Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Нейроиммунные нарушения при геморрагическом инсульте и пути их коррекции (экспериментально-клиническое исследование)

005055235

На правах рукописи

КУЛЬЧИКОВ АНДРЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

НЕЙРОИММУННЫЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ И ПУТИ ИХ КОРРЕКЦИИ (экспериментально-клиническое исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 НОЯ 2012

Москва - 2012

005055235

Работа выполнена в лаборатории нейроиммунопатологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Морозов Сергей Георгиевич

Официальные оппоненты: Меркулова Дина Мироновна Доктор медицинских наук, профессор

Центральная клиническая больница №2 им H.A. Семашко ОАО «РЖД» Руководитель Неврологического Центра им. проф. Б.М. Гехта Шевелев Олег Алексеевич Доктор медицинских наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов

Профессор кафедры общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится 2012 года вчасов на

заседании Диссертационного совета Д b01.003.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук, по адресу: 125315, Москва, Балтийская ул., 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан <2^ »уЦуьЛ)^ 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Скуратовская Лариса Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На современном этапе развития общества отмечается рост заболеваемости и смертности от геморрагического инсульта (ГИ) (Скворцова В.И. и др., 2005). Причиной смерти от ГИ очень часто являются осложнения, в структуре которых ведущее место занимают инфекционно-воспалительные осложнения (ИВО), возникающие вследствие нарушения иммунной системы и снижения резистентности к инфекционным агентам (Виленский Б.С., 2000). В таких условиях активируется условно патогенная и патогенная микрофлора, усугубляя тем самым течение ГИ и усиливая иммунную депрессию из-за накопления токсинов, протеолитических ферментов и медиаторов воспаления (Крыжановский Г.Н., 2003). Таким образом, формируется замкнутый патологический круг, при котором общепринятые стандарты лечения оказываются малоэффективными, а течение заболевания часто заканчивается летальным исходом. Вопрос о характере функциональных нарушений иммунокомпетентных клеток и нарушения иммунного ответа в зависимости от степени тяжести ГИ остается малоизученным.

Из существующих способов фармакотерапии ГИ широко используется патогенетическая и симптоматическая терапия, а для профилактики ИВО -антибиотики, которые усиливают иммунную депрессию и способствуют выработки устойчивых штаммов. В научной литературе представлено недостаточно данных об использовании иммунокорректоров для профилактики и лечения ИВО при ГИ (Старченко A.A., 2000). Вместе с тем перспективным направлением иммунотерапии при неврологических заболеваниях является использование нейроиммунокорректоров. К ним относятся нейропептидные препараты (церебролизин и кортексин), которые широко используются для лечения неврологических заболеваний (Скоромец A.A. и др.. 2005). Однако, вопрос использования нейропептидных средств для профилактики ИВО при ГИ в литературе недостаточно освящен. С другой стороны, при инсульте в головном мозге вырабатываются адаптогенные молекулы, которые оказывают нейротрофическое и репаративное действие (Гомазков O.A., 2001). На основе этого нами разработаны экспериментальные средства для лечения ГИ, которые получены из головного мозга животных прекондиционированных экспериментальной патологией. Средство Т1 представляет собой комплекс нейропетидов и аминокислот, полученных из коры головного мозга свиней, успешно перенесших экспериментальный ГИ (Макаренко А.Н. и др., 1994). Средство Т2 является комплексом нейропептидов и аминокислот, полученных из головного мозга свиней, прекондиционированных родовой гипоксией (Макаренко А.Н. и др., 2010). Изучению вопроса нейроиммунных нарушений при ГИ и способов их коррекции с помощью нейропетидных средств посвящена данная работа.

Цель исследования: изучение нейроиммунных нарушений при геморрагическом инсульте и их коррекцию с помощью нейропептидных средств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить нарушения иммунного ответа и неврологического статуса у мышей с различной степенью тяжести экспериментального монополушарного ГИ.

2. Оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток нарушения неврологического статуса у крыс при моделировании экспериментального монополушарного ГИ различной степени тяжести.

3. Провести оценку нейропротекторного и иммунокорригирующего действия нейропептидных средств, полученных из головного мозга интактных животных («церебролизин» и «кортексин») при монополушарном экспериментальном ГИ.

4. Исследовать нейропротекторное и иммунокорригирующее действие экспериментальных нейропептидных средств, полученных из головного мозга животных прекондиционированных ГИ (средство Т1) и родовой гипоксией (средство Т2) при экспериментальном монополушарном ГИ.

5. Дать сравнительную оценку клинико-иммунологических показателей у больных с ишемическим и геморрагическим инсультом.

Научная новизна исследования. В ходе проведения экспериментальных исследований разработана шкала оценки неврологического статуса у мелких лабораторных животных при поражении центральной нервной системы (Патент РФ №2327227).

В остром периоде экспериментального монополушарного ГИ у животных развивается вторичный иммунодефицит, который выражается снижением массы тимуса и селезенки, повышением титра гемагглютининов, снижением титра гемолизинов, повышением реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ), снижением функциональной активности Т- и В-лимфоцитов селезенки, макрофагов селезенки и перитонеальных макрофагов. Установлена, что чем тяжелее степень геморрагического инсульта, тем более выраженное развитие нейроиммунных нарушений.

Нейропептиды, полученные из головного мозга интактных животных (на модели «церебролизина» и «кортексина»), оказывают нейропротекторное и иммунокоррегирующее действие при экспериментальном монополушарном ГИ. Экспериментальные нейропептидные средства, полученные из головного мозга животных прекондиционированных геморрагическим инсультом и родовой гипоксией (средство Т1 и Т2) оказывают более выраженное нейроиммунокорректирующее действие, чем нейропептидные средства, полученные из мозга интактных животных (церебролизин и кортексин) при экспериментальном монополушарном ГИ.

У больных с ишемическим и геморрагическом инсульте, при локализации очага в лимбико-ретикулярных структурах, наиболее часто

развивается нарушения иммунитета, в виде угнетения фагоцитоза и клеточного звена иммунитета, а также повышение активности гуморального звена иммунитета, что приводит к развитию реактивация латентной герпетической инфекции в виде Herpes labialis, Herpes zoster, а также герпетического поражения тройничного нерва. _

Теоретическая и практическая значимость. В. экспериментальных лабораториях полученные нами данные могут использоваться для оценки фармакологической активности лекарственных средств по разработанной шкале оценки степени неврологического дефицита у мелких лабораторных животных при поражении центральной нервной системы. В клинической практике полученные данные представляют практическую значимость для проведения иммунологических исследований у больных с тяжелым течением инсульта, с целью ранней диагностики иммунодефицита и своевременным назначением нейропептидных средств, оказывающих

нейроиммунокорригирующее действие. Полученные данные о выраженном нейропротекторном и иммунокорригирующим действии экспериментальных нейропептидных средств Т1 и Т2, являются значимыми для отечественной фармацевтической промышленности, поскольку после проведения клинических исследований, могут быть выведены на фармацевтический рынок.

Положения, выносимые на защиту.

1. В остром периоде экспериментального монополушарного геморрагического инсульта, у животных развиваются нарушения иммунной системы в виде снижения титров гемолиозинов, повышения титров гемаглютинов и РГЗТ, а также снижения функциональной активности НК-клеток, пролиферативной активности Т- и B-лимфоцитов селезенки, функциональной активности перитонеальных макрофагов, макрофагов селезенки и повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов; данные нарушения выражены тем больше, чем тяжелее геморрагический инсульт.

2. Нейропепидные средства, полученные из головного мозга интактных животных (церебролизин и кортексин), а также из головного мозга животных прекондиционированных инсультом (средство Т1) и родовой гипоксией (средство Т2) оказывают нейропротекторное и иммунокорректирующее действие в остром периоде экспериментального монополушарного ГИ.

3. У больных с острым нарушением мозгового кровообращения при локализации очага в лимбико-ретикулярных структурах центральной нервной системы, развиваются нарушения иммунной системы (угнетение фагоцитоза, клеточного звена иммунитета, при одновременном повышении активности гуморального звена иммунитета), что приводит к реактивации латентной герпетической инфекции в виде Herpes labialis, Herpes zoster, герпетического поражения тройничного нерва, а также развитие других инфекционно-воспалительных осложнений (пневмония, инфекции мочевыделительной системы, инфекционного поражения глаз).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 68-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск,

2003) (работа отмечена дипломом конференции); Первой научной конференции «Вклад земляков-орловцев в развитие и становление российской науки, культуры и образования (Орел, 2003) (работа отмечена дипломом конференции); Третьем Российским Конгрессом по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем», посвященная 60-летию Российской Академии Медицинских наук (Москва,

2004); XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», (Москва, 2005) (работа отмечена дипломом конгресса); Открытом Российском научном конкурсе работ на лучшую научную работу студентов 2004 года по разделу «Медицинские науки» (Москва, 2005) (награжден медалью Министерства образования и науки РФ «За лучшую научную студенческую работу» по итогам открытого конкурса на лучшую научную работу студентов по естественным, техническим и гуманитарным наукам в ВУЗах Российской Федерации); 45-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Повышение качества и доступности медицинской помощи — стратегическое направление развития здравоохранения» (Ульяновск, 2010); II Национальном конгрессе «Неотложные состояния в неврологии» (Москва, 2011).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 27 работ, из них 20 тезисов, 1 пособие для врачей, 2 Патента РФ на изобретение и 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, заключения и выводов. Работа включает 54 рисунка и 32 таблицы. Список литературы содержит 164 источников, из них 115 работы отечественных и 49 работы зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть исследования

Эксперименты проводили на 180 крысах линии Вистар, самки, возраст 4 месяца, масса 200-250 г, а также на 260 беспородных белых мышах массой 2025г обоего пола (125 самцов, 135 самок). В течение эксперимента животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с существующими «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ Министерства здравоохранения РФ №267 от 19.06.2003) и «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Министерства здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977).

Моделирование экспериментального геморрагического инсульта. У наркотизированных животных диэтиловым эфиром, проводили трепанацию черепа. В области правой внутренней капсулы, осуществляли деструкцию

мозговой ткани и повреждение сосудов с помощью вращательных движений мандрена-ножа, введенного через направляющую иглу-канюлю (легкая степень тяжести ГИ). Средняя степень тяжести заключалась в дополнительном введении аутокрови в область правой внутренней капсулы, а при тяжелой форме ГИ в дополнение к введенной крови, вращательными движениями мандрена, разрушали вышележащие структуры головного мозга (Макаренко А.Н. и др., 2005).

Оценка степени тяжести неврологического дефицита и поведенческих нарушений. Неврологический статус у животных оценивали с помощью оригинальной шкалы, разработанной нами (Патент РФ №2327227). Неврологическая шкала заключается в тестировании 10 поведенческих реакций каждую из которых оценивают от 0 до 2 баллов, полученные баллы суммируют и при значении от 0 до 5 баллов диагностируют легкую степень, от 6 до 9 баллов - среднюю, от 10 до 20 баллов тяжелую степень поражения мозга. Шкала основана на рефлексе сгибания, реакций постановки лапы на опору, тестирования в открытом поле и подтягивания на перекладине. В качестве стандартной шкалы оценки неврологического статуса у животных использовали шкалу Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной. Для более подробного изучения специфики неврологического статуса и поведенческих нарушений проводили оценку неврологического статуса по каждому оцениваемому параметру используемых шкал.

Введение препаратов и экспериментальных средств. Все препараты животным вводили внутрибрюшинно, ежедневно, через 3 часа после моделирования ГИ. Физиологический раствор (плацебо), Церебролизин, Кортексин, средство Т1 и Т2 вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5 мл на кг массы тела животного.

Оценка состояния иммунного ответа. Первичный иммунный ответ проводили при использовании эритроцитов барана (ЭБ), для этого белым мышам внутрибрюшинно вводили ЭБ 108 клеток в объеме 0,2 мл на 20 г массы тела. Оценивали титры циркулирующих антител (гемолизинов (ГЛ) и гемагглютининов (ГА)) на микропанелях на 14-е сутки после иммунизации, которую проводили через 1 сут после воспроизведения ГИ). Клеточное звено оценивали по РГЗТ, с этой целью мышей сенсебилизировапи однократным внутрибрюшинным введением ЭБ в дозе 2х105 клеток в объеме 0,5 мл на 20 г массы тела. Через 5 сут животным в подушечку задней (опытной) лапы вводили 108 ЭБ в объеме 0,02 мл, а в правую заднюю (контрольную) лапу -изотонический раствор натрия хлорида в том же объеме. Через 24 часа у животных определяли массу регионарных (подколенных) лимфатических узлов; результаты опыта оценивали по индексу РГЗТ — отношению массы опытного лимфоузла к массе контрольного. У мышей регистрировали массу тела, тимуса и селезенки.

Оценка функционального состояния иммуннокомпетентных клеток.

1. Функциональную активность НК-клеток оценивали при помощи проточной цитометрии. В качестве клеток-мишеней использовали две линии опухолевых клеток: К-562 и J1CK (крысиная лимфосаркома, адаптированная к

условиям суспензионного культивирования). Выживаемость клеток-мишеней оценивали цитофлюориметрически по включению йодистого пропидия (PI).

2. Процесс индуцированной пролиферации Т- и B-лимфоцитов селезенки определяли с помощью метода проточной цитометрии, для чего ткань селезенки измельчали в среде RPMI-1640 и фильтровали до получения однородной клеточной суспензии. Клетки в концентрации 5x106 /мл инкубировали при 37°С и 5% С02 в течение 3 суток в полной культуральной среде RPMI-1640 в присутствии митогенов. В качестве стимулятора Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 30 мкг/ мл. В качестве стимулятора В-лимфоцитов — липополисахарид (ЛПС) Е. coli в концентрации 100 мкг/мл. По окончании культивирования спленоциты окрашивали флюорохромом PI. После осторожного встряхивания клетки инкубировали при 22~25°С в течение 30 мин в темноте. Определяли распределение клеток по фазам клеточного цикла.

3. Показатели фагоцитарной активности макрофагов селезенки и макрофагов перитонеального экссудата определяли с помощью проточной цитометрии на основе количественной оценки поглощенных меченных флюорохромом бактерий. Оценку фагоцитарной активности клеток проводили, используя штамм St. aureus, меченный флюоресцеинаизотиоцианатом (ФИТЦ). Для этого 90 мкл St. aureus, меченного ФИТЦ, в концентрации 109/мл вносили в пробирки для проточной цитометрии, добавляли равный объем клеток, в концентрации 2х106/мл, предварительно освобожденных от эритроцитарной массы при помощи лизируюшего раствора 0,9% NH4C1. В качестве контроля использовали клеточную суспензию в концентрации 2х106/мл без добавления St. aureus. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37°С, после чего добавляли к каждому образцу по 2мл охлажденного забуференного физиологического раствора и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 400 мкл 0,4%-ного раствора формалина. С помощью проточноцитометрического гейтирования определяли относительное количество фагоцитирующих клеток.

4. Уровень метаболической активности макрофагов селезенки и брюшной полости (спонтанной, а также индуцированной зимозаном и эфиром форболмиристатацетата) оценивали по восстановлению макрофагами нитросинего тетразолия (HCT). Этот тест является показательным для оценки эндогенной активации макрофагов в различных органах in vivo (спонтанная активность) и для оценки внутреннего метаболического ресурса клеток, проявляющегося при активации различными стимулирующими веществами in vitro (индуцированная активность). Для определения НСТ-восстанавливающей метаболической активности перитонеальные макрофаги вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета по 1х105 клеток на лунку. Для определения спонтанной активности клеток в лунки добавляли по 0,1 мл 0,2% красителя HCT, для определения индуцированной активности — по ОД мл 0,2 % HCT и 0,02мл зимозана (Змг/мл) или по 0,1мл 0,2% HCT и 0,02мл форболмиристатацетата. Спонтанную и индуцированную (зимозаном или форболовым эфиром) метаболическую активность перитонельних макрофагов

выражали в условных единицах, которые вычисляли путем умножения показателей экстинкции на 1: ООО.

5. Оценку адгезивных свойств перитонеапьных макрофагов проводили следующим образом: в лунки плоскодонного 96-луночного планшета вносили по 100 мкл клеточной суспензии с концентрацией 2 х 106/мл и инкубировали в течение 60 мин, после чего адгезировавшие клетки фиксировали 30 мин этиловым спиртом. После промывки адгезировавшие клетки окрашивали фиолетовым кристаллическим и оценивали колориметрическим методом количество прикрепленных клеток после растворения красителя в диметилсульфансид (ДМСО) при длине волны 570 им. Для оценки функционального резерва адгезии клетки стимулировали путем добавления форболмиристатацетата (модифицированная адгезия).

Морфологическая оценка. Морфологическую оценку поражения головного мозга производили по фронтальным срезам мозга. Мозг крыс фиксировали интракардиальной перфузией 4% раствора параформальдегида на 0,1 и фосфатном буфере (рН=7,4), обезвоживали, заливали в парафин и делали срезы на микротоме "Historange" (LKB) толщиной 6 мкм с шагом 200 мкм, после чего срезы окрашивали по методу Ниссля. Гибель нейронов в прилежащей к гематоме области в инсультном полушарии подсчитывалась по сравнению с симметричной областью у контрольных (интактные) животных.

Клиническая часть исследования

В данном исследовании принимали участие 31 пациент (15 мужчин и 16 женщин; возраст: 78 - 85 лет) с впервые возникшим инфарктом головного мозга и 32 больных (15 мужчин и 17 женщин; возраст: 75 - 88 лет) с впервые возникшим геморрагическим инсультом (у всех больных, включенных в исследование диагноз подтвержден нейровизуализационными методами исследования). Критериями исключения явились: отсутствие данных КТ/МРТ головного мозга, наличие врожденных иммунодефицитных заболеваний и ВИЧ-инфекции, наличие онкологических заболеваний, участие больного в другом исследовании, грибковое поражение легких и туберкулез, положительная реакция Вассерманна. Все пациенты, включенные в исследование, получали базисную максимально унифицированную терапию ишемического и геморрагического инсульта, при развитии пневмонии, больным назначалась антибактериальная терапия. Оценку степени неврологического дефицита у пациентов, включенных в исследование, проводили с помощью шкалы степени тяжести американского института неврологических расстройств и инсульта (NIH-NINDS). Оценку системной воспалительной реакции проводили с помощью шкалы синдрома системного воспалительного ответа (SIRS). Проводили исследование иммунного статуса. Оценивали Т-лимфоциты, Т-хелперы, Т-супрессоры и B-лимфоциты методом проточной цитометрии. Иммуноглобулины А, М, G определяли методом турбодиметрии. Фагоцитарное звено иммунитета оценивали с помощью прямого визуального метода. При выявлении у больных герпетических осложнений, больные консультировались врачом-инфекционистом, больным проводили исследование периферической крови методом ПЦР на выявление

ДНК вируса простого герпеса (ВПГ), а также определяли уровень иммуноглобулинов класса М и в на к ВПГ. Для оценки давности инфицирования оценивали индекс авидности антител к ВПГ. Данные показатели определяли на 7, 14 и 21 сутки от момента развития заболевания.

Статистический анализ проводили с использованием программ Вюз1а1 и 31ай8Нса 6.0. Все значения даны в виде средних арифметических и стандартных отклонений (М±80). Достоверность различий средних значений устанавливали с помощью ^критерия Стъюдента. Достоверность результатов поведенческих шкал устанавливали с помощью критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Разработка шкалы оценки неврологического дефицита у животных при поражении головного мозга

Опыты выполнены на 50 крысах линии Вистар, массой 200-250 г, самки, возраст 4 месяца. Животные были разделены поровну на 5 опытных групп (контроль, ложнооперированные (ЛО), ГИ легкая степень, ГИ средняя степень, ГИ тяжелая степень) (п=10). Неврологический дефицит оценивали у животных с помощью шкалы разработанной нами за сутки до моделирования ГИ, затем через сутки от момента моделирования ГИ (Патент РФ №2327227), оценивали выживаемость и проводили морфологическую оценку поражения ЦНС.

Установлено, что чем больше степень тяжести ГИ, тем больше балл по неврологической шкале, причем среднее количество баллов у животных совпадает с градацией степени тяжести при разработке данной шкалы, так у животных с легкой степенью ГИ средний бал: 3,25±1,48 (от 0 до 5 баллов), у животных со средней степенью ГИ средний бал: 7,50±1,04 (от 6 до 9 баллов), а у животных с тяжелой степенью ГИ средний балл: 16,25±0,95 (от 10 до 20 баллов). (Рисунок 1).

Средиий балл, по неврологической шкале (Патент РФ N9 2327227)

Контроль ЛО ГИ (легкая ГИ ГИ

степень) (средняя (тяжелая степень) степень)

Рисунок 1. Неврологический дефицит у крыс с различной степенью тяжести ГИ (количество баллов).

Примечание: * - р<0,05 - по сравнению с группой ЛО; * - р <0.05 - по сравнению с группой животные с легкой степенью ГИ, & - р <0,05 - по сравнению с группой животные со средней степенью ГИ.

Для оценки патоморфологических процессов происходящих в периинсультной зоне проводили подсчет количества погибших нейронов.

Отмечено, что наибольшее количество погибших клеток отмечается в группе ГИ тяжелая степень (41,2±7,6%) (р<0,05). Учитывая результаты поведенческих и морфологических исследований, можно судить, что разработанная шкала является оптимальной для оценки степени поражения ЦНС, а ее градация по степени тяжести полностью совпадает с экспериментальными данными. В последующих исследованиях использовали данную шкалу для оценки нейропротекторного действия нейропептидных препаратов. Для оценки нарушений нервной и иммунной системы при ГИ различной степени тяжести проведено следующее исследование.

Нарушение иммунного ответа и неврологического статуса в зависимости от степени тяжести экспериментального ГИ Опыты выполнены на 100 нелинейных белых мышах обоего пола массой 20-25 г. Животные разделены поровну на 5 опытных групп (контроль, ЛО, ГИ легкая степень, ГИ средняя степень, ГИ тяжелая степень) (п=20). У мышей тестировали неврологический дефицит на 1-е, 7-е и 14 сутки от момента моделирования ГИ по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной и неврологической шкале (Патент РФ №2327227). Определяли следующие показатели иммунного статуса на 14 сутки от момента ГИ (РГЗТ, ГЛ, ГА, массу тимуса и селезенки).

У животных появляется неврологический дефицит в виде парезов, полуптоза, тремора, манежных движений, нарушения реакции постановки лапы на опору, чувствительной и координационной сферы (р<0,05 по сравнению с группой JIO). Однако начиная с 7-х, суток от момента ГИ, отмечается постепенное восстановление неврологического статуса, что свидетельствует о репаративных процессах протекающих при ГИ. Отмечено, что чем тяжелее ГИ, тем больше неврологический дефицит, данные отображены на рисунке 2 на примере пареза конечностей (пирамидная сфера).

Поражение пирамидной нервной системы

(порегн&нечностей, по чтете Sr;oke-indexMcGiow вмодчфимацииИ В rannvuinunoiZt

ГИ (легкая ГИ (средняя ГИ (тяжелая степень) степень) степень)

День эксперимента

I 1 сут ■ 2 су г 8 сут ■ 11 сут ■ 15 cyi

Рисунок 2. Динамика неврологического статуса у мышей с различной степенью тяжести ГИ (процент животных с парезом).

Примечание: * - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО; * - р <0,05 - по сравнению с группой животные с легкой степенью ГИ, & - р <0,05 - по сравнению с группой животные со средней степенью ГИ.

У животных к 14-м суткам от момента ГИ отмечено нарушение иммунного ответа, которое проявляется в виде снижения титров ГЛ, при

одновременном повышении тиров ГА, повышение РГЗТ (легкая степень ГИ: 1,9±0,2; средняя степень ГИ: 2,1±0,3; тяжелая степень ГИ: 2,4±0,4) и снижение массы тимуса (легкая степень ГИ: 32,3±1,8 мг; средняя степень ГИ: 30,7±2,2 мг; тяжелая степень ГИ: 28,8±1,0 мг) и селезенки (легкая степень ГИ: 178,3±8,9 мг; средняя степень ГИ: 168,9±11,3 мг; тяжелая степень ГИ: 152,3±9,9 мг) (р<0,05 по сравнению с ЛО) (Рисунок 3). Показано, что чем тяжелее степень тяжести ГИ, тем более сильнее развитие иммунодефицита (р<0,05).

Сывороточные антитела, log 2

ГИ (легкая ГИ (средняя Ж (тяжелая тепень) степень) степень)

Индекс РГЗТ

ГИ (легкая ГИ (средняя ГИ (тяжелая тепень) степень) степень)

Рисунок 3. Показатели функциональной активности иммунного ответа у мышей при различных степенях тяжести ГИ.

Примечание: * - р<0,05 по отношению к группе ложнооперированных животных.

Таким образом, при моделировании ГИ в области внутренней капсулы помимо неврологических нарушений, развиваются нарушения иммунного ответа, которые зависят от степени тяжести ГИ. Изучению характера функциональной активности иммунокомпетентных клеток при ГИ посвящено следующее исследование.

Нарушение неврологического дефицита и функциональной активности иммунокомпетентных клеток при экспериментальном ГИ различной степени тяжести В эксперименте задействованы 50 крыс линии Вистар (самки, возраст 4 месяца, масса 200-220 г). Животные разделены на 5 опытных групп поровну (контроль, ЛО, ГИ легкая степень, ГИ средняя степень, ГИ тяжелая степень) (п=10). У всех животных за сутки до моделирования ГИ, а затем на 1 и 7 сутки оценивали неврологический статус по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной и неврологической шкале (Патент РФ №2327227). Оценивали функциональную активность НК-клеток селезенки, пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов селезенки, активность перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки, спонтанную НСТ-восстанавливающую активность макрофагов селезенки и перитонеального экссудата, метаболическую активность макрофагов брюшной полости, индуцированную зимозаном и форболмиристатацетатом, а также адгезивную активность макрофагов брюшной полости к 7-м суткам от момента ГИ.

В проведенном исследовании показано, что у крыс при моделировании ГИ различной степени тяжести возникают нарушения неврологического статуса при тестировании через сутки на 7-е сутки от момента развития ГИ по шкале

Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной, а также по неврологической шкале (р<0,05). Данные нарушения проявляются в виде парезов, параличей, тремора, полуптоза, манежных движений, нарушения реакции постановки лапы на опору, чувствительной и координационной сферы (р<0,05 по сравнению с группой JIO). Неврологический дефицит, тем сильнее, чем тяжелее степень ГИ (Рисунок 4).

Реакция постановки лапы на опору

(пошкале Патент РФ № 23272271

ГИ (легкая ГИ (средняя ГИ (тяжелая степень) степень) степень)

День g ксперименто

Чувствительная сфера

(пошколе Патент РФ №2327227)

День Q ксперимента

■ I

ГИ (легкая ГИ (средняя степень) степень!

ГИ (тяжелая степень)

Рисунок 4. Динамика неврологического статуса у крыс с различной степенью тяжести экспериментального ГИ (процент животных с неврологическгш дефицитом).

Примечание:* - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО: " - р <0,05 - по сравнению с группой животные с легкой степенью ГИ, & - р <0,05 - по сравнению с группой животные со средней степенью ГИ.

При моделировании ГИ у животных наблюдается снижение функциональной активности НК-клеток селезенки с клетками линии К-562 и линией ЛСК (Рисунок 5). Чем тяжелее ГИ, тем больше снижение функциональной активности НК-клеток._

Клетки линии К-562

Клетки ЛСК

t; Т 1;ч+1«-J- 7

Коитрш*. ПО ГН»паягтелечь ГИгр*дня=<геленьГО-

а

Рисунок 5. Функциональная активность НК-клеток селезенки у крыс с различной степенью тяжести ГИ, %.

Примечание: * - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО: * - р <0,05 - по сравнению с группой животные с легкой степенью ГИ, 4 - р <0,05 - по сравнению с группой животные со средней степенью ГИ.

Исследование функциональной активности лимфоцитов (без стимулирования митогеном), Т-лимфоцитов (стимулирование ФГА) и В-

лимфоцитов (стимулирование ЛПС) селезенки показало снижение их пролиферативной активности, что проявляется достоверным снижением количества лимфоцитов селезенки, находящихся в фазах S (дубликация ДНК), и увеличением количества лимфоцитов, находящихся в фазах G0/G1 (рост клетки и подготовка к делению) (р<0,05). Данные нарушения более выраженные у крыс со средней и тяжелой степенью тяжести ГИ (р<0,05).

Моделирование ГИ приводит к снижению функциональной активности макрофагов селезенки и брюшной полости (р<0,05 по сравнению с группой JIO). Отмечено, что чем тяжелее степень ГИ, тем более выраженное снижение функциональной активности макрофагов селезенки и брюшной полости (р<0,05). Эти данные указывают на угнетение неспецифического звена иммунитета, а именно функциональной активности, как тканевых макрофагов (брюшная полость), так и макрофагов селезенки. У животных с ГИ возникали нарушения спонтанной НСТ-восстанавливающей активности макрофагов селезенки и перитонеального экссудата, снижение метаболической активности перитонеальных макрофагов индуцированную зимозаном и форболмиристатацетатом (р<0,05 по сравнению с группой J10). Причем нарушение активности макрофагов селезенки и перитонеального экссудата более выраженное у животных с ГИ средней и тяжелой степени тяжести (р<0,05). Вместе с тем, у животных с ГИ, отмечается повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов. Более выраженное у крыс с тяжелой степенью ГИ (р<0,05).

Таким образом, у животных с ГИ наблюдается снижение функциональной активности иммунокомпетентных клеток, более выраженное у крыс с тяжелой степенью ГИ (р<0,05).

Сравнительное изучение влияние нейропептидных средств на иммунный ответ и неврологический статус при экспериментальном ГИ

Опыты выполнены на 160 нелинейных белых мышах обоего пола массой 20-25г. Животные были разделены поровну на 8 опытных групп (контроль, JIO, ГИ, ГИ+плацебо, ГИ+церебролизин, ГИ+кортексин, ГИ+средство Т1, ГИ+средство Т2) (и=20). Нейропептидные средства и плацебо вводили через 5 часов после моделирования ГИ в течение 14 суток 1 раз в день. Оценку нейропротекторного действия нейропептидных средств проводили на 1-е, 7-е и 14 сутки от момента моделирования ГИ по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной и неврологической шкале (Патент РФ №2327227). Иммунокорректирующее действие нейропептидов определяли на 14 сутки от момента ГИ с помощью тестирования следующих иммунологических показателей: РГЗТ, ГЛ, ГА, массу тимуса и селезенки.

Использование нейропептидных препаратов оказывало нейропротекторное действие, восстанавливая нарушенный неврологический статус (парез конечностей, полуптоз, тремор, манежные движения, вялость, замедленность движений, чувствительную сферу, реакцию постановки лапы на опору) к 7-м суткам после моделирования ГИ (р<0,05 по сравнению с группой ГИ+плацебо) (рисунок 6). Данная тенденция сохранялась до 14 суток ГИ

(р<0,05 по сравнению с группой ГИ+плацебо). Причем экспериментальные нейропептидные средства Т1 и Т2 оказывали более выраженное нейропротекторное действие, чем препараты церебролизин и кортексин (р<0,05).

Контроль ЛО ГИ ГИ+пл ГИ+кор ГИ+цер ГИ+Т1 ГИ+Т2

Демо _^

эксперимента ^ ■ 1-.у ■ 2 Су I 8су| ■ 11 (./; ш15су|

Рисунок 6. Оценка нейропротекторного действия нейропептидных препаратов у мышей с ГИ.

Примечание: * - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО; " - р <0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ + плацебо, &р<0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ+кортексин.

Отмечено, что введение нейропептидных средств в течение 14 суток у мышей с ГИ оказывает иммунокорректирующее действие путем восстановления массы лимфоидных органов (тимус, селезенка), нормализацией показателя РГЗТ (ГИ+кортексин: 1,6±0,2; ГИ+церебролизин: 1,5±0,3; ГИ+Т1: 1,4±0,3; ГИ+Т2: 1,3±0,3) и титра гемолизинов (ГИ+кортексин: 10,2+2,3/с^; ГИ+церебролизин: 10,9±2,1 /о£2; ГИ+Т1: 13,2±2,9/о&; ГИ+Т2:12,5+2,\log2 ) и геммаглютининов (ГИ+кортексин: 7,1±1,3/о£2; ГИ+церебролизин: 7,3+1,5 ГИ+Т1: 6,1±1,2/о§2; ГИ+Т2: 6,4+1,4/о^) (р<0,05 по сравнению с группой ГИ+плацебо). Более выраженное иммунокорректирующее действие отмечено у экспериментальных нейропептидных средств Т1 и Т2 (р<0,05) (Рис. 7 а, б).

Рисунок 7. Влияние нейропептидных препаратов на показатели иммунного ответа у животных с экспериментальным ГИ.

Примечание:* - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО; " - р <0,05 - по сравнению с группой э/сивотные с ГИ + плацебо, &р<0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ+кортексин.

Таким образом, нейропетидные средства оказывают нейропротекторное действие, восстанавливая нарушенный неврологический статус и иммунный ответ при экспериментальном ГИ. Изучению влияния нейропептидных препаратов на иммунокомпетентные клетки и неврологический статус при экспериментальном ГИ посвящено следующее исследование.

Сравнительное изучение влияние нейропептидных средств на функциональную активность иммунокомпетентных клеток и неврологический статус при экспериментальном ГИ В эксперименте задействованы 80 крыс линии Вистар (самки, возраст 4 месяца, масса 200-220 г) (п=10). Животные были разделены на 8 опытных групп (контроль, ЛО, ГИ, ГИ+плацебо, ГИ+церебролизин, ГИ+кортексин, ГИ+средство Т1, ГИ+средство Т2) (п=10). Нейропептидные средства и плацебо вводили через 5 часов после моделирования ГИ в течение 7 суток 1 раз в день. Оценку нейропротекторного действия нейропептидных средств проводили на 1-е и 7-е сутки от момента моделирования ГИ по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной и неврологической шкале (Патент РФ №2327227). Иммунокорректирующее действие нейропептидов определяли на 7 сутки от момента ГИ с помощью тестирования следующих иммунологических показателей: функциональная активность НК-клеток селезенки, пролиферативная активность Т- и В-лимфоцитов селезенки, активность перитонеальных макрофагов и макрофагов селезенки, спонтанная НСТ-восстанавливающая активность макрофагов селезенки и перитонеального экссудата, метаболическая активность макрофагов брюшной полости, индуцированная зимозаном и форболмиристатацетатом, а также адгезивная активность макрофагов брюшной полости. Использование нейропептидных препаратов оказывает нейропротекторное действие у крыс с ГИ, снижая неврологический дефицит (парезы конечностей, полуптоз, вялость, замедленность движений, манежные движения, реакция постановки лапы на опору, чувствительная сфера, координационная сфера, тремор) (р<0,05 по сравнению с группой ГИ+плацебо).

Рисунок 8. Нейропротекторное действие нейропептидных средств при экспериментальном ГИ.

Примечание: * - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО; # -р <0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ + плацебо, &р<0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ+кортексин.

При этом, экспериментальные нейропептидные средства оказывают более выраженное нейропротекторное действие (р<0,05) (Рис. 8).

Проведенное исследование показало, что нейропептидные средства оказывают иммунокорректирующее действие, восстанавливая сниженную функциональную активность НК-клеток селезенки, повышают пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов (увеличивая количество лимфоцитов в фазе 8 и снижение в фазе 00/01), улучшают функциональную активность макрофагов селезенки и брюшной полости, восстанавливают сниженную спонтанную метаболическую активность макрофагов селезенки и перитонеального экссудата, метаболическую активность перитонеальных макрофагов, индуцированную зимозном и форболмиристатацетатом, а также восстанавливают адгезивную активность макрофагов брюшной полости к 7-м суткам от момента моделирования ГИ (р<0,05 по сравнению с группой ГИ+плацебо). Отмечено, что экспериментальное средство Т1 оказывает наибольшее иммунокорректирующее действие (р<0,05) (Рисунок 9).

Таким образом, нейропептидные средства (церебролизин, кортексин) оказывают нейроиммунокорректирующее действие, а экспериментальные нейропептидные средства, полученные из головного мозга свиней прекондиционированных ГИ (средство Т1) и родовой гипоксией (средство Т2) оказывает более выраженное иммунокорректирующее действие.

Т-лимфоциты в фазах 62/М+5(ФГЛ], %

ш #&

-т-

Нп

Контроль ЛО ГИ ГИ+пл ГИ**ор ГИ.цер ГИ+Т1 ГИ+Т2

В-лимфоциты в фазах 62/М+5 (ЛСД %

онтроль ЛО ГИ ГИ+пл ГИ+кор ГИ.цер ГИ+Т1 ГИ+Т2

Рисунок 9. Иммунокорректирующее действие нейропептидных средств при экспериментальном ГИ.

Примечание: * - р <0,05 - по сравнению с группой ЛО: * - р <0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ + плацебо, &р<0,05 - по сравнению с группой животные с ГИ+кортексин.

Для изучения характера иммунных нарушений и особенностей течения проведено клиническое исследование у больных с инсультом.

Специфика иммунных нарушений у больных с острым нарушением мозгового кровообращения

Анализ полученных данных, показал, что на 7-е сутки развития ОНМК у больных развиваются нарушения показателей иммунитета в виде снижения количества Т-лимфоцитов, нарушение субпопуляционного состава Т-лимфоцитов (снижение Т-хелперов и повышение Т-супрессоров), угнетение фагоцитоза и повышение В-лимфоцитов, а также уровня иммуноглобулинов

класса А, М, О. Данные нарушения, прослеживаются к 14-м и 21-м суткам от момента ОНМК (Рисунок 10).

Т-лимфоциты

,'9/л Количество активных фагоцитов

ВИИ ■ I и

Hl

а 7сут 14 сут 21 сут g 7 сут сут 21 сут

Рисунок 10. Нарушения иммунной системы у больных с геморрагическим и шиемическим инсультом.

Примечание: ИИ - ишемический инсульт, ГИ - геморрагический инсульт.

При этом, иммунитет постепенно восстанавливаются к 14-м и 21-м суткам от момента развития заболевания, но не достигают нормативных показателей. У больных с геморрагическим инсультом, иммунные нарушения выражены больше, чем у больных с ишемическим инсультом. Эти данные указывают, на зависимость степени тяжести заболевания от степени иммунных нарушений. У больных изучали показатели воспалительного синдрома по шкале SIRS и уровня С-реактивного протеина, показано, что к 7-м суткам от момента развития ОНМК у больных отмечается развитие воспалительного процесса. К 14-м суткам показатели воспалительного синдрома постепенно снижаются. Данная тенденция сохраняется к 21-м суткам, но полностью не разрешается.

Анализ частоты развития инфекционно воспалительных осложнений показал, что у больных на фоне инсульт-индуцированного иммунодефицита к 7-м суткам от момента заболевания развиваются инфекционно-воспалительные осложнения (пневмония, пиелонефрит, инфекционные поражения глаз, серозный менингит, трахеобронхит, пролежни, герпетические поражения слизистых оболочек и полости рта, герпетические поражения тройничного нерва и Herpes zoster) (Таблица 1). Для решения вопроса о давности инфицирования проводили исследование ИФА на выявление

иммуноглобулинов класса М и G к ВПГ. При этом у всех больных в периферической крови определяется иммуноглобулин класса G и М к ВПГ. Все положительные сыворотки с иммуноглобулином G тестировали на индекс авидности антител, который во всех случаях был более 50%, следовательно, сыворотки содержат высокоавидные антитела, что указывает на давнюю инфекцию и подтверждает реактивацию латентных форм вируса простого герпеса, обусловленной снижением иммунной защиты. ПЦР анализ к ВПГ у больных с герпетическими осложнениями был также положительным.

Интересен тот факт, что у всех больных, включенных в исследование, затронуты структуры лимбико-ретикулярной системы, которая являются регуляторами иммунной системы организма (Г.Н. Крыжановский и др., 2010).

Таблица 1.

Инфекционно-воспалительные осложнения у больных с инсультом.

Осложнения Количество больных

Ишемический инсульт, п=31 Геморрагический инсульт, п=32

Пневмония 17 20

Пиелонефрит 5 6

Цистит 7 3

Инфекционно-воспалительное поражения глаз 2 4

Серозный менингит 1 2

Трахеобронхит 7 8

Пролежни 15 18

Герпетические поражения слизистых оболочек и полости рта 3 5

Герпетические поражения тройничного нерва 2 3

Herpes zoster 2 3

Таким образом, локализация очага инсульта в лимбико-ретикулярных структурах головного мозга приводит к развитию инсульт-индуцированного иммунодефицита, следствием чего является снижение резистентности к бактериально-вирусным инфекционным агентам и развитие инфекционно-воспалительных осложнений, в том числе и реактивация латентной герпептической инфекции.

ВЫВОДЫ

1. В остром периоде геморрагический инсульт сопровождается нарушением иммунного ответа и снижением функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

2. При моделировании монополушарного геморрагического инсульта в области внутренней капсулы у животных развивается нарушение иммунного ответа, которое проявляется повешением уровня гемагглютининов, снижением уровня гемолизинов, уменьшением массы тимуса и селезенки, повышением реакции гиперчувствительности замедленного типа, а также снижением функциональной активности НК-клеток селезенки, макрофагов селезенки и брюшной полости, пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов селезенки и повышением адгезивной активности перитонеальных макрофагов.

3. Установлено, что чем тяжелее степень тяжести экспериментального геморрагического инсульта, тем выражение нарушение иммунного ответа и функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

4. Использование нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга интактных животных (кортексин и церебролизин) в терапевтических дозах оказывает нейропротекторное и иммунокорректирующее действие, восстанавливая функцию нервной системы, иммунный ответ и функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

5. Применение экспериментальных нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга животных прекондиционированных инсультом (средство Т1) и родовой гипоксии (средство Т2) оказывают более выраженное

нейропротекторное и иммунокорректирующее действие, чем препараты полученные из мозга интактных животных.

6. У больных с ишемическим и геморрагическим инсультом в остром периоде развивается вторичный инсульт-индуцированный иммунодефицит, который проявляется снижением количества Т-лимфоцитов, повышением уровня В-лимфоцитов и иммуноглобулинов А, М, G, а также угнетением фагоцитоза; при этом нарушения иммунитета более выраженные при геморрагическим инсультом, чем при ишемическом.

7. На фоне инсульт-индуцированного иммунодефицита у больных развиваются реактивация латентной герпетической инфекции в виде Herpes labialis, Herpes zoster, герпетического поражения тройничного нерва, персистирования вируса простого герпеса в периферической крови, а также пневмония, инфекция мочевыделительной системы, инфекционное поражение глаз, серозный менингит и пролежни.

8. Локализация очага инсульта в лимбико-ретикулярных структурах головного мозга часто приводит к развитию инсульт-индуцированного иммунодефицита, следствием чего является снижение резистентности к бактериально-вирусным инфекционным агентам и развитие инфекционно-воспалительных осложнений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воропаева Т.В., Кульчиков А.Е., Макаренко А.Н. Морфология и патогенетические аспекты экспериментального геморрагического инсульта. // Материалы межрегиональной студенческой конференции, посвященной 85-летию Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко «Студенческая медицинская наука 2003». Воронеж. - 2003. - С. 230231.

2. Кульчиков А.Е., Воропаева Т.В. Морфологические изменения головного мозга крыс и состояние иммунной системы у мышей в остром периоде экспериментального геморрагического инсульта. II Материалы «68-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых». Курск 2003,- Часть I. - С. 38-39.

3. Кульчиков А.Е., Барсуков B.C., Макаренко А.Н. Морфологические изменения головного мозга крыс в остром периоде экспериментального геморрагического инсульта. // Материалы научной конференции «Вклад земляков-орловцев в развитие российской науки, культуры и образования». Орел. - 2003. - Т.5. (Часть II). - С. 47-48.

4. Макаренко А.Н., Кульчиков А.Е., Соломатина Л.П. Нейроиммунологические изменения, возникающие при остром геморрагическом инсульте. // Тезисы 7-й конференции «Актуальные вопросы научно-практической медицины». Орел.- 2003. - С. 348-349.

5. Makarenko A.N., Pznyakov R., Evzelman M., Kulchikov A., Vasilyva I. Morphological changes in the brain of rats in acute period of experimental hemorrhagic stroke. // Abstracts of 12th European Stroke Conference «Cerebrovascular Diseases». Valencia, Spain. May 21-24. - 2003. - P. 22.

6. Макаренко А.Н., Кульчиков А.Е., Анисимова Ю.Н. Нейроиммунологическая дизрегуляционная патология при остром геморрагическом инсульте и ее коррекция. // Материалы третьего Российского Конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патологи органов и систем». Москва. - 2004. - С. 104.

7. Makarenko A.N., Anisimova Y.N., Kulchikov А.Е. Morphological changes of rat brain in the course of acute stage of experimental hemorrhagic stroke. Abstracts of 8-th Conference "Stress and Behavior". // Психофармакология и биологическая наркология. - 2004,- №2-3.- С. 685.

8. Кульчиков А.Е., Макаренко А.Н., Евзельман М.А. Нейроиммунные нарушения, возникающие при остром геморрагическом инсульте, и их фармакологическая коррекция. // Тезисы работ участников открытого Российского Конкурса на лучшую научную работу студентов 2004 года по разделу «Медицинские науки». Москва. - 2005,- С. 52-54.

9. Makarenko A.N., Kulchikov А.Е., Novikova J.L. Study of neuroimmunological disorders discovered at acute stress. // Proceedings of the 9th International Multidisciplinary Conference "Stress and behavior". St-Petersburg, Russia. May 16-19. - 2005. - P. 54-55.

10. Макаренко A.H., Васильева И.Г., Анисимова Ю.Н., Кульчиков А.Е., Чопик Н.Г. Активация персистирующей герпетической инфекции головного мозга при остром аутогеморрагическом инсульте. Тез. XIV Всероссийской конференции «Нейроиммунология». // Нейроиммунология. - 2005. - Том 2, № 2. - С. 56-57.

11. Макаренко А.Н., Кульчиков А.Е. Иммунологические нарушения, возникающие при моделировании инсульта. Тез. XIV Всероссийской конференции «Нейроиммунология». // Нейроиммунология. — 2005. - Том 3, № 2.-С. 189.

12. Kulchikov А.Е., Makarenko A.N. Treatment of infection complications of the acute stroke by cerebrolysin. Abstracts of "Joint World Congress on Stroke". // International journal of stroke. - 2006. - Vol.1, Supplement. 1. - P. 81.

13. Макаренко A.H., Сивакова JI.Я., Кульчиков А.Е. Новые подходы и принципы в лечении и профилактике острого ишемического и геморрагического инсульта. // Материалы XIII Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Москва. - 2006. - С. 203.

14. Макаренко А.Н., Кульчиков А.Е., Григорьева Т.И., Анисимова Ю.Н. Развитие энцефалита при моделировании острого геморрагического инсульта -ранее не описанный вариант соматического осложнения. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2007. - №4. - С. 25-27.

15. Кульчиков А.Е., Ларин Ю.А., Макаренко А.Н. Использование церебролизина в терапии инсульт-индуцированной герпетической инфекции. // Материалы XIV Российского Национального Конгресса «Человек и лекарство». Москва. - 2007. - С. 559.

16. Kulchikov А.Е., Makarenko A.N., Vasilyva I.G. The use of cerebrolysin in therapy of stroke-induced herpetic infection. // Abstracts of Conference "The 23rd

International Symposium on Cerebral Blood Flow, Metabolism & Function". Osaka, Japan. May20-24.-2007.-P.91.

17. Kulchikov A.E., Makarenko A.N. Latent herpes infection reactivation contaminations at the acute ischemic stroke and its pharmacocorrection. // Abstracts of "Kuopio Stroke Symposium 2007". Microteknia, Kuopio, Finland. June 6-8. -2007.-P. 1.

18. Кульчиков A.E., Макаренко A.H. Нейроиммуннокоррегирующая терапия в качестве профилактики развития инфекционных осложнений острого инсульта. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008.- Т.71. -№6.-С. 34-38.

19. Способ определения неврологического дефицита у мелких лабораторных животных при поражении головного мозга / Кульчиков А.Е., Макаренко А.Н., Новикова Ю.Л., Добычина Ю.В. // Патент РФ №2327227 от 20.06.2008 г.

20. Кульчиков А.Е., Полканова В.И., Макаренко А.Н., Ларин Ю.А. Нарушение иммунного ответа у больных с инфекционными осложнениями инсульта и пути коррекции данного состояния. // Неврологический вестник. -2009. - Т. XLI. - Выпуск I. - С. 11-15.

21. Кульчиков А.Е., Макаренко А.Н., Гриненко Е.А. Герпетические осложнения инсульта и способы их фармакокоррекции (пилотное клиническое исследование). // Материалы 45-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Повышение качества и доступности медицинской помощи - стратегическое направление развития здравоохранения». Ульяновск, 20-21 мая 2010. - С. 357-358.

22. Кульчиков А.Е., Макаренко А.Н, Храновская Н.Н, Гарманчук Л.В. Иммунокоррегирующее действие церебролизина при иммунодефиците, индуцированным геморрагическим инсультом (экспериментальное исследование). // Материалы 45-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Повышение качества и доступности медицинской помощи - стратегическое направление развития здравоохранения». Ульяновск, 20-21 мая 2010. - С. 357-358.

23. Kulchikov А.Е., Grinenko Е.А., Morozov S.G., Parfenov A.L. Prognostic role of cerebral blood flow after intracranial pressure normalization in patients with aneurismal subarahnoid hemorrhage. Abstracts of 7th World Stroke Congress, Seul, Republic of Korea // International Journal of Stroke. - 2010.- Vol 5, Supplement 2. -P. 10159.

24. Лекарственный препарат для лечения токсических и митохондриальных дисфункций / Макаренко А.Н., Морозов С.Г, Кульчиков А.Е., Широбокова Л.П., Божко A.M. // Патент № РФ 2405558 от 10.12.2010 г.

25. Кульчиков А.Е., Морозов С.Г., Гриненко Е.А. Иммунокоррегирующее действие нейропептидов при иммунодефиците, индуцированным геморрагическим инсультом: от теории к практике (экспериментальное исследование) // Материалы II Национального конгресса «Неотложные состояния в неврологии», Москва. - 2011. - С. 123.

26. Кульчиков А.Е. К вопросу о герпетических осложнения при острой цереброваскулярной патологии. Пособие для врачей, 2011, 48 с.

27. Кульчиков А.Е., Морозов С.Г., Гриненко Е.А., Макаренко А.Н. Нарушение фагоцитоза и его фармакокоррекция при геморрагическом инсульте. // Цитокины и воспаление. - 2011-Том 10. - №3. - С. 102-107.

Kulchikov Andrey Evgenevich

Neuroimmune disorders in hemorrhagic stroke and their correction ways (experimental and clinical study)

Abstract

Cerebrovascular diseases, e.g. hemorragic stroke (HS), are known to be highly prevalent pathologies. Frequently, the cause of patients' death with HS is infectious complications (IC), such as pneumonia et al. The causes of IC in HS are immune disorders. New studies of immune response and functional activity of immune cells are required for improving HS management and prevention of IC. For effective therapy of IC in HS patients it is necessary to use drugs with neuroimmunecorrective activity, e.g. neuropeptide drugs. Our objective was studying neuroimmune disorders in HS and ways of their correction by neuropeptides. Using immunological, behavioral, morphological methods we demonstrated that in acute stage of experimental HS in mice disorders of immune response occurred notably, decreasing hemolysins level, and increasing hemagglutinines level, hypersensitivity reaction, reduction of thymus and spleen mass. We have also found disorders of functional activity of immune cells in acute stage in rats with experimental HS, their defined reducing activity of NK-cells, T- and B- lymphocytes and macrophagocytes in spleen and increasing activity of peritoneal cavity macrophagocytes. These disorders were more serious in animals with serious form of experimental HS than with the slight form. Neuroimmunocorrection therapy by neuropeptides (Cerebrolysin, Cortexin) has been separated out from intact brain of pigs and has neuroprotective and immunecorrective activity in experimental animals with HS. At the same time comparative research of new experimental drugs has been separated out form preconditioned pig's brain by HS (pharmaceutical substance Tl) and after birth hypoxia (pharmaceutical substance T2) has more effective neuroprotection and immunecorrection action than Cerebrolysin and Cortexin in experimental HS. In clinical trial we have shown that localization of stroke focus in limbical and reticular brain structures more frequently leads to development of immune disorders (depression of cellular immune, phagocytosis and activation of humoral immunity) and development of IC, such as reactivation of latent herpetic infection, pneumonia, infection of urinary tract and others. Taken together the results obtained in present study allow us to suggest about new immune disorders and effective ways of their pharmacocorrection by neuropeptides.

Подписано в печать 27.09.2012 г.

Заказ № 314 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность проблемы

На современном этапе развития общества отмечается рост заболеваемости и смертности от сосудистых заболеваний головного мозга [34]. Ежегодно инсульт развивается у 0,2% населения всего земного шара и более чем у 1% людей старше 65 лет [101]. По классификации выделяют два основных типа инсульта: ишемический и геморрагический. Геморрагический инсульт встречается реже (15%), чем ишемический (85%), но протекает тяжелее и в большинстве случаев имеет неблагоприятный исход в виде смерти больного или стойкой инвалидизации [91]. В последнее время, отмечена тенденция к увеличению частоты ГИ, который все чаще встречается в более молодом возрасте [84]. В основе ГИ лежит разрыв сосудов, развитие кровоизлияния и как следствие - формирование отека головного мозга, ишемии мозговой ткани, нарушение целостности ГЭБ, дисбаланса нейроиммунной системы, а также нарушение функции других систем и органов [158]. В 80% случаев ГИ причиной смерти являются инфекционно-воспалительные осложнения: пневмония, инфекция мочевыделительной системы, менингиты и менингоэнцефалиты [16]. По мнению ряда авторов, ИВО возникают вследствие сочетанного действия ряда неблагоприятных факторов (гибели нервных клеток, нарушение нейроиммунного гомеостаза мозга, развитие аутоиммунных реакций), приводящих к развитию нарушения иммунного статуса и формированию вторичного иммунодефицита [85]. Нарушения иммунного статуса складывается из образования аутоантител к нервным клеткам, повышением уровня Ig Е, ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-8, ИЛ-4 ИЛ-1(3 [99]. В условиях ИДС активируется размножение условно патогенной и патогенной микрофлоры, которые в свою очередь, усугубляют течение основного заболевания, усиливают иммунную депрессию из-за накопления бактериальных и вирусных токсинов, протеолитических ферментов и медиаторов воспаления [80]. Таким образом, формируется замкнутый патологический круг, при котором общепринятые стандарты лечения лечение оказывается малоэффективным, а течение заболевания заканчивается летальным исходом. Однако, остается неизученным вопрос о характере функциональных нарушений иммунокомпетентных клеток, нарушения иммунного ответа и зависимости степени выраженности нарушения иммунитета от степени тяжести ГИ. Ответ на данный вопрос позволит спрогнозировать риск развитие ИВО при ГИ.

Наиболее оптимальным подходом для лечения ГИ и профилактики ИВО, являются средства, оказывающие нейропротекторное действие и восстанавливающие нарушенный иммунный ответ. К ним относится ноотропные нейропептидные препараты - «церебролизин» ("Ever neuro pharm", Австрия), «кортексин» ("ГЕРОФАРМ", Россия), полученные из головного мозга животных [87, 93, 111]. Эти данные указывают на наличие адаптационного и регуляторного действия препаратов содержащих биологически активные нейропептиды и аминокислоты. Вместе с тем, в указанных работах отмечено только иммунокорректирующее действие нейропептидных препаратов при энцефалопатиях и психиатрических заболеваниях, а при ГИ данных за наличие иммунокорригирующего действия нейропептидных препаратов нет. Получив ответ на данный вопрос можно использовать данные средства у больных с нарушенным иммунитетом при ГИ, для профилактики развития ИВО.

С другой стороны, известно, что при ОНМК и острой гипоксии в головном мозге протекает не только комплекс патологических процессов приводящих к гибели нервных клеток, но и синтезируются молекулы, оказывающие адаптационное действие [3, 29, 113]. К ним относят, пептид выделенный из поврежденного мозга, индуктор фактора роста нервов А, транскрипционный фактор рецептора стероидного гормона, а так же фактор, индуцируемый гипоксией [116]. Нашей исследовательской группой разработаны средства для лечения ГИ, которые получены из неокортекса головного мозга животных успешно перенесших ГИ (средство Т1) и из головного мозга животных, успешно перенесших тяжелую родовую гипоксию (средство Т2). По данным исследователей эти вещества Т1 и Т2 оказывают нейропротекорное действие при гипоксии, ОНМК и ишемии мозга [27, 73, 115]. При этом в литературе не представлены данные о иммунокорригирующем действии данных веществ при геморрагическом инсульте.

Цель исследования: изучение нейроиммунных нарушений при геморрагическом инсульте и их коррекцию с помощью нейропептидных средств.

Задачи исследования:

1. Изучить нарушения иммунного ответа и неврологического статуса у мышей с различной степенью тяжести экспериментального монополушарного ГИ.

2. Оценить функциональную активность иммунокомпетентных клеток нарушения неврологического статуса у крыс при моделировании экспериментального монополушарного ГИ различной степени тяжести.

3. Провести оценку нейропротекторного и иммунокорригирующего действия нейропептидных средств, полученных из головного мозга интактных животных («церебролизин» и «кортексин») при монополушарном экспериментальном ГИ. .

4. Исследовать нейропротекторное и иммунокорригирующее действие экспериментальных нейропептидных средств, полученных из головного мозга животных прекондиционированных ГИ (средство Т1) и родовой гипоксией (средство Т2) при экспериментальном монополушарном ГИ.

5. Дать сравнительную оценку клинико-иммунологических показателей у больных с ишемическим и геморрагическим инсультом.

Положения, выносимые на защиту:

1. В остром периоде экспериментального монополушарного геморрагического инсульта, у животных развивается нарушение иммунной системы в виде снижения титров гемолиозинов, повышения титров гемаглютинов и РГЗТ, а также снижения функциональной активности НК-клеток, пролиферативной активности Т- и B-лимфоцитов селезенки, функциональной активности перитонеальных макрофагов, макрофагов селезенки и повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов; данные нарушения выражены тем больше, чем тяжелее геморрагический инсульт.

2. Нейропепидные средства, полученные из головного мозга интактных животных (церебролизин и кортексин), а также из головного мозга животных прекондиционированных инсультом (средство Т1) и родовой гипоксией (средство Т2) оказывают нейропротекторное и иммунокорректирующее действие в остром периоде экспериментального монополушарного ГИ.

3. У больных с острым нарушением мозгового кровообращения при локализации очага в лимбико-ретикулярных структурах центральной нервной системы, развиваются нарушения иммунной системы (угнетение фагоцитоза, клеточного звена иммунитета, при одновременном повышении активности гуморального звена иммунитета), что приводит к реактивации латентной герпетической инфекции в виде Herpes labialis, Herpes zoster, герпетического поражения тройничного нерва, а также развитие других инфекционно-воспалительных осложнений (пневмония, инфекции мочевыделительной системы, инфекционного поражения глаз).

Научная новизна:

В ходе проведения экспериментальных исследований разработана шкала оценки неврологического статуса у мелких лабораторных животных при поражении центральной нервной системы (Патент РФ №2327227).

В остром периоде экспериментального монополушарного ГИ у животных развивается вторичный иммунодефицит, который выражается снижением массы тимуса и селезенки, повышением титра гемагглютининов, снижением титра гемолизинов, повышением реакции гиперчувствительности замедленного типа, снижением функциональной активности Т- и B-лимфоцитов селезенки, макрофагов селезенки и перитонеальных макрофагов. Установлена, что чем тяжелее степень геморрагического инсульта, тем более выраженное развитие нейроиммунных нарушений.

Нейропептиды, полученные из головного мозга интактных животных (на модели «церебролизина» и «кортексина»), оказывают нейропротекторное и иммунокоррегирующее действие при экспериментальном монополушарном ГИ. Экспериментальные нейропептидные средства, полученные из головного мозга животных прекондиционированных геморрагическим инсультом и родовой гипоксией (средство Т1 и Т2) оказывают более выраженное нейроиммунокорректирующее действие, чем нейропептидные средства, полученные из мозга интактных животных (церебролизин и кортексин) при экспериментальном монополушарном ГИ.

У больных с ишемическим и геморрагическом инсульте, при локализации очага в лимбико-ретикулярных структурах, наиболее часто развивается нарушения иммунитета, в виде угнетения фагоцитоза и клеточного звена иммунитета, а также повышение активности гуморального звена иммунитета, что приводит к развитию реактивация латентной герпетической инфекции в виде Herpes labialis, Herpes zoster, а также герпетического поражения тройничного нерва.

Теоретическая и практическая значимость. В экспериментальных лабораториях полученные нами данные могут использоваться для оценки фармакологической активности лекарственных средств по разработанной шкале оценки степени неврологического дефицита у мелких лабораторных животных при поражении центральной нервной системы. В клинической практике полученные данные представляют практическую значимость для проведения иммунологических исследований у больных с тяжелым течением инсульта, с целью ранней диагностики иммунодефицита и своевременным назначением нейропептидных средств, оказывающих нейроиммунокорригирующее действие. Полученные данные о выраженном нейропротекторном и иммунокорригирующим действии экспериментальных нейропептидных средств Т1 и Т2, являются значимыми для отечественной фармацевтической промышленности, поскольку после проведения клинических исследований, могут быть выведены на фармацевтический рынок. Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на 68-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 2003) (работа отмечена дипломом конференции); Первой научной конференции «Вклад земляков-орловцев в развитие и становление российской науки, культуры и образования (Орел, 2003) (работа отмечена дипломом конференции); Третьем Российским Конгрессом по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем», посвященная 60-летию Российской Академии Медицинских наук (Москва, 2004); XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство», посвященная 60-летию ПОБЕДЫ В ВЕЛИКОЙ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ВОЙНЕ 1941 - 1945 гг. (Москва, 2005) (работа отмечена дипломом конгресса); Открытом Российском научном конкурсе работ на лучшую научную работу студентов 2004 года по разделу «Медицинские науки» (Москва, 2005) (награжден медалью Министерства образования и науки РФ «За лучшую научную студенческую работу» по итогам открытого конкурса на лучшую научную работу студентов по естественным, техническим и гуманитарным наукам в ВУЗах Российской Федерации); 45-й межрегиональной научно-практической медицинской конференции «Повышение качества и доступности медицинской помощи - стратегическое направление развития здравоохранения» (Ульяновск, 2010); II Национальном конгрессе «Неотложные состояния в неврологии» (Москва, 2011).

Публикации по теме диссертации. Опубликовано 27 работ, из них 20 тезисов, 1 пособие для врачей, 2 Патента РФ на изобретение и 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

выводы

1. В остром периоде геморрагический инсульт сопровождается нарушением иммунного ответа и снижением функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

2. При моделировании монополушарного геморрагического инсульта в области внутренней капсулы у животных развивается нарушение иммунного ответа, которое проявляется повешением уровня гемагглютининов, снижением уровня гемолизинов, уменьшением массы тимуса и селезенки, повышением реакции гиперчувствительности замедленного типа, а также снижением функциональной активности НК-клеток селезенки, макрофагов селезенки и брюшной полости, пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов селезенки и повышением адгезивной активности перитонеальных макрофагов.

3. Установлено, что чем тяжелее степень тяжести экспериментального геморрагического инсульта, тем выражение нарушение иммунного ответа и функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

4. Использование нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга интактных животных (кортексин и церебролизин) в терапевтических дозах оказывает нейропротекторное и иммунокорректирующее действие, восстанавливая функцию нервной системы, иммунный ответ и функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

5. Применение экспериментальных нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга животных прекондиционированных инсультом (средство Т1) и родовой гипоксии (средство Т2) оказывают более выраженное нейропротекторное и иммунокорректирующее действие, чем препараты полученные из мозга интактных животных.

6. У больных с ишемическим и геморрагическим инсультом в остром периоде развивается вторичный инсульт-индуцированный иммунодефицит, который проявляется снижением количества Т-лимфоцитов, повышением уровня В-лимфоцитов и иммуноглобулинов А, М, в, а также угнетением фагоцитоза; при этом нарушения иммунитета более выраженные при геморрагическим инсультом, чем при ишемическом.

7. На фоне инсульт-индуцированного иммунодефицита у больных развиваются реактивация латентной герпетической инфекции в виде Herpes labialis, Herpes zoster, герпетического поражения тройничного нерва, персистирования вируса простого герпеса в периферической крови, а также пневмония, инфекция мочевыделительной системы, инфекционное поражение глаз, серозный менингит и пролежни.

8. Локализация очага инсульта в лимбико-ретикулярных структурах головного мозга часто приводит к развитию инсульт-индуцированного иммунодефицита, следствием чего является снижение резистентности к бактериально-вирусным инфекционным агентам и развитие инфекционно-воспалительных осложнений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Острое нарушение мозгового кровообращения является третьей причиной смерти во всем мире. В России ежегодно инсультом заболевают более 400000 человек [66]. К наиболее тяжелой форме острого нарушения мозгового кровообращения относится геморрагический инсульт, поскольку именно эта форма инсульта протекает тяжело и имеет неблагоприятный прогноз [36, 69]. Среди причин смертности, от инсульта существенную роль играют инфекционно-воспалительные осложнения, причиной развития которых является вторичный иммунодефицит, индуцированный инсультом [23, 24]. Значит, для эффективной терапии ГИ, нужно использовать методы терапии, положительно влияющие не только на нервную, но и на иммунную систему. Поскольку, из всех существующих методов лечения геморрагического инсульта, наиболее эффективным является хирургический способ, то приобретает особую важность разработка эффективных средств терапии данного заболевания [118]. В настоящей работе показано, что в условиях экспериментального ГИ возникает гибель нервных клеток в периинсультной области, а также в области сенсомоторного неокортекса. Уже через сутки после воспроизведения геморрагического инсульта у животных развивается неврологический дефицит. Нарушения реакции иммунной системы при ГИ в остром периоде проявляется на различных моделях степени тяжести инсульта. Они выражаются, поражением всех звеньев иммунной системы, снижением массы лимфоидных органов, повышением РГЗТ, повышением уровня геммаглютининов, снижением уровня гемолизинов, а также снижением функциональной активности НК-клетою селезенки, макрофагов селезенки, Т- и В-лимфоцитов селезенки и макрофагов брюшной полости. Одновременно, происходит повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов, что указывает на адаптационные способности макрофагов при их одновременной сниженной функциональной активности. В работе установленная закономерность: чем тяжелее степень тяжести инсульта, тем тяжелее степень выраженности иммунопатологических процессов. В ходе выполнения работы удалось установить, что в остром периоде инсульта у больных происходит деперессия клеточного и неспецифического звеньев иммунитета, при одновременном повышении гуморального звена иммунитета, и развитием вследствие этого инфекционно-воспалительных осложнений. Причем у всех больных с нарушением иммунного ответа вывялено распространение очага инсульта на структуры лимбико-ретикулярной системы, которая в свою очередь являются регуляторами иммунной системы организма [64]. Отмечено, что у больных помимо развития пневмонии, инфекции мочевыделительной системы, развивается реактивация латентной герпетической инфекции в виде поражения слизистых губ, тройничного нерва и опоясывающего герпеса. С другой стороны, для эффективной терапии геморрагического инсульта, в работе использовалась нейроиммунокорректирующая терапия нейропептидными препаратами (церебролизин и кортексин) направленная на коррекцию нарушений нервной системы (нейропротекторное действие) и иммунной системы (иммунокорректирующее действие). При этом использование экспериментальных нейропептидных препаратов полученных из головного мозга животных прекондиционированных инсультом (средство Т1) и родовой гипоксией (средство Т2) оказывает более выраженное нейроиммунокорректирующее действие. Значит, головной мозг при действии на него экстремальных факторов вырабатывает адаптационных молекул, которые оказывают цитопротекторное и регуляторное действие. Именно выделение данных молекул из головного мозга (средство Т1 и Т2) служит новым направлением в фармакологии, для создания нового класса лекарственных средств. ,