Автореферат и диссертация по медицине (14.00.53) на тему:Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в экспериментальных опухолях у старых животных

На правах рукописи

/ /

БАРЫКИНА Ольга Павловна

ПЕПТИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА, МИКРООКРУЖЕНИЯ И АНГИОГЕНЕЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ У СТАРЫХ ЖИВОТНЫХ

14.00.53 - геронтология и гериатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2004

Работа выполнена в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Кветной Игорь Моисеевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

доктор биологических наук Монахов Александр Степанович

Ведущая организация:

Военно-медицинская академия Минобороны РФ

диссертационного Совета Д601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110 Санкт-Петербург, пр. Динамо, д.3.)

Защита состоится

на заседании

Ученый секретарь диссертационного Сов кандидат биологически

Автореферат разослан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание уделяется исследованиям механизмов развития возрастной патологии, в частности опухолей, и разработке новых геропротекторных препаратов.

Известно, что одной из важных особенностей злокачественных новообразований является их автономный рост, ре1улируемый локально продуцируемыми факторами [Кушинский Н.Е. и др. 2000, Nicolson G.L., 1993]. К таким аутокринным и паракринным регуляторам пролиферации опухолевых клеток относят «факторы микроокружения» опухолей, продуцируемые как самими опухолевыми клетками, так и клетками окружающей их стромы [Argiles J.M., Azcon-Bieto J., 1988J. Продуцируемые эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и тучными клетками интерлейкины, простагландины, регуляторные пептиды прямо или косвенно влияют на пролиферацию и индуцированную гибель опухолевых клеток.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о непосредственном участии клеток микроокружения опухолей в патогенезе злокачественного роста и их влиянии на чувствительность и ответ опухолевых клеток к той или иной методике лечения [Ярилин А А, 1999, Tutton P.J., 1987]. В процессе злокачественной трансформации клеток белковые продукты аберрантной экспрессии мутантных генов потенциально иммуногенны и могут служить в качестве антигенов отторжения. Однако, несмотря на то, что опухолевые клетки несут антигены, способные активировать цитотоксические Т-лимфоциты и вызывать образование антител, многие опухоли способны избегать механизмов иммунного надзора и не разрушаться факторами иммунной системы. Помимо множественных механизмов «ухода» от иммунных факторов, существуют механизмы защиты опухолевых клеток, основанные на индукции иммуносупрессии [Wu J., 1996]. Расшифровка и молекулярный анализ механизмов, лежащих в основе ухода опухолей от иммунного надзора, приведет к развитию новых стратегий для предотвращения у онкологических больных Т-клеточной иммуносупрессии. развитию новых иммунотерапевтических мероприятий, способных предотвращать прогрессию злокачественных новообразований и их развитие.

Одним из перспективных направлений терапевтических мероприятий в онкологии является применение биомодуляторов, повышающихГ усиливающих эффект противоопухолевых химиопрепа

ратов {ивАИОИКА СПетср

09 »о

Щ^ёЗ

Long S.J., 1996, Lumsden A.J. et ah, 1996]. Перспективными синтетическими пептидами, обладающими иммуномодулирующими свойствами и оказывающими влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, неспецифическую резистентность организма, являются вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В., 2000]. Исследование онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталона, их влияния на ангиогенез и микроокружение экспериментально индуцированных опухолей позволит более глубоко понять механизмы действия пептидов как биологических модификаторов, способных активировать эндогенные противоопухолевые защитные механизмы.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталона, их влияния на ангиогенез и микроокружение экспериментально индуцированных опухолей у старых крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие вилона на продолжительность жизни старых мышей-опухоленосителей эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис (КЛЛ);

2. определить способность вилона влиять на пролиферативную активность опухолевых клеток и уровень апоптоза в КЛЛ;

3. оценить эффекты действия вилона на КЛЛ при сочетанном применении с циклофосфаном;

4. изучить эффекты вилона при иммуносупрессорном действии опухоли на организм старых мышей;

5. исследовать влияние вилона и эпиталона на рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс и их онкомодифицирующее действие в условиях нарушенного ангиогенеза и пострадиационной гипоксии.

Научная новизна

В работе впервые получены новые данные о пролиферотропных и онкомодифицирующих свойствах синтетических пептидов — вилона и эпиталона, их влиянии на микроокружение экспериментально индуцированных опухолей и на продолжительность жизни старых животных - опухоленосителей. Установлены

молекулярно-клеточные механизмы действия пептидов на пролиферацию эндотелиальных клеток, функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и ангиогенез.

Практическая ценность работы

Полученные данные об ингибировании роста экспериментальных опухолей под действием пептидов, снижении иммуносупрессорного действия опухоли на организм под их влиянием, коррекции вилоном тимусзависимого иммунодефицита создают основу для дальнейшего изучения синтетических коротких пептидов, как естественных онкомодифицирующих факторов и разработки новых методов биотерапии опухолей в пожилом и старческом возрасте.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Синтетический пептид вилон оказывает онкомодифицирующее действие на рост эпителиоидной опухоли — карциномы легких Льюис у старых мышей, при этом эффективность его действия на опухоль зависит от дозы и продолжительности применения.

2. Выявленное снижение иммуносупрессорного действия опухоли на организм старых животных и коррекция вилоном тимуезависимого иммунодефицита создают основу для изучения его применения в качестве стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных пожилого и старческого возраста иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

3. При сочетанном применении вилона и циклофосфана тормозящее действие циклофосфана на рост опухолей менее выражено, чем при его изолированном применении и сопровождается повышением пролиферативной активности клеток нормальных тканей, что предполагает нецелесообразность одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.

5. Синтетический пептид эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс. По механизму действия

исследованный препарат можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей.

6. Полученные данные свидетельствуют об актуальности дальнейших исследований по изучению синтетических коротких пептидов как естественных биологических модификаторов опухолевого роста в пожилом и старческом возрасте.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на конференции Белорусской Академии Наук, (Минск, 2003), на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 2-ом съезде геронтологов России (Москва, 2003), Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2003).

Результаты диссертации используются в научной, клинической и педагогической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМП, НИИ онкологии им. Н.Н Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. ДООтта РАМН, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломною образования Минздрава РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертация выполнена по основному плану научно-исследовательских работ Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы биорегуляции злокачественного роста опухолей, роли peгуляторных пептидов в онкогенезе и коррекции иммунного статуса при опухолевом процессе. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, примененных в данном исследовании Главы 3 и 4 являются изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждением.

Текст диссертации изложен на 119 страницах, иллюстрирован 21 рисунками, 3 таблицами Указатель литературы содержит 175 работ, из них отечественных - 26, иностранных - 99.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение действия вилона па карциному легких Льюис у старых мышей Эксперименты выполнены на 80 самцах мышей линии С57В1/6 в возрасте 16-18 месяцев. В качестве объекта исследования использовали перевиваемый штамм эпителиоидной опухоли - карциному легких Льюис (КЛЛ) Суспензию опухолевых клеток вводили подкожно в правую заднюю конечность мышей инсулиновым шприцем по 50 мкл из расчета 105 клеток на одну инокуляцию. Чтобы обеспечить однородность опухолевого штамма в исследуемых группах материал от одной опухоли был введен 80 животным. Животные с имплантированной КЛЛ распределили на пять групп 1-я группа - животные - опухоленосители, не подвергающиеся воздействиям препаратов; 2-я группа - введение вилона животным на 8-17 сутки роста опухолей в разовой дозе 2 мкг/мышь (0,1 мг/кг) - 10 инъекций через сутки с курсовой дозой 20 мкг препарата на мышь (1 мг/кг массы тела); 3-я группа - введение вилона животным на 8-17 сутки роста опухолей в разовой дозе 100 мкг/мышь (5,0 мг/кг) - 10 инъекции через сутки с курсовой дозой 1,0 мг препарата на мышь (50 мг/кг массы тела); 4-я группа — введение животным опухоленосителям циклофосфана курсовой дозой 100 мг/кг. Производили три введения циклофосфана в разовой дозе 0,67 мг/мышь: первое на 8 день после перевивки опухолей, второе на 13-е и третье на 17-е сутки роста КЛЛ; 5-я группа - введение вилона по схеме 3-й группы и циклофосфана по схеме 4-й группы. Вилон и циклофосфан вводили внутрибрюшинно отдельными инсулиновыми шприцами.

Размеры опухолей на месте прививки определяли 2-3 раза в неделю и рассчитывали их объем по формуле эллипсоида:

V = 4/Зл(Ш)- (0/2)- [мм3], где Ь - длина опухоли; О = (Э, + 02)/2, а И, и - 2

других взаимно перпендикулярных диаметра (мм)

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен контрольный срок для гистологического изучения карциномы - 18-е сутки роста опухолей (10-е сутки от начала курсового лечения препаратами; 24 часа после последней инъекции препаратов в опытных группах). Эвтаназию мышей осуществляли путем дислокации спинного мозга.

Ткань КЛЛ вырезали в виде пластинок толщиной 3-4 мм, ориентированных вдоль длинной оси опухолевого узла. Также для исследования брали тимус и желудок. Кусочки опухоли и выделенные органы фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для

светомикроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. Обезвоженный материал заливали, соответственно, в очищенный гомогенизированный парафин для гистологических исследований и смесь эпонов (Epoxy-Einbettungsmittel-Kit, SMT Geraetehandel GmbH, Германия) для электронной микроскопии.

Изучение действия вилона и эпиталона на саркому М-1 у старых крыс Объектом для исследования была выбрана саркома М-1 - солидная соединительнотканная опухоль, имплантированная самцам белых беспородных крыс в возрасте 2 лет. Материал для имплантации получен от опухоли животного-донора при достижении ею объема 1 см3. После удаления капсулы, геморрагических и некротизированных участков паренхиму опухоли разрезали на кусочки массой 5-6 мг. Затем с помощью троакара трансплантат вводили под кожу в правое бедро крыс. Чтобы обеспечить однородность опухолевого штамма в исследуемых группах материал от одной опухоли был введен 90 животным. На 11 сутки 60 животных с пальпируемыми опухолевыми узлами правильной формы методом случайного отбора были распределены на 4 группы по 15 крыс: 1 группа - контроль; 2 группа - введение эпиталона; 3 группа -гамма-облучение опухолей в дозе 30 Гр; 4 группа - гамма-облучение опухолей в дозе 30 Гр + введение эпиталона. Общий процент прививаемости составил 84%. Измерение трех взаимно перпендикулярных диаметров опухолей производили 2-3 раза в неделю. Объем опухоли рассчитывали по вышеприведенной формуле.

На 18 сутки в экспоненциальной фазе роста саркомы животным 2 и 4 групп начинали вводить эпиталон. К этому сроку средний объем опухолей в контрольной группе достиг 1 см3. Препарат вводили внутрибрюшинно по 0,5 мкг на животное 7 дней подряд отдельным инсулиновым шприцем.

Местное однократное гамма-облучение опухолей животных 3 и 4 групп в дозе 30Гр выполнено на кобальтовой установке «Луч» при мощности дозы 0,8 Гр/мин. Размер поля облучения составил 10x10 см, время экспозиции 37,5 мин. В ноле облучения выводились и жестко фиксировались в области голеностопного сустава задние правые конечности с опухолями. Выбор дозы в 30 Гр был обусловлен необходимостью провести максимально возможную лучевую инактивацию опухолевых клеток при однократном облучении с учетом толерантности кожи крыс. Облучение проведено на 16 сутки роста опухолей (за 2 суток до начала введения эпиталона в 4 группе). Острые лучевые реакции кожи над опухолью оценивали на 10 сутки после гамма-облучения.

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен контрольный срок для гистологического изучения саркомы - 26 сутки роста

опухолей (2 сутки после окончания введения эпиталона во 2 и 4 группах); 10 сутки после гамма-облучения в 3 и 4 группах. Забой животных и выделение опухолей проведен под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). Ткань саркомы вырезали в виде пластинок толщиной 3-4 мм, ориентированных вдоль длинной оси опухолевого узла, с возможным сохранением прилегающей кожи. Кусочки фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для светомикроскопических исследований и по Карновскому для проведения электронной микроскопии- Обезвоженный материал заливали, соответственно, в парапласт и эпон.

Методы исследования Общую гистологию органов и опухолей изучали на гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Ультраструктурные исследования проводили в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) на ультратонких срезах, приготовленных на ультрамикротоме LKB-7A (Швеция), контрастированных уранилацетатом и цитратом свинца. Тип клеток идентифицировали способом серийных полутонких - ультратонких срезов. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим -азуром II - основным фуксином Тучные клетки селективно окрашивали 1% раствором толуидинового синего.

Для изучения пролиферативной активности клеток использовали мышиные моноклональные антитела к PCNA (1:100, Novocastra) и набор для выявления мышиных иммуноглобулинов (1CN, США) Серотонин-иимунопозитивные клетки выявляли с помощью поликлональных кроличьих антител к серотонину (1:50, BioGenex) и биотин-стрептавидин-пероксидазного набора (ICN). Для изучения гастринпродуцирующих клеток применяли кроличьи антитела к гастрину (1:50, DAKO) и авидин-биотин-пероксидазный набор (Sigma). Иммуноглобулин (Ig) -содержащие клетки идентифицировали набором для выявления мышиных иммуноглобулинов (BioGenex). Адгезионную связь клеток саркомы M-1 с базальной мембраной эндотелия сосудов и их способность к локальной инвазии изучали с помощью поликлональных кроличьих антител к ламинину (1:30, Sigma) и авидин-биотин-пероксидазного набора для кроличьих иммуноглобулинов (Sigma).

Функциональную активность опухолевых клеток изучали методом избирательной импрегнации ядрышковых организаторов. Определение числа апоптозных клеток и характера их распределения в паренхиме опухоли проводили на препаратах, импрегнированных по методу Мозера.

Индекс апоптоза (1АП) и митотический индекс (1мит) У животных с КЛЛ определяли по стандартной методике при иммерсионном увеличении микроскопа при подсчете не

менее 3000 ядер опухолевых клеток. Пролиферативный показатель по PCNA (IPCNA) определяли как отношение количественной плотности PCNA-позитивных ядер (NPCNA) К количественной плотности ядер клеток (Мяок). окрашенных гематоксилином. Количественную плотность определяли по числу сечений ядер на 1 мм2 площади среза. Исследования по определению Npcna И N Я O K выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR (Франция) с применением прикладных лицензионных программ Morphostar-2 и Colquant-2. Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили не менее чем в 60 визуальных тестовых полях по трем срезам каждой исследуемой опухоли. При этом тестовая площадь для ядер опухолевых клеток и определения индекса PCNA составляла 0,5 мм2 и включала не менее 2000 опухолевых клеток в препаратах контрольной группы; для ЗОЯ = 0,3 мм2 и включала не менее 1000 ядрышковых организаторов.

Кинетику роста опухолей рассчитывали по уравнениям линий тренда для участков, соответствующих определенным стадиям развития опухолей. Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением программы Statistika 5.0 (Statsoft).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие вилона на карциному легких Льюис (КЛЛ) у старых крыс

Контрольная группа (1 группа).

Опухолевые узелки появляются под кожей бедра на 4 - 6 сутки после имплантации опухолевых клеток. Опухоли привились у всех животных первой группы и к 8-м суткам достигли размеров, позволяющих проводить достаточно точные измерения. Самопроизвольного рассасывания привившейся карциномы не. зарегистрировано. В интервале от 8-х до 18-х суток большинство опухолей растет в достаточно узком диапазоне варьирования. Наиболее интенсивный рост наблюдается до 20-х суток, а кривая роста отображается формулой: V(t) = Vo X t", где а - коэффициент, определяющий скорость роста опухолей. В процессе роста время удвоения объема опухолей постепенно увеличивается от 2-х до 4-х суток. В контрольном интервале времени прирост массы опухолей по средней геометрической (G (я-18)) составил 289± 9,5 мм3. Первые животные в этой группе погибли на 21 сутки, последние — на 24. Средняя продолжительность жизни старых мышей после имплантации опухолей составила 23,0 ± 0,5 суток.

Гистологически карцинома легких Льюис имеет солидно-инфильтрирующий тип строения с выраженным клеточным полиморфизмом, явлениями тканевой и клеточной

атипии. Зоны инвазии имеют неправильные границы, образованы отдельными клетками или их скоплениями в виде небольших агрегатов и трабекулярных тяжей.

Известно, что опухолевая инвазия является результатом патологических взаимодействий между опухолевыми клетками, межклеточным матриксом и стромой. Активное участие в этих событиях принимают стромальные клетки микроокружения -фибробласты, макрофаги, эндотелиальные и тучные клетки. Инвазивность коррелирует со снижением адгезионных свойств опухолевых клеток, их подвижностью, потерей контактного торможения, выделением ферментов и других факторов, обусловливающих агрессивность новообразования.

При изучении ультраструктурной организации опухолевых клеток в группе старых животных без введения вилона установлено, что в интерфазных"клетках ядра крупные, занимают большую часть клетки, имеют полиморфную форму, иногда с глубокими инвагинациями, расщепляющими их на сегменты. На поверхности клеток определяется наличие пальцевидных выростов цитоплазмы. Цитоплазма опухолевых клеток содержит достаточное количество органоидов. Хорошо дифференцируются многочисленные фигуры митоза и единичные клетки, погибающие в форме апоптоза.

Характерной картиной для клеток КЛЛ является выраженный ультраструктурный полиморфизм. На гистологических препаратах определяется зональная неоднородность распределения кровеносных сосудов в паренхиме опухоли. Так, относительно васкуляризированы зоны инвазий опухолевых клеток в интактную ткань. В зонах инвазивного роста КЛЛ микроциркуляторное русло представлено тонкостенными сосудами синусоидного типа. Ядра эндотелиальных клеток имеют вытянутую овальную форму. В просвете сосудов часто обнаруживаются опухолевые клетки.

Результаты проведенных исследований показывают, что в зонах инвазии, в сетчатом слое дермы и подкожной клетчатке над опухолью концентрируются многочисленные тучные клетки. Их количественная плотность у животных -опухоленосителей контрольной группы составляет 162±22 клетки при их объемной плотности 0,64± 0,04 у.е., что почти в два раза выше, чем в зоне имплантации опухолей у интактных мышей. В зонах инвазии можно наблюдать миграцию тучных клеток в паренхиму опухоли.

Наши исследования покатали, что большая часть клеток стромального микроокружения карциномы представлена клетками гранулоцитарного ряда, в основном, моноцитами и макрофагами. Особенно высоко содержание макрофагов в зонах инвазивного роста опухолей. Обращает внимание, что в опухолевых клетках, которые непосредственно контактируют с макрофагами, цитологических признаков токсического

воздействия не обнаруживается. По данным проведенного нами компьютерного анализа микроскопических изображений, в периферической зоне плотность опухолевых клеток по ядрам, окрашенным гематоксилином, составляет 5022±124 клетки на 1 мм2. Рассчитанная фракция пролиферирующих клеток по индексу PCNA = 47,4 ± 1,7%. В ядрах определяются от 3 до 11 ядрышковых организаторов. Их интегральное содержание в ядре - 26,2±0,48%. Митотический индекс опухолевых клеток равен 2,15±0, 17%. На препаратах, импрегнированных серебром по Мозеру, апоптотический индекс составляет 0,99±0,06%. По индексу соотношения (!С = 2,17) митотическая активность опухолевых клеток почти в 2 раз выше, чем их гибель по механизму апоптоза.

При окрашивании паренхимы опухолей на иммуноглобулины позитивный продукт реакции выявляется в виде характерной сеточки, интенсивность которой более выражена вокруг сосудов. Продукт реакции контурирует в основном стромальные клетки. Вокруг опухолевых клеток видна следовая позитивная реакция при иммерсионном увеличении микроскопа. В паренхиме и в тканях, окружающих опухоли, обнаруживаются единичные ^-позитивные клетки с невысокой интенсивностью иммуноокрашивания цитоплазмы. Суммарное содержание ^-позитивного продукта у животных первой группы составляет 2,7±0,16%.

Действие вилона в курсовой дозе 1 мг/кг (2-я группа) По данным сравнительного анализа существенных изменений в динамике роста опухолей после инъекций вилона в указанной курсовой дозе не отмечено. Однако средняя продолжительность жизни животных в этой группе возросла на 13% и составила 26,0±0,7 суток (р < 0,05).

Действие вилона в курсовой дозе 50 мг/кг (3-я группа) В начальном интервале времени диапазон варьирования и кривые роста опухолей, построенные по средним значениям, в третьей и контрольной группе практически совпадают. Явных отклонений параметров роста отдельных опухолей от средних значений не выявлено. Однако после пятой инъекции вилона на 13-е сутки появляется отчетливая дивергенция между кривыми роста в опыте и контроле, а в последующий период линия роста новообразований в третьей группе располагается выше. Прирост массы опухолей по средней геометрической увеличился относительно первой группы на 33,5% (р < 0,05), а коэффициент а- на 11% .

Средняя продолжительность жизни животных в третьей группе снизилась до уровня контрольной группы животных-опухоленосителей.

Действие циклофосфана на опухоли при курсовой дозе 100мг/кг (4-я группа) У большинства животных эффект торможения роста опухолей начинает проявляться уже после первой инъекции цитостатика. По данным сравнительного анализа, на этапе наблюдений между 13-27-ми сутками отмечается наиболее выраженное торможение роста первичных опухолевых узлов. В контрольном интервале прирост массы привившихся опухолей был на 25% ниже, чем в контроле (Св.|8 = 219+33; р< 0,05). Коэффициент а, определяющий кинетику роста по степенной зависимости, снижается до 1,8. Средняя продолжительность жизни животных увеличилась на 15% относительно первой группы опухоленосителей и составила 26,4+0,8 суток.

Сочетайте действие вилона и циклофосфана (5-я группа) Обращает внимание своеобразная «синхронизация» ответа опухолей на введение циклофосфана в этой группе. Практически у всех животных регистрируется снижение скорости роста имплантированных новообразований в раннем периоде совместного применения вилона и циклофосфана, что подтверждается и тенденцией к снижению прироста массы опухолей (О^в = 189+23). До 20-х суток диапазон варьирования и кривые роста, построенные по средним значениям, для пятой и четвертой группы в основном, совпадают. Мало отличаются и количественные данные, полученные по уравнениям линий тренда. Однако в последующий период времени при сочетанном применении вилона и циклофосфана наблюдается очевидное ускорение роста новообразований. Средняя продолжительность жизни животных после сочетанного применения вилона и цитостатика снизилась до 21 суток (р < 0,05).

Таким образом, результаты кинетических исследований свидетельствуют, что синтетический дипептид вилон оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной эпителиоидной опухоли - КЛЛ. Онкомодулирующее действие этого препарата зависит от дозы и продолжительности его применения.

Введение вилона в разовых дозах 0,1 мг/кг в период активной фазы роста КЛЛ практически не влияет на ее кинетические параметры, но достоверно увеличивает продолжительность жизни опухоленосителей. Увеличение разовых доз исследуемого препарата до 5,0 мг/кг сопровождается активизацией темпа роста опухолей.

При сочетанном действии вилона и циклофосфана, в раннем периоде комбинированного лечения проявляется синхронизация ответа опухолей на тормозящее действие цитостатика с последующим ускорением скорости роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных.

Действие пилона на кинетику роста, ангиогенез и мнкроокруженне саркомы М-1

Действие вилона в дозе 0,5мкг в латентном периоде и экспоненциальной фазе роста опухоли (вторая и третья группы)

У животных второй группы опухолевые узелки в зоне имплантации начали визуализироваться на 7 - 13 сутки после перевивки. До 24 суток существенных изменений в скорости роста опухолей по коэффициенту а не регистрируется, однако обращает внимание, что прирост массы опухолей в этот период по средней геометрической снизился на 25% и составил 0,48±0,09 (р>0,05). Расхождение линий роста по средним значениям в контрольной и опытной группе было отмечено лишь через 2 недели после окончания введения вилона. по коэффициенту а уравнения линии тренда в интервале между 28 и 40 сутками темп роста опухолей снижался в 1,7 раза, а прирост массы опухолей по средней геометрической уменьшался на 33,2%. Различие становится достоверным по отношению к контрольной группе при р=0,05. Средняя продолжительность жизни животных-опухоленосителей в второй группе составила 40,5±3,4 сут (р>0,5).

В группе животных с введением вилона в дозе 0,5 мкг в экспоненциальной фазе роста. опухолевые узелки появились в зоне имплантации на 5-7 сутки (как и в контрольной группе). До 24 суток кинетические параметры роста саркомы в 3 группе практически не отличались от контрольных значений. В экспоненциальной фазе диапазон варьирования индивидуальною роста опухолей и кривые роста, построенные по средним значениям, практически совпадали. Коэффициент, определяющий кинетику роста по экспоненциальной зависимости, и прирост массы опухолей не отличались от аналогичных показателей, определенных для контрольной группы. В последующий период была отмечена тенденция к снижению скорости . роста и прироста массы опухолей,— коэффициент а снижается до значения 1,16, G28 40= 13,56± 1,63, однако различие с контрольными значениями не достоверно. Средняя продолжительность жизни животных -опухоленосителей в третьей группе увеличилась до 42,3± 3,6 суток (р>0,5).

При изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, и на полутонких срезах существенных изменений в гистологическом строении опухолей после введения вилона в разовых дозах 0,5 мкг не выявлено. Ультраструктурная организация паренхимы саркомы также соответствовала вариантам контрольной группы. Однако обнаружена активизация клеток стромы, Так, например, чаще регистрировались клетки гранулоцитарного ряда типа моноцитов, тучные клетки и нейтрофильные лейкоциты.

Результат гистохимических и иммуногистохимических исследований также практически полностью совпадали с данными по контрольной группе (таблица). В подкапсульной зоне количественная плотность опухолевых клеток во 2 группе составляет 4080±190 на 1 мм2, в 3 группе - 4136± 170. Пролиферативная активность по индексам PCNA оставалась столь же высокой, как и в контрольной группе. Вместе с тем, по данным компьютерного анализа, индекс апоптоза опухолевых клеток во 2 группе увеличился до 0,33±0,02, а в третьей группе составил 0,38±0,02.

Действие вилона в дозе 5,0 мкгв латентном периоде и экспоненциальной фазе роста опухоли (четвертая и пятая группы)

В четвертой группе латентный период времени до появления опухолевых узелков составил 6-7 дней, однако наблюдения над животными показали, что прививаемость саркомы в этой группе снизилась до 80%. По данным количественного анализа, в экспоненциальной фазе прирост массы привившихся опухолей по средней геометрической был в 1,7 раза выше по сравнению с контрольной группой 1,08±0,17), а в период 28 - 40 суток этот показатель превышал контрольные значения на 23% (О2840 = 18,05±2,5). Средняя продолжительность жизни животных после имплантации опухолей в этой группе составила 35,9 ± 4,2 суток (р>0,5).

В пятой группе опухоль не привилась у одной крысы В трех случаях после двух инъекций вилона в разовых дозах 5 мкг рост привившихся опухолей прекратился. В последующие несколько дней они полностью регрессировали. В интервале времени 10-24 сут существенных отклонений в характере роста отдельных опухолей от средних значений в контрольной группе не отмечено. Диапазон варьирования и кривые роста, построенные по средним значениям, в основном, совпадают. Не отличаются и количественные данные, полученные по уравнениям линий тренда. Однако на 5-7 сут после окончания инъекций вилона у 4-х животных кривые роста начали отклоняться от средних значений, характерных для контрольных животных. Замедленный темп роста опухолей сохранялся около 10 суток. По уравнению линии тренда в период 28-40 сут коэффициент а снизился на 20%, а прирост массы опухолей уменьшился на 23%. Средняя продолжительность жизни животных в 5-й группе составила 38,9 ± 2,6 суток.

При изучении гистологического строения опухолей животных 4-й и 5-й групп обращают внимание характерные изменения со стороны микроциркуляторного русла в капсуле и подкапсульной зоне. Просвет сосудов был расширен. Периваскулярно определялись характерные признаки отека с выходом форменных элементов крови в межклеточное пространство. В 5-й группе животных периваскулярный и

интерстициальный отек был выражен в большей степени. Проведенный анализ гистологических препаратов позволяет предположить, что введение достаточно больших доз вилона, по-видимому, стимулирует гемодинамику в опухолях. При этом в ранние сроки на первый план выступает усиление кровенаполнения практически всех звеньев сосудистого русла в саркоме, а в более поздние сроки - активизируется ангиогенез.

Пролиферирующие опухолевые клетки были концентрически сгруппированы вокруг новообразующихся капилляров в виде небольших групп. По ультраструктурным характеристикам (крупные ядра с гипертрофированными ядрышками; цитоплазма, насыщенная свободными рибосомами, слабо развитый пластинчатый комплекс) клетки саркомы М-1 в 4-й и 5-й группах практически не отличались от опухолевых клеток контрольной группы. Тучные клетки и моноциты в зонах их дифференцировки тесно контактировали с опухолевыми клетками. У животных, получавших вилон в разовых дозах 5 мкг, было отмечено повышение митотической, пролиферативной и функциональной активности эндотелиальных клеток. Кроме того, по данным количественною анализа, в подкапсульной зоне была отмечена небольшая тенденция к усилению пролиферативной и функциональной активности опухолевых клеток. Однако вместе с этим увеличивался индекс апоптоза опухолевых клеток. В 4-й группе индекс апоптоза составил 0,43+0,07; в 5-й группе - 0,49+0,02 (р<0,05).

При иммуноокрашивании препаратов на ламинин, существенных изменений в его экспрессии не выявлено. В то же время, заметно возросло содержание серотонин-иммунопозитивных клеток в нериваскулярной строме. Как и в контрольной группе, признаки экспрессии регуляторных пептидов в стромальных клетках микроокружения отсутствуют. Практически не выявлялись клетки с позитивной реакцией на иммуноглобулины В отличие от предыдущих групп, в 5-й группе животных отмечена повышенная дегрануляция тучных клеток в подкожной клетчатке, паретическое расширение сосудов капсулы и появление локальных микроочагов некроза в подкапсульной зоне опухолей.

Действие эпиталона на кинетику роста и функциональную морфологию саркомы М-1

До 24 суток рост опухолей в 6-й опытной группе практически полностью соизмерим с контролем. Однако на 2 - 4 день после окончания введения испытуемого препарата появляется отчетливая дивергенция линий роста. В период 28-40 сут прирост массы опухолей по средней геометрической снизился на 26% относительно контрольной

группы (р<0,05). По коэффициенту а скорость роста опухолей в группе животных, леченых эпиталоном, снижается в 1,5 раза (таблица). После 40 сут скорость роста опухолей начинает увеличиваться. При этом угол наклона кривой практически совпадает с контролем, а коэффициент а возрастает с 0,88 до 1,2. Средняя продолжительность жизни животных в этой опытной группе увеличилась на 20% и составила 44,9±2,7 сут (р<0,05).

Таким образом, по данным кинетических исследований, эпиталон достоверно замедляет рост саркомы М-1, а тормозящий эффект сохраняется в течение 2-х недель после окончания курса введения препарата.

Микроскопически в опухолях этой группы обнаружено появление в периферических зонах обширных, протяженных очагов некроза с вовлечением сосудов. В этих зонах пролиферирующие клетки сохранялись в виде «опухолевых манжеток», а оставшаяся часть паренхимы была представлена полями недавно погибших клеток с пикнотичными ядрами. В двух случаях гистологический рисунок опухолей в целом мало отличался от контроля. Однако в подкапсульной зоне крупные сосуды расширены, а в капиллярах видны признаки стаза крови. Кроме этого, в качестве характерного признака опухолей в этой группе можно отметить появление вокруг сосудов многочисленных клеток, окрашивающихся толуидиновым синим. Клетки дали отчетливую позитивную иммуногистохимическую реакцию на серотонин. При использовании метода серийных полутонких - ультратонких срезов эти серотонинпозитивные клетки были идентифицированы как тучные клетки. По своим ультраструктурным и иммуногистохимическим характеристикам идентифицированный нами тип клеток фенотипически отличается от тучных клеток, концентрирующихся по периферии опухолей, и больше соответствует интраэпителиальным тучным клеткам желудочно-кишечного тракта. Поскольку, ранее подобный тип тучных клеток в коже мышей был описан de Rey et al. (1994) при изучении механизмов экспериментального канцерогенеза, мы обозначили их как тучные клетки интратуморального типа. Детальное электронно-микроскопическое исследование показало, что после пролонгированного введения эпиталона основные события развертываются в периваскулярной строме. Судя по увеличению содержания коллагеновых волокон, активизировалась деятельность фибробластов. В подкапсульных участках опухолей обнаружены многочисленные моноциты, являющиеся, как известно, предшественниками макрофагов, и наряду с естественными киллерами, активированными Т-лимфоцитами и тучными клетками, обладающие противоопухолевой иитотоксичностью.

Таблица. Сравнительные характеристики изученных параметров по данным компьютерного анализа

в контрольной и опытных группах

Группа животных Нж ^ на 1 мм2 1гскл (%) 'миг (%) 1апопт {%) 1с 5зоя мкм2 Рзоя (%) Мтк(СТТ) на 1мм Нт'1 Г^ТК(СТП на 1 мм 11пГ2

1 (контроль) 4220±80 76,512,6 2,28+0,09 0,28+0,03■ 8,2+0,54 2,70+0,08 2,40+0,18 80-130 0-10

2 (эпиталон) ;4230+120 74,5+2,7 1,89+0,11 Р2.1>0,05 0,67±0,13 р2,|<0,05 3,26+0,59 Рд,1<0,()5 2,80+0,03 рц>0,05 7,38+0,17 70-140 20-90

3 (облучение) 35601205 р.!, 1 <0,05 62,3+3,9 р.,., <0,05 2,31+0,06 1,50±0,18 Р.1.1<0,01 1,6110,14 Р.1,1<0,01 3,1010,02 р3.1<0,05 5,90+0,14 рз,,<0,01 90-180 10-30

4 (облучение+ эпиталон) 33201190 рд_,>0,05 61,1+3,8 2,07+1,16 р4з>0,05 1,3010,12 р4^>0,05 1,64+0,18 р4,з>0,05 2,98+0,10 ро>0,05 5,10±0,20 Р4_з>0,05 80-140 20-50

'* - в связи с высокой подвижностью кожи над капсулой сохранить топографическую ориентацию подкожной клетчатки над опухолями удалось не во всех случаях.

2" - клетки этого типа распределены в паренхиме опухолей очень неравномерно. Данные отражают диапазон варьирования по тестовым полям, ориентированным на сосудлсто-стромальный компонент. -

При иммуноокрашивании препаратов на ламинин особых изменений в ею экспрессии и характере контурирования стенок сосудов не обнаружено. Однако, обращало на себя внимание появление в периваскулярном пространстве бесклеточных участков в виде своеобразных «зон отчуждения». На электроннограммах эти участки были представлены в виде скопления прозрачных вакуолей, отделяющих базальную мембрану эндотелия от прилегающих к сосудам опухолевых клеток, в цитоплазме которых появляются признаки ультраструктурной патологии, характерные для клеток, испытывающих недостаток в кислороде: уплотняется цитоплазма, усиливается гетерогенность строения внутриклеточных органелл, развивается субтотальное набухание и отек митохондрий.

В настоящее время базальную мембрану рассматривают как важный фактор, определяющий прочность межклеточных связей, рост и дифференцировку клеток. При этом особая роль в регуляции клеточной адгезии, миграции, дифференцировке и переносе информации от эффекторных клеток к иммунной системе отводится ламинину -интегральному гликопротеину, представляющему основной биохимический компонент базальных мембран. Полагают, что именно ламинин вовлечен в ряд событий, определяющих инвазию опухолевых клеток и процесс метастазирования. Показано, что адгезия опухолевых клеток к базальной мембране определяется экспрессией специфических рецепторов к ламинину и к IV типу коллагена, также входящему в состав базальных мембран, а ламинин способен как усиливать, так и ингибировать способность опухолевых клеток связываться с IV типом коллагена. По данным некоторых исследователей, адгезия опухолевых клеток к базальной мембране эндотелиальных клеток может приводить к защите опухолевых клеток от цитотоксического действия естественными киллерами. Различают два типа клеточной адгезии: «гомотипическая» адгезия - величина, характеризующая соединение между клетками в опухоли (межклеточное сцепление), и «гетеротипическая», отражающая взаимодействие поверхности опухолевой клетки со структурными элементами нормальной ткани. Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о том, что для клеток саркомы М-1 более характерна «гомотипическая» адгезия и слабо выраженная «прилипаемость» клеток к базальной мембране эндотелия сосудов. Не исключено, что образующиеся после введения эпиталона зоны «отчуждения» формируют дополнительный барьер для миграции опухолевых клеток через сосудистую стенку.

По результатам компьютерного анализа, в зонах активной пролиферации количественная плотность опухолевых клеток практически не отличается от контроля. Интенсивность иммуноокрашивания ядер на PCNA снижается лишь в области

периваскулярного отека Отмечена слабая тенденция к снижению пролиферативной активности опухолевых клеток по сравнению с контролем (ЖДОЛ = 74,5%; 1мит = 1,9%; р>0,05). Однако в зоне ангиогенеза РСМЛ-позитивные ядра эндотелиальных клеток встречаются редко. При этом рассчитанный индекс апоптоза увеличился по сравнению с контролем более чем в 2 раза.

Как уже отмечалось выше, для опухолей основными факторами «потери» являются некроз и апоптоз. Полученные нами результаты микроскопического исследования свидетельствуют о формировании в паренхиме опухолей животных, получавших эпиталон, как морфологических проявлений геморрагического некроза, так и усиление апоптоза опухолевых клеток, что позволяет предположить, модуляцию эпиталоном функциональной активности клеток, продуцирующих факторы инициации апоптоза.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический пептид вилон оказывает онкомодифицирующее действие на рост эпигелиоидной опухоли — карциномы легких Льюис у старых мышей. Эффективность действия вилона зависит от дозы и продолжительности ею применения.

2. Морфологическим отражением модифицирующего действия вилона является усиление пролиферативной активности опухолевых клеток и снижение уровня апоптоза, индуцированного факторами физиологического стресса. Эффект вилона реализуется через функциональную активизацию эндотелия сосудистою русла новообразований и усиление ангиогенеза.

3. При сочетанием применении вилона и циклофосфана у старых мышеи регистрируется двухфазный ответ опухолей на комбинированное воздействие препаратов. В первой фазе проявляется синхронизация ответа опухолей на тормозящее действие цитостатика с последующим ускорением роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных. Эти данные свидетельствуют о нецелесообразности одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Снижение иммуносупрессорного действия опухолей на организм и коррекция тимусзависимого иммунодефицита под действием вилона создают основу для применения вилона как стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

5. Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.

6. Эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли -саркомы М-1 у старых крыс, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей. Морфологическим отражением ингибирующего действия эпиталона является развитие геморрагического некроза опухолей.

7. Эпиталон снижает интенсивность проявления ранних лучевых реакций кожи у старых мышей с саркомой М-1, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения его применения в качестве модификатора радиотерапии опухолей.

8. Проведенные исследования на двух моделях опухолей у старых животных показали разнонаправленные эффекты действия двух разных синтетических пептидов - вилона и эпиталона, что свидетельствует о разных механизмах их биологического действия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сочетанное влияние вилона и циклофосфана на трансплантаты опухолей и эксплантаты лимфоидной ткани мышей и крыс разного возраста / О.П. Барыкина, В В. Южаков, Н.И.Чалисова, И.М. Кветной, С.С. Коновалов // Успехи геронтол. -2003. - Вып.12. - С. 132-143.

2. Барыкина О.П. Исследование роли пептидов в механизмах ангио1енеза и формирования микроокружения в опухлых у старых крыс / О.П Барыкина, В.В. Южаков, Н.И.Чалисова// Успехи геронтол.- 2003. - Вып.13. - С. 110-114.

3. Барыкина О.П. Регулирующая роль незаменимых и заменимых аминокислот в органотипической культуре лимфоидной ткани / О.П Барыкина., Н.И.Чалисова // Материалы научн. конф. Национальной Академии Наук Беларуси. - Минск, 2003. -С. 169.

4. Модулирующая роль аминокислот в органотипической культуре лимфоидной ткани с различной степенью иммунологической зрелости / Г. Хаазе, Н.И- Чалисова, О.П. Барыкина, В.А. Пеннияйнен // Материалы VII Всеросс. научн. Форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Мед. иммунол. - 2003. Т. 5, №3-4. - С. 219-220.

5. Polyakova V.O. Tissue-specific effects of peptides on differentiation and aging of thymic epithelial cells in vitro / V.O. Polyakova, S.S. Konovalov, O.P Barykina // Proc. Intern. Ecologic Forum "Enviroraent and Human Health". - St. Petersburg, 2003. - P. 534.

6. Полякова В.О. Влияние вилона на репаративные процессы в вилочковой железе при преждевременном (радиационном) старении / В.О. Полякова, О.П. Барыкина // Материалы 2-го съезда геронтологов России. - Москва, 2003. - С. 137.

БАРЫКИНА О. И. Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в экспериментальных опухолях у старых животных // Автореф. дис....канд. биол. наук: 14.00.53 - СПб., 2004. - 22 с.

Формат 60x84 1/8. Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Заказ 18. Бесплатно. Подписано к печати Отпечатано с готового оригинал-макета ЧП Свид. № 104090 ИТД-13 от 19.07.98

• •1551

РНБ Русский фонд

2004-4 26992

Актуальность работы

В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание уделяется исследованиям механизмов развития возрастной патологии, в частности опухолей, и разработке новых геропротекторных препаратов.

Известно, что одной из важных особенностей злокачественных новообразований является их автономный рост, регулируемый локально продуцируемыми факторами [7,24]. К таким аутокринпым и паракринным регуляторам пролиферации опухолевых клеток относят «факторы микроокружения» опухолей, продуцируемые как самими опухолевыми клетками, так и клетками окружающей их стромы [30]. Продуцируемые эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и тучными клетками иитерлейкины, простагландины, регуляторные пептиды прямо или косвенно влияют на пролиферацию и индуцированную гибель опухолевых клеток.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о непосредственном участии клеток микроокружения опухолей в патогенезе злокачественного роста и их влиянии на чувствительность и ответ опухолевых клеток к той или ииой методике лечения [26, 159]. В процессе злокачественной трансформации клеток белковые продукты аберрантной экспрессии мутантных генов потенциально иммуногенны и могут служить в качестве антигенов отторжения. Однако, несмотря на то, что опухолевые клетки несут антигены, способные активировать цитотоксические Т-лимфоциты и вызывать образование антител, многие опухоли способны избегать механизмов иммунного надзора и не разрушаться факторами иммунной системы. Помимо множественных механизмов «ухода» от иммунных факторов, существуют механизмы защиты опухолевых клеток, основанные на индукции иммуносупрессии [171]. Расшифровка и молекулярный анализ механизмов, лежащих в основе ухода опухолей от иммунного надзора, приведет к развитию новых стратегий для предотвращения у онкологических больных Т-клеточной иммуносупрессии, развитию новых иммунотерапсвтических мероприятий, способных предотвращать прогрессию злокачественных новообразований и их развитие.

Одним из перспективных направлений терапевтических мероприятий в онкологии является применение биомодуляторов, повышающих иммунную защиту организма и усиливающих эффект противоопухолевых химиопрепаратов [111-113]. Перспективными синтетическими пептидами, обладающими иммуномодулирующими свойствами и оказывающими влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, неспецифическую резистентность организма, являются вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [10]. Исследование онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталона, их влияния на ангиогенез и микроокружеиие экспериментально индуцированных опухолей позволит более глубоко понять механизмы действия пептидов как биологических модификаторов, способных активировать эндогенные противоопухолевые защитные механизмы.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталона, их влияния на ангиогенез и микроокружение экспериментально индуцированных опухолей у старых крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие вилона на продолжительность жизни старых мышей -опухоленосителей эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис (KJLJ1);

2. определить способность вилона влиять на пролиферативную активность опухолевых клеток и уровень апоптоза в KJ1JT;

3. оценить эффекты действия вилона на KJ1JI при сочетанном применении с циклофосфаном;

4. изучить эффекты вилона при иммуносупрессорном действии опухоли на организм старых мышей;

5. исследовать влияние вилона и эпиталона на рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс и их онкомодифицирующее действие в условиях нарушенного ангиогенеза и пострадиационной гипоксии.

Научная новизна

В работе впервые получены новые данные о пролиферотропных и онкомодифицирующих свойствах синтетических пептидов - вилона и эпиталона, их влиянии на микроокружение экспериментально индуцированных опухолей и на продолжительность жизни старых животных - опухоленосителей. Установлены молекулярно-клеточные механизмы действия пептидов на пролиферацию эндотелиальных клеток, функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и ангиогенез.

Практическая ценность работы

Полученные данные об ингибировании роста экспериментальных опухолей под действием пептидов, снижении иммуносупрессорного действия опухоли на организм под их влиянием, коррекции вилопом тимусзависимого иммунодефицита создают основу для дальнейшего изучения синтетических коротких пептидов, как естественных онкомодифицирующих факторов и разработки новых методов биотерапии опухолей в пожилом и старческом возрасте.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Синтетический пептид вилон оказывает онкомодифицирующее действие на рост эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис у старых мышей, при этом эффективность его действия на опухоль зависит от дозы и продолжительности применения.

2. Выявленное снижение иммуносупрессорного действия опухоли на организм старых животных и коррекция вилоном тимусзависимого иммунодефицита создают основу для изучения его применения в качестве стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных пожилого и старческого возраста иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

3. При сочетанием применении вилона и циклофосфана тормозящее действие циклофосфана на рост опухолей менее выражено, чем при его изолированном применении и сопровождается повышением пролиферативной активности клеток нормальных тканей, что предполагает нецелесообразность одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.

5. Синтетический пептид эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс. По механизму действия исследованный препарат можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей.

6. Полученные данные свидетельствуют об актуальности дальнейших исследований по изучению синтетических коротких пептидов как естественных биологических модификаторов опухолевого роста в пожилом и старческом возрасте.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на конференции Белорусской Академии Наук, (Минск, 2003), на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 2-ом съезде геронтологов России (Москва, 2003), Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2003).

Результаты диссертации используются в научной, клинической и педагогической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертация выполнена по основному плану научно-исследовательских работ Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы биорегуляции злокачественного роста, роли регуляторных пептидов в онкогенезе и коррекции иммунного статуса при опухолевом процессе. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, примененных в данном исследовании. Главы 3 и 4 являются изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждением.

ВЫВОДЫ

1. Синтетический пептид вилоп оказывает онкомодифицирующсе действие на рост эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис у старых мышей. Эффективность действия вилона зависит от дозы и продолжительности его применения.

2. Морфологическим отражением модифицирующего действия вилона является усиление пролиферативной активности опухолевых клеток и снижение уровня апоптоза, индуцированного факторами физиологического стресса. Эффект вилона реализуется через функциональную активизацию эндотелия сосудистого русла новообразований и усиление ангиогенеза.

3. При сочетанием применении вилона и циклофосфана у старых мышей регистрируется двухфазный ответ опухолей на комбинированное воздействие препаратов. В первой фазе проявляется синхронизация ответа опухолей на тормозящее действие цитостатика с последующим ускорением роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных. Эти данные свидетельствуют о нецелесообразности одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Снижение иммуносупрессорного действия опухолей на организм и коррекция тимусзависимого иммунодефицита под действием вилона создают основу для применения вилона как стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

5. Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.

6. Эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли -саркомы М-1 у старых крыс, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей. Морфологическим отражением ингибирующего действия эпиталона является развитие геморрагического некроза опухолей.

7. Эпиталон снижает интенсивность проявления ранних лучевых реакций кожи у старых мышей с саркомой М-1, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения его применения в качестве модификатора радиотерапии опухолей.

8. Проведенные исследования на двух моделях опухолей у старых животных показали разнонаправленные эффекты действия двух разных синтетических пептидов - вилона и эпиталона, что свидетельствует о разных механизмах их биологического действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из направлений в развитии методов лечения злокачественных новообразований является комбинированная терапия с использованием основных радикальных методов воздействия: хирургическое лечение, лучевая терапия и химиотерапия. В конце XX века в клинической практике нашли реальное применение и методы биологической терапии, основанные на применении естественных для организма модификаторов клеточных реакций, повышающих иммунную защиту и снижающих токсическое воздействие используемых препаратов на здоровые ткани. В настоящее время биологическая терапия рассматривается как четвертая методика лечения опухолевой болезни [48, 112], основным направлением которой является уход от неспецифического воздействия на иммунные механизмы к применению биопрепаратов, которые способны активировать эндогенные защитные механизмы организма специфическим действием на иммунную систему [114].

Обращает внимание, что введение испытуемого препарата опухоленосителям снижает инфицирование слизистой оболочки желудка патогенной флорой у подопытных животных, оказывает позитивное воздействие на клеточную и внутриклеточную репарацию секреторных клеток и покровного эпителия этого органа и, что особенно примечательно, сохраняет и даже усиливает функциональную активность нейронов интрамуральных ганглиев. Есть все основания полагать, что стимулирующее действие вилона на иммунитет и резистентность организма реализуется через его влияние на Т-лимфоциты [10]. Согласно результатам наших исследований, введение вилона сопровождается цитологическими признаками активизации функциональной активности эпителиальных клеток, что может свидетельствовать о реализации некоторых эффектов этого препарата через эпителиальный компартмент вилочковой железы.

Общепризнанно, что тимус представляет собой лимфоэпителиальный орган, который специализирован исключительно на развитии Т-лимфоцитов и миелоидных элементов собственного микроокружения. Эпителиальные клетки тимуса является стабильной составляющей местного происхождения, а лимфоидные элементы являются транзиторными. Их предшественники мигрируют в тимус из костного мозга, а основная часть созревших Т-лимфоцитов эмигрируют в периферический отдел иммунной системы, где включаются в функциональный пул Т-клеток. Клеточные и гуморальные факторы микроокружения, создаваемого элементами стромы и эпителием вилочковой железы, воздействуют на предшественники Т-лимфоцитов и контролируют созревание Т-клеток, их дифференцировку на субпопуляции и селекцию клонов [26, 164]. Есть данные, что дополнительно к ключевой роли тимуса в регулировании иммунных функций, этот орган расширяет свое влияние и на неиммунологические компоненты организма, включая нейроэндокринную систему. Поэтому считается, что ранее начало инволюции тимуса может действовать как запускающее событие, которое инициирует постепенное ухудшение гомеостатического потенциала организма и ускоряет процесс старения [74, 82, 100]. Эндокринология тимуса характеризуется действием многих гормонов и гормоноподобных веществ на клеточные компоненты тимуса, включая тимоциты, эпителиальные клетки и клетки стромы. Внутритимусное микроокружение характеризуется комплексной сетью паракринных, аутокринных и эндокринных сигналов, включая интерлейкины и пептиды тимуса. С возрастом и клеточным иммунным старением эти эндокринные влияния снижаются, что способствует развитию болезней и канцерогенезу [79, 87]. Инволюцию тимуса у млекопитающих считают одним из ведущих регуляторов старения. Экспериментальные данные показывают, что инволюцию тимуса и снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов можно частично восстановить путем трансплантации ткани тимуса или введением тимусных гормонов [36].

Полученные нами данные о стимулирующем влиянии вилона на репаративные процессы в тимусе в условиях острой акцидентальной инволюции при опухолевом росте предполагают перспективность применения этого синтетического пептида в гериатрии.

Согласно результатам морфо-кинетических исследований вилон оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной эпителиоидной опухоли. При этом онкомодулирующее действие этого препарата зависит от дозы и продолжительности его применения. Введение вилона в разовых дозах 2 мкг/мышь в период активной фазы роста карциномы легких Льюис практически не влияло на ее кинетические параметры, но достоверно увеличило продолжительность жизни животных. Однако, как и при изучении действия вилона на соединительно-тканную опухоль - саркому М-1, обнаружено, что при больших дозах вилон активизирует ангиогенез и ускоряет рост новообразований. Примечательно, что стимулирующий эффект фармакологических доз вилона на рост карциномы регистрируется даже при совместном применении этого препарата с цитостатиком. Стимуляцию опухолевого роста и снижение токсико-дистрофических изменений в цитоплазме опухолевых клеток, вызванных действием циклофосфана, по-видимому, можно объяснить своеобразным «трофическим и антигипоксическим» действием вилона, который реализуется путем функциональной активизации эндотелия сосудистого русла новообразований. Этим можно объяснить и двухфазный характер ответа опухолей на совместное применение двух совершенно разных по механизму действия препаратов. Очевидно, что «синхронизация» ответа опухолей на циклофосфан в первой фазе обусловлена активирующим действием вилона на микроциркуляторное русло опухолей, снижением факторов действия физиологического стресса и улучшением доставки цитостатика в паренхиму новообразований.

Возвращаясь к вопросу о факторах физиологического стресса, необходимо отметить, что уникальная физиология солидных опухолей, обусловленная неполноценностью ангиогенеза, создает специфические условия для устойчивости к лучевой терапии и противоопухолевым химиопрепаратам [41, 163], а также для формирования стрессорного ответа опухолевых клеток, обычно регулируемого глюкозой. Есть данные, что именно стрессорный ответ ведет к индукции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Кроме того, низкий уровень содержания кислорода, низкий внеклеточный рН, высокое содержания лактата и низкий уровень глюкозы в массе солидных опухолей являются факторами, оказывающими существенное влияние на отбор злокачественных фенотипов с потенциалом к метастазированию. Гипоксия может индуцировать точковые мутации и разрывы нитей ДНК, усиливая эпигенетическую и геномную нестабильность, обеспечивать физиологические условия для отбора клеток путем амплификации генов и усиления экспрессии продуктов, вовлеченных в метастатический каскад [143] и вести к злокачественной прогрессии с потерей чувствительности к индукции апоптоза [88]. Гибель клеток по механизму апоптоза рассматривают и как специфическую реакцию на физиологические и патологические стрессы, которые разрушают сбалансированные темпы пролиферации и элиминации клеток [15, 57]. В условиях противоопухолевой терапии апоптоз выступает как один из ведущих факторов, определяющих эффективность лечения [57, 102, 117].

Одним из актуальных направлений мультимодальной терапии рака является поиск агентов, обладающих способностью повышать эффективность цитостатической терапии [20] и в этом плане зарегистрированный «синхронизирующий» эффект вилона еще предстоит осмыслить. Однако следует учитывать и то, что во второй фазе стимулирующее и детоксикогенное влияние вилона начинает превалировать над действием цитотоксического препарата, что, в свою очередь, сопровождается ускорением роста опухолей.

Считаем необходимым специально подчеркнуть детоксикационное, ангиогенное и стимулирующее действие вилона, в том числе, и на соединительно-тканные клетки периваскулярной стромы, в частности фибробласты, играющие ключевую роль в процессах заживления ран. Стимуляция ангиогенеза играет особо важную роль в разработке эффективных методов лечения при заживлении ран и коллатеризации сосудистого русла при ишемических состояниях [55, 73]. Современные ангиогенные терапевтические стратегии включают не только подавление аберрантного ангиогенеза, который наблюдается в опухолях, но и его активизацию в условиях ишемии.

Стимулирующее действие вилона на ангиогенез в фармакологических дозах может найти применение для коррекции нарушенной гемодинамики, ускорения заживления ран и трофических расстройств. Не исключено, что восстановление тока крови в зоны ишемии путем стимуляции ангиогенеза может дать эффект «биологического шунтирования» при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

В заключение следует подчеркнуть также следующее положение. В последние годы теоретические представления, что дефицит в иммунных функциях организма способствует опухолевому росту, получили экспериментальное подтверждение открытием различных биохимических дефектов в Т-лимфоцитах, которые инфильтрируют злокачественные новообразования, но лишены функции цитотоксического действия на опухолевые клетки. Снижение экспрессии некоторых факторов, включенных в сигнальную транедукцию Т-клеток, позволяет опухолям избегать иммунного надзора. Предполагается, что реверсирование этих дефектов в эффекторной функции цитотоксических Т-лимфоцитов потенциально позволило бы проводить успешную иммунотерапию опухолей [139].

Использованная в данной работе в качестве экспериментальной модели опухолевого роста карцинома легких Льюис обладает выраженным иммуносупрессорным действием на организм. В настоящее время механизмы иммунодепрессивного действия, которые сопровождаются акцидептальной инволюцией тимуса хорошо изучены [80, 81, 96, 97]. Установлено, что прогрессивный рост карциномы легких Лыоис вызывает кроветворные изменения в виде анемии и нейтрофилии [81], что приводит к конкурентной стимуляции миелопоэза и появлению иммуносупрессорных CD34+ клеток костного мозга, обладающих естественной супрессорной активностью против цитотоксических Т лимфоцитов [72, 173,174].

Следует особо отметить, что зарегистрированные нами в этих условиях морфологические признаки стимуляции иммунной системы, снижение иммуносупрессорного действия карциномы на организм и замедление процесса гипоплазии тимуса свидетельствуют о специфической иммуномодулирующей роли вилона в активации иммунологической реактивности организма и перспективности его применения в комплексных методах биологической терапии опухолей

Основной задачей при создании новых противоопухолевых препаратов является получение веществ, которые могут избирательно угнетать пролиферацию и/или усиливать гибель опухолевых клеток, минимально повреждая нормальные клетки и здоровые ткани организма. Большинство существующих химиотерапевтических препаратов такой избирательностью не обладают [153]. Кроме того, существуют злокачественные опухоли, малочувствительные или нечувствительные к химиотерапии [24]. Поэтому в последние годы большие надежды возлагают на модификаторы биологических реакций, способные активировать эндогенные защитные механизмы.

Результаты комплексного морфо-кинетического исследования показали, что пептид эпифиза эпиталон обладает ингибирующим действием на рост саркомы М-1 с сохранением эффекта в течение около 2 недель после окончания курса введения препарата. По показателям пролиферативной активности, объективно регистрируемое замедление экспансии не связано с прямым цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки. Морфологические признаки развития геморрагического некроза опухолей свидетельствуют о специфическом механизме действия, реализующимся через микроциркуляторное русло. Следует отметить, что сосудистое русло злокачественных новообразований является важным структурно-функциональным компонентом, который в значительной мере определяет характер роста и эффективность лечения опухолей [8]. Известно, что эндотелий сосудов опухолей весьма чувствителен к действию различных повреждающих агентов и оптимизация некоторых методов лечения зависит от возможности дополнительно воздействовать на стромальные и сосудистые компоненты опухоли с целью эффективного подавления ее роста и разрушения.

Не исключено, что в «пусковой механизм» сосудисто-стромальных изменений в опухолях, регистрируемых после введения эпиталона, вовлечены вазоактивные медиаторы и, следует полагать, прежде всего, биологически активный амин — серотонин. Ранее проведенные исследования [106] показали, что эпиталон оказывает модулирующее действие на синтез серотонина в энтерохромаффинных клетках основных депо его содержания в организме. Однако по условиям проведения тех экспериментов (пролонгированное введение препарата), дать количественную оценку влияния эпиталона на секреторную фазу деятельности ЕС клеток было практически невозможно. Биологические процессы синтеза и секреции являются взаимосвязанной системой событий, однако их выраженность определяется не только прямым действием исследуемых субстанций на рецепторный аппарат клетки, но и компенсаторно-адаптационным ответом системной реакции организма в целом. В связи с этим, для изучения механизма каскадных реакций, определяющих конечный эффект, считаем целесообразным рекомендовать провести фундаментальные исследования испытуемых препаратов в «острых опытах».

В основе физиологических процессов лежит координированное, функциональное взаимодействие регуляторных систем, основанное на химической общности восприятия и передачи информации. Согласно современным представлениям, в интеграции адаптационных механизмов ключевая роль принадлежит регуляторным пептидам и биогенным аминам, выполняющим функции посредников химической информации в качестве нейротрансмиттеров, гормонов, иммуно- и цитокиномодуляторов. Изучение функциональной морфологии клеток, продуцирующих эти физиологически активные соединения, в ранние сроки после введения фармакологических доз препаратов позволит проследить основные закономерности развития компенсаторно-приспособительной реакции организма. На базе таких исследований можно спрогнозировать, а затем верифицировать возможность и целесообразность применения испытуемых препаратов для лечения той или иной патологии.

По данным комплексного анализа, на фоне выраженных радиационных эффектов терапевтическое действие эпиталона практически полностью нивелируется. По-видимому, в условиях радиационного повреждения сосудистой сети, подавленной неоваскуляризации и развития гипоксии в опухолях отсутствует структурно-функциональная основа для проявления действия испытуемого препарата.

Общепризнанно, что состояние кровоснабжения опухолей является одним из основных факторов, определяющих уровень оксигенации и, следовательно, радиочувствительности опухолевых клеток. Судя по механизму действия, эпиталон, усиливая некроз паренхимы опухолей, создает предпосылки для повышения фракции гипоксических клеток, являющихся, как известно, наиболее резистентными к лучевой терапии. Поэтому, использовать этот препарат в традиционных схемах радиотерапии злокачественных новообразований, на наш взгляд, неоправданно. Однако следует обратить внимание на некоторые способы повышения эффективности радиационного воздействия на опухоли при сочетании облучения и ингибировании кровотока. Так, при сочетании облучения с последующей гипергликемией эффект может был усилен введением мексамина, причем чем сильнее было угнетено кровоснабжение в опухоли, тем большего противоопухолевого эффекта можно достичь [172]. Современные методы планирования и проведения лучевой терапии, применение радиомодификаторов и защита нормальных тканей позволяют свести к минимуму возможное развитие лучевых повреждений. Тем не менее, для некоторых радиорезистентных опухолей суммарная очаговая доза при использовании схем динамического фракционирования достигает 80 Гр. При таких дозах возникает реальная опасность превышения толерантности нормальных тканей и развития ранних и отдаленных лучевых осложнений. Поэтому по-прежнему актуальны вопросы разработки эффективных методов их профилактики и лечения.

Мы не случайно обратили внимание на снижение выраженности лучевого дерматита в группе животных, леченых эпиталоном. Известно, что в патогенезе ранних лучевых реакций ведущим является острое нарушение гемодинамики в здоровых тканях, преимущественно функционального характера [6, 8]. Несмотря на некоторую субъективность визуальной оценки радиационной травмы по кожным лучевым реакциям, отмеченная тенденция к снижению остроты их проявления свидетельствует о перспективности испытания этого пептида как модификатора биологических реакций для коррекции воспалительных процессов.

Результаты кинетических и морфофункциональных исследований свидетельствуют о том, что пептид вилочковой железы вилон оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной соединительнотканной опухоли. Проявление его эффекта зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявился лишь после введения этого препарата в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции препарата в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияли на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия. Результаты морфофункционального анализа свидетельствуют, что после пролонгированного введения вилона в больших дозах основные события развертываются в периваскулярной строме и связаны с активизацией ангиогенеза. В этих условиях поддержание клеточного баланса в опухоли будет, по-видимому, определяться соотношением усиленной пролиферации опухолевых клеток и их индуцированной гибели. Результаты количественного анализа свидетельствуют, что уровень апоптоза опухолевых клеток после инъекций вилона во всех экспериментальных группах выше, чем в контрольной группе животных. При этом обращает внимание активизация стромальных клеток микроокружения - тучных клеток, гранулоцитов и моноцитов. Не исключено, что полученный положительный эффект вилона может еще более усиливаться в условиях терапевтических мероприятий, направленных на ингибирование ангиогенеза в опухолях. Вместе с тем, не вызывает сомнения актуальность дальнейшего изучения вилона, как препарата, оказывающего стимулирующее действие на пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез. Последнее может найти применение для коррекции нарушенной гемодинамики, ускорения заживления вяло текущих ран и трофических расстройств.

Полученные нами результаты микроскопического исследования свидетельствуют о формировании в паренхиме опухолей животных, леченых эпиталоном, как морфологических проявлений геморрагического некроза, так и усиление апоптоза опухолевых клеток. Можно было бы попытаться объяснить увеличение апоптотической гибели опухолевых клеток за счет нарастающей гипоксии. Между тем, существуют веские иммуногиетохимические доказательства, что в зонах гипоксии пролиферативный потенциал опухолевых клеток снижается. Иммуноокрашивание ядер клеток на PCNA в зоне локализации маркера гипоксии CCI-103F проявляется слабее, либо поля гипоксии и активной пролиферации клеток не перекрываются. Количественный анализ свидетельствует об отрицательной корреляционной связи между связыванием гипоксического маркера пимонидазола и иммунолокализацией PCNA [140,143]. В данной работе определение пролиферативной активности и апоптотической гибели опухолевых клеток было проведено на серийных гистологических срезах. Если бы зарегистрированная нами индукция апоптоза была обусловлена только гипоксией, то и пролиферативная активность опухолевых клеток также должна была существенно снизиться. Однако полученные данные не подтверждают это предположение. Анализ литературы по этому вопросу позволяет предположить, что эпиталон может модулировать функциональную активность клеток, продуцирующих факторы инициации апоптоза.

Таким образом, совокупность результатов проведенных исследований показала, что регистрируемый после введения эпиталона эффект торможения роста саркомы М-1 обусловлен развитием геморрагического некроза и усилением апоптоза опухолевых клеток. По показателям пролиферативной активности замедление роста опухолей не было связано с прямым цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки. Морфологические признаки свидетельствуют о специфическом механизме действия, который реализуется через сосудистое русло опухолей. Полученные данных и анализ литературы позволяют предположить, что регистрируемый после введения эпиталона эффект развития геморрагического некроза саркомы М-1 обусловлен комплексным действием ряда перечисленных выше факторов и реализуется через микроциркуляторное русло опухолей. По-видимому, в механизме запуска сосудистой реакции определенную роль могут играть тучные клетки и экспрессия в них серотонина. Полученные данные об усилении индуцированной гибели опухолевых клеток после введения эпиталона свидетельствуют о принципиальной возможности применения этого пептида в качестве потенциального противоопухолевого препарата, особенно в пожилом и старческом возрасте.