Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы

рГб ОД

г I т >т1

На правах рукописи

Гуревич Лариса Евсеевна

НЕЙРОЭНДОКРИННЫЕ ОПУХОЛИ

ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ).

14.00.23.- гистология, цитология и эмбриология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Московском областном научно- исследовательском институте им. М.Ф. Владимирского (МОНИКИ). Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Казанцева И.А. Научный копе) пьтапт:

член-корреспондент РАМН, профессор Калинин А.П.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Райхлин Н.Т.

засл. деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Юрина H.A.

Ведущая организация :

Российский государственный медицинский университет Защита состоится

мая 1997 г. в М часов на заседании диссертационного совета Д.001.04.01 НИИ морфологии человека РАМН по

адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.З. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН. Автореферат разослан ol^, ОЦ, 9

Ученый секретарь диссертационного совета канд. бнол. наук Емельяненко И.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. До 70-х годов нашего столетия эндокринные опухоли считались редкими к диагностировались не более, чем в 1% всех опухолей. В последние десятилетия, благодаря внедрению в морфологию современных методов и улучшению качества диагностики число выявляемых эндокринных новообразований пищеварительного тракта неуклонно растет. На основании результатов, полученных с использованием большого спектра маркеров - моноклональных антител (МКАТ) к тканевым и клеточным детерминантам, все более широкое распространение получает термин "нейроэндокрпнные опухоли" (НЭО), который базируется на структурном и функциональном подобии клеток нервной и эндокринной систем (Bordi С. et al., 1988; Heitz Ph. et ai., 1991; Klöppel G., 1994) и постепенно вытесняет термины "карциноиды", "апудомы", "островково-клеточные опухоли", употребляемые ранее для обозначения новообразований, в том числе и поджелудочной железы (ПЖ), с нейроэндокринной дифференцировкой. Гистологическая классификация эндокринных опухолей ПЖ (ВОЗ, Женева, 1983) уже не соответствует современным представлениям. Попытки создания новых классификаций предпринимались неоднократно, однако, они не увенчались успехом и предложенные варианты просуществовали недолго (Solcia Е. et al. 1981; Borger М. et al.Л 983). Поэтому группа ведущих европейских патологов (Capeila С., Heitz Ph. et al., 1995) предложила новую классификацию НЭО ПЖ, которая позволяет разделить эти новообразования на 4 группы в зависимости от степени зрелости, размеров, клинического синдрома и функциональной активности.

Тем не менее, НЭО ПЖ остаются недостаточно изученными новообразованиями с неопределенным прогнозом, так как для определения степени их злокачественности обычно применяемые в онкоморфологии критерии не пригодны (Калашников С.А., Клочков Н.Д., 1977; Калашников С.А., Черемных A.A., 1983; Райхлин Н.Т., Кветной И.М. и соавт., 1993). Долгое время большинство НЭО ПЖ, в первую очередь инсулиномы, считались доброкачественными, к злокачественным относили не более 5% инсулином (Bloodworth J. 1982; Liu Т.-Н. et а!., 1985). В настоящее время эти цифры значительно возросли и составляют, по разным данным, от 15-30 до 50% и выше (Broughan

Т. et al., 1986; Grama D. et al., 1992; Roth J. et al., 1992). Сейчас не вызывает сомнения, что НЭО ПЖ - это медленно растущие, потенциально злокачественные новообразования, что, как правило, недооценивается (Калашников С.А., Черемных A.A., 1983; Хмельницкий O.K., Никонов A.A., 1986; Дерижанова И.С., 1991). Одной из самых сложных является проблема своевременной диагностики нефункционирующих ("немых") НЭО ПЖ, которые имеют слабо выраженные или неспецифические клинические симптомы. Количество таких новообразований по материалам специальной скриннинговой программы составляет более 40% всех выявляемых НЭО ПЖ (Eriksson В. et al., 1990; Venkatesh S. et а!., 1990). Именно среди "немых" опухолей наиболее высок процент злокачественных (40-92%), так как они долгое время растут бессимптомно, достигая "критических" размеров (3 и более см) ( Калашников С.А. и coaBT.,1983;Eckhauser F. et al., 1986; Liu T.-H. et al., 1992).

Было показано, что в злокачественных НЭО ПЖ пролиферативная активность клеток выше, чем в доброкачественных (Pelosi G. et al., 1992). Темп и активность пролиферации регулируется генами-супрессорами. Большое значение в механизмах опухолевого роста придают нарушению функции регуляторного гена р53 (Di Giuseppe J. et al., 1995; Carson D. et al., 1995; May P. et al,, 1995). Об экспрессии этого гена в НЭО ПЖ имеются единичные сообщения (Bartz С. et al., 1996). Для объективизации дифференциальной диагностики

доброкачественных и злокачественных НЭО ПЖ представляется целесообразным изучать не только пролиферативную активность, но и экспрессию гена р53 опухолевыми клетками. Это тем более важно, что в последние годы накапливается все больше данных о позднем (спустя 5-10 и более лет) рецидивировании и\или метастазировании опухолей, которые во время операции были расценены, как доброкачественные (Eriksson В. et al., 1993; Lee С. et al., 1993). Это делает актуальной проблему гисто- и морфогенеза НЭО ПЖ. Известно, что в пределах каждого из гистологических типов опухолей, верифицированных на основе общепринятых диагностических критериев, имеются различные варианты. Так, иммуноморфологическими методами в желудочно-кишечном тракте выявляется все больше комбинированных, т.е. двух- и даже трехкомпонентных опухолей, которые часто отличаются злокачественным течением (Франк Г.А. и соавт., 1986; Белоус Т.А.

и соавт., 1995; Турбин Д.А. и соавт., 1996; Heller S.J. et al., 1984; Hassan M.O. et al., 1993). Такие новообразования, в том числе развивающиеся из амфнкринных клеток или "клеток-химер" (Райхлин Н.Т., 1983; ) описаны и в ПЖ, но такие сообщения пока немногочисленны. В связи с изложенным, не менее актуальным является вопрос о патогенезе изменений в эндокринном аппарате внеопухолевой ткани ПЖ. Доказано, что по крайней мере часть НЭО ПЖ имеют в основе генетически обусловленные хромосомные абберации (Larsson С. et al., 1988; Ding S.F., et al.. 1992; Padberg B. et al., 1995). Другим возможным механизмом считают ошибку при дифференцировке полипотентной стволовой клетки, которая на отдельных этапах может экспрессировать последовательно или одновременно гены протоковой, экзокринной, невральной и эндокринной дифференцировки, а также продуцировать гормоны, в норме не свойственные ПЖ (Ваш D. et al., 1985; Halban P.A., 1991; Teitelman G.. 1993).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель работы состояла в изучении морфологических и функциональных особенностей НЭО ПЖ. которые имеют значение для уточнения их диагноза и прогноза.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

• дать патоморфологическую характеристику НЭО ПЖ;

® изучить особенности гисто- морфогенеза отдельных опухолей;

® выявить функциональные особенности и верифицировать диагноз НЭО ПЖ:

в изучить пролиферативную активность клеток НЭО ПЖ с помощью маркера пролиферации PCNA и экспрессию ими гена-супрессора опухолей р53;

® охарактеризовать состояние внеопухолевой ткани ПЖ при опухолях с нейроэндокринной дифференцировкой.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Диссертация является законченной научно-исследовательской работой, содержащей новое решение актуальной научной задачи: на основе комплексного анализа гисто- и морфогенеза НЭО ПЖ выработаны более объективные критерии диагноза и послеоперационного прогноза

новообразований. Проведенное исследование позволило впервые:

• на основании анализа комплекса морфологических особенностей выделить из гистологически доброкачественных НЭО ПЖ группу риска малигнизации.

• установить, что НЭО ПЖ с клиническим диагнозом "инсулинома" являются сборной группой новообразований, гетерогенной не только по гистологическому строению, но и по гистогенезу, функциональной и пролиферативной активности клеток и экспрессии ими гена-супрессора опухолей р53;

• выявить среди гистологически доброкачественных НЭО ПЖ группу опухолей с повышенной пролиферативной активностью и увеличенным индексом экспрессии протеина р53, что может быть прогностически неблагоприятным показателем, свидетельствующем о потенциальной злокачественности новообразования;

• показать, что изменения в эндокринном аппарате внеопухолевой ткани ПЖ при наличии НЭО не только отражают влияние гормональных продуктов функционально-активных опухолей, но и представляют собой фоновую патологию, которая лежит в основе иеопластической трансформации.

НА УЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

1. Проведенная работа является частью комплексной темы: "Клиническая морфология, закономерности морфогенеза и критерии прогноза диспластических и опухолевых процессов эндокринных желез" МОНИКИ.

2. Полученные данные позволили уточнить диагностику НЭО ПЖ на основе иммуногистохимической верификации.

3. Комплексное исследование морфо-функциональных и ультраструктурных особенностей, пролиферативной активности и экспрессии клетками опухолей гена р53 дают необходимую объективизацию критериев прогноза НЭО ПЖ.

4. На основе материалов диссертации издано информационное письмо "Эндокринные опухоли и дисплазии поджелудочной железы" (МОНИКИ, 1994г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены и обсуждены на IV Российском симпозиуме по хирургической эндокринологии хирургии (Уфа, 1995 г.), I Съезде международного союза ассоциаций патологоанатомов (Москва, 1995 г.), III Всероссийском съезде эндокринологов (Москва, 1996

г.), 5-ой Общеевропейской неделе гастероэнтрологии (Париж, 1996 г.), межотделенческой конференции МОНИКИ ( февраль, 1997).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них одна в центральной печати, одно "Информационное письмо". Две работы приняты к печати для опубликования в 1997 году.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 38 рисунков. Список литературы содержит 160 источников, из них 39 на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена на биопсийном и операционном материале 69 больных, оперированных и обследованных по поводу синдрома стойкой гипогликемии (59 больных - в отделении хирургической эндокринологии МОНИКИ, 10 - в клинике факультетской хирургии ММА им.И.М.Сеченова). Интраоперационно опухоль была выявлена у 57 из 69 больных. В каждом случае предварительный диагноз основывался на клинико-анамнестических данных, исследовании гормонов в периферической крови и результатах патоморфологического исследования. Уточненный диагноз устанавливали после иммуногистохимического и электронно-микроскопического исследования.

ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ МАТЕРИАЛА. Для ретроспективного исследования использовали архив гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином. В 22 случаях свежий операционный материал и биопсии фиксировали в 10%-ном растворе формалина, забуференном по Лилли и/или в растворе Буэна, затем заливали в парафин по стандартной методике. Исследовали всю удаленную опухоль, по возможности с участками прилежащей паренхимы ПЖ. Серийные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по Гримелиусу, на амилоид по Пухтлеру и комбинированной окраской по Лизону (ШИК-реакция и альциановый синий).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЭО ПЖ.. Серийные срезы депарафинировали, обрабатывали Н2О2 для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем наносили моноклональные антитела (МКАТ) к инсулину (Тшгпипоп),

проинсулину (Dakopatt), глюкогону (moho, Dakopatt), соматостатину (поли, Dakopatt), панкреатическому полипептиду, РР (поли, Dakopatt), вазоактивному интестинальному пептиду, У1Р(поли, Dakopatt), гастрину (поли, Dakopatt), серотонину (moho, Dakopatt), кальцитонину (moho, Dakopatt), а также к хромагранину А ( ХрА) (Immunon), и виментину (Immunon) по методу Sternberger L.A. (1979 ). Для дальнейшей обработки использовали стандартный Kit фирмы DAKO

(StreptABComplex/HRP Duet, Mouse/Rabbit). Пероксидазу выявляли с помощью DAB (диаминобензидина), затем ядра докрашивали гематоксилином Майера. Интенсивность пероксидазной метки оценивали полуколичественным методом (+-слабая, ++- средняя, +++- умеренная, ++++- сильная), а также определяли индекс мечения- число клеток, имеющих метку, на 100 учтенных опухолевых клеток ( в % ).

ВЫЯВЛЕНИЕ ПРОЛИФЕРИРУЮЩИХ КЛЕТОК И КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ПРОТЕИН ГЕНА-СУПРЕССОРА ОПУХОЛЕЙ Р53. Первичную обработку срезов проводили аналогично описанной выше. После блокирования эндогенной пероксидазы срезы, погруженные в деионизированную воду, для увеличения чувствительности метода подвергали обработке в микроволновой печи. Затем срезы обрабатывали МКАТ к антигену ядер пролиферирующих клеток - PCNA (PC-10, DAKO) или протеину р53 (DO-7, DAKO). Последующую обработку проводили по стандартной схеме. Интенсивность пероксидазной метки оценивали полуколичественным методом- по числу позитивных ядер на 100 опухолевых клеток (при учете 200500 опухолевых клеток). Процент меченных ядер представлен в виде индекса пролиферации или экспрессии протеина р53( в % ).

ЭЛЕКТРОННО - МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД'. Биоптаты 8 опухолей, полученные во время операции, фиксировали в охлажденном 4%-ном растворе параформальдегида, затем в 2%-ном растворе осмиевой кислоты. Фиксированный материал обезвоживали, затем заливали в смесь эпона и аралдита по стандартной методике. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5 (Швеция), контрастировали

' Электронно-микроскопические исследования проводились совместно с В.Б. Смирновым, H.H. Квитко и Е.В. Бородатой, за что выражаем им глубокую благодарность.

уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу, просматривали в электронном микроскопе JEM-7A (Япония) при увеличениях 8 500, 11 ООО, 14 ООО и 24 ООО.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Патоморфологическое исследование проведено в 59 наблюдениях НЭО ПЖ, из которых в 53 случаях были удалены солитарные опухоли, в одном- множественные (3), в трех случаях -произведены диагностические биопсии метастазов в печень. У 58 пациентов клинически определялся гипогликемический синдром различной тяжести( уровень глюкозы в крови от 0,7 до 4,6 ммоль/л). Средний возраст больных составил 47,3 года (от 16 до 73 лет). Число больных в возрасте до и после 50 лет было практически одинаковым (51 и 49%. соответственно), однако, средний возраст проявления клинической манифестации НЭО ПЖ в этих двух возрастных группах отличался почти вдвое - 34,4 и 61,2 года.

В 34% случаев опухоли локализовались в головке, в 30% - в хвосте, в 18% - в теле и в 18% - на границе тело-хвост ПЖ.

Опухоли, имевшие размеры до 2 см в диаметре, составили 50% наблюдений, размеры 2,1-3,0 см - 39%, а более 3 см - 11%.

При патогистологическом исследовании НЭО ПЖ, в том числе инсулипомы, диагностируют обычно как доброкачественные и злокачественные. Однако, ряд исследователей полагают, что из группы гистологически доброкачественных опухолей целесообразно выделить промежуточную группу, или "группу риска", с учетом индивидуальных гистологических и цитологических особенностей опухолей (Калашников С.А., Черемных A.A.. 1983; Дерижанова И.А., 1991).

Все НЭО ПЖ были нами разделены на три группы: доброкачественные (24), пограничные (23) и злокачественные (7 первичных и 3 метастатические). Критериями для отнесения опухоли к "пограничной группе" были следующие: размеры 3 см и более, ядерный полиморфизм, инфильтрирующий (ИНФ) и местнодеструирующий (МД) рост, инвазия мелких сосудов опухоли или капсулы. В отдельную группу выделены опухоли ПЖ, ассоциированные с синдромом множественной эндокринной неоплазии (МЭН-1)- 8 опухолей от 6 больных.

В данном исследовании мы выделяли 5 типов гистологического строения НЭО ПЖ: солидный, альвеолярный, трабекулярный, аденомоподобный (по преобладанию в опухоли этих гистологических структур) и смешанный. Эти типы строения в различной комбинации выделяются большинством исследователей (Калашников С.А., Черемных A.A.. 1983; Хмельницкий O.K., Никонов A.A., 1986; Дерижанова H.A., 1991; Саввина Т. В., Скуба Н.Д., 1993; Liu Т.-Н. et al, 1985; Roth J. et al, 1992).

Обычно между типом гистологического строения и злокачественностью НЭО ПЖ связи не обнаруживают (Heitz Ph. et al., 1982, 1988; Roth J. et al, 1992). Выделение промежуточной группы позволяет выявить некоторые тенденции. Так, в группе доброкачественных опухолей (I) преобладали солидный и аденомоподобный типы строения (по 25%), в группе промежуточных опухолей (II) - солидный (30%) и альвеолярный (22%), в группе злокачественных опухолей (III)- альвеолярный и трабекулярный (по 43%), в группе МЭН-1 ассоциированных (IV) -трабекулярный (44%). При этом большинство опухолей аденомоподобного строения (25%) были отнесены к доброкачественным, лишь единичные- к промежуточной группе (4%) и совсем не было их среди злокачественных. Противоположная тенденция отмечена для опухолей с трабекулярным и альвеолярным типами строения.

Исследование цитологических особенностей опухолей показало, что очаговый ядерный полиморфизм (ОЯП) встречается в целом в 23% случаев, но умеренный (УЯП) и выраженный ( ВЯП) - только во II и III группах (в 18% и 83%, соответственно). Единичные митозы встречаются в 19% случаев, а >5 митозов в 10 репрезентативных п/зр только в группе злокачественных опухолей -в 33%. Инвазию сосудов клетками опухоли наблюдали только во II и Ш группах- в 9%- 50%, соответственно. В МЭН-1 -ассоциированных опухолях ПЖ все эти показатели имели значения промежуточные между соответствующими показателями I и II групп.

Протоковые структуры встречались в 57% НЭО ПЖ, что согласуется с аналогичными данными (Дерижанова И.А., 1991; Liu Т.-Н. et al., 1985), однако, в злокачественных опухолях и опухолях промежуточной группы они встречались в 3 и в 2 раза чаще, чем в доброкачественных. Отложения амилоида и кальцификаты

несколько реже встречались в доброкачественных опухолях. В МЭН-1 - ассоциированных опухолях ПЖ чаще преобладала строма.

Нами показано, что эозинофильная и, особенно, лимфоидная инфильтрация стромы и паренхимы опухоли, формирование лимфоидных фолликулов в зоне роста опухоли характерны, в первую очередь, для злокачественных опухолей. Так, эозинофильная инфильтрация в I-III группах была отмечена соответственно в 27-43% опухолей, лимфоидная - в 18 - 57%. Лимфоидные фолликулы встречались только во II-III группах - 4 и 14%, соответственно. Для доброкачественных опухолей более характерен продуктивный склероз с формированием широкой псевдокапсулы.

На основании гистологического исследования препаратов, окрашенных рутинными методами, верифицировать НЭО ПЖ невозможно, а диагноз базируется на клиническом синдроме и данных биохимического анализа уровня гормонов крови. В то же время клинические симптомы очень изменчивы и далеко не всегда коррелируют с функциональной активностью таких опухолей, в части случаев они неспецифичны или вообще отсутствуют. Определение гормонов в плазме в большинстве случаев ограничивается инсулином и С-пептидом. Особенно трудно, а иногда и невозможно, без применения специальных методов установить диагноз нефункционирующих ("немых"), а также низкодифференцированных НЭО ПЖ. Поэтому верификация опухоли проводилась нами только на основе результатов иммуногистохимических исследований.

Иммуногистохимическое исследование проведено на материале 22 НЭО ПЖ от 20 больных. Трем пациентам, в том числе с множественными опухолями, был поставлен диагноз МЭН-1. У этих больных новообразования ПЖ сочетались с гиперплазией паращитовидных желез (2 сл.) и узловой гиперплазией надпочечников (1 сл.).

20 опухолей были функционирующими и клинически проявлялись гипогликемическим синдромом. Обе нефункционирующие НЭО были обнаружены у больных с МЭН-1. Именно при синдроме МЭН-1 особенно часто встречаются "немые" НЭО ПЖ (Balle А.Е.,1994; Padberg В. et al., 1995). В трех случаях гистологически был установлен диагноз злокачественная "инсулинома": одна опухоль прорастала в селезеночную вену,

другая отличалась выраженным ядерным и клеточным полиморфизмом и инфильтрировала окружающие ткани, третья -с множественными метастазами в печень.

Нейроэндокринная дифференцировка опухолей подтверждалась с помощью МКАТ к маркеру эндокринных гранул - хромагранину А (ХрА). Иммунореактивными к ХрА оказались 20 опухолей, негативными - 2. По характеру реакции с ХрА опухоли можно разделить на 4 типа: 1 тип- негативная реакция - 2 оп.; 2-ой тип - равномерная позитивная реакция более, чем 80% клеток - 59% (13 оп.); 3-ий тип - равномерная позитивная реакция менее, чем 80% клеток -14% (3 оп.); 4-ый тип - очаговая позитивная реакция -18% (4 оп.). Следовательно, 59% опухолей состояли из равномерно распределенных нейроэндокринных клеток. Иммунореактивность к ХрА варьировала по интенсивности: в 55% случаев была сильной (+++, ++++), а в 36% -слабой (+, ++); локализовалось в цитоплазме диффузно или полярно (вблизи мембраны). На ультраструктурном уровне диффузное окрашивание ХрА цитоплазмы обычно коррелировало с равномерным распределением в ней большого числа нейроэндокринных гранул, а полярное- с небольшим количеством гранул, расположенных вблизи мембраны. Полученные результаты свидетельствуют о гетерогенности НЭО ПЖ с синдромом гиперинсулинизма, как по иммунореактивности к ХрА. так и по числу и локализации гранул в цитоплазме клеток, что не противоречит данным литературы Число высоко-, среднегранулированных и агранулярных НЭО ПЖ оценивают как 30%, 20% и 9%, соответственно (НеНг РИ. й а1., 1988; Ьш Т.-Н. е1 а1„ 1992).

Маркер мезенхимальной дифференцировки- виментин выявил большое количество элементов пролиферирующего эндотелия капилляров в 40% опухолей, а в 3-х случаях реактивность к виментину обнаружена в цитоплазме опухолевых клеток.

Для определения функциональной активности опухолей были использованы 9 МКАТ к гормонам: инсулину (Ин), проинсулину {Про), глюкагону (Гл), соматостатину (Сом), панкреатическому полипептиду (РР), У1Р-у, гастрину (Гас), серотонину (Сер), кальцитонину (Ка).

Из 22 опухолей клетки трех (13,6%) не проявляли реактивности ни к Ин, ни к Про, из них 2 нефункционирующие

("немые") и 1 злокачественная. Из 19 ////-продуцирующих опухолей 12 (63,1%) имели в своем составе более половины Ин-реактивных клеток, но только в 5 (26%) они составляли подавляющее число клеток опухоли. Про выявлялся в 71% случаев, но число клеток, позитивных к нему, колебалось в разных опухолях в очень широких пределах - от 5 до 100%. В трех случаях, когда опухоли состояли из большого числа Я/?о-реактивных клеток, на ультраструктурном уровне определялась большая пропорция клеток с незрелыми (без кристаллоидного ядра) или атипичными ß-гранулами. В одном случае, наряду с клетками, содержащими зрелые и незрелые ß-гранулы, были также обнаружены амфикринные клетки, или "клетки - химеры", в которых одновременно находились а- и ß-гранулы, a-, ß- и зимогенные гранулы. Такие клетки описаны в НЭО (Райхлин Н.Т., 1983; Cheifec G. et al„ 1985; Hassan O.M. et а!., 1993.).

/л-позитивные клетки содержали 47% опухолей, но только в 3-х случаях число их было существенным и превышало 15% всех опухолевых. Ссш-продуцирующие клетки обнаружены в 43% случаев, но только в одном они составляли большинство клеток опухоли ( > 90 %). ////-позитивных клеток в этой опухоли было только 14%, а 30% клеток проявляли иммунореактивность к кальцитонину. На ультраструктурном уровне большинство клеток этой опухоли были агранулярными или содержали небольшое количество мелких, электронно-плотных, полиморфных, недифференцируемых гранул нейроэндокринного типа. Очевидно, что эта опухоль имеет своеобразный гистогенез, хотя гипогликемический синдром с увеличением уровня Ин в плазме больного до 544 нмоль/л (при норме до 128 нмоль/л) давали основание поставить клинический диагноз "инсулинома". С другой стороны, учитывая небольшое количество Ин-продуцирующих клеток с немногочисленными ß-гранулами, продукцию клетками опухоли Сом и Ка можно думать о ее происхождении из полипотентных стволовых клеток. Отсутствие характерного синдрома, а, главное, данных об уровне Сом в плазме до операции не дает необходимых оснований считать ее "соматостатиномой". Данный случай позволяет еще раз акцентировать внимание на том, что клинический синдром НЭО ПЖ может возникнуть в результате сложных взаимодействий гормональных продуктов опухоли, в том числе эктопических, как в данном случае кальцитонин. Обычно из-за ограниченности

набора используемых МКАТ не все продукты НЭО выявляются, поэтому клинико-морфологический диагноз часто является условным. Описывают все новые случаи НЭО ПЖ с неспецифическими синдромами, с одновременной продукцией, в том числе одними и теми же клетками, Сом и Ка, Ин и Ка, АКТГ, гормона роста и других (Galmiche J.P. et al., 1980; Pommelet С. L. et al., 1992). PP продуцировали клетки 36% опухолей, в одном случае такие клетки располагались только в месте прорастания капсулы опухолью. Физиологическое действие РР в ПЖ изучено недостаточно, но хорошо известно,что уровень этого полипептида, как и ХрА, постоянно увеличен в плазме у пациентов с НЭО ПЖ, что все шире используется при проведении скриннинга этих новообразований (Heitz Ph. et al., 1982, 1988; Eriksson В. et al.,1990). Небольшое количество К//>-позитивных клеток входило в состав 36% опухолей, но в большинстве случаев была характерна, прежде всего, интенсивная VIP- позитивная реакция клеточных элементов в строме, периваскулярных пространствах и капсуле опухолей. Гяс-продуцирующие клетки определялись в 54% случаев- в единичных клетках. Исключением была одна из злокачественных опухолей, 30% клеток которой проявляли реактивность к Гас. Часть клеток этой же опухоли экспрессировали виментин, что отражает особенности гистогенеза данной опухоли. Сер определялся в единичных клетках 2-х опухолей, а Ка - в одной.

Таким образом, 59% опухолей (13 оп.), которые сопровождались гипогликемическим синдромом, оказались мультигормональными и продуцировали, кроме Ин и Про, другие гормоны ( Табл.1). Очевидно, что эти цифры значительно занижены, т.к. ограничены набором используемых МКАТ. Этим объясняется и значительный разброс данных при оценке мультигормональности НЭО ПЖ - 52-89% (Liu Т.-Н. et al., 1985; VenkateshS. et al., 1990).

Табл. 1. Результаты исследования НЭО ПЖ с использованием

клеточно-специфических маркеров.

№ Обозн. Количество Количество %

п/п маркера исследованных позитивных позитивных

опухолей опухолей опухолей

1 ХрА 22 20 91

2 Ин 22 19 86

3 Про 17 12 71

4 Гл 15 7 47

5 Сом 21 9 43

6 РР 15 5 33

7 V1P 15 4 27

8 Гас 15 4 27

9 Сер 17 -> 12

10 Юн 13 1 8

Сложность клеточного состава и широкий спектр гормональных продуктов НЭО ПЖ позволяют понять и объясняют описанные случаи перехода синдромов из одного в другой, проявления вторичных и неспецифических симптомов (Eriksson В. et а!., 1992). Это еще больше затрудняет диагноз и прогноз НЭО ПЖ.

С целью получения более объективных критериев для прогноза злокачественного потенциала НЭО ПЖ были использованы маркеры клеточного цикла- PCNA и р53.

PCNA является маркером активности клеточной пролиферации. При исследовании с помощью этого маркера пролиферативной активности НЭО ПЖ показано увеличение индекса PCNA в злокачественных опухолях и опухолях с признаками инвазивного роста (Pelosi G. et al., 1992). Особый интерес вызывает регуляторный протеин, кодируемый геном р53. Физиологическая роль немутантного ("дикого") типа р53 заключается в блокаде клеточного деления в фазе Gl. Более, чем для 50°о новообразований различного генеза. особенно злокачественных, отсутствие экспрессии р53 связано с мутацией гена, в других случаях отмечена сверхэкспрессия этого протеина. До недавнего времени считалось, что в НЭО ПЖ он не выявляется, т.к. в них не обнаружено мутации гена р53. Сейчас показано, что сверхэкспрессия р53 в НЭО ПЖ имеет место, однако, она происходит в результате нарушений в позднем посттранслокационнном периоде клеточного цикла (Bartz С. et al.. 1996).

С помощью PCNA были исследованы 20 НЭО ПЖ. В пределах одной опухоли распределение клеток, меченных PCNA, как правило, неравномерное и соответствует полиморфизму их гистологического строения. Пролиферирующие клетки чаще преобладают в периваскулярных зонах и по периферии опухоли. Особое внимание привлекли опухоли своеобразного гистогенеза ,

клетки которых имели иммуногистохимические и/или ультраструктурные признаки амфикринных или полипотентных клеток. Таких опухолей было 5. Для них часто характерно настолько неравномерное распределение пролиферирующих клеток, что не представлялось возможным дать усредненный индекс для всей опухоли; в таких случаях мы вычисляли несколько индексов для различных ее участков. Все три злокачественные опухоли имели самый высокий индекс РСИА - 45%, 49% и 55%.

Группа гистологически доброкачественных опухолей (16) была гетерогенной по пролиферативной активности опухолевых клеток. Индекс РСЫА варьировал от случая к случаю в широких пределах (от 4 до 42%). Четыре из 16 опухолей этой группы имели индекс РСЫА от 21 до 45%, что может свидетельствовать о менее благоприятном прогнозе. Это соответствует существующему представлению о невозможности прогноза НЭО ПЖ на основании только общепринятых морфологических критериев (Некг РЬ. е1 а1., 1988;ЬееС.В. е1 а1„ 1993).

Экспрессия р53 изучена в 12 гистологически доброкачественных и 3 злокачественных НЭО ПЖ. Все три злокачественные опухоли были р53-негативными. Для доброкачественных опухолей индекс р53 варьировал от 0 до 32%. Семь опухолей имели низкие индексы р53, причем и индекс РСКА у них также был низким -5-14% ( в среднем 9,3%) в 6 из 7 опухолей. Остальные 5 опухолей имели индекс р53 14-32%, а индекс РСЫА составил 14-22% ( в среднем 17,6%). Таким образом, НЭО ПЖ и по экспрессии р53 являются гетерогенной группой новообразований. Среди гистологически доброкачественных НЭО ПЖ можно выделить 2 группы: с вероятным благоприятным прогнозом ( низкий индекс РСКА и низкий или равный 0 индекс р53) и группу риска малигнизации ( с повышенными индексами РСЫА и р53). Злокачественные опухоли имели самый высокий индекс PCNA при отсутствии экспрессии р53.

Для 22 опухолей, исследованных с помощью иммуногистохимических маркеров, были использованы дополнительные гистохимические окраски. По методу Гримелиуса позитивно окрашивались 70% опухолей, что ниже, чем при реакции с ХрА (91%). При исследовании слизеобразования с помощью комбинированной окраски (ШИК-реакция + альциановый синий) в 2-х опухолях обнаружено внутриклеточное

слизеобразование, а электоронно-микроскопически в клетках встречались гранулы муцина и внутриклеточные протоки.

Основываясь на морфологической и функциональной характеристиках НЭО ПЖ, а также учитывая их пролиферативный потенциал, мы распределили их по степени зрелости в соответствии с классификацией, предложенной Capella C.et al., 1995 (Табл. 2).

Механизмы, которые лежат в основе развития НЭО ПЖ, изучены недостаточно и, в связи с этим, представляется весьма важным исследование изменений в эндокринном аппарате внеопухолевой ткани ПЖ (Елецкий Ю.К., Яглов В.В., 1977, 1978, 1989; Bani D. et al, 1985; Kohnert K.-D. et al, 1988 ; Bani S. et al 1989, 1992). Также требует объяснения пато- и морфогенез поздних рецидивов и метастазов НЭО ПЖ. Комплексное патоморфологическое, иммуногистохимическое и электронно-микроскопическое исследование позволяет выявить не только гипоплазию или гиперплазию островков Лангерганса, но и охарактеризовать функциональные сдвиги, обусловленные изменениями в клеточном составе и локализации островковых клеток.

Табл. 2. Распределение НЭО ПЖ

№ Группы Кол. % Средний индекс PCNA Средний индекс P53

1 Доброкачественные: Инсулиномы Нефункционирующие 6 27,3

5 22,8 9 2,8

1 4,5 5 . 0

2 Доброкачественные или низкой степени злокачественности: Инсулиномы Другие 12 54,6

10 45,4 19,8 15,4

2 9,1 18,5 15

3 Низкой степени злокачественности: Инсулиномы 3 13,6 52 0

4 Высокой степени злокачественности 1 4,5 45 0

Всего 22 100

При исследовании гистологических препаратов прежде всего выявляется увеличение количества островков и изменение их формы (Табл.3).

Табл. 3. Характеристика островков Лангерганса внеопухолевой

ткани ПЖ..

№ Наименование признака I гр. % Игр. % III гр. % IV гр. % МЭН-1 %

1 Увеличение числа островков 83 100 100 100 100

2 Увеличение размеров островков 33 50 100 100 67

3 Изменение формы островков 67 92 100 100 67

4 Незидиобластоз 33 58 100 100 67

5 Микроаденоматоз 33 33 100 0 50

Примечание: I - IV группы соответствуют группам в классификации НЭО ПЖ СареПа С. й а!., 1995.

Как видно из табл. 3, изменения в эндокринном аппарате внеопухолевой ткани ПЖ по мере уменьшения степени зрелости НЭО ПЖ становятся более выраженными вплоть до появления микроаденом и обширного незидиобластоза. Наблюдалась также протоковая пролиферация ( 47% случаев), аденоматоз (23% ) и кистозная трансформация протоков (17% случаев). Иммуногистохимически в островках уменьшалось как число В-клеток, так и содержание в них иммунореактивного инсулина. Напротив, число А-клеток в островках и содержание в них глюкагона увеличивались, А-клетки занимали не только периферическую, но и центральную часть островков. Такие гиперплазированные А-клеточные островки характерны для инсулин-продуцирующих НЭО ПЖ, особенно с высокой функциональной активностью. В случаях, когда опухоли не секретировали инсулин или секретировали мало, локализация и количество А-клеток в островках Лангерганса почти не отличалось от нормы. Число Д-клеток и их иммунореактивность к соматостатину во всех случаях увеличивались. С помощью ХрА выявлялось значительно больше эндокринных клеток как в составе гиперплазированных островков, так и диффузных, расположенных в ацинарной ткани, строме, протоках и капсуле опухоли, чем при использовании гормональных маркеров. Это,

вероятнее всего, свидетельствует о том, что ХрА позволяет выявить также популяцию "промежуточных клеток", которые дифференцируются из полипотентных стволовых клеток протоков (Ваги Ь. е1 а1., 1985; СТ^ес в. е1 а!., 1985). Считают, что именно последние ответственны за неопластическую трансформацию при НЭО ПЖ (ТеИе1тап в., 1993).

Таким образом, группа НЭО ПЖ с гипогликемическим синдромом является неоднородной по морфо- и гистогенезу, а в основе неопластической трансформации лежат, по крайней мере, 2 патогенетических механизма - генетический дефект и ошибки при дифференцировке полипотентных клеток.

ВЫВОДЫ.

1. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы, сопровождающиеся гипогликемическим синдромом и объединенные клиническим диагнозом "инсулинома", представляют собой сборную группу новообразований и отличаются по гистогенезу, дифференцировке опухолевых клеток, гистологическому строению и функциональной активности.

2. Гипогликемический синдром возникает не только в результате гинерсекреции инсулина и проинсулина клетками нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы, но и как суммарный эффект гормонов, секретируемых мультигормональными опухолями.

3. Хромогранин А является надежным иммуногистохнмическим маркером нейроэндокрпнной дифференцировки опухолей поджелудочной железы. Для менее зрелых новообразований характерно увеличение популяции клеток, реактивных к хромагранину А, а для более зрелых-клеток, реактивных к инсулину.

4. Нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы гетерогенны по уровню пролиферативной активности и экспрессии протеина р53. В злокачественных опухолях часто происходит инактивация гена р53. Для доброкачественных аденом характерны низкий уровень пролиферативной активности и отсутствие или слабая экспрессия протеина р53. Опухоли, отнесенные к группе риска малигнизации (размеры 3 см и более, местнодеструирующий или инфильтрирующий рост, наличие митозов, инвазия сосудов) отличаются повышением уровня пролиферации и экспрессии р53, что определяет, вероятно.

возможность их прогрессирования с трансформацией в более злокачественные формы.

5. Источником развития первичных и рецидивных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы являются незидиобластоз и множественный микроаденоматоз островков Лангерганса. Эти процессы могут быть ответственны и за персистенцию эндокринного синдрома после хирургического удаления опухоли.

6. Состояние эндокринного аппарата внеопухолевой ткани поджелудочной железы (изменение числа, формы, размеров островков, их клеточного состава) косвенно позволяет судить о функциональной активности нейроэндокринной опухоли. Преобладание А-клеток в островках характерно для инсулин-продуцирующих опухолей, а нормальная локализация А- и В-клеток в островках - для нефункционирующих нейроэндокринных новообразований.

7. Ультраструктурные особенности гранул клеток нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы отражают функциональную гетерогенность этой группы опухолей и коррелируют с иммуногистохимической характеристикой новообразований. Для клеток хорошо дифференцированных инсулин-продуцирующих опухолей характерно большое количество зрелых гранул с кристаллоидным ядром, способных "запасать" инсулин, а для клеток менее дифференцированных опухолей со значительной пропорцией проинсулин-секретирующих клеток - увеличенное количество незрелых и атипичных гранул.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Казанцева И.А., Полякова Г.А., Гуревич Л.Е., Тихомиров О.Ю. Морфологическая характеристика фоновой активности эндокринного аппарата поджелудочной железы. Тезисы докладов 5 съезда эндокринологов Украины "Современные проблемы экспериментальной и клинической эндокринологии", Ивано-Франковск, 14-17 сентября 1994 г., стр. 108.

2. Казанцева И.А., Калинин А.П., Полякова Г.А., Гуревич Л.Е. "Эндокринные опухоли и дисплазии поджелудочной железы". Информационное письмо, М., 1994.

3. Казанцева И.А., Гуревич Л.Е., Полякова Г.А., Скуба Н.Д. Функциональная морфология в диагностике инсулином. Материалы 4-го Российского симпозиума: "Хирургия эндокринных желез", г. Уфа, 26-28 сентября 1995 г, Санкт-Петербург, 1995 г., стр.57-60.

4. Смирнов В.Б., КвиткоН.Н., Бородатая Е.В., Гуревич Л.Е. Особенности ультраструктуры клеток инсулиномы. Материалы 4-го Российского симпозиума:"Хирургия эндокринных желез", г. Уфа, 26-28 сентября 1995 г, Санкт-Петербург, 1995 г., стр. 172176.

5. Калинин А.П., Полякова Г.А., Гуревич Л.Е., Богатырев О.П. Мезенхимальная опухоль малого таза с синдромом гипогликемии. "Архив патологии", 1997, №2, стр. 59-62.

6. Казанцева И.А., Полякова Г.А., Гуревич Л.Е., Свищев A.B. Клиническая морфология эндокринных панкреатических опухолей. Тезисы I съезда Международного союза ассоциаций паталогоанатомов, г. Москва, 3-6 октября 1995 г., стр.75.

7. Гуревич Л.Е., Казанцева И.А., Калинин А.П., Смирнов В.Б., Бородатая Е.В. Морфо-функциональная характеристика олухолевой и внеопухолевой ткани поджелудочной железы при эндокринных панкреатических опухолях. Тезисы докладов III Всероссийского съезда эндокринологов: "Актуальные проблемы эндокринологии", г.Москва, 4-7 июня 1996 г., стр. 4546.

8. Смирнов В.Б., Квитко H.H., Бородатая Е.В., Гуревич Л.Е. Ультраструктурные особенности секреции инсулином островково-протокового строения. Тезисы докладов III Всероссийского съезда эндокринологов: "Актуальные проблемы эндокринологии", г. Москва, 4-7 июня 1996 г., стр.23.

9. Калинин А.П., Казанцева H.A., Гуревич Л.Е., Тишенина P.C., Квитко H.H., Бородатая Е.В. Эндокринные опухоли поджелудочной железы и органический гиперинсулинизм. 1 съезд онкологов стран СНГ, г. Москва, 3-6 декабря 1996 г., ч.2, стр. 688-689.

10.L.E. Gurevitch, I.A. Kazantseva, А.Р. Kalinin. Р53 in endocrine tumors of pancreas. 5th United European Gastroenterology Week, Paris, Frace, 2-6 November 1996, Gut 1996, 39, (Suppl 3 ), p.A 92.

П.Казанцева H.A., Гуревич Л.Е. Пролиферативная активность и экспрессия гена р53 в эндокринных опухолях поджелудочной

железы.- Сб.: Актуальные проблемы общей и частной патологии. Принято в печать. 12. Казанцева И.А., Тишенина P.C., Гуревич JI.E., Калинин А.П. Гипогликемический синдром и лабораторная верификация нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы. Национальный Всероссийский съезд по клинической и лабораторной диагностике. Принято в печать.