Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Молекулярно-клеточные механизмы геморрагического инсульта (в экспериментальном исследовании)

На правах рукописи

ХАМА-МУРАД Армаи Хамалав

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ

ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА (В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИССЛЕДОВАНИИ)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

7 ДПР ?П11

Санкт-Петербург 2011

4842072

Работа выполнена в Государственном Учреждении Российской академии наук Института физиологии им. И.П.Павлова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Николаев Валентин Иванович

доктор медицинских наук, профессор Зайчик Альберт Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Тюкавин Александр Иванович

Ведущая организация: Федеральное государственное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Министерства обороны Российской Федерации «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» (ФГВОУ ВПО МО РФ) (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

Защита состоится «....».................2011 г. в ... часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208.090.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования (ГОУ ВПО) «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

(197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6\8).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6\8).

Автореферат разослан «......»................2011 г.

Ученый секретарь иссертационного совета, доктор медицинских наук

профессор Митрейкин В.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы. Заболеваемость геморрагическим инсультом представляет собой значительную социально-экономическую проблему для современного общества. Летальность в остром периоде кровоизлияния составляет 40-50%, а инвалидизация пациентов достигает 75%. Геморрагический инсульт составляет 15% от всех инсультов в США и Европе и 20-30 % у населения в Азии. Последствия, тяжесть протекания заболевания и смертность от геморрагического инсульта значительно выше, чем при ишемическом инсульте. Основными этиологическими факторами геморрагического инсульта являются гипертоническая болезнь (в 80-85% случаев) (Quereshi et al., 2009; Taylor, Quereshi, 2009), врожденные и приобретенные артериальные и артерио-венозные аневризмы (O'Brien et al., 1999; Cheung, 2007; Gil-Nunez, Vivancos-Mora, 2005; Abasova, 2009; Schräder, 2009).

Среди больных старше 25 лет заболеваемость и смертность увеличиваются примерно в 2-3 раза с каждым последующим десятилетием. Среди выживших до 80% пациентов остаются до конца жизни инвалидами, нуждающимися в посторонней помощи и финансовой поддержке государства, а 33% - полностью зависят от помощи окружающих и остро нуждаются в длительной и дорогостоящей медико-социальной реабилитации (Одинак, Воз-нюк, 2000). Геморрагические инсульты инвариантны к полу и возрасту больных, хотя с возрастом частота заболевания возрастает, но в то же время имеет место тенденция развития геморрагического инсульта у более молодых людей, у которых присутствует более двух сопутствующих заболеваний (Lee et al., 2007; Pathak, Sloan, 2009). Особенности в уровне и образе жизни и состоянии окружающей среды, (Bejot et al., 2007), метереологические, сезонные, психоэмоциональные и циркадные ритмы (Jimenez-Conde et al., 2008) имеют большое значение в заболеваемости и смертности от геморрагического инсульта. Мозговой инсульт часто сопровождается нарушением когнитивных процессов, зрительного восприятия, наблюдаются нарушения абстрактного мышления, вербальной памяти, функции речи у подавляющего числа пациентов (60-70%) (Nys et al., 2007; Gamaldo et al, 2006).

Патофизиология геморрагического инсульта, изучаемая, в основном, в моделях in vivo, описывает изменения физиологического статуса и ряда поведенческих параметров. Остается совершенно не исследованной проблема функциональной активности нервных клеток в самые ранние периоды патологии. Известно, что процесс нейродегенерации под действием возбуждающих аминокислот, связанный с нарушением работы возбуждающих глутаматных рецепторов нейронов, является ключевым механизмом инсульта (Garthwaite, 1991; Domoki et al., 2002; Bonvento et al., 2002; Aarts et al., 2003; Kang et al., 2005; Fellin et al., 2006). Однако не известно, как кровь,

ее компоненты, продукты ее лизиса воздействуют на нейрональную активность, какова динамика нарушения электрогенеза нервной ткани, которая приводит к гибели нейронов, и, в конечном счете, разрушает деятельность мозга. Важно также представлять, каким образом артериальная гипертен-зия, которая является одним из основных факторов развития геморрагического инсульта, влияет на функционирование как механизмов электрогенеза нервных клеток мозга, так и более сложных процессов - пластических модификаций мозга.

Для того, чтобы ответить на эти и другие вопросы, были проведены электрофизиологические исследования in vitro, в которых с первого момента контакта нервной ткани с кровью on-line фиксировались изменения активности нейронов, обусловленные как возбуждающими, так тормозными механизмами. Эти модели геморрагического инсульта in vitro являются единственными в настоящее время подходами, применение которых позволило не только исследовать динамику нарушений синаптической глутама-тергической и ГАМК-эргической активности нейронов в мозге, но и активно воздействовать на них, используя протективные вещества, способные защитить процессы электрогенеза нервной ткани от блокады и разрушения.

Цель исследования: изучение молекулярно-клеточных механизмов повреждения нервных клеток при их контакте с кровью после кровоизлияния в мозг у гипертензивных крыс линии SHR, а также усовершенствование принципов защиты и восстановления функций нервных клеток после геморрагического инсульта.

Задачи исследования:

1. Используя методы электрофизиологического определения амплитуд параметров фокальных потенциалов в срезах мозга выявить различия в базисных синаптических процессах при устойчивой гипертензии. Провести сравнение базисных характеристик возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR и крыс линии Вистар, использованных в качестве контроля. Исследовать различия в развитии процессов научения в переживающих срезах мозга крыс этих линий.

2. Разработать надежные и воспроизводимые модели геморрагического инсульта, позволяющие регистрировать изменения параметров фокальных потенциалов in vitro на переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс линии SHR, происходящих как в начальный момент воздействия целой аутокрови и ее отдельных фракций, так и в отставленные периоды времени. Изучить изменения параметров возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR в первые часы контакта с кровью в моделях in vitro.

3. На основании данных о повреждениях синаптических механизмов при действии аутокрови определить срок от начала действия аутокрови до того момента, когда наступает необратимая гибель нервных клеток - «терапевтическое окно». Определить длительность «терапевтического окна» в переживающих срезах мозга при воздействии на них аутокрови.

4. Исследовать динамику развития отека в срезах обонятельной коры мозга, возникающего при моделировании геморрагического инсульта под действием сгустка аутокрови.

5. Изучить роль глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов в развитии отека в срезах мозга при действии аутокрови.

6. Используя вовлеченность глутаматэргических и ГАМКэргических ионотропных рецепторов в нарушение механизмов работы нейронов при контакте с кровью, осуществить поиск нейропротекторов эндогенного происхождения, способных протектировать функционирование этих рецепторов при геморрагическом инсульте in vitro.

7. Разработать способ определения физиологической активности в нервной системе белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа.

Научная новизна. Впервые разработаны и успешно применены в научных исследованиях 2 типа моделирования геморрагического инсульта, позволяющие исследовать молекулярно-клеточные механизмы, ответственные за повреждения нервных клеток головного мозга, опосредованные их контактом с кровью, излившейся в мозговую ткань, в ранний и поздний периоды патологического процесса (патент на изобретение № 2307396 РФ; патент на изобретение № 2340951 РФ).

Выявлены протективные эффекты веществ - дипептида ¿-карнозина (патент на изобретение № 2360295 РФ), БТШ70 (патент на изобретение № 2359337 РФ), гепарина (патент на изобретение № 2361283 РФ), а также витамина Е (патент на изобретение № 2359272 РФ), способные уменьшать отек тканей головного мозга после повреждения.

Показана роль глутаматергических и ГАМКергических синаптических рецепторов в развитии патологических процессов в нейронах ЦНС (от первых минут до 6 часов воздействия аутокрови).

Впервые для геморрагического инсульта экспериментально обоснована длительность «терапетического окна», которая составляет 6-7 часов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Изучение динамики нарушений биоэлектрической активности нейронов, происходящих в мозге в самые ранние сроки геморрагического инсульта, имеет не только важный теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования патологии в ЦНС при контакте нервной ткани с кровью, приводящее к прекращению синаптической

деятельности нейронов, дает возможность поиска путей их регуляции или компенсации, и полученные результаты могут быть использованы в целенаправленном поиске нейропротективных средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Чувствительность АМПА и НМДА подтипов глутаматных рецепторов в срезах гипертензивных крыс на естественный медиатор снижена по сравнению с чувствительностью глутаматных рецепторов в срезах нор-мотензивных крыс, что свидетельствует о десенситгоация этих рецепторов при гипертензии. Это может иметь значение в механизмах когнитивных нарушений у гипертензивных крыс.

2. При моделировании геморрагического инсульта in vitro аппликация аутокрови на срезы обонятельной коры мозга (гипертензивных) крыс оказывает негативное и необратимое воздействие на синаптическую передачу в нервных клетках, а также на АМПА и НМДА глутаматные рецепторы.

3. В развитие отека нервной ткани срезов мозга при воздействии аутокрови вовлечены ионотропные глутаматные рецепторы, модуляция активности которых специфическими антагонистами, а также рядом выявленных соединений эндогенной природы, оказывает протективный эффект.

Личное участие автора в исследовании. Автором лично выполнен объем клинических и экспериментальных исследований. Автором сформулированы цель, задачи, научно обоснованы выводы и практические рекомендации. Кроме того, соискателем лично выполнено формирование базы данных и статистическая обработка результатов исследования.

Реализация и внедрение результатов работы. Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением мо-лекулярнно-клеточных механизмов развития патогенеза инсульта на основе экспериментальных моделей и могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и нейрологии. Полученные данные рационально использовать в фармакологии при разработке протектив-ных препаратов. По материалам проведенных исследований получено 9 патентов на изобретение в Федеральном Институте Промышленной Собственности РФ (ФИПС).

Апробация работы. Материалы исследования изложены в 34 публикациях и материалах российских и международных конференций, 17 из которых в журналах рекомендованных ВАК РФ. Автором получено 9 патентов на изобретение, зарегистрированные в ФИПС.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 480 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных

исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, из них 127 отечественных и 1037 зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 20 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы и методы исследований. Переживающие срезы мозга, их характеристика, приготовление и инкубация в искусственной цереброспинальной жидкости. В данном исследовании была использована техника работы на переживающих срезах мозга, уникальные характеристические особенности которых обусловлены морфологической, физиологической и нейрохимической идентичностью среза целому мозгу (Mokrushin, Emelianov, 1991; 1993; Mokrushin, 2001; Pirumov et al., 2001). Срезы обонятельной коры характеризуются четко выраженным афферентным входом - латерального обонятельного тракта (ЛОТ), правильной 3-слойная внутрикорковой организацией, возможностью имитировать электрической стимуляцией ЛОТ поток афферентной импульсации в этих волокнах как в целом организме и одновременно регистрировать и анализировать различные, но взаимосвязанные нейрофизиологические процессы. Техническим преимуществом является возможность специфицировать инкубационную среду, рН, температуру, газовый состав, не требуется применение анестетиков и других чужеродных веществ и т.д.

Эксперименты были проведены на переживающих тангенциальных срезах обонятельной коры мозга крыс-самцов линии SHR (виварий Института физиологии им. И.П. Павлова РАН) с устойчивой гипертензией (систолическое давление 180,0 ± 7,0 мм рт. ст.) в возрасте 4-х месяцев, весом 150-180 г. В работе использовали переживающие срезы, взятые от 290 животных. В качестве контроля были исследованы такие же срезы обонятельной коры мозга крыс линии Вистар с нормальным артериальным давлением (120,0 ± 4,0 мм рт. ст.). Артериальное давление у крыс определялось при помощи манжеты с датчиками давления, укрепленной на хвосте. Переживающий срез мозга представляет собой небольшой кусочек нервной ткани, приготовленный при помощи специальных устройств (Митюшов и др., 1986; Мокрушин, Мусящикова, 1989), размером обычно 10 х 10 мм и толщиной от 100 до 500 мкм. Животных декапитировали при помощи специального ножа - гильотины. При помощи хирургических инструментов головной мозг быстро извлекался и помещался на фильтровальную бумагу, покрывающую металлический столик, охлажденный до + 4° С. Скальпелем по средней линии, мозг рассекался на две половины, аккуратно переворачивался так, чтобы обонятельная кора была сверху. Кисточкой срез переносили во флакон с искусственной цереброспинальной аэрированной жидкостью,

объемом 1 мл следующего состава (мМ): №С1 - 124; КС1 - 5,0; СаС12 - 2,6; КН2Р04 - 1,24; М^Б04 - 1,2; ИаНСОз - 3,0; глюкоза - 10; трис-НС1 -23. Раствор тщательно насыщался кислородом, температура поддерживалась на уровне 37 °С, рН - 7,2 - 7,3. Осмомолярность изотонической среды составляла 308 - 310 осм/л. Длительность всей процедуры приготовления среза от момента декапитации до его помещения в среду обычно составляла 1-1,5 мин. После помещения среза во флакон газовую атмосферу над жидкостью со срезом заменяли на кислород, продуванием в течение 1 мин. Флакон со срезом помещали в аппарат Варбурга с частотой 120 качаний в минуту и температурой 37° С, где срез преинкубировали до его помещения в регистрирующую камеру. Инкубационную среду со срезом меняли дважды через 1 и 3 часа преинкубации с тем, чтобы удалить из среды остатки разрушенных клеток и их метаболитов, после этого срезы использовали для электрофизиологического исследования.

Определение биоэлектрической активности нейронов при электрофизиологическом исследовании. Характеристика фокальных потенциалов. Биоэлектрическая активность нейронов в срезах определяли в электрофизиологической установке, которая включает в себя комплекс устройств и приборов, которые можно условно разделить на две части. Первая - предназначена для электростимуляции и регистрации нейрофизиологических процессов в срезах. Вторая - включает в себя комплекс приборов и устройств, для длительного сохранения нормальной жизнедеятельности срезов. Срезы помещались в специальной камере и непрерывно перфузиро-вались инкубационной средой со скоростью 1 мл/мин. Атмосферу над срезом в камере заменяли на увлажненный и подогретый кислород. Фокальные потенциалы (ФП), возникающие в указанных структурах при раздражении латерального обонятельного тракта (ЛОТ) имеют типичную конфигурацию. Начальное часто двухфазное колебание, является суммарным потенциалом действия ЛОТ (ПД ЛОТ). Этот потенциал отражает прохождение возбуждения по волокнам ЛОТ и является пресинаптическим компонентом ФП. Вслед за ним последовательно возникает комплекс пост-синаптических потенциалов. Первый из них суммарный возбуждающий постсинаптический потенциал (для краткости в дальнейшем - ВПСП). Он гетерогенен и состоит из раннего и отставленного компонента. При его генерации активируются АМПА подтип глутаматных рецепторов. Он обозначается как АМПА ВПСП. Выемка положительной полярности на нисходящей фазе этой волны - быстрый ТПСП (ТПСПб). Этот потенциал отражает активацию ГАМКа рецепторов. Затем регистрируется медленная волна негативной полярности, которая генерируется НМДА рецепторами, её обозначают как НМДА ВПСП. После этого потенциала вновь развивается

волна положительной полярности - медленный ТПСП (ТПСПм). Генез ТПСПм связан с активацией ГАМКБ рецепторов и кальций-зависимых калиевых токов. В работе измерялись амплитуды компонентов, составляющих ФП от изолинии до пика. Ортодромное электрическое раздражение латерального обонятельного тракта (ЛОТ) производилось стимулами прямоугольной формы, длительностью 0,1 мс, интенсивностью 1 - 3 В от стимулятора ЭСУ-1 и изолирующего блока через платиновые биполярные электроды, изолированными лаком по всей длине за исключением кончиков. Последние электролитически затачивались. Межэлектродное расстояние было 0,5 мм.

В срезах регистрировались ФП при помощи стеклянных микроэлектродов, заполненных 1 М №01 с 2 % агар-агаром, сопротивлением 1-5 мОм. Точка регистрации локализовалась в фокусе максимальной активности. При помощи шагового микроманипулятора микроэлектрод погружался на глубину 270-300 мкм от поверхности среза. Индифферентный электрод (толстая серебряная хлорированная проволока) располагался в камере в перфу-зионном растворе рядом со срезом.

Электрические сигналы с электрода подавались на выносной блок истокового повторителя усилителя биопотенциалов (НТО). Усиленный сигнал подавался на аналого-цифровой преобразователь и далее на компьютер для оперативной регистрации и обработки сигналов. Сигнал записывался на жестком диске для последующего анализа. С помощью специально разработанной программы анализировались отдельные компоненты ФП: суммарный потенциал действия волокон ЛОТ, АМПА и НМДА - компоненты ВПСП, а также поздний ТПСПм. С тем, чтобы стандартизировать условия проведения опытов, применяли элементы управляемого эксперимента.

Способы приготовления аутокрови, проведение процедуры аппликации на переживающие срезы мозга (моделирование геморрагического инсульта) и электрофизиологическое исследование. Исследования с моделированием геморрагического инсульта проведены на линии спонтанно гипертензивных крыс БНЯ. Аутологичная кровь забиралась из сонных вен крыс в процессе приготовления переживающих срезов обонятельной коры мозга. Кровь собиралась в пенициллиновые флаконы в объеме 1 - 3 мл и к ней добавляли 10 - 30 мкл гепарина (5000 ЕД/1мл) (Россия). Все флаконы помещались в холодильник и хранились при температуре + 4° С до тестирования.

Для изучения влияния компонентов крови (плазма, форменные элементы) на отдельные компоненты глутаматергической и тормозной ГАМ-Кергической синаптических передач применяли разделение крови методом центрифугирования. С этой целью была использована центрифуга ЭЛЕКОН

ЦЛМН-Р10-01 (Россия). Для отделения суммарных форменных элементов крови от плазмы использовалась скорость вращения 2000 мин-1 в течение 30 мин. Для получения фракции эритроцитов применялась скорость вращения 2500 мин"' в течение 40 - 50 мин. Полученные отдельные фракции крови хранились в холодильнике в течение 2-3 час при температуре + 4° С до начала их тестирования. При этих условиях получались три фракции: «тяжелая», «средняя» и «легкая». Микроскопический анализ этих фракций показал, что «легкая» фракция представляла собой аутогенную плазму, «средняя» фракция - взвесь тромбоцитов и лейкоцитов в плазме, с небольшим количеством эритроцитов. «Тяжелая» фракция состояла, в основном, из эритроцитарной массы.

При электрофизиологическом исследовании срез сначала в течение 15-20 мин омывали контрольной средой и в нем регистрировали ФП, вызванные электрической ортодромной стимуляцией ЛОТ (одиночные импульсы, интенсивностью 1 - 3 В, с интервалом 5 мин). Усредненная стабильная амплитуда этих ФП являлась контролем. После снятия контрольных показателей срез начинали омывать целой кровью или ее отдельными компонентами. Для определения изменений возбудимости среза в этот период в нем регистрировали ФП, возникающих при стимуляции ЛОТ электрическими одиночными импульсами с теми же параметрами, как и в контроле. Исследовали действие аутокрови при разных разбавлениях: была использована целая кровь, а также инкубационная среда, с содержанием крови 30, 20, 10, 6 и 1 процента от объема. Этими растворами перфузировали срез мозга в течение 25 - 40 мин, продолжая регистрировать вызванные ФП. Подача кислорода к срезу в это время прекращалась. Затем срезы отмывали в течение 15 мин и продолжали регистрировать параметры ФП, при этом перфузию срезов осуществляли нормоксическим раствором. При изучении эффектов отдельных компонентов крови отдельные фракции аутокрови растворялись в инкубационной среде в соотношении: 50 мл среды + 1,5 мл кровь. Этим раствором перфузировали переживающий срез в течение 25 - 40 мин, продолжая регистрировать вызванную биоэлектрическую активность клеток. Исходные параметры ФП сопоставляли с их параметрами при аппликации целой, разбавленной аутокрови и отдельных ее компонентов, определяя степень повреждения механизмов электрогенеза. Сравнение исходных параметров ФП с параметрами после отмывания позволяло оценить возможность восстановления биоэлектрической активности нервных клеток в период раннего воздействия крови на нейроны (первые 40 мин).

Применение другого способа моделирования геморрагического инсульта позволяло исследовать биоэлектрическую активность нейронов при контакте с кровью (сгустком крови) в срок до 7 часов. При этом срезы

обонятельной коры гипертензивных крыс после приготовления помещали в стеклянные сосуды с аутокровью (без гепарина) объемом 1 мл, где они находились в течение 60 - 420 мин. В определенные интервалы времени (60, 120, 180, 240, 300 и 360 мин) срезы извлекали из аутокрови и помещали в перфузионную камеру. Срезы отмывали инкубационной средой от аутокрови и в них регистрировали ФП, вызываемые электрической стимуляцией проксимального конца ЛОТ. Сопоставляя параметры активности клеток после воздействия аутокрови с их контрольными значениями (без воздействия крови), полученными на отдельной группе срезов, определяли степень повреждения нейронов и оценивали возможность их восстановления.

Для изучения возможных протективных эффекта гепарина переживающие срезы обонятельной коры мозга выдерживали с гепарином натрия (2,5 мл гепарина в концентрации 5000 ЕД /мл на 50 мл инкубационной среды) в течение 15 мин. Затем среду со срезом заменяли на аутокровь объемом 3 мл для моделирования геморрагического инсульта, в которой они находились в течение 360 мин. После этого срезы помещали в перфузионную камеру для отмывания их от аутокрови и для регистрации компонентов ФП, возникающих в ответ на электростимуляцию ЛОТ.

Исследование динамики развития отека нервной ткани при контакте с кровью. Ввиду того, что срезы мозга при нахождении в инкубационной среде и нормальной оксигенации раствора увеличивают свой вес (Митюшов и др., 1986; Brahma et al., 2000; Hrabetova et al., 2002), мы первоначально определяли набухание срезов в контрольной и нормоксической среде при 37° С в течение 360 - 420 мин и сравнили два использованных нами способа определения набухания срезов (Митюшов и др., 1986; Hrabetova et al., 2002). Различия в значениях набухания с использованием двух методов оказалось недостоверным, степень набухания срезов с использованием первого метода составляла в среднем 8,1 % и 11,2 % - второго. Поэтому в дальнейших использовали упрощенный способ, когда срезы, взятые в разные интервалы времени, обсушивались в течение 1-2 с на фильтровальной бумаге и взвешивались на торсионных весах типа ВТ-500. Процедура взвешивания занимала не более 10 с. Далее срезы вновь помещались в виалы с контрольной инкубационной средой на разные интервалы времени или в виалы, содержащие 1 мл аутокрови (без гепарина), на те же сроки потом извлекались из виал, обмывались контрольной средой, обсушивались на фильтровальной бумаге и вновь взвешивались. Набухание срезов определялось по разнице веса среза после инкубации в аутокрови и веса среза после инкубации в контрольной среде (мг).

Для изучения вовлечения глутаматных рецепторов в процесс набухания (развития отека) в срезах обонятельной коры после инкубации с аутокровью были использованы специфические блокаторы АМПА глутаматных

рецепторов - DNQX (6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione - селективный блока-тор этих рецепторов), НМДА рецепторов (25 мкМ) и APV (Z,-(+)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid, L-(+)-2-amino-5-phosphonovaleric acid) (50 мкМ) и метаботропных глутаматных рецепторов подтипа mGlu 1,5- MCPG [(+)-а-methyl-(4-carboxyphenylgycine)] в концентрации 100 мкМ (Sigma). Для этого срезы предварительно инкубировали в среде того же состава с добавлением блокаторов в течение 15 мин и далее помещали в аутокровь на определенные сроки времени.

Для изучения противоотечных эффектов естественных антиоксидан-тов в модели геморрагического инсульта были исследованы витамины: витамин Е (альфа-Токоферол-ацетат)(0,7 мг/мл), витамин С (аскорбиновая кислота) в концентрации 1,2 мг/мл и витамина Д (акваДетрим) (0,5мл -15000 ЕД).

Кроме того, исследовали противоотечное действие ¿-карнозина (Sigma или Fluka) (в концентрации 5 мг на 1 мл инкубационной среды) и БТШ70 концентрации 1 мкг/мл. Для этого переживающие срезы обонятельной коры мозга выдерживали с данными соединениями в течение 30 мин, а затем помещали в аутокровь на 360 мин.

Статистическая обработка осуществлялась применением методов непараметрической статистики (Гублер, Генкин, 1969) с использованием U-критерия Вилкоксона-Манн-Уитни, а также статистической компьютерной программы Excel 2003.

Результаты исследований и их обсуждение. Анализ функционирования глутаматергической и гамкергической синаптических систем в обонятельной коре гипертензивных крыс в сравнении с нормотензивными крысами. Для достижения поставленных в работе задач были использованы спонтанно гипертензивные крысы линии SHR. Эти животные также используются в качестве экспериментальной модели для изучения известного клинического феномена - дефицита внимания у детей с ювенильной гипер-тензией. Крысы этой линии характеризуются тем, что устойчивая гипертен-зия у них формируется в возрасте 3-4 недель, и высокие показатели систолического и диастолического артериального давления стабильно удерживаются на протяжении всей жизни. Устойчивая гипертензия в значительной степени влияет на функционировании различных отделов мозга и является одной из главных причин возникновения ишемических и геморрагических инсультов мозга. В настоящей работе проведено сравнение базисных характеристик возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМК-эргической синаптических трансмиссий в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR и крыс линии Вистар, использованные в качестве контроля. Кроме того, были исследованы эффекты, вызываемые аппликацией I-глутамата, а также развитие процессов научения в переживающих срезах мозга крыс этих линий.

Отдельная группа срезов обонятельной коры мозга нормальных и гнпертензивных крыс была использована для исследования эффектов экзогенной аппликации ¿,-глутамата (Sigma, США) в концентрации 1 мМ, которая, как показали специально проведенные эксперименты, индуцирует небольшую, но стабильную активацию глутаматных рецепторов, не вызывая токсических реакций нервных клеток (Мокрушин и др., 2005).

ФП в срезах обонятельной коры мозга гнпертензивных крыс в сравнении с нормотензивными крысами. Были установлены различия как по активности механизмов глутаматергической возбуждающей передачи, так и по активности ГАМКБ-зависимого тормозного механизма (рис. 1). По сравнению с ФП нормотензивных крыс в срезах крыс линии SHR регистрировались ФП с кратковременным АМПА компонентом ВПСП, который к тому же имел достоверно меньшую амплитуду, чем ФП нормотензивных крыс. НМДА компонент ВПСП гнпертензивных крыс был в два раза меньшей амплитуды и большей длительности, чем НМДА компонент ВПСП в срезах нормотензивных крыс. Амплитуда ТПСПм в срезах гнпертензивных крыс имела в два раза большую величину, и эти различия были достоверны.

Рис. 1. Фокальные потенциалы, регистрируемые в срезах обонятельной коры мозга гнпертензивных и нормотензивных крыс.

Пунктирная линия - изолиния. * - ответ глиальных клеток.

Существенной отличительной особенностью ФП гипертензивных крыс было наличие позднего негативного потенциала с амплитудой 60 мкВ, который возникал после завершения ТПСПм. Этот потенциал при действии кратковременной аноксии (1-2 мин) исчезал. По этой характеристике, а также по латентному периоду генерации этого потенциала и его амплитудно-

0,1 мВ

10 мс

-гипертензивные

----нормотензивные

*

временным параметрам его можно рассматривать как проявление активности глиальных клеток обонятельной коры. Следует отметить, что в срезах нормотензивных крыс такой потенциал не регистрировался. Эти данные свидетельствуют о значительном возбуждении при гипертензии не только нейронов, но и глии.

Чувствительность глутаматных рецепторов в срезах обонятельной коры мозга гипертензивиых крыс также имеет свои отличия. В обонятельной коре мозга основным возбуждающим медиатором является ¿-глутамат. Были проанализированы реакции отдельных компонентов глу-таматергической синаптической передачи на аппликацию ¿-глутамата в концентрации 1 мМ в срезах гипертензивиых и нормотензивных крыс. Аппликация ¿-глутамата на срезы нормотензивных крыс сопровождалась небольшим увеличением амплитуды АМПА ВПСП (без изменения его длительности), и возрастанием, как амплитуды, так и длительности НМДА ВПСП. Эти реакции свидетельствуют о нормальной чувствительности АМПА и НМДА подтипов глутаматной синаптической передачи к натуральному медиатору в нервной системе нормотензивных крыс.

В срезах гипертензивиых крыс реакции ФП на аппликацию Ь- менялись на противоположные, по сравнению с ФП нормотензивных крыс. 1-глутамат вызывал снижение амплитуды, как АМПА, так и НМДА компонентов ВПСП глутаматергической передачи. Причем НМДА ВПСП "отделялся" от АМПА ВПСП глубокой выемкой, появление которой указывает на активацию прямого торможения в кортикальных структурах, опосредуемого активацией ГАМКД механизмов (Мокрушин, 1997). Кроме того, сам НМДА ВПСП "делился" на две части, что, вероятно, свидетельствует об активации двух разных популяций НМДА рецепторов, ответственных за генерацию НМДА ВПСП. Более того, такие изменения профилей НМДА ВПСП могут указывать на то, что для гипертензивиых крыс используемая концентрация экзогенного 1-глутамата становится избыточной.

Полученные факты доказывают, что чувствительность АМПА и НМДА подтипов глутаматных рецепторов в срезах гипертензивиых крыс на естественный медиатор снижена по сравнению с чувствительностью глутаматных рецепторов в срезах нормотензивных крыс, то есть развивается де-сенситизация этих рецепторов. По-видимому, мозг гипертензивиых крыс имеет более низкий потенциал для трансляции сигналов по глутаматергиче-ским структурам, по сравнению с мозгом нормотензивных крыс. Следовательно, протекание процессов научения и, вероятно, формирования памяти у гипертензивиых крыс будет ухудшаться.

М. Лехохла и соавторы (ЬеЬоЫа е1 а1., 2001) обнаружили, что поглощение ионов кальция кортикальными нейронами в срезах мозга БНЯ крыс

было меньшим, чем в срезах мозга крыс линии Вистар. Эти данные подтверждают наши результаты об ухудшении функционирования НМДА рецепторов в мозге гипертензивных крыс.

Однако впоследствии было выявлено, что аппликация агониста НМДА рецепторов - N- метил-£>-аспартата, сопровождалась одинаковыми трансмембранными потоками кальция в кортикальных нейронах у крыс обеих линий (Lehohla et al., 2004), что указывает на одинаковый уровень функционирования НМДА рецепторов в обеих линиях крыс, тогда как аппликация глутамата в наших экспериментах сопровождалась снижением активности этих рецепторов. Более того, в отличие от наших данных аппликация глутамата на срезы префронтальной коры мозга SHR крыс индуцировала большую активацию АМПА рецепторов, по сравнению с нормо-тензивными крысами (Rüssel, 2001), а в наших экспериментах такое воздействие приводило к снижению активности этих рецепторов.

Такие противоречия могут быть объяснены тем, что на начальной стадии развития гипертензии негативные изменения функционирования АМПА и НМДА рецепторов еще не являются необратимыми. Нестабильностью возникающих отрицательных изменений в деятельности нейрональных структур можно объяснить факт выделения в равных количествах глутамата и ГАМК из синапсов кортикальных нейронов в мозге крыс линии SHR и линии Вистар. Однако с возрастом негативные проявления функций НМДА как, очевидно, и других рецепторов, стабилизируются. Молекулярной основой таких нарушений, как можно полагать, являются изменения в экспрессии и обмене отдельных белковых компонентов рецепторных структур. НМДА рецептор является тетрамерным белковым комплексом, состоящим из нескольких субъединиц. Установлено, что экспрессия главных субъединиц НМДА рецепторов оказалась сниженной в кортикальных структурах крыс линии SHR по сравнению с этими же мозговыми структурами крыс линии Вистар. Причем с возрастом отмечается тенденция к дальнейшему снижению экспрессии главных субъединиц НМДА комплекса в мозге у крыс линии SHR по сравнению с линией Вистар (Edwards et al., 2004).

ТПСПм в срезах мозга SHR крыс также изменялись под действием экзогенного ¿-глутамата. Амплитуда этих потенциалов снижалась в два раза и достоверно сокращалась их длительность по сравнению с таковыми у нормотензивных крыс. Эти факты можно интерпретировать как развитие десенситизации глутаматных рецепторов, локализованных на вставочных тормозных интернейронах, обеспечивающих генерацию ТПСПм.

Активность глиальных клеток, измеряемая по наличию и амплитуде позднего негативного потенциала, в ответ на аппликацию L-глутамата возрастала на 105% по сравнению с изменением активности этих клеток на

электрическую стимуляцию без действия глутамата. Это, безусловно, указывает на то, что активация глиальных клеток направлена против глутамат-ной эксайтотоксичности, развивающейся в мозге гипертензивных крыс.

При отмывании срезов от I-глутамата наблюдалось восстановление параметров АМПА ВПСП и достоверное увеличение на 75 % амплитуды и длительности НМДА ВПСП. Вместе с тем амплитуда ТПСПм не восстанавливалась, а сохранялась такой же, как и при действии ¿-глутамата, что, вероятно, свидетельствует о необратимом нарушении функционирования части ГАМКБ-эргических тормозных нейронов.

Активность глиальных клеток при отмывании снижалась на 87 %, что, вероятно, говорит об обратимости нарушений. Все это свидетельствует о важной роли глии в сохранении устойчивости нервной ткани.

Развитие долговременной посттетанической потенциации (ДПП) в срезах мозга гипертензивных крыс. Выраженные реакции глутаматер-гической синаптической передачи в срезах спонтанно гипертензивных крыс на действие экзогенного ¿-глутамата дали основание полагать, что пластические свойства клеток и синаптических передач в них будут отличаться по этим характеристикам от нормотензивных крыс. Для этого, было исследовано развитие ДПП, которая рассматривается как модель неассоциативного научения и формирования памяти (Bliss, Colingridge, 1993).

ЛОТ в срезах мозга как нормотензивных, так и гипертензивных крыс подвергался кратковременной электрической тетанизации с частотой 100 Гц, длительность пачек 5 с, межимпульсный интервал 5 с в течение 25 с. Затем в течение 81 мин регистрировались изменения амплитуд НМДА компонента ВПСП, который, как принято считать, отражает развитие по-тенциированного состояния глутаматергической передачи (рис. 2).

Выявлено, что развитие ДПП в срезах мозга гипертензивных крыс существенно отличается от ДПП нормотензивных крыс. Скорость развития фазы индукции ДПП в срезах гипертензивных крыс была медленнее. Уровень максимальной потенциации был на 27 % достоверно ниже, чем в срезах нормотензивных крыс. Время возникновения максимального потенции-рованного состояния в срезах этих крыс сокращалось на 9 мин. Самое существенное отличие в развитии ДПП заключалось в том, что потенциация была кратковременной и длилась в среднем 33 мин, а далее трансформировалась в длительную депрессию с амплитудой снижения ответов на 32 % от исходной величины до тетанизации.

Эти данные свидетельствуют о том, что процессы позитивного научения в популяциях клеток гипертензивных крыс редуцированы. Более того, развитие депрессии после кратковременной потенциации указывает на возрастание процесса "забывания" в кортикальных структурах гипертензивных

крыс и блокирование нормального научения. Возможно, ухудшение процессов научения в нашей модели является нейрофизиологическим коррелятом ухудшения обучения у детей с ювенильной гипертензией, как и у

время (мин)

Рис. 2. Развитие посттетанической потенциации в срезах мозга нормотензивных и гипертензивных крыс.

По оси абсцисс: К - контроль, стрелка - тетанизация (частота 100 Гц, длительность пачек 5 с с интервалом 5 с), время - мин. По оси ординат: амплитуда НМДА ВПСП, % к контролю.

Таким образом, впервые получены данные демонстрирующие, что спонтанная гипертензия модифицирует активность глутаматергической возбуждающей и ГАМКергической тормозной синаптических передач в кортикальных структурах, то есть устойчивая гипертензия вызывает отчетливые нейротропные эффекты. Эти изменения возникают в организме не сразу, а формируются по мере развития длительной гипертензии, при переходе ее в хроническую форму. Особенно выразительные нейротропные изменения были выявлены для НМДА подтипов глутаматных рецепторов. Снижение их активности при гипертензии свидетельствует о нарушении кальциевого обмена между внутриклеточной и экстраклеточной средой.

Нарушения нормального функционирования отдельных подтипов глутаматных рецепторов, индуцируемые устойчивой гипертензией, свидетельствуют, во-первых, об ухудшении трансляции сенсорных сигналов, осуществляемых через глутаматергические рецепторы; во-вторых, о нарушении процессов научения и формирования памяти. Очевидно, эти процессы лежат в основе известного клинического феномена - дефицита внимания и ухудшения научения у людей с выраженной артериальной гипертензией. В основе таких негативных изменений лежат процессы, вызываемые "мягкой" эксайтотоксичностью, индуцируемой устойчивой гипертензией.

Мы полагаем, что эти процессы развиваются следующим образом. Формирование устойчивой гипертензии индуцирует нарушение кровоснабжения структур головного мозга, причем в первую очередь поражаются мелкие артерии. Такие изменения стимулируют формирование гипоксиче-ских/ишемических условий деятельности мозговых структур. Как следствие этого в мозге происходит гиперактивация НМДА рецепторов, но она имеет не импульсивный, а тонический, длительный характер, происходит длительное воздействие избытка внеклеточной концентрации глутамата.

Именно такое небольшое, но постоянно избыточное количество глутамата присутствует в мозге и вызывает слабую, но перманентную гиперактивацию глутаматных рецепторов на разных нейронах, по механизму объемной передачи амакринным и паракринным способами (Мокрушин и др., 2005). Это приводит к дисфункции синаптической передачи, поскольку снижается такой принципиальный показатель ее деятельности как соотношение сигнал/шум. Если не проводить превентивную терапию, то такая устойчивая гиперактивация НМДА рецепторов, в конечном счете, ведет к повреждению и гибели наиболее уязвимых нейронов, не способных справиться с этой ситуацией, а в итоге приводит к развитию устойчивого дефицита биоэлектрической активности нейронов.

Анализ функционирования глутаматэргической и гамкэргиче-ской синаптических систем в обонятельной коре гнпертензивных крыс в первые минуты воздействия крови при моделировании геморрагического инсульта in vitro. Разработка моделей геморрагического инсульта. В настоящем исследовании осуществлена разработка модели геморрагического инсульта in vitro с высокой надежностью при ее воспроизведении, которая позволяет изучать молекулярно-клеточные механизмы повреждения нервной ткани, обусловленные нарушениями синаптических рецеп-торных систем. Применение этой модели позволяет тестировать вещества, способные защитить и восстановить функционирование нервных клеток, подвергшихся воздействию кровоизлияния, что необходимо для поиска и испытания эффективных протективных антигеморрагических препаратов.

В настоящее время известны способы моделирования геморрагического инсульта in vivo путем ультразвукового воздействия, введения ауто-логичной крови или ее отдельных компонентов, а также бактериальной коллагеназы в различные структуры мозга целого животного под давлением. Однако, известные к настоящему времени способы, имеют следующие недостатки: высокая летальность животных (80 % и выше) в ранние сроки из-за проникновения значительного количества крови в мозговые желудочки, что вызывает повреждение, зачастую необратимое, структур мозга, находящихся дистально от места введения аутокрови. Кроме того, в мозге нарастает компрессия за счет введения аутокрови под давлением, это приводит к сдавливанию и повреждению кровеносных сосудов, питающих другие структуры мозга, то есть картина геморрагического инсульта усложняется процессами ишемического поражения структур мозга. Неопределенность локализации пораженных структур мозга при моделировании геморрагического инсульта, возникающая вследствие присоединения общемозговых симптомов (глутаматэксайтотоксические, ишемические и др.) в результате ретроградных проникновений избытка крови вдоль инъекционной иглы под мозговые оболочки, не позволяет исследовать уровень активности нейронов в первые часы воздействия.

При моделировании геморрагического инсульта in vitro аутокровь апплицировалась на срез мозга, который находился в электрофизиологической установке, что позволило с первых секунд наблюдать изменения пре-и постсинаптических компонентов ФП в режиме on-line. Этот подход отличается от способа моделирования in vivo по следующим характеристикам:

1. Позволяет достичь 100 % уровня повторяемости, тогда как в прототипе она снижена до 60 - 80% за счет летальных исходов экспериментальных животных;

2. Величина поражения мозга от действия аутокрови стандартна, в прототипе - неконтролируема и варьирует от одного животного к другому;

3. Отсутствует травматический (механический, компрессионный) компонент воздействия на клетки мозга, в прототипе он является значительным или даже доминирующим;

4. Позволяет выявить последовательность нарушений нормального функционирования базисных механизмов нервной ткани при геморрагическом инсульте, в прототипе это чрезвычайно затруднено;

5. Позволяет упростить возможность тестирования фармакологических препаратов для защиты нервных клеток от разрушающего действия аутокрови;

6. Метод позволяет стандартизировать условия возникновения геморрагического инсульта, повысить до 100 % воспроизводимость модели и выявить молекулярно-клеточные механизмы, сопровождающие развитие геморрагического инсульта.

На описанный способ моделирования геморрагического инсульта in vitro получен патент на изобретение в ФИПС: Мокрушин A.A., Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., Смирнова Г.П. «Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта» № 2307396, опубликовано 27.09.2007, Бюл. М> 27.

Динамика изменений механизмов электрогенеза в срезах при аппликации целой крови (первые 40 мин воздействия). В экспериментах было исследована биоэлектрическая активность нейронов в начальный период при моделировании тотального кровоизлияния. Для этого срезы подвергались действию целой крови. Аутокровь индуцировала выраженную депрессию постсинаптических процессов, которая начиналась спустя 1-2 мин, а через 20 - 25 мин все постсинаптические механизмы были блокированы. Функционирование проводящих волокон ЛОТ оказалось более устойчивым: амплитуда ПД ЛОТ при действии аутокрови сохранялась на уровне 5 % от исходной величины. При отмывании восстановления активности возбуждающих и тормозных постсинаптических механизмов не происходило. Активность волокон ЛОТ при отмывании восстанавливалась до уровня 27% от контроля.

Полученные данные показали, что при контакте нейронов с кровью при имитации тотального инсульта происходит угнетение и блокаде возбуждающих глутаматергических и тормозных ГАМК-эргических механизмов электрогенеза.

Для того, чтобы понять динамику изменений механизмов электрогенеза под действием компонентов крови был использован прием разбавления крови в перфузионном растворе. Было исследовано действие аутокрови, количество которой в перфузионной среде составляло 6 мл на 100 мл среды. Через 5 мин после начала перфузии средой с кровью регистрировали увеличение, по сравнению с исходными, амплитуд ПД ЛОТ, АМПА и НМДА ВПСП. ТПСПм был заблокирован. Эти изменения амплитуд компонентов ФП свидетельствуют об усилении возбуждающих и блокаде тормозных процессов. На 10-й мин было зарегистрировано снижение амплитуд АМПА и НМДА ВПСП, отсутствовал ТПСПм, а на нисходящей фазе НМДА ВПСП появились спонтанные эпилептиформные разряды, что свидетельствует о возникновении эпилептического состояния в нервных клетках, подвергнутых действию аутокрови. К 40-й мин была зарегистрирована блокада механизмов электрогенеза АМПА и НМДА ВПСП. Примерно вдвое снизилась амплитуда ПД ЛОТ. ТПСПм были ингибированы. В этот период времени ЭР были апериодичными и редкими.

Восстановление параметров отдельных компонентов ФП до исходных после отмывания не происходило, что свидетельствует о необратимости негативного воздействия целой аутокрови, находящейся в перфузион-ном растворе, на нервные клетки и синаптическую передачу.

При тестировании более высоких количеств аутокрови в перфузион-ной среде: 10 мл, 20 мл и 30 мл на 100 мл были получены результаты аналогичные тем, что получены при испытании аутокрови в количестве 6 мл на 100 мл. Отличие заключалось в том, что скорость блокирования механизмов электрогенеза в ткани срезов зависела от количества аутокрови: чем концентрация крови была больше, тем быстрее наступала блокада механизмов электрогенеза. По-видимому, существует концентрационный порог токсического действия крови на механизмы электрогенеза в кортикальных структурах.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что действие аутокрови на нервные клетки, синаптическую передачу и проводящие волокна оказывает негативное и необратимое воздействие. Аутокровь в кортикальных структурах индуцирует последовательный каскад событий, приводящих к нарушению их нормального функционирования. Необратимость воздействия аутокрови на нервные клетки свидетельствует о том, что механизмы, ответственные за генерацию отдельных компонентов их функционирования нарушены необратимо. Эти данные можно расценить как нейрофизиологический коррелят обширного кровоизлияния, возникающего при геморрагическом инсульте.

Представляло интерес выяснить при действии какой объемной концентрации крови функционирование глутаматергических и ГАМК-эргических механизмов сохранится.

Уменьшение количества аутокрови (1 мл аутокрови в 100 мл перфу-зионной среды) выявило несколько иную картину функционирования отдельных механизмов электрогенеза нервных клеток, чем при высоких концентрации крови (рис. 3). Сначало происходило увеличение амплитуд АМ-ПА и НМДА ВПСП, а также возрастание амплитуды ПД ЛОТ по сравнению с контролем. Тормозный потенциал - ТПСПм исчезал. На нисходящей фазе НМДА ВПСП возникали ЭР. Все эти модификации компонентов ФП указывают на повышение уровня возбудимости в нервных клетках под действием аутокрови. На 10-й мин амплитудные характеристики уменьшились, но апериодические ЭР сохранились. При продолжающемся воздействии аутокрови происходило уменьшение, по сравнению с исходными, амплитуд АМПА и НМДА ВПСП, но полной блокады механизмов их генерации не наблюдалось. ЭР возникали, но были редкими. После отмывания восстановление исходных параметров ФП не происходило.

Рис. 3. Изменения фокальных потенциалов под действием аутокрови в меньшей концентрации - 1, 0 мл крови в 100 мл инкубационной среды.

Цифры: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 - 5, 10, контроль, 20, 30, 40, отмыв 30 мин, соответственно. Горизонтальная Пунктирная линия - изолиния. ЭР - эпилептиформ-ные разряды. Калибровка: 0,1 мВ, 10 мс.

Данные результаты указывают на то, что низкие количества аутокрови, воздействующей на нервные клетки, не приводят к необратимым и полностью разрушающим действиям аутокрови на нервные структуры. Это может быть рассмотрено, как нейрофизиологический коррелят клинического микроинсульта, а также свидетельствует о том, что наиболее подверженными разрушающему действию крови являются нейроны, с которыми кровь контактирует непосредственно.

Отдельные механизмы электрогенеза проявляют различную толерантность к разрушающему действию крови. Наиболее устойчивыми оказались проводящие волокна ЛОТ (вероятно, медленнопроводящие). Менее устойчивыми были АМПА-зависимые механизмы глутаматергической си-наптической передачи. Самыми "слабыми" были НМДА- и ГАМКБ-зависимые механизмы. Значение этих данных в том, что они указывают на молекулярно-клеточные мишени, которые в первую очередь должны быть защищены от разрушающего действия крови.

Исследование эффектов различных фракций аутокрови на механизмы электрогенеза в переживающих срезах. Для того, чтобы исследовать, как при развитии геморрагического инсульта аутоплазма или эритроци-тарная составляющая крови действует на базисные параметры электрогенеза

нервных клеток, были исследованы нейротропные эффекты отдельных фракций аутокрови. С этой целью при перфузии переживающих срезов обонятельной коры мозга крыс разными фракциями аутокрови с последующим отмыванием в режиме on-line были исследованы изменения амплитуд отдельных компонентов вызванных ФП. Были протестированы три фракции аутокрови: «легкая», «средняя» и «тяжелая».

«Легкая» фракция индуцировала два типа реакции в срезах мозга. Наиболее часто в срезах возникали ЭР. Латентный период их возникновения составлял 1 - 3 мин. Они были апериодичными, негативно-позитивной формы или с частыми и быстрыми высокоамплитудными разрядами. ЭР продолжались в течение всего времени воздействия «легкой» фракции аутокрови на срезы. После отмывания в течение 15-20 мин ЭР прекращались и при стимуляции ЛОТ было существенное увеличение амплитуд постси-наптических компонентов как возбуждающих (АМПА и НМДА ВПСП), так и тормозных (ТПСПм), что свидетельствует об увеличении возбудимости нервных клеток срезов (табл. 1).

Таблица 1

Изменение параметров отдельных компонентов ФП при аппликации «легкой» фракции аутокрови на переживающие срезы обонятельной коры мозга крыс линии SHR

Компоненты Аппликация «легкой»

ФП (мкВ) Контроль фракции аутокрови Отмывание

ПД ЛОТ 295,0 ± 10,0 3,0 ± 1,0 279,0 ± 16,0

АМПА ВПСП 187,0 ±9,0 0 170,0 ±5,0

НМДА ВПСП 67,0 ± 12,0 0 42,0 ± 11,0

ТПСПм 23,0 ±7,0 0 17,0 ±6,0

В другой группе срезов реакции на «легкую» фракцию выражались в блокаде всех постсинаптических компонентов ФП и значительном снижении амплитуды пресинаптического компонента - ПД ЛОТ. Отмывание срезов сопровождалось достаточно быстрым восстановлением активностей АМПА, НМДА глутаматергических механизмов, а также тормозных процессов - ТПСПм. Таким образом, вещества, содержащиеся в «легкой» фракции аутокрови или увеличивают возбудимость нейронов и индуцируют эпилептическое состояние в срезах, или вызывают обратимую блокаду механизмов электрогенеза клеток. Оба вида реакции в срезах выявляются только при воздействии этой фракции аутокрови, а после отмывания устраняются, то есть являются обратимыми. Можно полагать, что обнаруженные реакции являются неврологическими коррелятами легкой, транзиторной формы геморрагического инсульта, наблюдаемого в клинике в тех случаях

когда в паренхиму мозга из кровеносных сосудов изливается плазма ауток-рови. При этом у больных развивается повышенная возбудимость в пораженных участках мозга и развиваются эпилептоподобные состояния. В ряде случаев больные испытывают сильную депрессию. Все эти явления через несколько часов после такой инсультной атаки проходят.

«Средняя» фракция. Вещества, содержащиеся в данной фракции, всегда вызывали однотипные реакции в срезах мозга - возникновение ЭР. ЭР самопроизвольно прекращались через 8-10 мин от момента начала действия этой фракции, но вновь появлялись с 15 мин и продолжались на протяжении всего оставшегося времени действия данной фракции аутокрови.

После отмывания амплитуды отдельных компонентов ФП восстанавливались, но не полностью. Вероятно, это свидетельствует об активации эндогенных механизмов, направленных на понижение уровня гипервозбудимости в срезах, вызванных действием веществ «средней» фракции.

Таким образом, «средняя» фракция воздействует на механизмы элек-трогенеза нервных клеток, что повышается их общий уровень возбудимости и это приводит к развитию эпилептического состояния в срезах мозга. Однако эти изменения электрогенеза обратимы и после отмывания они прекращаются.

«Тяжелая» фракция была протестирована в концентрации 1 мл в 100 мл перфузионной среды + 0,5 мл гепарина. Через одну минуту после действия «тяжелой» фракции аутокрови появлялись спонтанные ЭР. Они были апериодичными, различной амплитуды и длительности. ЭР продолжались в течение 2-3 мин. С третьей мин ЭР исчезали и все постсинапти-ческие компоненты ФП были заблокированы. Амплитуда пресинаптическо-го компонента ФП - ПД ЛОТ была значительно угнетена и составляла 1 - 2 % от исходной величины. После отмывания в течение 15-20 мин амплитуды как постсинаптических так и пресинаптического компонентов ФП восстанавливались (табл. 2).

Таблица 2

Изменение механизмов электрогенеза в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс при их инкубации в «тяжелой» фракции аутокрови

Компоненты ФП (мкВ) Контроль Аппликация "тяжелой" фракции аутокрови Отмывание

ПДЛОТ 295,0 ±9,0 12,0 ±3,0 279,0 ± 12,0

АМПА ВПСП 187,0 ±7,0 0 171,0 ± 11,0

НМДА ВПСП 67,0 ± 5,0 0 54,0 ±8,0

ТПСПм 23,0 ±2,0 0 17,0 ±6,0

Таким образом, поскольку амплитуды отдельных компонентов ФП восстановились после действия «тяжелой» фракции аутокрови, то это указывает на то, что вещества, содержащиеся в этой фракции аутокрови, во время своего действия вызывали угнетение активностей глутаматергической и ГАМК эргической синаптических механизмов, и эта депрессия была обратимой.

Эффекты гепарина на действия аутологичной крови в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс. При

тестировании «тяжелой» фракции аутокрови на переживающих срезах было замечено, что эта фракция аутокрови лишь в 75 % необратимо блокирует электрогенез. А в 25 % исследованных срезах блокирование наступало в отставленные интервалы времени (40 - 70 мин). Поскольку в таких экспериментах использовался гепарин, то было высказано предположение, что именно он осуществляет "протективный" эффект от разрушающего действия «тяжелой» фракции аутокрови. Для проверки этого предположения были проведены исследования нейротропных эффектов гепарина без аутокрови как возможного антигеморрагического препарата. Было изучено его действие на биоэлектрическую активность нервных клеток мозга в условиях длительного воздействия крови.

Преинкубация срезов с гепарином (2,5 мл гепарина натрия (5000 ЕД/мл) в 50 мл инкубационной среды) не изменяла амплитудные характеристики возбуждающих и тормозных механизмов электрогенеза в контрольных опытах. Однако наблюдалась пролонгация длительности постсинаптических процессов как возбуждающих, так и тормозных. Так, длительность АМПА ВПСП увеличивалась в среднем на 16 %, длительность НМДА ВПСП возрастала на 27 %. Активация тормозных ГАМКБ-эргических процессов ТПСПм в пролонгировалась среднем на 23 %. Отсутствие влияния гепарина на амплитуды отдельных компонентов ФП свидетельствует о его возможности выполнять протективную функцию, вероятно, стабилизируя механизмы электрогенеза.

В следующей серии экспериментов была изучена возможная защитная роль гепарина натрия в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс при моделировании геморрагического инсульта. Предварительная инкубация срезов в растворе с гепарином и последующим действием на них аутокрови проявлялась в том, что сохранялись неповрежденными исследованные механизмы электрогенеза. Протекция тормозных механизмов была на уровне 75 % от первоначальных данных до действия аутокрови, тогда как при контакте срезов с аутокровью (360 мин) происходит блокирование всех постсинаптических механизмов электрогенеза, сохраняются лишь активности в проводящих волокнах ЛОТ.

Таким образом, представленные данные доказывают, что предварительное воздействие гепарином на нервные клетки срезов мозга защищает их функционирование от разрушающего действия аутокрови в модели геморрагического инсульта in vitro. Следовательно, гепарин выполняет функцию нейропротективного вещества при развитии негативных последствий геморрагического инсульта в эксперименте. На основании проведенных исследований можно полагать, что помимо основного антикоагулянтного действия профилактическое применение гепарина у гипертензивных больных может оказывать выраженный нейротропный эффект. Эти результаты следует принимать во внимание при стратегии профилактики и лечения инсульта при гипертензии.

С тем, чтобы исключить протективный, маскирующий эффект гепарина и максимально приблизиться к моделированию геморрагического инсульта in vivo, во всех наших последующих экспериментах использование гепарина было исключено.

На предложенный метод защиты нервных клеток от последствий геморрагического инсульта с использованием гепарина получен патент на изобретение: Хама-Мурад А.Х. "Способ определения защитного действия гепарина при геморрагическом инсульте в эксперименте" М 2361283, опубликовано 10.07.2009, Бюл. № 19.

Динамика изменений механизмов электрогенеза в срезах при контакте срезов с кровью (сгустком крови) в срок до 7 часов. Для выяснения молекулярно-клеточных модификаций электрогенеза клеток и синап-тических передач при контакте с аутокровью в течение нескольких часов, использование варианта аппликации крови на срез в электрофизиологической установке крайне затруднительно, поскольку для этого требуются большие объемы перфузионной среды (1 - 1,5 л) и аутокрови для аппликации на срезы мозга. Кроме того, при длительном воздействии аутокрови в этой модели необходимо использование гепарина для избежания ее коагулирования. Однако, гепарин вызывает протективные влияния на нервную ткань при развитии геморрагического инсульта.

Определение "терапевтического окна" - срока, в течение которого возможно восстановление биоэлектрической активности нейронов. В настоящем исследовании использован разработанный метод моделирования геморрагического инсульта in vitro для изучения молекулярно-клеточных процессов в нервной ткани в поздние периоды времени после начала действия аутокрови до того момента, когда наступает необратимая гибель нервных клеток (7 часов). Такой подход позволяет установить длительность так называемого «терапевтического окна» (Гусев и др., 1999).

Феноменологически описанную модель следует рассматривать как аналог обширного геморрагического инсульта, возникающего в целом организме согласно классификации сосудистых поражений головного мозга (Виленский, 1995), то есть развитие патологических процессов в функционировании нервных клеток при действии аутокрови, излившейся в паренхиму мозга.

Для определения "терапевтического окна" были исследованы следующие интервалы времени действия аутокрови: 60, 120 и 420 мин.

В интервалы времени 60 и 120 мин от начала действия аутокрови происходило возрастание активности пресинаптических процессов, т. е. активация проводящих волокна ЛОТ. Одновременно с этим аутокровь индуцирует снижение активности постсинаптических механизмов как возбуждающих, так и тормозных. Однако они демонстрируют различную «устойчивость». Так, АМПА глутаматергические процессы угнетались в зависимости от времени действия аутокрови. НМДА-зависимые механизмы оказались наиболее уязвимыми и под влиянием аутокрови их активность блокировалась. Тормозные ГАМК-эргические механизмы при воздействии аутокрови значительно угнетались, но не блокировались. Эти данные свидетельствуют о сохранности основных механизмов биоэлектрической активности в срезах мозга и, следовательно, можно полагать, что интервал времени длительностью до 120 мин, определяемый между началом действия аутокрови на мозговую ткань и ее прекращением можно рассматривать как «терапевтическое окно», в течение которого активность нервных клеток может быть восстановлена до исходных значений при активации эндогенных механизмов или применением терапевтических средств (табл. 3).

Таблица 3

Параметры ФП в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс в контроле и после их инкубации в аутокрови без гепарина (1 мл) в течение 120 мин (р <0,05)

Параметры ФП (мкВ) Контрольные данные После инкубации в аутокрови

ПД ЛОТ 280,0 ± 9,0 410,0 ±11,0 *

АМПА ВПСП 240,0 ± 8,0 80,0 ±5,0 *

НМДА ВПСП 90,0 ± 7,0 0± 2,0 *

ТПСПм 30,0 ±3,0 20,0 ± 4,0

Конечным интервалом действия аутокрови было выбрано время длительностью 420 мин. Аутокровь в течение 420 мин воздействует одинаково негативно на исследованные механизмы электрогенеза нервных клеток срезов, а именно, происходила выраженная депрессия как возбуждающих, так

и тормозных механизмов электрогенеза. Наблюдалось блокирование активности тормозных механизмов (ТПСПм, ГАМК-эргические процессы) (табл. 4).

Таблица 4

Параметры ФП в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс в контроле и после их инкубации в аутокрови без гепарина (1 мл) в течение 420 мин (р <0,05)

Параметры ФП (мкВ) Контрольные данные После инкубации в аутокрови

ПДЛОТ 300,0 ± 10,0 150,0 ±3,0*

АМПА ВПСП 250,0 ±9,0 20,0 ± 4,0 *

НМДА ВПСП 100,0 ±7,0 0 ± 2,0 *

ТПСПм 30,0 ±3,0 0± 1,0*

Высокая степень нарушения в ткани, проявляется в том, что срезы после инкубации в аутокрови такой длительности сильно набухали, что было определено по их взвешиванию до и после инкубации в аутокрови. Это указывает на развитие к этому времени значительного отека в нервной ткани срезов.

Таким образом, эти данные демонстрируют, что при действии аутокрови к 420 минуте в клетках срезов прогрессивно развивается угнетение и блокада основных механизмов биоэлектрической активности. Следовательно, можно полагать, что этот интервал времени, определяемый между началом действия аутокрови на мозговую ткань и ее прекращением, является крайним сроком (пределом) «терапевтического окна», когда для восстановления активности нервных клеток необходимо экстренное применение эффективных терапевтических средств.

Таким образом, второй метод моделирования геморрагического инсульта позволяет проследить динамику развития депрессии и последующей блокады отдельных механизмов биоэлектрической активности в мозге при геморрагическом инсульте, позволяет выявить интервал времени, когда происходят необратимые нарушения отдельных механизмов электрогенеза («терапевтическое окно»).

На предложенный метод моделирования геморрагического инсульта получен патент на изобретение в ФИПС: Мокрушин А.А., Хама-Мурад А.Х. "Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта in vitro" № 2340951, опубликовано 10.12.2008, Бюл. №>34.

Исследование развития отека нервной ткани в модели геморрагического инсульта in vitro. Из клинических наблюдений известно, что одним из последствий острого нарушения мозгового кровообращения является отек нервной ткани, который приводит к серьезным нарушениям функционирования мозга и последующим летальным исходам (Kasner et al., 2001; Steiner et al., 2001).

Отек или набухание нервной ткани обычно определяется как увеличение содержания воды в ней (Staub et al., 1984). Полагают, что при отеке возрастает свободный компартмент воды внутри клеток (Hrabetova et al., 2002). В настоящей работе были проведены исследования развивающегося отека в нервных клетках срезов обонятельной коры мозгагипертензивных крыс линии SHR при действии аутокрови при моделировании геморрагического инсульта с использованием второй модели инсульта при контроле модификаций электрогенеза. Было изучено набухание срезов в контрольных опытах, на других срезах изучалось их набухание при инкубации в аутокрови, а также при использовании блокаторов глутаматных рецепторов. Определение степени набухания производили в таких же условиях, как и в электрофизиологических экспериментах.

Исследование набухания нервной ткани в переживающих срезах мозга в модели геморрагического инсульта. При нахождении срезов в аутокрови происходило значительное нарастание содержания воды в срезах. Так, спустя 60 мин набухание срезов превышало контрольное значение, и в конце 420 мин после пребывания срезов в крови содержание воды достоверно возрастало в 1,4 раза по сравнению с контрольным значением.

время инкубации (мин)

Рис. 4. Динамика набухания срезов при их инкубации в аутокрови и в контрольной инкубационной среде.

Было отмечено, что при воздействии аутокрови на мозговую ткань в модели геморрагического инсульта наблюдается значительное набухание срезов, что свидетельствует о нарастании отека. Это развитие отека происходит на фоне прогрессивного угнетения постсинаптических компонентов ФП (АМПА и НМДА ВПСП), активность ТПСПм также снижается. При этом в течение 120 мин еще не возникает блокада основных механизмов биоэлектрической активности при действие аутокрови на клетки срезов, тогда как к 420 мин происходят необратимые изменения (рис. 4). Следует отметить, что отмечается определенная корреляция между степенью набухания и нарушением работы НМДА и АМПА компонентов ВПСП глута-матных рецепторов, что свидетельствует о сопряженности этих нарушений и развития отека нервной ткани. Вместе с тем, в процесс развития отека, вероятно, вовлечены и другие механизмы.

Вовлечение глутаматных рецепторов при развитии геморрагического инсульта на срезах мозга. Поскольку главной возбуждающей ме-диаторной системой в срезах обонятельной коры является глутаматергиче-ская передача, то нами была проверена гипотеза о вовлечении глутаматных рецепторов в развитии отека при геморрагическом инсульте.

Для исследования вовлечения различных типов глутаматных рецепторов в процесс развития отека в срезах обонятельной коры после их инкубации с аутокровью были использованы специфические блокаторы: для блокады НМДА рецепторов - АРУ, для выключения АМПА рецепторов применяли ОМ<ЗХ, а для угнетения активности метаботропных глутаматных рецепторов подтипа тЯи 1,5- МСРО. Кроме того, был также использован прием совместной фармакологической блокады АМПА и НМДА ио-нотропных рецепторов специфическими блокаторами - БКС)Х и АРУ.

150 140 130

| 120

х

ф

5 но

100

АР\/ + кровь ОМОХ + кровь

АР\/ + +

кровь

Рис. 5. Изменение содержания воды в срезах обонятельной коры гипертен-зивных крыс при их инкубации в аутокрови в зависимости от их предварительной инкубации с блокаторами ионотропных глутаматных рецепторов АРУ, ОЫ(ЗХ и их совместном действии (р <0,05 - достоверные различия между аутокровью; АРУ+кровь и аутокровью и АРУ+ БКОХ+кровь).

Как показали результаты исследований, блокада НМДА глутаматных рецепторов с помощью APV препятствовала развитию отека, наблюдалось сохранение тех величин набухания срезов, как и в контроле (рис. 5). Это свидетельствует о том, что развитие отека под действием аутокрови в значительной степени обусловлено нарушением механизма активации НМДА рецепторов, что, по-видимому, приводит к дисбалансу водно-солевого обмена. Предварительное блокирование активности НМДА рецепторов оказывает протек-тивный эффект, препятствуя развитию отека, вызванного геморрагическим инсультом. Применение предварительной блокады АМПА глутаматных рецепторов с помощью DNQX в использованной модели геморрагического инсульта оказывало менее выраженный эффект, хотя также наблюдалось снижение степени набухания клеток при инкубации в аутокрови.

При одновременной блокаде АМПА и НМДА рецепторов при сравнении со значениями, полученными при действии аутокрови, наблюдается такой же протективный эффект, который был выявлен при применении одного APV. Уровень набухания срезов практически не отличался от степени их набухания в контрольной инкубационной среде. По-видимому, блокирование глутаматных ионотропных рецепторов (АМПА и НМДА рецепторов) препятствует избыточному проникновению ионов натрия, кальция и воды внутрь клеток срезов обонятельной коры в данной модели геморрагического инсульта. Можно полагать, что механизм развития отека при различных видах инсульта связан с работой ионотропных глутаматных рецепторов. По-видимому, блокада глутаматных ионотропных рецепторов препятствует избыточному проникновению ионов натрия, кальция и воды внутрь клеток и последующему их разрушению.

Известно, что важную роль в развитии толерантности против церебральной ишемии играют метаботропные глутаматные рецепторы (Pellegrini-Giampietro et al., 1999; Sommer et al.,2000). С тем, чтобы проверить степень вовлечения этих типов рецепторов в развитие геморрагического инсульта, в нашей модели был исследован уровень набухания ткани мозга переживающих срезов под действием аутокрови при использовании блокатора метабо-тропных глутаматных рецепторов подтипа mGlu 1,5- MCPG.

Срезы предварительно инкубировались в среде с MCPG по схеме, примененной для блокаторов ионотропных рецепторов. Было обнаружено, что блокада этой группы метаботропных глутаматных рецепторов также сопровождается снижением уровня набухания срезов при их длительном нахождении в аутокрови, и эти величины были сравнимы с величинами при блокаде НМДА рецепторов (рис. 6).

Рис. 6. Изменение содержания воды в срезах обонятельной коры гипертен-зивных крыс при их инкубации в аутокрови в зависимости от их предварительной инкубации с блокатором метаботропных глутаматных рецепторов MCPG (100 мкМ) и блокатором ионотропных глутаматных рецепторов APV (50 мкМ) (р <0,05, достоверные различия между аутокровью и APV+кровь или MCPG + кровь).

Таким образом, полученные на модели геморрагического инсульта in vitro данные свидетельствуют, что в механизм набухания ткани при действии аутокрови вовлечены глутаматные рецепторы: ионотропные (НМДА и частично АМПА) и метаботропные (подтипа mGlu 1, 5). Своевременное ингибирование активности этих рецепторов в значительной степени может предотвратить риск нарастания отека, приводящего к угнетению синапти-ческой активности нейронов. Можно утверждать, что при поиске лекарственных препаратов следует учитывать эти возможные терапевтические мишени для предотвращения отека мозга при геморрагическом инсульте.

Исследование антигеморрагических свойств витаминов Е, Д и С. Окислительный стресс, вызываемый активными формами кислорода (АФК), играет важную роль в формировании отека, это обуславливает необходимость применения веществ с антиоксидантами свойствами для лечения инсультов (MacGregor et al., 2003). Среди многочисленных представителей веществ с антиоксидантными свойствами члены семейства витамина Е (чаще всего альфа-Токоферол) используется в клинике в качестве нейро-протективного вещества для интенсивной терапии нервных клеток от последствий ишемического и геморрагического инсультов. В настоящей работе в условиях длительного пребывания срезов мозга в аутокрови, при контролировании изменений электрогенеза и степени набухания ткани срезов, было изучено действие витаминов при моделировании геморрагического инсульта. Степень нарушения механизмов электрогенеза в различные периоды действия аутокрови определялось при регистрации модификаций

биолектрической активности, а именно при анализе изменений амплитуд отдельных компонентов ФП.

Для получения противоотечного эффекта при моделировании геморрагического инсульта были использованы витамины, естественные антиок-сиданты: витамин Е (альфа-Токоферол-ацетат), витамин С (аскорбиновая кислота) и витамин Д (акваДетрим). Известно, что аскорбиновая кислота применяется в клинике для лечения последствий при ишемического инсульта мозга (Brahma et al., 2000; Rice, 2000). Витамин Д проявляет антиок-сидантные свойства, как показали исследования in vitro с гомогенатами мозговой ткани, а также в работах in vivo, когда он тормозил окисление липидов и снижал апоптоз (Lin et al., 2005).

Рис. 7. Изменение содержания воды в срезах обонятельной коры гипертен-зивных крыс при их инкубации в аутокрови в зависимости от их предварительной инкубации с витаминами С, Д и Е ( * - р <0,5 для витамина Е и аутокрови, ** -р <0,5 для контроля и аутокрови).

Жирорастворимую форму альфа-Токоферол-ацетата (10 % раствор) переводили в водорастворимую, для этого его нагревали до 37±0,2°С и растворяли в твин-20 Олуееп-20 - неионный детергент, молекулярный вес 1228). Срезы мозга преинкубировали с альфа-Токоферол-ацетатом (0,7 мг/мл) или другими витаминами в течение 30 мин. Предварительное применение водорастворимой формы альфа- Токоферол-ацетата до действия аутокрови на нервные клетки ткани мозга протестировало срезы от сильного набухания (рис. 7) (отличия достоверны). Это свидетельствует о выраженных антиотечных свойствах этого вещества при моделировании

геморрагического инсульта in vitro. Поскольку в процессе приготовления альфа-Токоферол-ацетата был применен твин-20, необходимо было исключить действие самого детергента на механизмы электрогенеза и степень набухания ткани. Как показали наши результаты, применение твин-20 в серии электрофизиологических опытов с определением изменений амплитуд компонентов ФП выявило отсутствие значительного действия детергента на электрогенез в срезах обонятельной коры, при этом также не было обнаружено изменений в степени набухания срезов. В разные, от 30 до 420 мин, интервалы времени производили измерение амплитуд отдельных компонентов ФП, вызванных электростимуляцией ЛОТ срезов, при одновременном действии твин-20 с последующим отмыванием срезов в течение 15 мин. Обнаружено, что он не индуцировал изменения исследованных компонентов ФП и при отмывании. Их статистические отличия были недостоверны по сравнению с контролем. Причем, к 360 мин действия твин-20 амплитуды всех компонентов ФП практически соответствовали исходным значениям, амплитуды всех компонентов ФП. Таким образом, твин-20 практически не оказывает влияния на модификации электрогенеза в срезах обонятельной коры мозга крыс. Поэтому противоотечный эффект, как нам представляется, обусловлен именно действием альфа-Токоферол-ацетата.

Предварительное воздействие аскорбиновой кислоты на нервные клетки срезов не защищало их от набухания и развития воспалительных процессов, поскольку их вес возрастал на 50 % по сравнению с исходным. Воздействие акваДетрим (витамин Д) на переживающие срезы до их контакта с аутокровью оказалось более эффективно, чем при действии витамина С, при этом степень набухания срезов достоверно отличалась от значений, которые были получены для срезов, которые находились в аутокрови.

На предложенный метод защиты нервных клеток от последствий геморрагического инсульта с использованием витамина Е получен патент на изобретение в ФИПС: Хама-Мурад А.Х. Способ определения воздействия биологически активного вещества (БАВ) на ткань мозга // Патент на изобретение № 2359272, опубликовано 20.06.2009, Бюл. № 17.

Исследование протективных, антигеморрагических свойств ди-пептида карнозина. Одной из главных задач практической неврологии является поиск надежных и эффективных фармакологических препаратов для защиты нервных клеток от тяжелых последствий геморрагического инсульта. К настоящему времени известны препараты в основном для лечения ишемического инсульта: церебролизин, ноотропил, глиатилин, семакс и др. Эти же лекарственные средства используются для лечения геморрагического инсульта. Однако они малоэффективны, поскольку не обладают выраженными нейропротективными действиями, многие из них не проникают

через гематоэнцефалический барьер и проявляют побочные эффекты и др. Установлено, что карнозин (p-alanyl-£-histidine) - природный гидрофильный дипептид, один из регуляторов природного антиоксидантного статуса (Болдырев 1998; Федорова и др., 2006), оказывает защитный эффект в условиях развивающегося окислительного стресса, вызывающего повреждение мозга, в том числе при гипобарической гипоксии и ишемии (Стволинский, Доброта, 2000; Федорова и др., 2006; Dobrota et al„ 2005).

В работе были исследованы свойства ¿-карнозина как возможного антигеморрагического препарата. Опыты проведены на переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR, изучали действие карнозина на биоэлектрическую активность нейронов и на набухание ткани мозга при длительном воздействии аутокрови.

Для этого переживающие срезы обонятельной коры мозга выдерживали с ¿-карнозином (Sigma или Fluka) (в концентрации 5 мг на 1 мл инкубационной среды) в течение 30 мин. Выбор данной конентрации ¿-карнозина обусловлен результатами ранее проведенных исследований (Хама-Мурад и др., 2008). Согласно этим данным, экзогенная аппликация ¿-карнозина в разных концентрациях (1, 2, 5, 10, 20 мг/мл) оказывает ней-ротропный эффект, однако наиболее выраженным он был при концентрации карнозина 5 мг на 1 мл инкубационной среды.

После преинкубации с карнозином и контакте с аутокровью в течение 360 мин в срезах регистрировали компоненты ФП (табл. 5).

Таблица 5

Параметры ФП срезов контрольных животных, после инкубации срезов в аутокрови в течение 360 мин, а также после предварительной

инкубации с ¿-карнозином (5 мг/мл) и последующей в аутокрови. * достоверные различия < 0,05 по сравнению с исходными параметрами

^ПараметрьТфГ1\^ Исходные данные (" = 8) После инкубации в аутокрови (Л = 8) После инкубации с ¿-карнозином и в аутокрови («=12)

ПД ЛОТ (мкВ) 300,0 ± 9,0 150,0± 7,0 * 285± 10,0

АМПА ВПСП (мкВ) 250,0± 8,0 20± 3,0* 225± 8,0

НМДА ВПСП (мкВ) 80,0± 1,0 0± 1,0* 68± 6,0

ТПСПм (мкВ) 20, 0± 1,0 0± 1,0* 17± 1,0

Предварительное воздействие ¿-карнозина до действия аутокрови защищало функционирование исследованных параметров электрогенезанерв-ных клеток срезов, наблюдается сохранение амплитуд этих параметров.

Таким образом, ¿-карнозин эффективно защищает глутаматэргическую и ГАМКэргическую синаптическую проводимость в нервных клетках срезов мозга, проявляя свойства нейропротектора в модели геморрагического инсульта.

Таблица 6

Антиотечные эффекты /,-карнозина и веществ сравнения на нервную ткань обонятельной коры мозга крыс при действии на них аутокрови в течение 360 мин. *р - < 0,05 по сравнению с исходным весом

Вес срезов Исходный средний вес срезов (мг) % изменения веса по отношению к исходному

исходный после их изготовления 24 ±2 100% (и = 8)

после инкубации в контрольном растворе 27 ±3 113% (и = 8)

после инкубации в аутокрови 42 ±2 * 154 % (п = 12)*

после предварительной инкубации с ¿-карнозином (5 мл/мл) + аутокровь 26 ±4 108 % (п = 16)

I-карнозин, примененный до воздействия аутокрови, препятствовал набуханию срезов обонятельной коры мозга (табл. 6). Это свидетельствует о том, что I-карнозин эффективно ингибирует вход молекул воды в нервные клетки, возрастающий при действии такого мощного стресс-фактора как аутокровь.

Протективный эффект в нашей модели геморрагического инсульта in vitro, по-видимому, обусловлен тем, что предварительное применение его, защищая биоэлектрическую активность нервных клеток, препятствовало гиперактивации глутаматергических, особенно НМДА-связанных рецеп-торных компонентов. Обнаруженный антиотечный эффект Х-карнозина -отсутствие значительного набухания ткани срезов мозга в результате воздействия аутокрови в тех случаях, когда срезы преинкубировались с I-карнозином, возможно, также опосредован его влиянием на глутаматные рецепторы.

На предложенный метод защиты нервных клеток от последствий геморрагического инсульта с использованием L-карнозина - получен патент на изобретение в ФИПС: Хама-Мурад А.Х. "Способ определения воздействия белка на ткани мозга" №. 2360295, опубликовано 27.06.2009, Б юл. №18.

Исследование антигсморрагических и антиотечных свойств эндогенного белка БТШ70. Одной из главных задач современной неврологии является разработка высокоэффективных препаратов, способных защитить нервные клетки от повреждающего действия аутокрови. Важным требованием к таким препаратам является отсутствие побочных эффектов. Этому условию удовлетворяют вещества, имеющие эндогенное происхождение. Среди потенциальных протекторов важное место занимают эндогенные пептиды. Было показано, что белок теплового шока с молекулярным весом 70 кДа (БТШ70) защищает нервные клетки переживающих срезов от тяжелой аноксии и глутаматной эксайтоксичности (Мокрушин и др., 2004; Мокрушин и др., 2005).

Однако на пути широкого применения БТШ70 как в научных исследованиях, так и в клинике имеются серьезные препятствия. Как показали исследования, биологическая активность БТШ70 при его экзогенном применении в нервной системе непостоянна. Один и тот же препарат, введенный животным, примерно, в одинаковой дозе индуцирует реакции разной направленности (Андреева и др., 2003; Флеров и др., 2003; МокшБЫп е( а1, 2004). Причина таких противоречий, как нам представляется, заключается в различной активности БТШ70, отличающейся от партии к партии при получении белка.

В связи с этим был разработан способ определения биологической, нейротропной активности БТШ70 в нервной системе как для стандартизации условий при проведении экспериментальных исследований свойств БТШ70, так и при клинических испытаниях в качестве терапевтического средства для лечения некоторых нейродегенеративных заболеваний. На основе анализа изменения амплитуды компонента ФП - НМДА рецептор-ного компонента (ВПСП) определяли активность БТШ70 по трем параметрам - индексам: нейротропный, пластический и протективный. Затем определяли активность БТШ70 по формуле:

А = (1^ * 1/> * 1Рг) х 100%, где: А - активность БТШ70 в %, 1дг-нейротропный индекс, у.е.; \Р— индекс пластичности, у.е.; 1Рг- протективный индекс, у.е.

По полученному результату определяли уровень физиологической активности БТШ70, который позволяет стандартизировать условия проведения экспериментов и клинических испытаний с использованием БТШ70, исключить возможные ошибки в эффектах, вызываемых белком при его применении с разным уровнем активности.

На предложенный способ исследования свойств БТШ70 получен патент на изобретение: Хама-Мурад А. X. "Способ исследования свойств белка теплового шока (БТШ70)"№ 2334988, опубликовано 27.09.2008, Бюл. № 27.

На втором типе модели геморрагического инсульта предварительное воздействие БТШ70 с нормальным уровнем активности до действия ауток-рови защищало функционирование отдельных механизмов электрогенеза нервных клеток срезов (табл. 7).

Таблица 7

Параметры ФП исходные, после инкубации срезов в физиологическом растворе с БТШ70 (1 мг/мл) и в аутокрови в течение 360 мин. *р -< 0,05 по сравнению с исходным весом.

Параметры ФП (мкВ) Исходные данные После инкубации в аутокрови После инкубации с БТШ70 + аутокровь

ПД ЛОТ 350,0 ±8,0 170,0 ±9,0* 311,0± 11,0

АМПА ВПСП 300,0 ±9,0 80,0 ±7,0* 267,0 ± 10,0

НМДА ВПСП 130,0 ±7,0 30,0 ±6,0* 110,0 ±9,0

ТПСПм 30,0 ±5,0 0 ± 2,0* 25,0 ± 3,0

Эти данные доказывают, что БТШ70 защищает нервные клетки срезов мозга от разрушающего действия аутокрови. При такой протекции сохраняется активность не только относительно резистентных механизмов (ПД ЛОТ, АМПА ВПСП) к разрушающему действию аутокрови, но, что особенно важно, удерживается активность наиболее чувствительных механизмов к разному роду цитотоксических воздействий, в том числе и крови — НМДА возбуждающих и ГАМК-эргических тормозных механизмов. Последний факт чрезвычайно важен в том отношении, что указывает о подавлении гипервозбудимости нервной ткани и развитии эпилептического состояния, которое развивается при геморрагическом инсульте (Хама-Мурад, Мокрушин, 2008). Следовательно, БТШ70 проявляет нейропротективные свойства в модели геморрагического инсульта.

Были исследованы эффекты БТШ70 как антиотечного препарата (табл. 8). При нахождении срезов в контрольной инкубационной среде их набухание составило 11 % и это увеличение весов было статистически недостоверно. Аутокровь вызывала значительное набухание нервных клеток, при этом их веса по сравнению с исходными величинами увеличивались на 54 %. Предварительное воздействие на нервные клетки БТШ70 до действия аутокрови протестировало их от сильного набухания. Так, при воздействии белка набухание составляло лишь 18 %, тогда как при действии аутокрови -54 % и это различие было достоверно.

Таблица 8

Антивоспалительные эффекты БТШ70 (10 мг/мл) на нервные клетки обонятельной коры мозга крыс от действия на них аутокрови в течение 360 мин. *р -< 0,05 по сравнению с исходным весом

Вес срезов Средний вес срезов (мг) % изменения веса по отношению к исходному

исходный после их изготовления 27 ±4 100 % (п = 8)

после инкубации в контрольном растворе 30 ±2 111 % (п = 8)

после инкубации в аутокрови 42 ±2 * 154 % (и = 12)*

после предварительной инкубации с БТШ70 (1 мкг/мл) и в аутокрови 32 ± 1 118% (/7= 16)

На предложенный метод защиты нервных клеток от последствий геморрагического инсульта с использованием БТШ70 получен патент на изобретение в ФИПС: Хама-Мурад А.Х. Способ определения воздействия белка на ткань мозга (БТШ70)// Патент на изобретение М> 2359337, опубликовано 20.06.2009, Бюл. Ms 17.

Заключение. Геморрагический инсульт является сложным многофакторным процессом, начало и развитие которого на уровне нейронов обусловлено нарушением работы синаптосомальной проводимости, вызванной эксайтотоксичностью. Развитие патобиохимических механизмов геморрагического инсульта в каждом отдельном нейроне проявляется в несогласованности работы нейрональных ансамблей в разных отделах мозга и, самое главное, в работе центральной нервной системе.

Поэтому таким важным является изучение динамических изменений электрогенеза нейронов в момент инсульта и в ранний его период. Нами был подробно изучены механизмы работы глутаматергической и ГАМКер-гических рецепторных систем при развитой гипертензии на переживающих срезах крыс. Были выявлены особенности биоэлектрической активности нейронов и динамика развития долговременной посттетанической потен-циации, свидетельствуещие о модификации процессов научения и памяти при гипертензии.

Применение методов моделирования геморрагического инсульта in vitro на переживающих срезах гипертензивных крыс дало возможность установить точные параметры изменений в работе ионотропных глутаматных и ГАМКергических рецепторов в первые минуты и начальные часы при действии крови и ее компонентов. Это позволило определить период

времени - "терапевтическое окно", не превышающий 7 часов, когда можно восставить электрогенез нейронов применением фармакологических средств. Нами был установлен механизм ингибирования активности глута-матных рецепторов в нейронах, вызываемый контактом их с кровью, и показано, что этот процесс сопряжен с развитием отека ткани мозга гипертен-зивных крыс. Была показана возможность восстановления электрогенеза нейронов, разрушенного контактом с кровью, и предотвращение отека ткани предварительным применением эндогенных веществ - карнозина и БТШ70.

Полученные данные подтверждают возможность протекции нейронов при геморрагическом инсульте. Одной из первостепенных задач лечащих врачей в условиях инсульта является сохранение нормальной мозговой активности пациента. Поэтому, весьма важные данные, полученные в модельных исследованиях, о возможности корректировать работу нейронов в условиях воздействия крови и, особенно гематомы в течение первых часов, с помощью таких эндогенных соединений, как БТШ70 и карнозин, открывает новое перспективное направление в предупреждении и, возможно, профилактике тотальной гибели нейронов при геморрагическом инсульте.

Выводы

1. При гипертензии электрогенез нейронов в головном мозге крыс характеризуется сниженной чувствительностью АМПА и НМДА подтипов глутаматных рецепторов. При стойкой гипертензии наблюдается тоническая гиперактивация НМДА рецепторов, что вызывает нарушение работы глутаматных рецепторов и приводит к развитию устойчивого дефицита биоэлектрической активности нейронов.

2. Контакт нервной ткани с кровью приводит к значительным нарушениям в электрогенезе нейронов. Аппликация аутокрови (1-я модель геморрагического инсульта in vitro) на переживающие срезы нервных клеток мозга гипертензивных крыс вызывает в них фазные изменения вызванной биоэлектрической активности клеток: ранняя фаза. В первые минуты аутокровь индуцирует в нервных клетках увеличение их возбудимости и развитие эпилептоподобного состояния, снижает возбудимость нервных клеток. Эти изменения носят обратимый характер. Эритроциты также обратимо блокируют все компоненты фокальных потенциалов.

3. Плазма крови вызывает два типа реакции в срезах мозга: эпилепто-формные разряды и блокаду всех компонентов фокальных потенциалов, причем отмывание срезов сопровождается достаточно быстрым восстановлением механизмов электрогенеза.

4. При воздействии крови на переживающие срезы обонятельной коры мозга гипертензивных крыс активность блокировалась уже в первые 120 мин. Тормозные ГАМК-эргические механизмы при этом значительно угнетались, но не блокировались.

5. При длительном воздействии аутокрови на нервные клетки (до 7 часов) (2-я модель геморрагического инсульта in vitro) степень нарушений активности нервных клеток нарастала, постсинаптические глутаматерги-ческие и ГАМКергические синаптические процессы были блокированы, сохранялась лишь сниженная вдвое активность проводящих путей латерального обонятельного тракта. Это позволило определить период времени - «терапевтическое окно», когда существует возможность восстановления электрогенеза нейронов, которое составило интервал времени от 2 до 7 часов.

6. Динамика развития отека нервной ткани при геморрагическом инсульте, вызываемого контактом срезов обонятельной коры мозга гипертензивных крыс со сгустком крови, коррелировала с уровнем биоэлектрической активности нейронов. Выявлена зависимость степени отека мозговой ткани от уровня активности ионотропных и метаботропных глу-таматных рецепторов. Возрастание нарушений синаптической активности нейронов сопровождалось увеличением набухания нервной ткани срезов. Блокада глутаматных рецепторов антагонистами APV и MCPG препятствовала развитию отека, вызываемого действием крови.

7. Предварительная обработка срезов I-карнозином оказывала выраженный протективный эффект, препятствуя негативному действию крови: применение L-карнозин приводило к восстановлению активности пост-синаптических глутаматергических и ГАМКэргических рецепторов, ингибируемых кровью, что препятствовало набуханию срезов.

8. Предварительная инкубация срезов обонятельной коры мозга гипертензивных крыс с белком теплового шока 70 оказывает защитный эффект при последующем воздействии крови в течение 360 мин. Сохраняется высокий уровень их электрогенеза, сравнимый с контрольными значениями, набухания ткани не происходит.

Публикации по теме диссертации.

Статьи в журналах, включенных в перечень ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации:

1. Хама-Мурад А.Х. Сравнение показателей газового состава, водно-солевого и кислотно-основного баланса крови при геморрагическом и ишемическом инсультах при артериальной гипертензии / Хама-Мурад А. X. // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. - 2006. -№4(7).-С. 66-70.

2. Хама-Мурад А.Х. Вторичное повреждение при мозговом инсульте и возможность восстановления функций мозга (роль цитокинов, нейроторофических факторов, адгезионных молекул) / Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., Мокрушин A.A. // Нейрохимия. - 2007. - Т. 24. - № 2. - С. 121-131.

3. Хама-Мурад А.Х. Анализ функционирования глутаматергической и ГАМК-ергической медиаторных систем в обонятельной коре мозга спонтанно ги-пертензивных крыс in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин A.A. // Известия РАН, Сер. Биол. - 2007. - № 4. - С. 454-461.

4. Хама-Мурад А.Х. Нейротропные эффекты экзогенного L-карнозина в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс / Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., Мокрушин A.A. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008.-Т. 146,-№7.-С. 4-7.

5. Хама-Мурад А.Х. Геморрагический инсульт: молекулярные механизмы патогенеза и перспективные терапевтические мишени / Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., Мокрушин A.A. // Успехи физиологических наук. - 2008. - Т. 39 -№ 3. - С. 74-94.

6. Хама-Мурад А.Х. Устойчивая гипертензия модифицирует глутаматерги-ческую и ГАМК-эргическую синаптические передачи в обонятельной коре мозга крыс in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин A.A. // Доклады Академии Наук. -

2008. - Т. 418. - № 6. - С. 842-846.

7. Хама-Мурад А.Х. Моделирование геморрагического инсульта in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин A.A., Павлинова Л.И. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 2008. - № 22. - С. 66-70.

8. Хама-Мурад А.Х. Эффекты длительного воздействия аутокрови на нервные клетки в модели геморрагического инсульта in vitro / Мокрушин A.A., Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146. - № 9. - С. 355- 357.

9. Хама-Мурад А.Х. Исследование протективных антионтечных свойств белка теплового шока (БТШ70) вмодели геморрагического инсульта in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин A.A., Павлинова Л.И. // Молекулярная Медицина. -

2009.-Т. 6.-С 46-50.

10. Хама-Мурад А.Х. Развитие отека нервной ткани в модели геморрагического инсульта in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин A.A., Павлинова Л.И. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. - 2009. - Т. 10. - № 2. - С. 47-52.

11. Хама-Мурад А. X. Протекторные свойства дипептида L-карнозина на модели геморрагического инсульта in vitro / Хама-Мурад А. X. // Экспериментальная и Клиническая Фармакология. -2009. - №72(6). - С. 46-48.

12. Хама-Мурад А. X. Исследование биоэлектрической активности нейронов при действии гепарина на модели геморрагического инсульта in vitro / Хама-Мурад А. X. // Экспериментальная и Клиническая Фармакология. — 2011. - Т. 74. - № 1. -С. 36-39.

13. Хама-Мурад А. X. Метод определения шаперонной активности белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин A.A., Павлинова Л.И. // Новости медико-биологических наук (News of Biomedical Sciences). - 2010. - Т. 1,-№2.-С. 208-213. (ВАК-Белоруссия и РФ).

14. Хама-Мурад А. X. Применение альфа-Токоферол-ацетата препятствует набуханию срезов мозга при действии аутокрови в модели геморрагического инсульта / Хама-Мурад А.Х. Мокрушин А.А, Павлинова Л.И. // Патофизология. -2011. (находится в печати).

15. Khama-Murad A. Kh. Neuroprotective properties of 1-carnosine in the brain slices exposed to autoblood in the hemorrhagic stroke model in vitro / Khama-Murad A. Kh., Mokrushin A. A, Pavlinova L. I. // Regulatory Peptides. - 2011. -№ 167. - P. 65-69.

16. Хама-Мурад А.Х Отек нервной ткани в модели гемморогического инсульта in vitro / Хама-Мурад А. X. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. (находится в печати).

17. Хама-Мурад А.Х Роль ионов кальция, эксайтотоксичности и окислительного стресса в патологии инсультов. Перспективные направления терапиин / Хама-Мурад А.Х, Павлинова Л.И, Мокрушин А.А. // Нейронауки -2007- - №3-11-е.3-16. сша

Публикации, переведенные на английский язык и цитированные в PubMed и Springer:

18. Khama-Murad A.Kh. Effects of long-term exposure of nerve cells to autoblood in in vitro model of hemorrhagic stroke / Mokrushin A. A., Khama-Murad A.Kh, Pavlinova L. I. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2008. - V. 146. - N 3. -P. 379-382. (PubMed).

19. Khama-Murad A.Kh. Neurotropic effect of exogenous L- carnosine in cultured slices of the olfactory cortex from rat brain / Khama-Murad A.Kh, Pavlinova L. I, Mokrushin A. A. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2008. - V. 146.-N l.P. 1-3. (PubMed).

20. Khama-Murad A.Kh. Stable hypertension modifies glutamatergic and GABA-ergic synaptic transmission in the rat olfactory brain cortex in vitro / Khama-Murad A.Kh, Mokrushin A.A. // Doklady Biological Sciences. - 2008. - V. 418. -N 6. - P. 1-4. (Springer).

21. Khama-Murad A.Kh. Analysis of function of the glutamatergic and GABAer-gic mediator systems in the olfactory cortex of spontaneously hypertensive rats in vitro / Khama-Murad A. Kh, Mokrushin A. A. // Biology Bulletin. - 2007. - V. 34. - N 4. -P. 376-381. (Springer).

22. Khama-Murad A.Kh. Persistent hypertension modifies glutamatergic and GABA-ergic synaptic transmission in the rat olfactory brain cortex in vitro / Khama-Murad A. Kh, Mokrushin A. A. // Doklady Biological sciences. - V. 414. - N 1. -P. 16-19. (Springer).

9 патентов на изобретения, зарегистрированные в ФИПС:

23. Патент на изобретение № 2307396 РФ. Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта / Мокрушин А.А., Хама-Мурад А.Х, Павлинова Л.И, Смирнова Г.П.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». № 2005133737/14; заявл. 01.11.2005; опубл.27.09.2007, Бюл. № 27.

24. Патент на изобретение № 2334988 РФ. Способ исследования свойств белка теплового шока (БТШ70) / Хама-Мурад А. X.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». -№ 2007110991/15; заявл. 26.03.2007; опубл. 27.09.2008, Бюл. № 27.

25. Патент на изобретение № 2340951 РФ Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта in vitro / Мокрушин А. А., Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». -№ 2007113239/14; заявл. 09.04.2007; опубл. 10.12.2008, Бюл. № 34.

26. Патент на изобретение № 2361283 РФ. Способ определения моделирования и исследованния последствий при геморрагическом инсульте / Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». -№ 2007148711/14; заявл. 24.10.2007; опубл. 10.07.2009, Бюл. № 19.

27. Патент на изобретение № 2359271 РФ. Способ определения воздействия белка БТШ70 на ткань мозга / Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». - № 2007129260/15; заявл. 30.07.2007; опубл. 20.06.2009, Бюл. № 17.

28. Патент на изобретение № 2361221 РФ. Способ определения воздействия белка на ткань мозга (эпилепсия 2) / Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». - № 2007129297/15; заявл. 30.07.2007; опубл. 10.07.2009, Бюл. № 19.

29. Патент на изобретение № 2359337 РФ. Способ определения воздействия белка на ткань мозга (БТШ70) / Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». -№ 2007126509/14; заявл. 11.07.2007; опубл. 20.06.2009, Бюл. № 17.

30. Патент на изобретение № 2360295 РФ. Способ определения воздействия белка на ткани мозга / Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». -№ 2007126502/14; заявл. 11.07.2007; опубл. 27.06.2009, Бюл. № 18.

31. Патент на изобретение № 2359272 РФ. Способ определения воздействия биологически активного вещества (БАВ) на ткань мозга (альфа-токоферол ацетат) / Хама-Мурад А.Х.; ГУ «РАН Институт физиологии им. И. П. Павлова». -№ 2007129259/15; заявл. 30.07.2007; опубл. 20.06.2009, Бюл. № 17.

Список статей и тезисов по материалам диссертации, опубликованных в других изданиях

32. Хама-Мурад А.Х. Изменения биохимических показателей крови у крыс линии Wistar и Wky при функциональной нагрузке (бег на тредмиле) / Барвитенко H.H., Хама - Мурад А. X. // III Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 175-летию со дня рождения Ф.В.Овсянникова «Механизмы функционирования висцеральных систем», Санкт-Петербург. - Санкт-Петербург, 2003.-С. 31-32.

33. Хама-Мурад А.Х. Влияние физической нагрузки на реологические показатели крови у крыс / Катюхин Л.Н., Хама-Мурад А. X., Тавровская Т. В. // III Всероссийская конференция с международным участием, посвященная 175-летию со дня рождения Ф.В.Овсянникова «Механизмы функционирования висцеральных систем», Санкт-Петербург. - Санкт-Петербург, 2003. - С. 133-134.

34. Хама-Мурад А.Х. Влияние тревожности на межполушарную асимметрию при распозновании фрагментированных изображений / Лавров В.В., Герасимов А. П., Пашкевич Б. П., Пушкарев Ю. П., Хама-Мурад А.Х. // Вторая всероссийская научная конференция «Актуальные вопросы функциональной межпо-лушарной асимметрии», Москва. - Москва, 2003. - С. 149-151.

35. Хама-Мурад А.Х. Характеристики мобильности у пациентов страдающих хронической сердечной недостаточностью / Хама-Мурад А.Х., Малеев Э.Г. // Российский национальный конгресс кардиологов «Российская кардиология: от центра к регионам», Томск. - Томск, 2004. - С. 503.

36. Хама-Мурад А.Х. Кинетика линии SHR функциональных показателей крови спонтанно гипертензивных крыс при функциональных нагрузках / Хама-Мурад А.Х., Маслова М. Н. // Юбилейная конференция к 60-летию Российской Академии Медицинских Наук. Журнал Медицинской Академии, Санкт-Петербург. -Санкт-Петербург, 2004. - Т. 4. - № 3. - С. 74.

37. Хама-Мурад А.Х. Характеристики мобильности у пациентов, страдающих хронической сердечной недостаточностью / Хама-Мурад А.Х., Малеев Э.Г. // Российский национальный конгресс кардиологов «Российская кардиология: от центра к регионам», Томск. - Томск, 2004. - С. 503.

38. Хама-Мурад А.Х. Универсальный измеритель 02 и температуры в тканях для изучения функций системы кровообращения / Кислякова Л.П., Кисляков Ю.Я., Хама-Мурад А.Х. // Третья всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения, посвященная 250-летию Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова, Москва. - Москва, 2004. -С. 36-37.

39. Хама-Мурад А.Х. Изменения функционально-биохимических показателей крови у крыс линии Вистар и спонтанно гипертензивных крыс линии SHR при кратковременном и длительном беге на тредмиле / Маслова М.Н., Хама-Мурад А.Х., Казенное A.M., Кислякова Л.П., Тавровская Т.В., Барвитенко Н.Н. // Журнал эволюционной биологии и физиологии. - 2005. - Т. 41. - № 2. - С. 129-133. (Khama-Murad A.Kh. Changes of functional and biochemical blood parameters in Wistar rat and in spontaneously hypertensive rats of the SHR line during short-term and long treatment running / Maslova M.N., Khama-Murad A.Kh., Kazennov A.M., Kislyakova L.P., Tavrovskaya T.V., Barvitenko N.N. // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. - 2005. -V. 41.-N2.-P. 162-168.)

40. Хама-Мурад А.Х. Изменения реологических и гематологических показателей у крыс линии Вистар и SHR при однократном и многократном беге на тредмиле / Катюхин Л.Н., Хама-Мурад А.Х., Кислякова Л.П., Казеннов A.M., Маслова М.Н., Тавровская Т.В. // Журнал эволюционной биологии и физиологии. - 2005. -Т. 41. - № 3. - С. 272-276. (Khama-Murad A.Kh. Changes of rheological and hematological parameters in rats of Wistar and SHR lines at single and multiple tredmill running / Katukhin L.M., Khama-Murad A.Kh., Kislyakova L.P., Kazennov A.M., Maslova M.N., Tavrovskaya T.V. // Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. - 2005. -V. 41.-N3.-P. 341-346.)

41. Хама-Мурад А.Х. Электрофизиологические характеристики переживающих срезов обонятельной коры мозга гипертензивных крыс / Мокрушин А. А., Хама-Мурад А.Х. // IV всероссийская конференция с международным участием «Механизмы адаптивного поведения», посвященной 80-летию организации Института физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург. - Санкт-Петербург, 2005. - С. 94.

42. Хама-Мурад А.Х. Реологические показатели эритроцитов у больных пожилого возраста с геморрагическим и ишемическим инсультом / Хама-Мурад А.Х. // XI Международная научно-практическая конференция «Пожилой больной. Качество жизни», Журнал Клиническая геронтология, Москва. - Москва, 2006. - С. 50.

43. Хама-Мурад А.Х. Характеристика нарушений формы и структуры мембраны эритроцитов при артериальной гипертензии, сопровождающейся стенокардией напряжения у больных пожилого возраста без физической нагрузки / Хама-Мурад А.Х. // XI Международная научно-практическая конференция «Пожилой больной. Качество жизни», Журнал Клиническая геронтология, Москва. - Москва, 2006.-С. 91.

44. Хама-Мурад А.Х. Роль ионов кальция, эксайтотоксичности и окислительного стресса в патологии инсультов. Перспективные направления терапии / Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., Мокрушин А.А. // Нейронауки. - 2007. - Т. 3. - № 11. -С. 3-16.

45. Хама-Мурад А.Х. Метод моделирования геморрагического инсульта на переживающих срезах мозга крыс / Мокрушин А.А., Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И. // V Всероссийская конференция с международным участием поев. 100-летию со дня рожд. В.Н.Черниговского. «Механизмы функционирования висцеральных систем», 16-19 октября, Санкт-Петербург. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 210.

46. Khama-Murad A.Kh. Electrophysiological characteristics of depressive conditions with passive strategy of the adaptive behavior in rats / Mokrushin A. A., Khama-Murad A. Kh., Semenova O. G., Shaliapina V.G. //1. M. Sechenov Russian Physiology Journal. - 2008. - N 94 (2). - P. 230-237.

47. Хама-Мурад А.Х. Влияние кортиколиберина на синаптическую передачу в срезах обонятельной коры мозга крыс в водно-иммерсионной модели депрессии / Шаляпина В.Г., Мокрушин А.А., Хама-Мурад А.Х., Семенова О.Г. // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. -2008. - Т. 94. -№ 8. - С. 952-96.

48. Хама-Мурад А.Х. Механизмы электрогенеза в срезах мозга при действии крови в модели геморрагического инсульта в условиях in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин А.А., Павлинова Л.И. // Конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга», 10-12 сентября, СПб-Колтуши. - СПб-Колтуши, 2008. - С. 90.

49. Хама-Мурад А.Х. Действие компонентов аутокрови на электрогенез обонятельной коры в модели геморрагического инсульта на срезах мозга крыс / Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., А.А.Мокрушин // Сборник статей международной конференции "Закономерности развития патологических состояний и их коррекция", (НАН Беларусь), Минск. - Минск, 2009. - С. 102-105.

50. Хама-Мурад А.Х. Модель геморрагического инсульта in vitro как способ определения протективных свойств биологически активных соединений / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин А. А., Павлинова Л.И. // Международная конференция

«Фундаментальные и прикладные аспекты применения биологически активных соединений», Новый свет, Крым. - Крым, 2009. - С. 22-23.

51. Khama-Murad A.Kh. Swelling of nervous tissue and changes of the glutamate receptor activity in the model of hemorrhagic stroke in vitro / Khama-Murad A.Kh. // XIV International Congress in rehabilitation in medicine and immunorehabilitation, 16-21 October. International Journal on Immunorehabilitation, Tel-Aviv. - Tel-Aviv, 2009. -V. 11.-№ l.-P. 31.

52. Хама-Мурад A.X. Предобработка гепарином восстанавливает биоэлектрическую активность нервных клеток в модели геморрагического инсульта in vitro / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин А.А., Павлинова Л.И. // Четвертая Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов», Новосибирск. - 2009. - С. 59-61.

53. Khama-Murad A.Kh. Electrophysiological characteristics of depressive states in rats with passive strategies of adaptive behavior / Mokrushin A.A., Khama-Murad A.Kh., Semenova O.G., Shalyapina V.G // Neuroscience and Behavioral Physiology, 2009. - V. 39. - N 3. - P. 275-280.

54. Khama-Murad A.Kh. Effects of exogenous application of corticotrophin-releasing hormone to slices of the olfactory cortex from rats with an active strategy of adaptive behavior on the water-immersion model of depression / Mokrushin A.A., Khama-Murad A.Kh., Semenova O.G., Shalyapina V.G. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2009. - V. 147. -N 3. - P. 244-248.

55. Хама-Мурад A. X. Антиотечные свойства витамина E / Хама-Мурад A. X. // Доклад на Всемирном Научном Конгрессе МВАК МУФО, 20 января, Санкт-Петербург. - Санкт-Петербург, 2009.

56. Хама-Мурад А. X. Действие компонентов аутокрови на электрогенез обонятельной коры в модели геморрагического инсульта на срезах мозга крыс / Хама-Мурад А.Х., Мокрушин А.А., Павлинова Л.И. // Международная научная конференция «Закономерности развития патологических состояний и их коррекция», 27-28 октября, Минск. - Минск, 2009.-С. 14-15.

57. Khama-Murad A.Kh. Effects of corticoliberin on synaptic transmission in rat olfactory cortex slices in a water immersion model of depression / Shalyapina V. G., Mokrushin A. A., Khama-Murad A. Kh., Semenova O. G. // Neuroscience and Behaviour Physiology. - 2009. - N 39 (7). - P. 701 -707.

58. Hama-Murad A. H. National Health Project: "Hemorrhagic stroke -L-carnosine - protector of a stroke" / Hama-Murad A. H. // A Report at The Second International Conference of Medical Sciences, 28 - 30 March, Erbil, Kurdistan. - Erbil, Kurdistan, 2010.

59. Хама-Мурад A.X. Исследование антигеморрагических свойств гепарина в модели геморрагического инсульта / Хама-Мурад А.Х. // Физиол. о-во им. И.П.Павлова. Съезд, XXI . Тез. докл. XXI съезда Физиол. о-ва им.И.П.Павлова, 1925 сентября, Калуга. - Калуга, 2010. - С.651-652.

60. Хама-Мурад А.Х. Способ определения протективных БТШ 70 и L -карнозин в модель геморрагического инсульта / Хама-Мурад А.Х. // Физиол. о-во им. И.П.Павлова. Съезд, XXI. Тез. докл. XXI съезда Физиол. о-ва им.И.П.Павлова, 19-25 сентября, Калуга. - Калуга, 2010. - С. 652.

61. Хама-Мурад А.Х. Воздействие аутокрови на биоэлектрическую активность нервных клеток в модели геморрагического инсульта in vitro / Мокрушин А.А., Павлинова Л.И., Хама-Мурад А.Х., Боровиков С.Е. // V Всероссийская конференция с международным участием, поев. 85-летию со дня основания Инт-та физиологии им. И.П.Павлова РАН «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды», 7-9 декабря, Санкт-Петербург. -Санкт-Петербург, 2010. - С. 196-197.

Список сокращений:

АД - артериальное давление

АМПА- а-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовая кислота

(a-amino-3hydroxyl-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)

БТШ 70 - белок теплового шока с молекулярной массой 70кДа

ВПСП- возбуждающий постсинаптический потенциал

ГАМК- гамма-аминомасляная кислота

ЛОТ- латеральный обонятельный тракт

НМДА - N-метил-О-аспартат

ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения ТПСП- торможение постсинаптического потенциала ФП - фокальный потенциал

APV - D-(-)-2amino-5-phosphonopentanoic acid - конкурентный блокатор NMDA рецепторов

L- карнозин - бета-аланил-Ь-гистидин

DNQX - (6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione - селективный блокатор АМРА рецепторов MCPG - [(+)-a-methyl-(4-carboxyphenylgycine)] - блокатор ме-таботропных глутаматных рецепторов подтипа mGlu 1, 5

Лицензия ИД № 00597 от 15.12.99 г. Подписано в печать 10.03.11. Усл. печ. л. 3,0 Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 465/11. 197022, Санкт-Петербург, улица Льва Толстого, 6/8 Издательство СПбГМУ

АКТУАЛЬНОСТЬ.

Заболеваемость геморрагическим инсультом представляет собо*Ь значительную социально-экономическую проблему для современного общества. Летальность в остром периоде кровоизлияния составляет 40-50%, а инвалидизация пациентов достигает 75%. Геморрагический инсульт составляет 15% от всех инсультов в США и Европе и 20-30 % у населения в Азии. Последствия, тяжесть протекания заболевания и смертность от геморрагического инсульта значительно выше, чем при ишемическом инсульте. Основными этиологическими факторами-геморрагического инсульта являются гипертоническая болезнь (в 80-85% случаев) (Quereshi et al., 2009; Taylor, Quereshi, 2009), врожденные и приобретенные артериальные и артерио-венозные аневризмы (O'Brien et al., 1999; Cheung, 2007; Gií-Núñez, Vivancos-Mora, 2005; Abaso va, 2009; Schräder, 2009).

Инсультом называют повреждение мозговых структур головного мозга в результате острого нарушения мозгового кровообращения. При разрыве кровеносного сосуда головного мозга вследствие кровоизлияния в мозг (контакта плазмы и форменных элементов'крови с мозговыми структурами) развивается геморрагический инсульт. При спазме или закупорке кровеносного сосуда головного мозга - ишемический инсульт (инфаркт мозга). В большинстве случаев инсульт вызывает стойкие необратимые изменения в ЦНС, приводящие к инвалидности. В мире ежегодно заболевает инсультом около 16 млн. человек, а около 30-60 млн. находятся в зоне риска развития этого заболевания. Среди больных старше 25 лет заболеваемость и смертность увеличиваются примерно в 2-3 раза с каждым последующим десятилетием. Среди выживших до 80% пациентов остаются до конца жизни инвалидами, нуждающимися в посторонней помощи и финансовой поддержке государства, а 33% - полностью зависят от помощи окружающих и остро нуждаются в длительной и дорогостоящей медико-социальной реабилитации (Одинак, Вознюк, 2000). Геморрагические инсульты инвариантны к полу и возрасту больных, хотя с возрастом частота заболевания возрастает, но в то же время имеет место тенденция развития геморрагического инсульта у более молодых людей, у которых присутствует более двух сопутствующих заболеваний (Lee et al., 2007; Pathak, Sloan, 2009). Особенности в уровне и образе жизни и состоянии окружающей среды, (Bejot et al., 2007), метереологические, сезонные, психоэмоциональные и циркадные ритмы (Jimenez-Conde et al., 2008) имеют большое значение в заболеваемости и смертности от геморрагического инсульта. Мозговой инсульт часто сопровождается нарушением когнитивных процессов, зрительного восприятия, наблюдаются нарушения абстрактного мышления, вербальной- памяти, функции речи у подавляющего числа пациентов (60-70%) (Nys et al., 2007; Gamaldo et al., 2006).

Патофизиология геморрагического инсульта, изучаемая, в основном, в моделях in vivo, описывает изменения физиологического статуса и ряда поведенческих параметров. Остается совершенно неисследованной проблема функциональной- активности нервных клеток в самые ранние периоды патологии. Известно, что процесс нейродегенерации под действием возбуждающих аминокислот, связанный с нарушением работы возбуждающих глутаматных рецепторов нейронов, является ключевым механизмом инсульта (Garthwaite, 1991; Domoki et al., 2002; Bonvento et al., 2002; Aarts et al., 2003; Kang et al., 2005; Fellin et al., 2006). Однако не известно, как кровь, ее компоненты и продукты ее лизиса воздействуют на нейрональную активность, какова динамика нарушения электрогенеза нервной ткани, которая приводит к гибели нейронов, и, в конечном счете, разрушает деятельность мозга. Важно также представлять, каким образом артериальная гипертензия, которая является одним из основных факторов развития геморрагического инсульта, влияет на функционирование как механизмов электрогенеза нервных клеток мозга, так и более сложных процессов - пластических модификаций мозга.

Для того, чтобы ответить на эти и другие вопросы, были проведены электрофизиологические исследования in vitro, в которых с первого момента контакта нервной ткани с кровью on-line фиксировались изменения активности нейронов, обусловленные как возбуждающими, так тормозными механизмами. В настоящей работе для раскрытия молекулярно-клеточных механизмов возникновения, патогенетических процессов, при развитии геморрагического инсульта были разработаны и исследованы два' типа моделирования геморрагического инсульта in vitro на переживающих срезах мозга. Первый тип моделирования позволяет исследовать "электрогенез при развитии патологических процессов, развивающихся в нервной ткани в начальный период времени после действия аутокрови (до 40 мин). Второй тип моделирования дает возможность изучать молекулярно-клеточные механизмы процессов, происходящих в более поздние периоды времени развивающегося геморрагического инсульта (до 7 часов).

Эти типы моделирования геморрагического инсульта in vitro являются единственными в настоящее время подходами, применение которых позволило не только исследовать динамику нарушений синаптической глутаматергической и ГАМК-эргической активности нейронов в мозге, но и активно воздействовать на. них, используя протективные вещества, способные защитить процессы электрогенеза нервной ткани от блокады и разрушения.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучение молекулярно-клеточных механизмов повреждения нервных клеток при их контакте с кровью после кровоизлияния в мозг у гипертензивных крыс линии SHR, а также усовершенствование принципов защиты и восстановления функций нервных клеток после геморрагического инсульта.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Используя методы электрофизиологического определения амплитуд параметров1 фокальных потенциалов в срезах мозга, выявить различия в базисных синаптических процессах при устойчивой гипертензии. Провести сравнение базисных характеристик возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR и крыс линии

Вистар, использованных в качестве контроля. Исследовать различия в развитии процессов наученияв переживающих срезах мозга крыс этих линий.

2. Разработать надежные и воспроизводимые* типы модели геморрагического инсульта, позволяющие регистрировать изменения параметров фокальных потенциалов in vitro на переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс линии SHR, происходящих как в начальный момент воздействия целой аутокрови и ее отдельных фракций, так и в отставленные периоды времени. Изучить изменения параметров возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга I гипертензивных крыс линии SHR в первые часы контакта с кровью в моделях in vitro.

3. На основании данных о повреждениях синаптических механизмов при действии аутокрови определить срок от начала действия аутокрови до того момента, когда наступает необратимая гибель нервных клеток -«терапевтическое окно». Определить длительность «терапевтического окна» в I переживающих срезах мозга при воздействии на них аутокрови. I

4. Исследовать, динамику развития отека в срезах обонятельной коры мозга, возникающего' при моделировании геморрагического инсульта под I действием сгустка аутокрови.

5. Изучить роль глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов в развитии отека в срезах мозга при действии аутокрови.

6. Используя вовлеченность глутаматэргических и ГАМКэргических ионотропных рецепторов в нарушение механизмов работы нейронов при контакте с кровью, осуществить поиск нейропротекторов эндогенного происхождения, способных протектировать функционирование этих рецепторов при геморрагическом инсульте in vitro.

7. Разработать способ определения физиологической активности в нервной системе белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ ПОЛОЖЕНИЯ:

1. Чувствительность АМПА и НМДА подтипов глутаматных рецепторов в срезах гипертензивных крыс на естественный медиатор снижена^ по сравнению с чувствительностью глутаматных рецепторов в срезах нормотензивных крыс, что свидетельствует о десенситизация этих рецепторов при гипертензии. Это может иметь значение в механизмах когнитивных нарушений у гипертензивных крыс.

2. При моделировании геморрагического инсульта in vitro аппликация аутокрови на срезы обонятельной коры мозга (гипертензивных) крыс оказывает негативное и необратимое воздействие на синаптическую передачу в нервных клетках, а также на АМПА и НМДА глутаматные рецепторы.

3. В развитие отека нервной ткани срезов мозга при воздействии аутокрови вовлечены ионотропные глутаматные рецепторы, модуляция активности которых специфическими антагонистами, а также рядом выявленных соединений эндогенной природы, оказывает протективный эффект.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые разработаны два типа модели геморрагического инсульта in vitro на переживающих срезах мозга. Первая тип из них позволяет исследовать молекулярно-клеточные механизмы процессов, развивающихся в нервной ткани в ранние периоды времени после действия аутокрови. Вторая тип - в более поздние периоды времени развивающегося геморрагического инсульта (патенты на изобретение № 2307396 РФ и № 2340951 РФ).

Впервые получены сведения о том, что действие аутокрови активирует развитие множественных, последовательно и параллельно протекающих процессов в нервной системе: гиперактивация глутаматных рецепторов, развитие процессов эксайтотоксичности, эпилепсия, блокада механизмов электрогенеза, развитие отека нервных клеток и др.

Впервые показано, что при действии крови на нервные клетки они реагируют фазно: первоначальная активация и последующее угнетение, заканчивающееся необратимой блокадой механизмов электрогенеза.

Впервые установлено, что наиболее уязвимыми механизмами электрогенеза являются НМДА-зависимые и ГАМКергические механизмы. Именно они первыми разрушаются под действием крови. Эти данные необходимо использовать при разработке нейропротективных препаратов.

Впервые установлено, что молекулы-индукторы, вызывающие эпилептическое состояние, находятся в плазме крови (патент на изобретение № 2359271 РФ и № 2361221 РФ).

Впервые определена длительность «терапевтического окна» - 6-7 час.

Впервые установлено, что при воздействии крови в нервной ткани развивается отек, который реализуется посредством гиперактивации глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов.

Впервые найдено, что водорастворимая форма витамина Е препятствует развитию отека при моделировании геморрагического инсульта (патент на изобретение № 2359272 РФ).

Впервые выявлены протективные эффекты веществ - дипептида Ь-карнозина (патент на изобретение № 2360295 РФ), БТШ70 (патент на изобретение№ 2359337 РФ), гепарина (патент на изобретение № 2361283 РФ).

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Изучение динамики нарушений биоэлектрической активности нейронов, происходящих в мозге в самые ранние сроки геморрагического инсульта, имеет не только важный теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования патологии в ЦНС при контакте нервной ткани с кровью, приводящее к прекращению синаптической деятельности нейронов, дает возможность поиска путей их регуляции или компенсации, и полученные результаты могут быть использованы в целенаправленном поиске нейропротективных средств.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы исследования изложены в 34 публикациях и материалах российских и международных конференций, 17 из которых в журналах, рекомендованных ВАК, РФ.' Автором получено* 9 патентов на изобретение, зарегистрированные в ФИПС.

Представленные в диссертации материалы были доложены, на: IV всероссийской конференции с международным участием «Механизмы адаптивного поведения», посвященной 80-летию организации Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, (Санкт-Петербург, 2005), на XI международной научно-практической конференции «Пожилой больной. Качество жизни» (Москва, 2006), на V всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В. Н. Черниговского «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007), на конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы, формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (СПб-Колтуши, 2008), международной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты применения* биологически активных соединений» (Украина, 2009), международной научной конференции «Закономерности развития патологических состояний и их коррекция» (Минск, Беларусь, 2009), XIV международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Тель-Авив, Израиль, 2009), четвертой всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009). Был изложен доклад на Всемирном Научном Конгрессе МВАК МУФО, 20 января, Санкт-Петербург, 2009, Report "National Health Project - L-carnosine" at the 2nd International Conference of Medical Sciences, 28th - 30th March, 2010, Erbil, Kurdistan, Съезд, XXI. докл. XXI съезда Физиол. о-ва им. И. П. Павлова, 19-25 сентября, Калуга, 2010. Кроме того, представленные в диссертации материалы были доложены на Всероссийской конференции с международным участием, поев. 85-летию со дня основания Инт-та физиологии им. И. П. Павлова РАН

Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды», 7-9 декабря, Санкт-Петербург, 2010.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 441 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, из них 100 отечественных и 840 зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 20 таблицами и 27 рисунками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ