Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы

На правах рукописи

Гордиенко Елена Николаевна

Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы

14.03.02.- патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2014

19 ИАП 2СН

005549286

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор О.В. Зайратьянц) ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И.Евдокимова» (ректор - Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор О.О. Янушевич) Минздрава России.

Научный руководитель:

Паклина Оксана Владимировна доктор медицинских наук, заведующая отделением патологической анатомии ГБУЗ Городская клиническая больница имени С.П. Боткина Департамента здравоохранения города Москвы.

Научный консультант:

Чекмарева Ирина Александровна доктор биологических наук, заведующая отделом электронной микроскопии ФГБУ «Институт хирургии имени A.B. Вишневского» Минздрава России.

Официальные оппоненты:

Делекторская Вера Владимировна доктор медицинских наук, заведующая лабораторией гистохимии и электронной микроскопии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Смольянникова Вера Анатольевна доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России.

Ведущее учреждение: ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится «_»_2014 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.041.02 при ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России. Адрес: Москва, ул. Делегатская д.20/1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета по адресу: 125206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а., http://dissov.msmsu.ru Автореферат разослан «_»_2014г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Ярема Владимир Иванович

Условные сокращения

FISH - метод флюоресцентной гибридизации insitu AT — антитела

ГКОЯ - гранулезоклеточные опухоли яичников

ИГХИ - иммуногистохимическое исследование

НЭО - нейроэндокринные опухоли

ПЖ - поджелудочная железа

СППО — солидно-псевдопапиллярные опухоли

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Солидно-псевдопапиллярные опухоли (СППО) являются редкими и малоизученными новообразованиями поджелудочной железы (ПЖ). Они составляют 0,2-2,7% от общего числа злокачественных опухолей и около 6% - от ее экзокринных новообразований [Santini D., et al., 2006]. По данным других исследователей, СППО встречаются более чем в 24% наблюдений резецированных кистозных новообразований ПЖ и в 30% - всех опухолей ПЖ у пациентов в возрасте до 40 лет [Solcia Е., et al., 1997; Klöppel G., et al., 2001]. В 1996 г. эксперты ВОЗ выделили СППО в отдельную нозологическую форму в группе опухолей экзокринной части ПЖ с пограничным потенциалом злокачественности [Klöppel G., et al., 1996]. Тем не менее, критерии злокачественности данного вида новообразований разработаны недостаточно. С учетом клинического поведения СППО, а также с открытием скрытых мутаций в определенных онкогенах, в новой редакции гистологической классификации опухолей пищеварительного тракта СППО рассматриваются как злокачественные новообразования (ICD-0 8452/3; WHO, 2010 г.) [Bosman F.T., et al., 2010]. Несмотря на это, ряд таких опухолей отличается доброкачественным клиническим поведением, поэтому вопрос об их потенциальной злокачественности остается дискутабельным.

Термин «солидно-псевдопапиллярная опухоль» и множество его синонимов дают возможность судить лишь о морфологической характеристике новообразования, в то время как гистогенез этих опухолей до настоящего времени остается не ясным. Гипотезы гистогенеза СППО основаны на результатах исследований иммуногистохимической (ИГХ) экспрессии определенных маркеров, а также ультраструктурных особенностей опухолевых клеток [Сао D., et al., 2006, Cavard С., et al., 2009, Bergmann F., et al., 2011, Guo Y., et al., 2011]. Однако ни одна из существующих гипотез гистогенеза СППО не утвердилась в качестве окончательной.

Для ИГХ диагностики СППО используют достаточно большой набор антител (AT), часто не обладающих специфичностью. Нередко на предоперационном этапе, имея небольшие по объему образцы ткани и используя минимальный набор AT, врачу-патологоанатому необходимо верифицировать диагноз для определения дальнейшей тактики лечения. Оптимальная ИГХ панель для СППО требует дальнейшей разработки и уточнения.

Благодаря внедрению молекулярных методов исследования, стало возможным определение мутаций различных генов, характерных для каждой опухоли человека. Единственным нарушением, обнаруженным в более чем 90% СППО, является мутация в 3-м экзоне гена Р-катенина (CTNNB1) [Abraham S.C., et al., 2002]. р-катенин является важным звеном канонического WNT-пути, играющего главную роль в патогенезе СППО, а также опухолей стромы полового тяжа, например в гранулезоклеточной опухоли яичника (ГКОЯ) [Lague М., et al., 2008; Boyer A., et al., 2009]. Сходные молекулярные нарушения в СППО и ГКОЯ дают направление для поиска общих морфологических признаков и сходных путей гистогенеза этих новообразований.

Цель исследования: повышение качества диагностики солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы и уточнение ее гистогенеза на основании результатов клинико-морфологического,

иммуногистохимического, цитологического, ультраструктурного и молекулярно-биологического методов исследования.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические и морфологические особенности солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы.

2. Изучить иммуногистохимический профиль солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы и разработать оптимальную панель антител

для ее диагностики и проведения дифференциального диагноза с другими панкреатическими новообразованиями.

3. Изучить цитологические и ультраструктурные особенности строения клеток солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы.

4. Определить при помощи флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) молекулярные нарушения в генах CTNNB1, C-Myc, N-Myc в клетках солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы.

5. Сравнить иммуногистохимические, ультраструктурные и молекулярно-биологические характеристики солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы с опухолями стромы полового тяжа для уточнения ее гистогенеза.

6. Выявить на основе полученных данных морфологические критерии злокачественности солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы.

Научная новизна

Проведено комплексное гистологическое, иммуногистохимическое, цитологическое, электронно-микроскопическое и молекулярно-биологическое исследование 26 случаев солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы. Получены новые данные, относящиеся к молекулярно-биологической характеристике опухоли, а именно, обнаружена амплификация гена N-Myc.

Разработана оптимальная иммуногистохимическая диагностическая панель антител, определены морфологические признаки злокачественного течения солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы.

В результате проведенного сравнительного комплексного морфологического исследования солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы и гранулезоклеточной опухоли яичников получены новые доказательства теории ее гистогенеза, основанной на положении об эмбриональной миграции

зародышевых клеток яичников в поджелудочную железу на ранних этапах органогенеза.

Практическая значимость работы

Разработана иммуногистохимическая панель антител для диагностики и дифференциальной диагностики солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы. Определены морфологические признаки злокачественного течения солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы, что в клинической практике позволит прогнозировать вероятность метастазирования и развития ее рецидивов.

Основные положения, выносимые на защиту

• Для морфологической диагностики, дифференциальной диагностики и прогнозирования биологического поведения солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы необходимо иммуногистохимическое исследование с использованием панели антител к СБ99, Р-катенину, рецепторам прогестерона, синаптофизину и виментину; характерна амплификация гена Ы-Мус. Специфическими цитологическими признаками являются группы мелких мономорфных клеток, формирующие сосочки или «веерообразные» структуры вокруг тонких фибро-васкулярных стержней, а в ядрах клеток опухоли - продольные бороздки (ядра вида «кофейных зерен»). Достоверными признаками злокачественности являются размеры опухоли более 7 см и пролиферативный индекс Кл-67, превышающий 2%.

• На ультраструктурном уровне клетки солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы и гранулезоклеточной опухоли яичников имеют много общих признаков, что в совокупности со сходным морфологическим строением и биологическим потенциалом подтверждает

теорию гистогенеза солидно-псевдопапиллярной опухоли, основанную на положении об эмбриональной клеточной миграции зародышевых клеток яичников в поджелудочную железу на ранних этапах органогенеза.

Внедрение результатов в практику

Полученные в работе данные по морфологическим, иммуногистохимическим, цитологическим, электронно-микроскопическим и молекулярно-биологическим особенностям солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы используются в практической работе в ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, ФГБУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского» Минздрава РФ и ГУ «Центральный Научно-исследовательский институт гастроэнтерологии» ДЗ г. Москвы. Результаты работы используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России.

Апробация материалов диссертации

Основные материалы диссертации доложены на совместном Российско-Германском медицинском форуме "Diseases of the Pancreas. Innovations in Diagnostics and Therapy" (Санкт-Петербург, 2013 г.), 25th European Congress of Pathology (Лиссабон, 2013 г.).

Апробация диссертационной работы проведена на заседании кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И.Евдокимова» Минздрава России (11.12.2013 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 - в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирован 13 таблицами, 87 фотографиями и графиками.

Библиографический указатель включает 183 источников, из них 13 -отечественных и 170 - зарубежных.

Материал и методы исследования

Материал для исследования получен из хирургических отделений ФГБУ Института хирургии им. А.В.Вишневского МЗ РФ и ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России.

Выполнен анализ операционного материала 26 больных СППО ПЖ, находившихся на лечении в указанных выше медицинских учреждениях в период с 2004 по 2012 гг.

Всего за данный период находилось на лечении 636 больных с опухолями ПЖ. Протоковая аденокарцинома обнаружена в 428 случаях, нейроэндокринные опухоли (НЭО) - в 142, кистозные опухоли - в 69 (в том числе 22 - СППО), что составило, соответственно, 67%, 22% и 11%. Доля СППО оказалась равна 3,4% от числа всех опухолей ПЖ и 4,4% - новообразований ее экзокринной паренхимы.

Все больные с СППО были исключительно женского пола, возраст колебался от 15 до 67 лет (средний - 33,9±2,64 лет). Распределение больных по возрасту проводили согласно рекомендациям ВОЗ (1963 г.): возраст до 44 лет считается молодым, 45-59 - средним и 60-74 - пожилым. При этом до 44 лет было 20 больных (77%), в возрасте 45-59 лет - 5 (19%) и 60-74 лет - 1(4%) (рис. 1).

В молодой и средний ■ пожилой

Рис. 1. Распределение больных СППО ПЖ по возрастным

группам (в соответствие с рекомендациями ВОЗ, 1963)

Для контроля и сравнительного анализа было исследовано 5 образцов ткани неизмененной ПЖ (аутопсийный материал, умершие от острой сердечнососудистой патологии и не страдавшие заболеваниями поджелудочной железы) и 5 хирургически удаленных ГКОЯ взрослого типа.

Для выработки критериев дифференциальной диагностики между СППО и нейроэндокринными опухолями (НЭО) ПЖ проведено морфологическое и ИГХ-исследование 30 панкреатических НЭО.

При макроскопическом исследовании и описании макропрепаратов удаленной части ПЖ с опухолевым узлом оценивали количество опухолевых узлов, их размер, цвет, и локализацию новообразования в железе, а также наличие и характер вторичных изменений в опухоли.

При гистологическом исследовании препараты, полученные с использованием стандартного метода парафиновой заливки, окрашивали гематоксилином и эозином. Для ИГХ исследования применяли панель из 13 первичных моноклональных АТ к: Кл-67, СОЮ, СБ56, СЭ99, (3-катенину, рецепторам прогестерона, циклину Б1, синаптофизину, цитокератинам 18 и общему, виментину, хромогранину А, Е-кадгерину («Бако»),

Интенсивность пероксидазной метки для каждого цитоплазматического или мембранного ИГХ маркера оценивали полуколичественным методом с

учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. ИГХ реакцию оценивали как негативную («-» - нет реакции), слабо позитивную («+» - <10% окрашенных клеток), умеренную («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и выраженную («+++» - >50% клеток высокой интенсивности окраски).

Определение индекса пролиферации на основании экспрессии Ki-67 в ядрах клеток опухоли проводили по той же методике, но вычисляли среднее значение от числа меченых ядер на 100 учтенных (при анализе 500-1000 опухолевых клеток). Подсчет меченых ядер проводили в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Клетки на периферии срезов, где чаще наблюдают неспецифическое фоновое окрашивание, не учитывали.

Для статистического анализа полученных данных использовали пакет программ Statistica для Microsoft Office, версия 6.0. Силу и значимость связи между анализируемыми признаками оценивали с помощью корреляционно-регресионного анализа непараметрическим методом. Для количественных признаков вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. За уровень статистической значимости принимали р< 0,05.

Материал для цитологического исследования получали путем изготовления мазков-отпечатков с поверхности среза нефиксированного операционного материала опухоли. Мазки фиксировали в растворе эозин-метиленовый синий по Май-Грюнвальду с последующей окраской азуром и эозином по Романовскому.

Для проведения электронно-микроскопического исследования из нефиксированного свежего операционного материала вырезали кусочки ткани объемом около 1 мм3. После фиксации и заливки в аралдитовую смолу из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1,5-2 мкм. Ультратонкие срезы толщиной 100-200 нм получали на ультрамикротоме фирмы «LKB» (Швеция). Ультраструктурное изучение препаратов проводили при

помощи электронного микроскопа JEOL JEM 100-СХ (Япония) в трансмиссионном режиме при ускоряющем напряжении 80 КВ.

Двухцветную интерфазную FISH-реакцию выполняли на парафиновых срезах толщиной 3 мкм. Использовали локус-специфические ДНК-пробы (молекулярные зонды): LSI N-MYC (2р24)/СЕР 2 (2pl 1 .l-ql 1.1), LSI MYB (6q23), TelVysion 6qVysis, LSI MYC(8q24.1-24.3) и соответствующие им центромерные пробы («Vysis Abbott Laboratories Inc.», США). Сигналы подсчитывали в 100 отдельно лежащих ядрах каждого образца, при этом не учитывали число сигналов в плохо очерченных (внеядерный сигнал), а также лежащих друг на друге ядрах. Неизмененную ткань ПЖ использовали в качестве контроля. Кариотипический профиль считали нормальным (сбалансированным), если более 50% ядер опухолевых клеток содержали по 2 сигнала от каждой из локус-специфических проб. При выявлении в 50% ядер более двух сигналов диагностировали амплификацию генов.

Результаты исследования и их обсуждение

Морфологическая характеристика солидно-псевдопапиллярной опухоли

поджелудочной железы

Макроскопически СППО во всех наблюдениях были представлены солитарными узлами, размером от 0,6 до 15 см (средний размер 5,4±0,72 см). Отмечена прямая корреляционная зависимость между размером опухолевого узла и наличием метастазов (R=0,47; р<0,05): чем больше размер опухолевого узла, тем больше вероятность метастазирования (рис. 2).

Категориз.гистограмма: размер по группам х мтс

размер по группам: до 2

размер по группам: 2,1-6,4

Рис. 2. Распределение

СППОв зависимости от размеров опухоли и наличия метастазов (11=0,47; р<0,05)

размер по группам: 6.6-7

размер по группам: больше 7

Опухолевые узлы были инкапсулированы и хорошо отграничены от окружающей паренхимы ПЖ. В 61,5% (16/26) случаев новообразования локализовались в головке железы, в 19,2% - в ее теле и 15,4% - в хвосте. Это расширяет существующие представления о возможной локализации СППО. Так, большинство авторов отмечает, что СППО с равной частотой встречается в головке, теле и хвосте ПЖ [Martin R.C., et al., 2002; Papavramidis T., et al., 2005; Reddy S., et al., 2009]. Однако имеются также сообщения о преимущественной локализации опухоли в хвосте [Coleman К.М., et al., 2003; Nguyen N.Q., et al., 2011] или головке ПЖ [Frost M., et al., 2011; Peng-Fei Y., et al., 2010]. Статистической зависимости между локализацией опухоли в железе и ее размером не выявлено (р=0,458). Самые крупные опухоли (более 7 см) локализовались в головке ПЖ, составив 83,3% (5/6) наблюдений.

Макроскопически преобладал солидный тип строения опухоли - 69,2% (18/26) случаев, также встретился кистозно-солидный - 19,3% (5/26) и кистозный - 11,5% (3/26). Выявлена прямая корреляционная зависимость между размером опухолевого узла и макроскопическим типом (R=0,37; р<0,05). С ростом наибольшего диаметра опухоли солидный тип менялся на кистозно-

солидный, при этом корреляционная зависимость между локализацией опухоли и ее макроскопическим типом не выявлена (р=0,282).

По данным Q. Yin, M. Wang и соавт. (2011), обнаружение в СППО очагов кальциноза и оссификации является благоприятным прогностическим признаком. В проведенном исследовании очаги обызвествления чаще встречались в опухолях больших размеров, что позволило рассматривать их как один из видов вторичных изменений. Макро- и микроскопическая характеристика метастазов и рецидивных опухолей была аналогична первичным СППО.

В результате проведенного ИГХ исследования во всех наблюдениях отмечена утрата мембранной экспрессии Р-катенина и наличие цитоплазматической и/или ядерной реакции различной степени интенсивности. Следует отметить, что в неизмененной ткани ПЖ обнаружена мембранная реакция Р-катенина в протоковых и части ацинарных клеток. Выраженная ядерная экспрессия Р-катенина свидетельствует об активации WNT-сигнального пути [Ikeda S., et al., 1998]. Вместе с тем, по результатам проведенного FISH-анализа, профиль гена CTNNB1 в клетках СППО был во всех случаях диплоидным. Мутации р-катенина приводят к нестабильности комплекса межклеточной адгезии, а самой распространенной молекулой межклеточной адгезии принято считать белок Е-кадгерин [Sadot Е., et al., 1998]. В СППО в 92,3% (24/26) случаях отмечена полная инактивация Е-кадгерина, а именно отрицательная ИГХ реакция в опухолевых клетках, вне зависимости от наличия или отсутствия метастазов, а также размеров опухолевого узла. При этом в нормальной ПЖ и неизмененной панкреатической ткани при СППО наблюдали только мембранное окрашивание с Е-кадгерином в ацинарных клетках. Выявленная потеря мембранной экспрессии Е-кадгерина согласуются с результатами исследований ряда авторов [Serra S., et al., 2008; Chetty R., et al., 2008].

Несмотря на то, что полная утрата мембранной экспрессии Е-кадгерина способствует, как известно, формированию инвазивного потенциала раковых клеток и прогрессии как местной, так и отдаленной диссеминации опухоли, в СППО данной зависимости не выявлено (р>0,05). Однако с ослаблением межклеточных взаимодействий, в которых задействован Е-кадгерин, исследователи связывают образование псевдопапиллярных структур СППО [Tang W.W., et al., 2007].

Показано, что для СППО характерна выраженная цитоплазматическая . экспрессия виментина, также, в части клеток, может выявляться положительная реакция с цитокератинами (АЕ1/АЕЗ, САМ5.2) [Kosmahl М., et al., 2000; Notohara К., et al., 2000; Nguyen N.Q., et al., 2011]. В проведенном исследовании в большинстве СППО - 76,9% (20/26) - отмечена выраженная (+++) диффузная цитоплазматическая реакция с виментином в опухолевых клетках. При оценке экспрессии общего цитокератина в 50% (13/26) случаев обнаружена очаговая реакция умеренной интенсивности (++), в 38,5% (10/26) - очаговая слабой интенсивности (+) и в 11,5% (3/26) - отрицательная.

Проведенное исследование показало, что в СППО выражена диффузная ядерная реакция с циклином D1. Доля окрашенных ядер варьировала от 30% до 95%. Полагают, что такая ядерная экспрессия циклина D1 при СППО обусловлена активацией WNT-сигнального пути, вызванного мутацией Р-катенина [TanakaY., et al., 2001]. Выявлена статистически значимая связь между ядерной экспрессией Р-катенина и циклина D1 (R=0,44; р<0,05) (рис. 3).

_ г "

6 _______ й-

•г^Г

^ у Т П^ !

75 Ю 05 90 90 100 ядерная экс^рес«» Ысатешка

Рис. 3. Связь ядерной экспрессии Р-катенина и циклина Б1 (11=0,44; р<0,05).

Кроме генов циклина Б1 на длинном плече 11 хромосомы локализуются гены СБ56 и рецепторов прогестерона, экспрессия которых также часто обнаруживается в опухолевых клетках при СППО [ТЧетапп К., е! а1., 2007]. Для оценки реакции с антителами к рецепторам прогестерона применяли балльную шкалу по АПгес!, используемую при диагностике рака молочной железы [АПгес! О.С., е! а1., 1998]. Во всех наблюдениях СППО выявлена положительная реакция от 4 до 8 баллов. В неизмененной ткани ПЖ экспрессия рецепторов прогестерона обнаружена только в клетках островков Лангерганса.

Во всех наблюдениях СППО выявлена специфическая околоядерная точечная экспрессия СБ99 в клетках опухоли, вне зависимости от клинико-морфологических параметров новообразований (рис. 4). Обнаруженная специфическая экспрессия СЭ99 описана ранее рядом авторов [1л Ь., е1: а1., 2011; вио У., е1 а1., 2011].

Рис. 4. Околоядерная точечная экспрессия CD99 в клетках СППО. ИГХ-реакция; xlOOO.

Согласно современной классификации опухолей желудочно-кишечного тракта СППО относят к группе злокачественных опухолей экзокринной части ПЖ. Тем не менее, для них характерен медленный экспансивный рост и низкий уровень индекса пролиферации - экспрессии Ki-67 (WHO, 2010). Пролиферативный индекс (экспрессии Ki-67) в СППО исследованных наблюдений не превысил 7%. Выявлена прямая корреляционная зависимость средней силы между индексом пролиферации Ki-67 и размерами опухоли (R=0,40; р<0,05). Так, в 2 наблюдениях, в которых наибольшие размеры опухоли не превышали 2-х см, ее пролиферативный индекс составил менее 1%. С увеличением размеров опухолевого узла пролиферативная активность опухолевых клеток нарастала. Для СППО размерами > 5 см пролиферативный индекс составил от 2 до 5%. Самые высокие показатели индекса пролиферации Ki-67 (5-7%) оказались характерны для опухолей размерами более 7 см. (рис. 5). Полученные результаты согласуются с данными литературы [Takahashi Y., et al., 2006]. Зависимости между индексом пролиферации, макроскопическим вариантом строения опухоли и наличием метастазов не выявлено (р > 0,05).

Рис. 5. Распределение СППО по размерам и индексу пролиферации -экспрессии Кл-67 (11=0,40; р<0,05).

Дифференциальный диагноз СППО принято проводить, главным образом, с НЭО ПЖ. Результаты проведенного сравнительного комплексного клинико-морфологического и ИГХ исследования СППО и НЭО представлены в таблице

Таблица 1

Сравнительная клинико-морфологическая и иммуиогистохимическая характеристика СППО и НЭО ПЖ

Признак СППО (п=26) НЭО (п=30)

1 2 3

Клинические данные

Пол (М:Ж) 26:0 23 : 7

Возраст (лет) 15-67 (средний 33,9±2,64) 25-78 (средний 51,3±2,95)

Макроскопические данные

Локализация (%, п)

Головка 61,5% (16) 46,7% (14)

Тело 19,2% (5) 6,7% (2)

Хвост 15,4% (4) 33,3% (10)

Головка-тело 3,8% (I) 0

Головка-тело-хвост 0 6,7% (2)

Тело-хвост 0 6,7% (2)

Количество узлов один (100%) один (83%)

несколько (16,7%)

Размеры (см) 0,6- 15 (средний - 5,4±0,72) 0,6- 15 (средний - 4,4±0,62)

Цвет опухоли Серовато-белый Розовато-белый

1 2 3

Вариант строения (%, п) Солидный Кистозно-солидный Кистозный 69,2% (18) 19,3% (5) 11,5% (3) 76,6% (23) 16,6% (5) 6,6% (2)

Микроскопические данные

Солидные поля ++ ++

Трабекулярная форма - +

Псевдососочки ++ -

Выраженная строма + -

Гиалиновые шарики ++ -

Хроматин «соль и перец» - ++

Ядерная бороздка «кофейные зерна» ++ -

ядрышки - +

Иммуногистохимические данные (экспрессия антигенов)

р-катенин ядерная в 100% случаях с различной долей окрашенных ядер отрицательная

Виментин (+++) отрицательная

Рецепторы прогестерона 4-8 баллов - 100% отрицательная

С056 (++) (++)

СБ99 околоядерная точечная экспрессия - 100% цитоплазматическая и мембранная

Синаптофизин отрицательная 65,4% (17) (+) 34,6% (9) (+++) 100%

Хромогранин А отрицательная 100% (+++) 80% (24) (++) 16,7% (5) отрицательная 3,3%(1)

Циклин Б1 ядерная в 100% случаях с различной долей окрашенных ядер ядерная в 40% случаев с различной долей окрашенных ядер

Таким образом, сравнительное ИГХ исследование СППО и НЭО ПЖ с применением расширенной панели антител позволило определить оптимальный набор ИГХ маркеров для диагностики и дифференциальной диагностики СППО в сложных и/или сомнительных случаях:

1. Цитоплазматическое окрашивание - виментин (диффузная), синаптофизин (очаговая);

2. Ядерное окрашивание: р-катенин, рецепторы прогестерона (7-8 баллов), СБ99 (околоядерная точечная реакция).

В результате проведенного цитологического исследования мазков-отпечатков выявлены патогномоничные цитологические признаки, характерные для СППО: группы мелких мономорфных клеток, часто формирующих «веерообразные» структуры вокруг тонких фиброваскулярных стержней, наличие в некоторых ядрах продольных борозд (рис. 6). Данный вид исследования широко используется в предоперационной диагностике и позволяет правильно выбрать тактику дальнейшего лечения [ТИН У., й а1., 2013]. Дополнительное иммуноцитохимическое исследование повышает роль данного анализа в дифференциальной диагностике СППО.

Рис. 6. Мазок-отпечаток

СППО. Клетки опухоли с овальными ядрами

вокруг фиброваскулярного стержня. Окраска по Романовскому; хЮОО.

FISH-реакция проведена в 21 наблюдении СППО. В 4 случаях (после длительной фиксации в формалине) материал оказался непригодным для анализа результатов флуоресцентной гибридизации in situ из-за невозможности визуализировать сигналы от ДНК-зондов. В остальных случаях (17) получен сбалансированный сигнал гена С-Мус и CTNNB1 (рис. 7). Амплификация гена N-Myc выявлена в 7 из 17 исследованных опухолей (41%), среди них в 2-х случаях СППО отличались агрессивным клиническим течением с развитием метастазов.

Методом электронной микроскопии изучены образцы опухоли от 11 больных с СППО ГШ и 5 - с ГКОЯ взрослого типа. При сравнительном ультраструктурном исследовании образцов ткани опухолей обращало внимание наличие двух типов клеток как в ГКОЯ, так и в СППО. Первый тип клеток с округлыми ядрами, в которых мелкодисперсный гетерохроматин был распределен равномерно по всей нуклеоплазме с конденсацией ближе к нуклеолемме и формированием в отдельных клетках выраженных ядрышек. Второй тип клеток содержал ядра с глубокими инвагинациями нуклеолеммы в виде продольных борозд (на светооптическом уровне эти ядра имели специфический вид кофейных зерен) (рис. 8, 9).

Рис. 8. Ядра клеток ГКОЯ с продольной Рис. 9. Ядра клеток СППО с

бороздой; ЭМИ; х8900 продольной бороздой; ЭМИ; х9800

В ГКОЯ и СППО межклеточные контакты представлены мостиковидными и более плотными десмосомами. Вероятно, именно в области мостиковидных соединений, как в менее прочных, происходит разрыв клеточных контактов с формированием псевдососочковых структур. Выраженные дистрофические изменения СППО, представленные на светооптическом уровне кистозной трансформацией, нашли объяснение при ультраструктурном исследовании: вакуолизация цитоплазмы на границе опухолевых клеток и мостиковидные непрочные контакты создают предпосылки дальнейшей кистозной дегенерации опухоли.

Вопросы гистогенеза СППО ПЖ остаются спорными до настоящего времени. Так, G. Zamboni и соавт. (1999) предложили концепцию, объясняющую развитие опухолей ПЖ, чаще поражающих женщин (к ним относят серозную и муцинозную цистаденомы ПЖ). Во время эмбриогенеза (на 5-6 неделе эмбрионального развития) зачатки ПЖ локализуются близко к половым гребням, что делает возможным миграцию клеток. Проведенные отечественными учеными исследования подтвердили это предположение [Молдавская A.A., и соавт., 2011]

Согласно теории эмбриональной миграции Zamboni, примитивные ткани яичников могут быть включены в ткань ПЖ в процессе слияния ее дорсального и вентрального зачатков. После этого, дислоцированные ткани яичников могут стать источником развития опухоли в ответ на эстрогенную стимуляцию в подростковом возрасте, что косвенно подтверждается экспрессией рецепторов прогестерона опухолевыми клетками. Применительно к СППО эту теорию осветил Watanabe D. и соавт. (2010).

Из всех новообразований яичников СППО наиболее близка к ГКОЯ. Их объединяет не только морфологическое сходство, но и биологический потенциал, клиническое течение и прогноз заболевания. Основным методом

лечения для данных опухолей является их радикальное хирургическое удаление [Лиса МЛ., е! а1., 2009; Вовтап Р.Т., е1 а1., 2010; ОаЬЬэ Б., е1 а1„ 2010].

Результаты проведенного исследования подтвердили теорию эмбриональной миграции гистогенеза СППО ПЖ. Выявленные гистологические, ИГХ и ультраструктурные особенности также подтверждают близость СППО и ГКОЯ (Табл. 2, 3), что позволяет обосновать перспективы разработки сходной тактики лечения этих новообразований.

Таблица 2

Сравнительная клинико-морфологическая характеристика солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы и гранулезоклеточной

опухоли яичников взрослого типа

Сравниваемые параметры СППО ГКОЯ

Эпидемиология Редкая опухоль Встречается у женщин детородного возраста (90%)

Этиология Неизвестна

Клинические проявления Бессимптомное течение; клиническая картина «острого живота» при разрыве капсулы

Макроскопическая характеристика Узлы инкапсулированы, опухолевая ткань мягкая, встречаются светло-коричневые или желтоватые солидные участки, кистозные полости и кровоизлияния

Микроскопическая характеристика Мономорфные клетки с эозинофильной или пенистой цитоплазмой, округлыми ядрами с продольными бороздками (вида кофейных зерен); эозинофильные внеклеточные включения; низкая митотическая активность

Прогноз Пятилетняя выживаемость более 90%; метастазы при большой давности заболевания; критерии злокачественности и агрессивного поведения не определены

Таблица 3

Сравнительная иммуногистохимическая характеристика солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы и гранулезоклеточной опухоли яичников взрослого типа

ИГХ-маркеры сппо гкоя

виментин « »

(3-катенин РЯ 1 Г.'ЛИ"Л» || ■ Ц.11111 Гц

СБ56 ■ ш дщ

СБ10 ..... ШШШШт

СЭ99 «+»сЫМкс

Рецепторы прогестерона яицнв ммииинж « ! -»

СК АЕ1/3, САМ 5,2 тш^тмшш ШшоШтт

Синаптофизин «-+» релко шятт щщ

Б-100 щщщ ш

Нейрон-специфическая т

енолаза

Циклин :<<4->> нет данных

Е-кадгерин «+» нет данных

а-антитрипсин «+» нет данных

Ингибин «+>>

Кальретинин «+»

л\гг1 «+»

Рецепторы эстрогенов

Десмин «-+»редко

а-гладкомышечный «-+»редко

актин

Примечание: «+»-выраженная экспрессия маркера определяется в 100% случаев, «+-»-экспрессия маркера определяется часто, «-+»-экспрессия маркера определяется редко, «-»-экспрессия маркера не выявляется.

выводы

1. СППО является редкой опухолью ПЖ, в проведенном исследовании она составила, 4,4 и 3,4% от числа, соответственно, ее экзокринных и всех новообразований; СППО наблюдается только у женщин, преимущественно (77%) в возрасте до 44 лет (средний возраст - 33,9± 2,64 лет). Имеется прямая зависимость между размерами опухолевого узла, макроскопическим типом его строения и наличием метастазов (11=0,47; р<0,05). Более агрессивным поведением обладают опухоли размерами более 7 см солидно-кистозного типа.

2. Наиболее чувствительным ИГХ маркером для диагностики СППО является СБ99 (экспрессии в 100% наблюдений); оптимальная ИГХ панель для диагностики и дифференциальной диагностики СППО включает в себя набор антител к С099, Р-катенину, рецепторам прогестерона, синаптофизину и виментину.

3. Специфическими цитологическими признаками СППО являются группы мелких мономорфных клеток, формирующие сосочки или «веерообразные» структуры вокруг тонких фибро-васкулярных стержней, а в ядрах клеток опухоли - продольные бороздки (ядра вида кофейных зерен).

4. В СППО обнаружена амплификация гена К-Мус (41% наблюдений), из них в 12% случаев опухоли обладали агрессивным биологическим поведением.

5. На ультраструктурном уровне клетки СППО и ГКОЯ имеют много общих признаков, что в совокупности со сходным морфологическим строением и биологическим потенциалом подтверждает теорию гистогенеза СППО в результате эмбриональной клеточной миграции.

6. Более агрессивным поведением обладают СППО с наибольшими размерами (более 7 см) и пролиферативным индексом (экспрессией Кь67) > 2% клеток (11=0,40; р<0,05). Статистически значимых гистологических и ИГХ критериев злокачественности опухоли не обнаружено.

Практические рекомендации

1. Пациентам с СППО при исследовании операционного материала с диагностической и прогностической целью целесообразно проведение комплексного морфологического исследования, включающего наряду с рутинным гистологическим исследованием, ИГХ, цитологическое и, по возможности, молекулярно-биологическое.

2. Для дифференциальной диагностики СППО рекомендуется применение ИГХ панели, включающей антитела к CD99, ß-катенину, рецепторам прогестерона, синаптофизину и виментину.

3. Морфологическое заключение при СППО должно быть максимально полным и содержать детальное описание опухоли с указанием размеров, макроскопического типа новообразования, индекса пролиферации (экспрессии Ki-67) и стадии прогрессии по международной системе стадирования опухолей (TNM).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кригер А.Г., Сложности диагностики и возможности хирургического лечения солидно-псевдопапиллярных опухолей поджелудочной железы. / Горин Д.С., Берелавичус C.B., Паклина О.В., Казаков И.В., Гордиенко.Е.Н. // Хирургия. Журнал имени Н.И.Пирогова. - 2013. - №1. - с.72-75.

2. Гордиенко E.H., Семейство Мус генов в солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы. / Паклина О.В., Чекмарева И.А., Ротин Д.Л., Горин Д.С. // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. - 2013- №2. - с. 13-21.

3. Паклина О.В., Гистогенез солидно-псевдопапиллярной опухоли поджелудочной железы. / Гордиенко E.H., Чекмарева И.А. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - Том VIII, №2. - с.64-68.

4. Гордиенко Е.Н., Солидно-псевдопапиллярная опухоль поджелудочной железы. Актуальные клинико-морфологические и молекулярно-биологические аспекты. Обзор литературы. / Паклина О.В., Чекмарева И.А., Горин Д.С. // Хирургия. Журнал имени Н.И.Пирогова. - 2013. - №8. - с.70-75.

5. Gordienko E.N., Amplification of MYC oncogene in solid pseudopapillary tumor of the pancreas. / Paklina O.V., Rotin D.L.,Chekmareva I.A., Setdikova G.R. // Abstracts of Russian-German medical forum "Diseases of the Pancreas. Innovations in Diagnostics and Therapy. - Санкт-Петербург, 2013. - с. 39.

6. Gordienko E., Genetic aberrations in solid pseudopapillary tumor of the pancreas. / Chekmareva I., Paklina O., Rotin D. // VirchowsArchiv. - 2013, V.463, N.2, pp.101352, p.289

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 387. Тираж 100 экз.