фибро-нектин), а также другие медиаторы воспаления (цитотоксины), повреждающие клетки (Шехтер A.B., Серов В.3.,1991; Маянский А.Н., 1988). Вместе с бактериальными токсинами эти вещества способствуют повреждению окружающих тканей и, воздействуя на систему микроциркуляции, через деструкцию эндотелия и базальных мембран микрососудов, поддерживают и усиливают гнойно-воспалительный процесс. Длительное присутствие в ране избыточного числа нейтрофилов ведет к разрушению их ферментами опсонических факторов, компонентами

ную антибактериальную активность лейкоцитов, пролонгируя воспалительный процесс. В целом, это способствует в гнойных ранах выраженной деструкции тканей, вплоть до образования фокусов вторичного некроза, выявляемых на фоне распространенного расстройства мик-» роциркуляции..

Действительно, в контрольной серии опытов в ранние сроки исследования (3-5 сутки) вследствие инфицирования раны развиваются выраженные и распространенные микроциркуляторнке расстройства,

комплемента

которые морфологически проявляются в расширении просвета микрососудов, гемостазе и сладж-феномене эритроцитов, деструкции эндотелия, повышенной проницаемости стенки сосудов для нейтрофильных лейкоцитов, моноцитов и эритроцитов, микротромбозе и лимфостазе. Все это ведет к возникновению диапедезных и более крупных кровоизлияний, выраженному отеку и нейтрофильной инфильтрации ткани, фиб-ринозно-гнойной экссудации, вплоть до образования микроабсцессов. Значительно выражены процессы альтерации: дистрофии и некроза кле-•ток и ткани в области дна раны (жировой и мышечной) и формирования очагов вторичного некроза. .

фибрин и нейтрофялы мигрируют в раневой экссудат, который приобретает фибринозно-гнойный характер, богат некротическим тканевым детритом и колониями бактерий. Подобные воспалительные и некротические изменения значительно пролонгируются и сохраняются еще до 10-15.суток.

Известно, что альтерация (повреждение), воспаление и регенерация являются фазами единого воспалительно-репаративного процесса заживления ран и находится во взаимозависимости (Шехтер А..Б,, Серов В.В.,1991). Пролонгация некротического и воспалительного процессов тормозит пролифератпвную фазу: пролиферацию фиброблас-тов, рост сосудов и образование грануляционной ткани.

Одной из важнейших причин этого является то, что выраженная нейтрофильная инфильтрация тормозит макрофагальную реакцию в то время, как макрофаг является ключевой клеткой, сопрягающей воспаление и регенерацию. Через секретируемые монокины макрофаги взаимодействуют с фибробластами, индуцируя пролиферацию последних и ангиогенез. ,

В нашем исследовании установлено, что макрофагальная реакция в гнойных ранах как по количеству клеток, так и по их фагоци-

' тарной активности заторможена. Пролиферация фибробластов и рост сосудов также значительно ингибированы. Только к 7 суткам развивается грануляционная ткань, однако она отличается крайней незрелостью, недостаточной дифференцировкой фибробластов, ослабленным фибриллогенезом коллагена и роспалительной инфильтрацией. Регенерация эпидермиса также запаздывает и к 10 суткам только начинается краевая эпителизация раны. На 15-е сутки, когда в асептических ранах уже наблюдается фиброзно-рубцовая трансформация грануляционной ткани, в гнойных нелеченных ранах еще встречаются микроабсцессы, очаги вторичного некроза, микроцир;суляторные расстройства. Отмечается сравнительная незрелость и воспалительные изменения грануляционной ткани.

Даже в 21 сутки сохраняется еще слой вертикальных сосудов, а фиброзирование наблюдается только в глубоком слое. Сохраняются, хотя и уменьшаются в интенсивности воспалительные проявления. Это говорит о том, что замедление созревания грануляционной ткани, которое связано с воспалительными изменениями, ведет и к торможению третьей фазы раневого процесса - рубцевая и эпителизации. Действительно, даже к 30 суткам, когда грануляционная ткань уже созревает, не у всех животных происходит полная эпителизация дефекта, в центре еще остается раневая поверхность. Все это свидетельствует о значительной пролонгации воспалительных и торможении репаратпв-ных процессов у животных с экспериментальной моделью инфицированной раны.

Использование для лечения ран ферментов, иммобилизованных на текстильной матрице - диальдегидцеллюлозной марле, значительно ускоряет заживление ран. Эффект этих раневых покрытий связан с действием ферментов, так как, по данным нашего исследования, во второй контрольной группе, где применялось раневое покрытие ДАЦ

без ферментов, не удалось получить заметного ускорения раневого процесса. По морфологическим данным это раневое покрытие лишь незначительно на 7-10 сутки снижает активность воспалительного процесса и мало способствует усилению репаративных процессов. Это подтверждается и слабо выраженным ускорением очищения раны (на 2 сутки) и срока заживления ран (в среднем на 1,9 суток).

Протеолитические ферменты с успехом применяются для лечения гнойных ран и трофических язв, особенно эффективно их использование в иммобилизованном виде в составе раневых покрытий, что значительно увеличивает время воздействия фермента на рану (пролонгация) и подтверждает отрицательные моменты их передозировки и повреждения здоровых тканей.

В наших экспериментальных исследованиях из всего спектра применяемых в хирургии ферментов мы использовали трипсин, как наиболее известный из протеолитических ферментов в качестве группы сравнения, коллитин - фермент с коллагенолитической и трипсинопо-добной активностью,, лизоамидазу - фермент со сложной (полиферментной) активностью, пока еще редко используемой в хирургии»

Влияние неспецифических протеолитических ферментов типа трипсина на заживление ран, как известно, основывается на: I) про-теолизе некротического тканевого детрита, гнойного экссудата; кровянистых сгустков и фибрина; 2) непосредственной стимуляцией синте за ДНК фибробластов ( т.е. пролиферации последних) и 3) повышенной концентрацией нуклеотвдов и других низкомолекулярных ростковых факторов ("раневых гормонов"), которые появляются в результате протеолиза и распада белков, нуклеиновых кислот и других макромоле кул (Толстых П.И.,1970,1990).

Введение трипсина в раневое покрытие (4 группа) на ранних сроках усиливает очищение ран от гнойно-некротического детрита

(остатка разрушенных лейкоцитов и тканевых элементов), что уменьшает,.инфицированность, ослабляет воспаление и усиливает регенерацию. Ослабляются микроциркуляторные расстройства, проницаемость сосудистых стенок, отек и воспалительная инфильтрация ткани, сти-. мулируется пролиферация фибррбластов и ангиогенез. Быстрее, чем в контроле, формируется грануляционная ткань, созревание и фгбро-зирование которой происходит на 10-15 сутки. Быстрее начинается регенерация эпителия, чему способствует очищение раневой поверхности, к 21-30 суткам полностью эпителизируются раны у всех животных. Это соответствует и данным цитологического изучения раневого экссудата, а также планиметрическим показателям уменьшения размеров ран, ускорению очищения раны на 2 суток, окончательного ■ заживления в среднем на 6,1 суток.

В 5 группе для лечения ран был использован иммобилизованный на ДАЦ-покрытии ферментный препарат коллитин, сочетающий в себе коллагенолитическую (коллагеназнуго) активность и трипсиноподоб-ное воздействие. Благодаря этим свойствам он подвергает протеоли-зу не только клеточный детрит (разрушенные нейтрофильные лейкоцита), фибрин, белки крови и другие компоненты, но и коллагеновие волокна, которые в большом количестве находятся в некротизирован-ных тканях гнойной раны, но остаются стойкими к воздействию трипсина' и других неспецифических .протеаз, В результате очищения ран от гнойно-некротических масс происходит в этой группе быстрее,чем в группе, где применялся иммобилизованный трипсин.

Следует также отметить, что в 3,5,7 сутки в этой группе более выраженной была также макросагальная реакция, обычно ингиби-рованная в гнойных ранах, активнее происходило макрофагально-фиб-робластическое взаимодействие и пролиферация фибробластов, что ве-

ло затем к более быстрому росту грануляционной ткани и заживлению раны. Помимо очищения ран от гнойно-некротических масс, имеется еще один важный механизм такого воздействия коллитина. Известно, что продукты распада коллагена через стимуляцию макрофагальной реакции и макрофагально-фибробластического взаимодействия по механизму обратной связи активируют пролиферацию фибробластов и продукцию коллагена (А.Б.Шехтер, В.В.Серов,1991). Указанный лизис коллагена под влиянием коллитина может запускать такой механизм сти-■муляции репаративного процесса.

Еще лучшие результаты были получены нами при применении фермента лизоамидазы, иммобилизованной на ДАЦ. В отличие от других ферментов лизоамидаза является сложным препаратом: в ее состав входят шесть ферментов: нейтральная фосфатаза, две протеиназы и три фермента, обладающие бактериолитической активностью, а также полисахарид,.который усиливает стабильность всего комплекса. Благодаря этому лизоамидаза совмещает бактерицидный эффект с выраженным протеолитическим (некролитическим) действием, а также иммуностимулирующим воздействием полисахарида (А.Н.Иванян,1996).

Как лекарственное средство лизоамидаза начинает использо- ' ваться для лечения ран, ожогов, стоматологических и других забо- . леваний, однако применение нативного ферментного препарата должно быть менее эффективным, чем иммобилизованного на раневом покрытии, поскольку хорошо известно, что иммобилизованные ферменты, обладающие пролонгированным действием, лучше осуществляют протеоли-тическую функцию и препятствуют колонизации микробов в ране (Г.Е. Афиногенов и др. 1993).

Действительно, в наших экспериментах использование нативной лизоамидазы для лечения гнойных ран показало ее эффективность по сравнению не только с контролем I (нелеченые раны) и контролем П

(покрытие ДАЦ), но и по сравнению с 4 группой, где использовался ДАЦ-трипсин, отмечалось более раннее снижение воспалительных процессов л усиление процессов репаратлвных, что способствовало более активному раневому заживлению. Б среднем окончательное заживление ускорялось на 10,9 суток по сравнению с контролем I, на 9,0 суток по сравнению с контролем П к на 1,9 суток ( статистически недостоверно) по сравнению с ДАЦ-тр;шсином.

Применение в наких опытах иммобилизованного на ДАЦ ферментного препарата лизоамицазы (группа 6) существенно улучшает не только планиметрические показатели и ускоряет заживление на 2,9 суток по сравнению .с контролем Ш (натявная лизоамидаза), но и морфологическое исследование свидетельствует о преимуществах этого покрытия над всеми другими. Так, было отмечено очень хорошее очищение ран от гнойно-некротических масс уже на 3 сутки после начала лечения, быстрое очищение от микрофлоры, усиление фагоцитоза бактерий нейтрофилами и макрофагами, активизация реакции тучных клеток, влияющих на микроцйркуляцию. Активизировалась не только макрофа-гальная реакция, но и ранняя лимфо-плазмоцитарная инфильтрация, liro свидетельствует об иммунной стимуляции. Быстрее нормализуются ли;;роциркуляторные расстройства и доугие прояв гения воспаления. Это приводит к раннему росту .сосудов грануляционной ткани, пролиферации фибробластов. Динамика раневого процесса значительно уско-зяется: уже на 5 сутки развивается, а на 7 сутки созревает грану-шционная ткань, к 10 суткам она претерпевает фиброзно-рубцовую трансформацию. Эпителизация раневого дефекта в этой группе также шачительно ускоряется. В среднем на 15,3 суток раны заживают.

Таким образом, использование нового раневого покрытия диаль-сегядцеллюлозы лизоамидазы по клиническим, планиметрическим, цито-:огическим, цитобактериологическим, гистологическим и гистохими-

химическим данным по нашим наблюдениям является новым и высокоэффективным средством для лечения гнойных ран.

ВЫВОДЫ

I. мобилизация лизоамидазы на диальдегидцеллюлозе не изменяет гигроскопических и механических свойств исходных материалов. Раневое покрытие диальдегидцеллюлоза-лизоамидаза обладает достаточными гигроскопическими свойствами для впитывания раневого отделяемого.

2. Биологическая активность лизоамидазы, иммобилизованной на целлюлозном носителе, зависит от условий иммобилизации: рН раствора для иммобилизации, концентрации фермента, характера связи белка с носителем, длительности хранения препарата и гамма-стерилизации. В то же время лучевая обработка предохраняет диальде-гидцеллюлозу-лиэоамидазу от полной потери биологической активности в течение длительного срока хранения.

3. Цитологическое и цитобактериологическое изучение в динамике раневого экссудата гнойных ран показывает, что при заживлении их под струпом (без лечения) прослеживается вяло текущий ранезой процесс с растянутым периодом очищения раневой поверхности от микрофлоры и тканевого детрита, ингибированием фагоцитоза, пролонгированием гнойно-воспалительного характера экссудата (дистрофически измененных нейтрофилов), замедлением макросагальной и фиброблаа тической реакции. При использовании покрытий из ДАЦ без ферментов цитологическая картина принципиально не отличалась. ,

5. Иммобилизация на ДАЦ трипсина, коллитина и лизоамидазы по анализу цитограмм приводит к ускорению процесса очищения раневой поверхности от микрофлоры и детрита, усиления фагоцитоза, макрофа-гальной'и фибробластической реакции. Подобная стимуляция раневого процесса является наибольшей при использовании покрытия с иммоби-

лизованной лизоамидазой и наименьшей сиг-мобилизованным трипсином. Нативная лизоамидаза обладает меньшим стимулирующим эффектом, чем иммобилизованная на ДАЦ.

5. Гистологическое и гистохимическое изучение гнойных ран в динамике от 3 до 30 суток показало, что без лечения раневой процесс значительно замедлен, быстро развиваются и долго остаются микроциркуляторные расстройства, отек, нейтробильная инфильтрация, первичные и вторичные некрозы. Тормозится макрофагальная реакция, нарушаются макрофагально-фибробластическое взаимодействие, пролиферация фибробластов и сосудов, рост и созревание грануляционной ткани, эпителизация. Раневое покрытие ДАЦ без ферментов лишь незначительно сникает воспалительный процесс и мало способствует ре-паративным процессам.

6. Использование раневых покрытий Д\Ц с иммобилизованным кол-литином и особенно лизоамидазой ведет к наиболее быстрому очищению ран, нормализации микроциркуляторных нарушений и снятию воспалительных и некротических проявлений, усилению тучноклеточной, макро-фагальной и лимфо-плазмоцитарной реакций, максимальному сокращению фазы воспаления, а также стимуляции регенерации: пролиферации и дифференцировки фибробластов, созревания грануляционной ткани, быстрого рубцевания и эпителизации. Иммобилизованный трипсин и нативная лизоамидаза в меньшей степени ведут к интенсификации раневого процесса.

7.. Разработанное раневое покрытие на основе природного полимерного носителя (ДАЦ-лизоамидаза), обладающее полиферментной и бактериолитической активностью, по эффективности воздействия на течение раневого процесса по клиническим,цитологическим,цитобактерио-литическим, гистологическим п гистохимическим данным значительно превосходит эффективность традиционных раневых покрытий, в том

числе используемых на основе диальдегидцеллюлозы - диальдегидцел-люлозу-трипсин.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Арсенал средств и методов лечения гнойных ран широк. Среди них важная роль принадлежит раневым покрытиям. На основании сравнительного анализа.влияния современных раневых покрытий на раневой процесс диальдегидцеллюлоза-лизоамидаза является высокоэффективным средством в лечении ран. Это позволяет рекомендовать диальде-.гидцеллюлозу-лизоамидазу для широкой апробации данного материала в гнойно-септической хирургии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ

1. Лизоамидаза - новы2 ферментный антибактериальный препарат, используемый в хирургии //Острые заболевания и повреждения органов брюшной полости.-М.,1996.-0.102-104 (в соавт. И.О. Кулаев, Э.О.Луцевич, Г.П.Толстых, А.В.Шульга).

2. Опыт использования раневых покрытий бинарной протеолитической и антиоксвдантной активности при лечении гнойных ран.// Акт. вопросы совершенствования лечебно-диагностического процесса на поликлиническом этапе. Сб.тез. и докладов науч.-практ.конф., посвященных... Мин.обороны РФ.Москва, 21 ноября 1996.-С.71-72. (в соавт. Ф.Е.Шин и др.).

Методические рекомендации I. Комбинированный способ лечения гнойных ран и трофических язв с использованием лазерного аппарата "Узор" в сочетании с биологически активными препаратами (трипсин-лизоцим, коллитр'иом, ли-зоамидазой и др.), иммобилизованных на природных и синтетических текстильных носителях".-Москва,1997. ( в соавт. с П.И.Толстых, В.А.Дербеневым и др.)