Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Прогнозирование акушерских осложнений и исходов беременностей у женщин с привычным выкидышем на основании молекулярно-генетических исследований

На правах рукописи

о

ПАРСАДАНЯН Нанэ Геворковна

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ АКУШЕРСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ И ИСХОДОВ БЕРЕМЕННОСТЕЙ У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ НА ОСНОВАНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 АПР 2015

Москва-2015 005567944

005567944

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Тетруашвили Нана Картлосовна

доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич

Официальные оппоненты:

Серова Ольга Федоровна - доктор медицинских наук, профессор, Московский областной перинатальный центр, главный врач

Шалина Раиса Ивановна - доктор медицинских наук, профессор, Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, кафедра акушерства и гинекологии, профессор

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Защита диссертации состоится« 19 » мая 2015 г. в 13.00. ч. на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 на базе федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова». Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. http://sciense.ncagp.ru/upfiles/pdi/ParsadanyanNG_diss.pdf

Автореферат разослан « /У» 2015 г.

Ученый секретарь

доктор медицинских наук

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Привычный выкидыш (ПВ) является одной из сложных проблем современного акушерства. Реализация репродуктивной функции в старшем репродуктивном возрасте, полиэтиологичность данной патологии, усугубление нарушений с увеличением числа неудач создают предпосылки к формированию синдрома привычной потери плода, который встречается у 3-5% супружеских пар (В.С.Баранов с соавт, 2007; О. Ф. Серова с соавт, 2007; В.М. Сидельникова, 2010). Особенно обсуждаемыми являются генетические причины привычного выкидыша. Известно, что хромосомные аномалии являются наиболее частыми генетическими нарушениями, встречающимися при спорадических и привычных выкидышах.

При ведении беременностей женщин с привычным выкидышем, протекающих с выраженной угрозой прерывания до 20 недель, встает вопрос о целесообразности проведения сохраняющей терапии. Отсутствие данных о кариотипе развивающегося плода, осложняет выбор правильной акушерской тактики (M.Entezamietal., 2012).

Существующий в настоящее время протокол скрининга беременных включает определение белковых маркеров материнского происхождения в совокупности с данными УЗИ. Однако, у женщин с привычным выкидышем, относящихся к старшей возрастной группе, получающих гормональные препараты, результаты скрининга могут быть ложнопозитивными. Проведение инвазивных процедур, с последующим классическим кариотипированием является «золотым стандартом» постановки диагноза. Существует риск потери беременности при инвазивных вмешательствах, составляющий 0,5 -2,0% (D. L. Rolniketal. 2015), а у женщин с выкидышами в анамнезе он достигает 5,0%.

Внедрение методов высокопроизводительного секвенирования открыло новые возможности в неинвазивной пренатальной диагностике анеуплоидий, которые подлежат изучению и валидации (В.С.Баранов, 2007).

Методы неинвазивной пренатальной молекулярно-генетической диагностики основаны на определении свободной эмбриональной ДНК (сэ-ДНК), источником которой, как полагают, является апоптоз клеток трофобласта. Установлено, что резкое повышение уровней сэ-ДНК в крови матери отражает ишемию и апоптоз трофобласта, что ассоциировано с плацентарной недостаточностью или развитием анеуплоидного плода.

Проводились попытки прогнозирования преэклампсии и плацентарной недостаточности по резким выбросам сэ-ДНК в материнский кровоток отдельными группами зарубежных ученых (С. Б. Wrightetal., 2009; Т. Я. 1акоЬзепе1а1, 2012; К I. Wapneretal., 2014). Установлено, что повышение уровней сэ-ДНК и общей ДНК происходит задолго до клинических проявлений преэклампсии и плацентарной недостаточности. Аналогичных исследований в области привычных потерь беременностей, а также прогнозирования поздних гестационных осложнений на ранних сроках беременности вне зависимости от пола плода в доступной литературе найти не удалось.

Цель исследования Оптимизация программы неинвазивной пренатальной диагностики и прогнозирования исходов беременностей у супружеских пар с привычным выкидышем.

Задачи исследования

1. Провести анализ нарушений репродуктивной функции у супружеских пар с привычным выкидышем на основании комплексного клинико-лабораторного обследования.

2. Определить уровни сэ-ДНК независимо от пола плода в периферической крови женщин в динамике при нормальной и осложненной беременности.

3. На основании анализа течения и исходов наблюдаемых беременностей провести оценку эффективности прогнозирования гестационных осложнений и исходов беременностей по уровням сэ-ДНК в сроках до 22 недель.

4. Оценить возможность выявления анеуплоидий 21, 18 хромосом, копийности половых хромосом X и У методом высокопроизводительного секвенирования до 18 недель беременности по периферической крови беременных женщин высокого риска.

5. Разработать алгоритм обследования и пренатальной диагностики пациенток с привычным выкидышем для оптимизации акушерской тактики.

Научная новизна

Впервые в стране определены ДНК маркеры для оценки уровней сэ-ДНК вне зависимости от пола плода в периферической крови беременных женщин, на когорте супружеских пар с ненарушенной репродуктивной функцией, с угрожающим и привычным выкидышем. Установлено, что апоптотические выбросы сэ-ДНК трофобластического происхождения, поступающие в материнский кровоток, имеют место при угрожающем и начавшемся выкидыше, как универсальный механизм, возникающий при отслойке хориона. Оценка уровней сэ-ДНК у пациенток с угрожающим, привычным выкидышем, нормальным течением гестационного процесса позволила расширить понимание

патогенетических механизмов реализации самопроизвольного прерывания беременности.

Установлена возможность неинвазивного определения сэ-ДНК в периферической крови женщин до 18 недель беременности для диагностики анеуплоидий - трисомии 21, 18, а также копийности половых хромосом (X и У) методом высокопроизводительного секвенирования.

Динамическое определение уровней сэ-ДНК у женщин с 6 по 22 неделю беременности независимо от пола плода позволило оценить уровень апоптоза клеток трофобласта, что послужило критерием успешности процессов имплантации и эффективности проводимого лечения.

Практическая значимость

Проведена оценка клинической значимости выявления анеуплоидий по 21 и 18 хромосомам, а также копийности половых хромосом (X и У) с помощью высокопроизводительного секвенирования по сравнению с общепринятым скринингом беременных. Проведенная валидация метода высокопроизводительного секвенирования показала высокую точность тестов неинвазивного определения трисомий 21, 18, копийности половых хромосом (X и У), что дает основание рекомендовать данную методику для включения в систему скрининга беременных.

Неинвазивное пренатальное определение анеуплоидий у женщин с клинической картиной начавшегося выкидыша позволяет оптимизировать тактику ведения беременности с отказом от ненужных терапевтических мероприятий в случае хромосомной патологии плода.

Разработан алгоритм мониторинга течения беременности и контроля за эффективностью проводимой терапии на основании оценки уровней сэ-ДНК до 22 недель. Согласно полученным данным, высокие уровни сэ-ДНК являются маркерами предикторами самопроизвольного

прерывания беременности до 22 недель, анеуплоидий, плацентарной недостаточности. Показано, что нормализация уровней сэ-ДНК в процессе терапии у женщин с начавшимся выкидышем является положительным прогностическим признаком и коррелирует с пролонгированием беременности. Внедрение предложенного алгоритма позволит прогнозировать осложнения и исходы беременностей и оценить эффективность проводимой терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. У беременных с угрожающим и начавшимся выкидышем отмечаются апоптотические выбросы в материнский кровоток сэ-ДНК трофобластического происхождения, как универсальный механизм, возникающий при отслойке хориона.

2. При отсутствии клинических проявлений угрозы прерывания беременности у женщин с привычным выкидышем уровни общей и сэ-ДНК достоверно превышают аналогичные показатели пациенток с неотягощенным акушерским анамнезом, что создает предпосылки к формированию плацентарной недостаточности.

3. Установленная высокая точность тестов неинвазивного определения трисомий 21, 18, копийности половых хромосом (X и У), методом высокопроизводительного секвенирования дает основание рекомендовать данную методику для включения в систему скрининга беременных высокого риска развития хромосомной патологии.

4. Определение высоких уровней общей и сэ-ДНК в периферической крови беременных позволяет прогнозировать угрожающий, начавшийся выкидыш, самопроизвольное прерывание беременности за 2 недели до реализации клинических симптомов.

Личный вклад автора

Автором проведена систематизация литературных данных по теме диссертации, лично разработана анкета для сбора анамнеза, проведен анализ клинико-анамнестических данных и результатов обследования

256 женщин в проспективном исследовании, удовлетворяющих критериям включения в исследование. Автор лично участвовал в ведении беременности и родоразрешении женщин, включенных в исследование. Автором осуществлялись: забор, подготовка, хранение биологического материала на преаналитическом этапе, участие в молекулярно-биологических и генетических исследованиях. Анализ, статистическая обработка полученных данных проведены автором самостоятельно в соответствии с правилами и обеспечивают достоверность результатов и сформулированных выводов. Написание и публикация результатов выполнены автором лично.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 2 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции 2-гоотделения акушерского патологии беременных, совместно с лабораторией молекулярно-генетических методов 16.12.2014 года и на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (22.12.2014 года, протокол №17).

Внедрение результатов работы в практику Основные рекомендации, полученные в ходе исследования, используются во 2-м отделении акушерском патологии беременности ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России при обследовании и лечении супружеских пар с привычным выкидышем.

Публикации

По теме диссертации опубликовано бпечатных работ, все в рецензируемых научных изданиях.

Структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Работа изложена на 145 страницах компьютерного текста, содержит 31 таблицу и 12 рисунков. Библиографический указатель включает 159 литературных источников, из них 45 отечественных и 114 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Результаты диссертационной работы основаны на динамическом обследовании 256 женщин, обратившихся в Центр за период с 2011 по 2014 гг. В соответствии с поставленными задачами, неинвазивную пренатальную диагностику проводили двум категориям пациенток. Первая часть работы посвящена прогнозированию гестационных осложнений у беременных с привычным выкидышем (ПВ) (основная группа) и с неотягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом (контрольная группа). Проведено проспективное исследование, забор крови для определения уровней сэ-ДНК проводился, начиная со срока 6 до 22 недель с 2 недельным интервалом, далее 1 раз в 4 недели до родов. Таким образом, у пациенток, выносивших беременность до доношенного срока, проведено 12 заборов крови.

Дизайн 1 части работы представлен на рисунке 1. Всего обследовано 93 супружеские пары. На основании критериев включения/исключения отобраны 67. В связи с невозможностью определения сэ-ДНК по отличиям отцовских делеционных полиморфизмов в исследовании продолжили участие 56 супружеских пар.

Рисунок 1. Дизайн первого этапа исследования

Критерии включения в основную группу: срок беременности 6 недель, подтвержденный данными УЗИ, нормальный кариотип партнеров, привычный выкидыш (наличие в анамнезе 3 и более потерь беременности до 22 недель от одного и того же партнера или 2 и более потерь, если в каждом случае был подтвержден нормальный кариотип плода), подписанное информированное согласие на проведение исследования.

Критерии включения в контрольную группу: физиологическое течение беременности на момент обследования, срок 6 недель, неосложненный акушерский и гинекологический анамнез, подписанное информированное согласие на проведение исследования.

Критерии исключения: многоплодная беременность, наличие генетических, анатомических причин привычного выкидыша, наличие хронических инфекционных, онкологических, системных аутоиммунных заболеваний, ожирение (ИМТ более 30 кг/м2).

Все пациентки прошли обследование по специально разработанной схеме, включавшей: подробный сбор анамнестических данных, объективный осмотр, гинекологический осмотр, ультразвуковое исследование, гемостазиологическое исследование, скрининг на наличие инфекционно-воспалительных заболеваний, оценка фето-плацентарного комплекса в динамике беременности.

Во второй части работы сэ-ДНК использована для валидации метода неинвазивного пренатапьного определения анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования. Данный метод неинвазивной пренатальной диагностики (НПД) анеуплоидий впоследствии может быть использован у женщин с угрожающим и привычным выкидышем для определения дальнейшей тактики ведения беременности.

Критерии включения: срок беременности от 10 до 18 недель; высокий риск хромосомной патологии плода по результатам общепринятого скрининга беременных; согласие на проведение инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез); информированное согласие на забор крови из вены для проведения исследования.

Рисунок 2. Дизайн второго этапа исследования

Критерии исключения:

• отказ или невозможность проведения инвазивной пренатальной диагностики (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез);

• невозможность проведения пункции периферической вены;

• отказ от участия в исследовании.

Выполнено сопоставление результатов инвазивной

цитогенетической и неинвазивной молекулярно-генетической диагностики.

Специальные методы исследования 1. Метод ПЦР в режиме реального времени (гваШтеРСЫ) для определения сэ-ДНК, независимо от пола плода. В качестве «мишени» выбирались участки генома, содержащие делеционные полиморфизмы,

что позволяло отличить геном плода от генома беременной на основании отцовских полиморфизмов. Использовался комплект реагентов «Проба-ГС» (ДНК-технология, Россия).

2. Высокопроизводительное секвенирование. Для оценки наличия или отсутствия анеуплоидий 21,18 хромосом, хромосомы X, а также наличия хромосомы Y у плода проводили выделение внеклеточной ДНК, содержащей материнскую и фетальную фракции, приготовление библиотек ДНК для полупроводникового секвенирования, эмульсионную ПЦР и высокопроизводительное секвенирование на приборе IonProton (LifeTechnologies, США). Результаты оценивали с помощью биоинформатической обработки данных секвенирования ДНК, для сравнения покрытия внутри образца применяли T-test.

Статистические методы исследования

Все полученные анамнестические данные, анализы и исследования были обработаны с помощью компьютерной программы StatisticaforWindows v 8.0.

Для всех количественных показателей были определены: среднее значение (М), стандартное отклонение (5), ошибка среднего (ш), 95% доверительный интервал, медиана (Ме), интерквартильный размах, а для номинальных значений рассчитаны частоты (%). Полученные данные были проверены на соответствие нормальному распределению с помощью критерия Шапиро-Уилка. При сравнении средних значений между группами применяли параметрический t-критерий Стьюдента. Анализ показателей, изменяющихся в течение беременности (уровни общей и сэ-ДНК), производился с помощью непараметрического аналога t-критерия Стьюдента - критерия Вилкоксона.

Сравнение распределения показателей (частот) между группами осуществлялось с помощью критерия Хи-квадрат с построением соответствующих таблиц (2x2 или 2x3).

Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведен тщательный сбор анамнеза пациенток исследуемых групп - данные о возрасте, социально-экономическом положении, профессиональных вредностях, наследственности, проанализирована частота экстрагенитальных и гинекологических заболеваний, менструальная функция, репродуктивный анамнез.

Женщины исследуемых групп были сопоставимы по возрасту -средний возраст женщин основной группы составил 30,6±4,5 лет, контрольной группы 28,5±4,6 лет (р>0,05). Все женщины проживали в одинаковых климатогеографических условиях - преимущественно в городе Москва и Московской области, имели среднее и высшее образование. Профессиональных вредностей не выявлено.

При анализе частоты соматических заболеваний достоверных отличий между группами не отмечено. Гинекологический анамнез у женщин основной группы был достоверно чаще отягощен воспалительными заболеваниями органов малого таза - в 72,0% случаев отмечен, сальпингит, оофорит, хронический эндометрит. У женщин контрольной группы ВЗОМТ в анамнезе отмечены в 12,0% наблюдений (р=0,000053).В сериях исследований была доказана высокая частота воспалительных процессов у женщин с привычным выкидышем, что скорее всего связано с генетической предрасположенностью к реализации воспалительной реакции и неоднократными инструментальными внутриматочными вмешательствами (В. Н. Серов с соавт, 2007; О. Ф. Серова с соавт, 2009; Н. Юдаев с соавт, 2010).

При анализе анамнестических данных женщин основной группы, установлено, что большинство пациенток 56,3% имели 3 и более ранних

потерь беременности, во всех случаях первичного характера, 79,6% всех гестационных потерь было отмечено в сроках до 12 недель, 85,7% всех беременностей прервалось до 22 недель. Из 98 беременностей женщин основной группы 7 закончились преждевременными родами, 5 из них -очень ранними преждевременными родами с 22 по 28 неделю беременности.

Следовательно, беременные основной группы составляли группу риска по реализации как ранних, так и поздних гестационных осложнений, исходя из анамнестических данных. В контрольной группе 16 (66,7%) женщин было первобеременными, у 5 (20,8%) женщин беременность была второй, у 3 женщин (12,5%) третьей, в анамнезе рождение здоровых доношенных детей.

Все пациентки основной и контрольной групп наблюдались и родоразрешались в НЦАГиП, где проведен анализ течения беременностей с сопоставлением частоты гестационных осложнений. При необходимости в госпитализации стационарное лечение проводилось во 2-м отделении акушерском патологии беременности. В 71,8% (23) случаях у женщин основной группы беременность осложнилась угрожающим/начавшимся выкидышем, подтвержденными клиническими признаками и данными УЗ исследования. Угрожающий выкидыш у женщин основной группы отмечен в 71,8% наблюдений, в 62,5% сопровождающийся умеренными или обильными кровянистыми выделениями из половых путей, по данным эхографического исследования ретрохориальные гематомы отмечены в 43,7% случаев. У остальных 9,3% женщин жалоб в течение первого триместра беременности не отмечено. В контрольной группе в течение I триместра беременности регистрировались следующие осложнения: ОРВИ с субфебрильной температурой тела - 12,5%, умеренная рвота беременных - 16,6%, анемия беременных — 16,6%. Явления угрожающего/начавшегося выкидыша в виде болей внизу живота и в

пояснице, кровянистых выделений отмечены в 37,5%случаях. При угрожающем выкидыше проводилось стационарное лечение, прием гестагенов в терапевтических дозах, гемостатическая терапия.

Проведен сравнительный анализ уровней общей и сэ-ДНК женщин с привычным выкидышем с и без явлений угрожающего выкидыша. Установлено, что в 12 недель беременности у женщин с привычным выкидышем и клинической картиной угрожающего выкидыша средние значения уровней общей ДНК равнялись 47,0 копий/мл х 103, тогда как без угрожающего выкидыша - 11,5 копий/мл х 103 (р=0,0055). В 20 недель беременности также отмечались достоверные различия: у женщин с угрозой выкидыша средний показатель уровня общей ДНК составлял 23,8 копий/мл х 103, тогда как без угрозы прерывания беременности 11,5 копий/мл х 103 ({5=0,0455).

В уровнях сэ-ДНК отмечена та же закономерность: у женщин с ПВ при кровотечениях в сроках до 12 недель уровни сэ-ДНК достоверно выше, чем у женщин с ПВ без клинической картины угрожающего выкидыша, (средние значения уровней сэ-ДНК составили 0,74 копий/мл х 103 по сравнению с 0,34 копий/мл х 103 (р=0,0416)). В 14 недель беременности также отмечались достоверные различия: у женщин с угрозой выкидыша средний показатель уровня сэ-ДНК составлял 0,34 копий/мл х 103, тогда как без угрозы 0,06 копий/мл х 10\ (р=0,0098).

Выявлены достоверные различия среди пациенток с начавшимся выкидышем и неосложненным течением данной беременности. Данные изменения касались уровней и общей и сэ-ДНК. По показателям общей ДНК достоверные различия получены в сроках 6,10,12,14,16 недель, по сэ-ДНК - в 10 и 14 недель.

копий/мл 45

40

35

30

Женщины с начавшимся выкидышем Женщины с

25

20

15

нормальным течением беременности

10

5

0 J---

6 8 10 12 14 16 18 20

недели беременности _

Рисунок 3. Сравнительный анализ средних уровней сэ-ДНК женщин с начавшимся выкидышем и неосложненным течением беременности

Таким образом, высокие уровни общей и сэ-ДНК в первом триместре, могут рассматриваться, как ранние маркеры неблагоприятного течения беременности (начавшегося выкидыша).

У женщин с ПВ и неосложненным течением первой половины беременности уровни общей и сэ-ДНК были статистически значимо выше, чем у здоровых беременных, что может предрасполагать к реализации плацента - ассоциированных гестационных осложнений (плацентарной недостаточности, задержки роста плода, выкидышам, преждевременным родам, обусловленным плацентарной недостаточностью). В систематических обзорах показана большая частота осложнений второго и третьего триместров беременности у женщин с ПВ по сравнению с женщинами с неотягощенным анамнезом [Ь^агавша^ 2010, Н.Сагр, 2013].

Несмотря на проводимую терапию у 7 из 32 (21,8%) женщин группы с ПВ произошли самопроизвольные потери беременности. В 4 из 5 случаев неразвивающихся беременностей отмечены хромосомные нарушения - анеуплоидии — трисомия 18, трисомия 16 и трисомия 21, а

также в одном наблюдении триплоидия (кариотип абортуса 69,XXY). Отдельно были проанализированы данные сэ-ДНК и общей ДНК у 7 женщин с потерями беременностей и 7 женщин контрольной группы с самопроизвольными родами (метод пар). Полученные результаты представлены на рисункее 4.У остальных женщин с ПВ в результате проведения патогенетической терапии беременность была пролонгирована, что сопровождалось снижением уровней общей и сэ-ДНК, при этом не достигавших значений в контрольной группе.

Mean Box Mean±SE; sker Mean±SD

p<0,05

^Контропьная rpvnna Нерзэвив бер-ть

Рисунок 4. Уровни сэ-ДНК у женщин основной и контрольной групп (метод пар)

Одним из частых осложнений III триместра у женщин с ПВ была угроза преждевременных родов, которая осложняла беременность в 36,0% наблюдений. Проводилась госпитализация, токолитическая терапия (Р-миметиками внутривенно), профилактика РДС плода. Анемия легкой степени у женщин контрольной группы встречалась в 12,5% случаев, у женщин основной группы в 16,6% наблюдений. Установлено, что при возникновении угрозы преждевременных родов

уровни общей и сэ-ДНК достоверно превышали аналогичные значения у женщин с неосложненным течением беременности. В одном наблюдении у пациентки с тяжелой плацентарный недостаточностью, потребовавшей элективного досрочного родоразрешения в сроке 29-30 недель были отмечены высокие апоптотические выбросы общей и сэ-ДНК. Уровни общей ДНК превосходили средние показатели в группе с ПВ и угрозой преждевременных родов в 6,7 раз, в группе с физиологическим течением беременности в 35 раз. Та же тенденция получена при анализе уровней сэ-ДНК: в 2,2 раза выше показателей в группе с ПВ и угрозой преждевременных родов, и 5,6 раз с неосложненной беременностью. Эти предварительные данные требуют проведения дальнейших исследований для оценки прогностической значимости метода на поздних гестационных сроках.

При анализе исходов беременностей у женщин с ПВ установлено, что своевременные роды произошли в 68,8% случаев, преждевременные роды у 9,4% наблюдаемых женщин, в 15,6% наблюдений имели место ранние потери беременности до 12 недель (в 12,5% случаев обусловленные анеуплоидиями), в 6,2% выкидыши с 12 по 22 неделю беременности. У женщин контрольной группы в 91,7% случаев произошли своевременные роды и в 8,3% преждевременные роды.

Выполненное исследование показало, что у женщин с ПВ в 12,5% желанные беременности прервались в связи с хромосомными аномалиями (ХА). Своевременное проведение неинвазивной пренатальной диагностики позволит выработать правильную тактику ведения беременности с отказом от ее дальнейшего пролонгирования в случае ХА плода. С другой стороны, снижение частоты проведения инвазивных процедур позволит избежать осложнений, имеющих место в 2-5% случаев, когда происходит самопроизвольное прерывание желанных беременностей.

Для решения поставленных задач проведена валидация метода неинвазивной диагностики анеуплоидий в группе женщин, проходивших инвазивную пренатальную диагностику (второй этап исследования).

Во всех 200 наблюдениях в образцах тканей плодового происхождения - хорион, плацента, амниотическая жидкость, был определен кариотип плода, а в периферической крови женщины — отсутствие или наличие анеуплоидий и У-хромосомы.

В последующем сопоставляли результаты инвазивной

цитогенетической и неинвазивной молекулярно-генетической диагностики.

Среди беременных, включенных в исследование, превалировали женщины в возрасте от 30 до 39 лет, составляющие 59,0%. Вместе с тем, на инвазивную пренатальную диагностику направлялись и молодые женщины до 30 лет - в 27,0 % случаев.

У 5,0 % женщин в родословной отмечены случаи наследственной и врожденной патологии у близких родственников. При анализе исходов предыдущих беременностей установлено, что в 11,0% случаев отмечалось рождение детей с генетическими нарушениями, а также неразвивающиеся беременности с установленной анеуплоидией плода.

В анамнезе у женщин исследуемой группы в 7,0% случаев отмечался привычный выкидыш, в 13,0% наблюдений беременность наступила в результате программы ЭКО, проведенной в связи с бесплодием. Донорства яйцеклетки не было ни в одном случае.

Из 200 наблюдений у 167 плодов (83,5%) установлен нормальный хромосомный набор, у 33 (16,5%) - патологический. У женщин с анеуплоидией плода в большинстве случаев причиной направления на инвазивную процедуру являлись результаты УЗИ (толщина воротникового пространства, отек мягких тканей, гипоплазия носовых

костей). Из 167 женщин, у которых не было определено хромосомной патологии, причиной направления на инвазивную процедуру в 20,6% случаев был старший репродуктивный возраст, в 35,3% наблюдениях данные УЗИ и в 44,1% результат исследования биохимических маркеров. Патология кариотипа при проведении инвазивной цитогенетической диагностики была представлена следующими анеуплоидиями: трисомия 21 - 19 наблюдений, трисомия 18 - 8, трисомия 13 - 1, трисомия 16 -1, моносомия X - 4 наблюдения. В 197 -98,0% случаев полученные данные были идентичны при анализе как цитогенетическим, так и молекулярно-генетическим методом.

Среднее содержание доли фетальной ДНК в образцах составило 11,6% (90% С1: 6.6%-17.5%). В двух образцах мужского пола уровень фетальной ДНК был менее 4,0%, что делало невозможным корректное проведение молекулярно-генетического исследования. Все клинические образцы при определении У-хромосомы были оценены, как принадлежащие к мужскому полу, все отрицательные по У-хромосоме образцы - как относящиеся к женскому полу.

Моносомия X была определена в 5 наблюдениях и подтверждена данными цитогенетического анализа в 4 случаях. В одном случае был получен результат, трактуемый как моносомия по X при наличии у плода хромосом XX в кариотипе. Таким образом, чувствительность определения пола цлода составила более 0,995~99,5%, что свидетельствует о возможности использования метода для определения статуса половых хромосом, в том числе для определения моносомии по Х-хромосоме (рисунок 5).

доля V хромосомы

X хромосома

Рисунок 5. Неинвазивная пренатальная диагностика: определение статуса половых хромосом у плодов.

При проведении неинвазивной молекулярно-генетической диагностики всего было выявлено 28 анеуплоидий по 21, 18, 13 и 16 хромосомам, из них трисомия по 21 хромосоме - 17 наблюдений, трисомия по 18 хромосоме - 8 наблюдений, трисомия по 16 хромосоме -1 наблюдение, трисомия по 13 хромосоме — 2 наблюдения. Результаты определения анеуплоидий в клинических образцах представлены на рисунке 6.

значение Т для 21 хромосо

значение Т для 18 хромосо

Т для 13 хромосомы

Рисунок 6. Неинвазивная пренатальная диагностика: определение анеуплоидий по 21, 18, 16 и 13 хромосомам.

Оценка диагностической ценности неинвазивной пренатальной диагностики представлена в таблице 1.

Таблица 1

Оценка диагностической ценности «Неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий по 21, 18, 16 и 13 хромосомам методом высокопроизводительного секвенирования (ИОБ)» (сравнение с кариотипированием)

Результат исследования Подлинный статус

Патология Норма Сумма

Патология а - истинно положительный - 28 наблюдений Ь - ложно положительный - 1 наблюдение а + b = 29

Норма с — ложно отрицательный - 2 наблюдения <1 - истинно отрицательный — 169 -

Сумма а + с =30 Ь + ё =170 a+b+c+d= 200

Внедрение метода неинвазивной пренатальной диагностики для скрининга беременных высокого риска как теста второй линии перед проведением инвазивной пренатальной диагностики обосновано уже на современном этапе. В настоящее время широко дискутируется вопрос о внедрении данной методики в рутинный скрининг всех беременных. Исследования зарубежных авторов показывают, что неинвазивная пренатальная диагностика является эффективным методом скрининга для ХА плода с частотой обнаружения более 99,0% при ложноположительных результатах менее 0,1% (Y.Li, G. etal., 2007; М. Mortarinoetal., 2011; А. Nakashimaetal.,2012; Т. J. Muscietal., 2013).Международное общество пренатальной диагностики рекомендует

принять этот современный тест вместе с генетическим консультированием, в случаях, когда существующие стратегии скрининга показывают у плода высокий риск развития ХА. Применение неинвазивной пренатальной диагностики в качестве скрининга первой или второй линии позволило бы предотвратить потери здоровых детей и оптимизировать затраты на проведение высокотехнологичной помощи беременным женщинам. Необходима национальная валидация методов неинвазивной пренатальной диагностики и разработка нормативных документов, определяющих их место в обследовании беременных женщин в условиях системы Российского здравоохранения.

ВЫВОДЫ

1. При анализе клинико-анамнестических данных установлено, что пациентки с привычным выкидышем и женщины без отягощенного анамнеза сопоставимы по возрасту, характеру менструальной функции, частоте соматических заболеваний. Отмечено статистически значимое различие в частоте воспалительных заболеваний органов малого таза в анамнезе у женщин с привычным выкидышем (72,0%) по сравнению с пациентками контрольной группы (12,0%) - р<0,001. Отмечена высокая частота осложнений первого триместра беременности в виде угрожающего и начавшегося выкидыша у женщин основной группы -72,0%.

2. Определение уровней сэ-ДНК независимо от пола плода в периферической крови женщины возможно с 6 недели беременности. Установлено, что при угрожающем и начавшемся выкидыше, независимо от предшествующего анамнеза пациентки, происходит резкое повышение уровней общей и сэ-ДНК, что может служить патогенетическим механизмом в реализации прерывания беременности. Высокие уровни общей и сэ-ДНК на ранних сроках беременности ассоциированы с угрожающим/начавшимся выкидышем и являются

неблагоприятным прогностическим маркером развития беременности до 22 недель.

3. Установлено, что у женщин с привычным выкидышем за 2 недели до возникновения угрозы прерывания беременности уровни общей ДНК статистически значимо превышали аналогичные показатели женщин с привычным выкидышем и неосложненным течением беременности в сроках 12 и 20 недель, что совпадает с общепринятыми сроками проведения биохимического и ультразвукового скрининга.

4. При неосложненном течении первой половины беременности у женщин с привычным выкидышем и здоровых беременных получены достоверные различия в уровнях общей и сэ-ДНК. При отсутствии клинических проявлений угрожающего выкидыша, уровни общей и сэ-ДНК пациенток с неоднократными потерями беременностей значительно превышают аналогичный показатель здоровых беременных женщин, особенно в сроках 12 и 14 недель.

5. Отмечено достоверное повышение уровней общей и сэ-ДНК при начавшемся спорадическом выкидыше у женщин без отягощенного акушерского анамнеза по сравнению с женщинами с неосложненным течением данной беременности. По показателям общей ДНК достоверные различия получены в сроках 6,10,12,14,16 недель, по сэ-ДНК - в 12 и 14 недель.

6. В проведенном исследовании, посвященном валидации метода неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий у 200 беременных женщин установлено 29 истинно положительных анеуплоидий по аутосомам и 4 моносомии X. В одном случае имелся ложноположительный результат по 13 хромосоме и один - по моносомии X, возможно, из-за плацентарного мозаицизма, и два ложноотрицательных результата по трисомии 21 с долей фетальной ДНК менее 4,0%. Установлено, что метод неинвазивной пренатальной

диагностики анеуплоидий 21, 18 хромосом, копийности половых хромосом X и У методом высокопроизводительного секвенирования по периферической крови беременных женщин обладает чувствительностью 93,0% и специфичностью 99,0%.

7. У женщин с отягощенным акушерским анамнезом, угрожающим и начавшимся выкидышем неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования является методом выбора в выявлении хромосомной патологии плода, позволяющим избежать осложнений, обусловленных инвазивными диагностическими процедурами и оптимизировать дальнейшую тактику ведения беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования является эффективным методом скрининга хромосомных аномалий плода с чувствительностью метода 93,0% и специфичностью 99,0%. Рекомендовано проведение данного метода, как скринингового в популяции женщин с одноплодной беременностью при высоком риске реализации хромосомной патологии плода (возрастной и анамнестический факторы, беременность, протекающая с выраженной угрозой прерывания, УЗ маркеры хромосомных аномалий плода).

2. Рекомендуется использование неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования с 11 до 18 недель у беременных с угрожающим и привычным выкидышем, отягощенным акушерским анамнезом для выработки рациональной тактики ведения беременности и определения целесообразности ее пролонгирования. Предлагаемый подход позволит избежать ненужных инвазивных диагностических процедур при

отсутствии хромосомной патологии плода и снизить риск гестационных осложнений.

3. Высокие значения уровней сэ-ДНК в I триместре беременности являются неблагоприятным прогностическим фактором ранних гестационных осложнений (самопроизвольного прерывания беременности, начавшегося выкидыша, анеуплоидии) и должны служить основанием для расширенного клинико-лабораторного обследования, углубленного мониторинга и подбора терапии.

4. Рекомендуется исследование уровней общей и сэ-ДНК в скрининговые сроки 12 и 20 недель для прогнозирования акушерских осложнений у групп беременных высокого риска. Высокие уровни сэ-ДНК у женщин с привычным выкидышем и отсутствием клинических проявлений угрозы прерывания беременности ассоциированы с последующим развитием плацентарной недостаточности, преждевременных родов, элективного досрочного родоразрешения.

5. Нормализация уровней сэ-ДНК в динамике беременности у женщин с угрожающим и привычным выкидышем свидетельствует об эффективности проводимой терапии и может служить благоприятным прогностическим маркером пролонгирования беременности (приложение).

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свободная эмбриональная ДНК в прогнозировании исхода беременности при акушерской патологии / Н.Г.Парсаданян, Е.С.Шубина, Д.Ю.Трофимов, Н.К. Тетруашвили // Акушерство и гинекология,-2014. -№6.- С. 10-13.

2. Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплодий методом секвенирования внеклеточной ДНК. Современный взгляд на проблему / Н.К. Тетруашвили,Н.Г.Парсаданян,Н.И.Федорова, Д.Ю. Трофимов, Е.С. Шубина// Акушерство и гинекология,- 2014. - №10,- С.4-7.

3. Уровень свободной эмбриональной ДНК при угрожающем, привычном выкидыше и неосложненном течении беременности в сроках до 22 недель / Н.Г.Парсаданян, Е.С. Шубина, Н.К. Тетруашвили, Д.Ю. Трофимов, Г.Т. Сухих // Акушерство и гинекология,- 2015. - №2,-С.33-38.

4.Неинвазивнаяпренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования(ЪГС8) в группе женщин высокого риска /Г.Т. Сухих, H.A. Каретникова, Е.Е. Баранова, Е.С. Шубина, Д.О. Коростин, А.Н. Екимов,Н.Г. Парсаданян, А.И. Гус, В.А. Бахарев, Д.Ю. Трофимов, С.М. Воеводин, Н.К. Тетруашвили //Акушерство и гинекология,- 2015. - №4.- С.5-10.

5. Уровни свободной эмбриональной днк у пациентки с привычным выкидышем и тяжелой плацентарной недостаточностью / Н.Г.Парсаданян, Е.С. Шубина,Н.К. Тетруашвили,A.A. Агаджанова, Д.Ю. Трофимов//Акушерство и гинекология,- 2015. -№4,- С.90-94.

6. Свободная эмбриональная ДНК при самопроизвольных ранних потерях беременности у женщин с привычным выкидышем /Н.Г.Парсаданян, Е.С. Шубина, Н.К. Тетруашвили,Д.Ю. Трофимов // Астраханский медицинский ' журнал.-2015.-№1.-С.84-90.

Приложение

АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ОБЩЕЙ И СЭ-ДНК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ТЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ

АЛГОРИТМ ОБСЛЕДОВАНИЯ ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ ВЫКИДЫШЕМ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ УРОВНЕЙ ОБЩЕЙ И СЭ-ДНК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ В ТЕЧЕНИЕ БЕРЕМЕННОСТИ (продолжение)

Нормальный результат при проведении УЗИ и неинвазивной пренатальной диагностики

I

Выявлена анеуплоидия, подтверждение при проведении амниоцентеза и кариотипирования -консультативное решение вопроса о прерывании беременности до 20 недель

Подписано в печать: 17.03.2015 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 120 экз. Заказ № 416 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru