Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Неинвазивная визуализация гемопоэтических и опухолевых клеток с использованием молекулярно-биологических методов (экспериментальное обоснование и клинические исследования)

На правах рукописи

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НЕИНВАЗИВНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛ ОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

Дубровин Михаил Михайлович

14.00.29 - гематология и переливание крови 14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ОЙЗ»

Москва 2005

Работа выполнена в ФГУ НИИ детской гематологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ (директор - член-корреспондент РАМН, профессор А.Г.Румянцев) и лаборатории нейро-онкологии Мемориал Слоан-Кеттеринг Онкологического Центра, США (заведующий - профессор Р.Г.Бласберг)

Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор А.Г. Румянцев

Доктор медицинских наук, профессор Р.Г.Бласберг Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Б.В.Афанасьев Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор И.ВЛоддубная

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор И.Решетов

Ведущая организация:

Гематологический Научный Центр РАМН

Защита состоится « »

2005 г. На заседании диссертационного совета Д 208.050.01 при

Научно-исследовательском институте детской гематологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию по адресу: 117997, Москва, Ленинский проспект, дом 117.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ детской гематологии. Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного

Совета, доктор медицинских наук, профессор В.М.Чернов

7 v ¿5 (о

Введение

Актуальность проблемы.

Развитие методов молекулярной визуализации клеток-мишеней в гематологии и онкологии продиктовано требованиями современного уровня развития медицины, ориентированного на применение лечения, специфически влияющего на патогномоничные биологические механизмы, лежащие в основе патологического процесса [J. Quiao, 2002; W.Pao, 2004; N. Rosen 2004]. Поиск биологических путей и подходов к контролю опухоли обусловлен необходимостью преодоления лекарственной резистентности [N. S hah 2 004] и системной токсичности, развивающейся при повышении терапевтических доз [S.F. Gardner, 1993]. Применение узко-специализированных методов лечения, таких как таргет-терапия, требует тщательного отбора пациентов, с нарушениями именно в данном физиологическом звене, что требует тщательного контроля за функциями на клеточном и субклеточном уровне как с научной, так и с этической точки зрения [G.D. Demetri, 2002]. Последнее отражается в ужесточении требований к разрабатываемым препаратам и биологическим компонентам, в особенности связанным с использованием рекомбинантного генетического материала и переноса донорских или аутологичных искусственно выращеных клеток [C.M.Rooney, 1995].

Основы развития молекулярной визуализации были заложены на стыке молекулярной биологии, ядерной медицины, фармакологии, биохимии и клеточной биологии [J. Gelovani Tjuvajev, 2003]. Разработанные ещё на заре ядерной медицины принципы использования следовых концентраций радиофармпрепаратов [L. Sokoloff, 1972], прямых и непрямых подходов к визуализации получили дальнейшее развитие при использовании последних достижений генной инженерии [S.S.Gambhir, 2005] и протеиномики [G.D. Luker, 2002; D. Piwnica-Worms, 2005]. Вклад молекулярной визуализации, как в область породивших её базовых наук, так и в практическую или клиническую науку неоценим. Существенная часть биологических исследований в целом и большая часть экспериментальных работ по иезучению биологических механизмов гемо- и оякогенеза на экспериментальных моделях используют на различных этапах генные репортерные конструкции, позволяющие получать неинвазивным образом иформацию о физиологических и патологических процессах на клеточном уровне [Mayer-Kuckuk, 2002].

Именно гематология и онкология стали основными областями приложения достижений молекулярной визуализации, так как в основе патологических процессов гемопоэза и онкогенеза лежат нарушения на молекулярном уровне, приводящие к нарушению системной регуляции и тяжелым последствиям для всего организма [V.A. Miller, 2004; T.J. Lynch, 2004]. Наблюдение за этими процессами станло первым шагом к созданию и проведению патогенетической терапии заболевний [X. Wang, 2003]. Молекулярная визуализация играет также важную роль на этапах доклинических испытаний, выполняя функцию контрольного инструмента, мониторирующего биологический эффект лечения [S.Stroobans, 2003]. В данный момент qT^^^^j^mujieij^mpHofi визуализа-

ции начали проходить клинические испытания.

ММИОТЕКА i

STSffîcà

Таким образом, внедрение в клиническую практику достижений биотехнологий требует осуществления строгого контроля за используемыми в лечении препаратами и агентами. Возможности, предоставляемые в этом отношении молекулярным имиджиигом (визуализацией), делают его незаменимым инструментом биомедицинской науки и клинической гематологии/онкологии.

Цель исследования.

Разработать и внедрить в практику диагностическую технологию, объединяющую визуальное наблюдение и количественную оценку биологических процессов, вовлеченных в гемо-, иммуно- и онкогенез, для контроля эффективности проводимой терапии опухоли на уровне клетки-мишени, межклеточного взаимодействия и организма в целом с минимальным вмешательством, не способным повлиять на течение процесса.

Задачи:

Экспериментально-теоретические доклинические исследования:

1. Доказать преимущества использования «суррогатных» радиомеченных фармпрепаратов, имитирующих существенные (ключевые) компоненты, участвующие в регуляции гемопо-эза, опухолевом метаболизме, позволяющих количественно оценить распространенность и характер роста опухоли с диагностической и терапевтической целями.

2 Определить возможность повышения специфичности и расширения функционального потенциала противоопухолевой терапии с помощью непрямых визуализирующих методов с использованием генных репортсрных систем регулируемых на транскрипторном и по-спранскрипционном уровне передачи биологического сигнала.

3 Доказать необходимость комплексного подхода к использованию молекулярного имиджин-га и количественной оценки изображений для повышения чувствительности и специфичности визуализирующих методов исследования биологии опухолей и противоопухолевого ответа для усиления их диагностической значимости

4 Обосновать использование неинвазивной молекулярной визуализации для мониторирова-ния миграции опухолевых и нормальных клеток организма на различных этапах гемо-, иммуно- и онтогенеза и противоопухолевой терапии, включая трансплантацию гемопоетиче-ских стволовых клеток и адоптивную иммунотерапию.

5 Оценить применимость прямого имиджинга для определения показаний и мониторирования лечения опухолей с помощью биологически направленной терапии ингибиторами протеин-киназ, являющихся фармакологической мишенью для подавления функции рецепторов, поддерживающих опухолевый рост.

Клинические испытания методов молекулярной визуализации:

1. Разработать и внедрить в клиническую практику систему прямой визуализации опухолевых клеток для определения показаний к назначению препаратов группы ингибиторов протеин-киназ, позволяющую определить чувствительность опухоли к противоопухолевой терапии, специфичность терапии по отношению к здоровым тканям и монигорироватъ ход лечения больных.

2. Оценить возможность повышения специфичности и улучшения чувствительности метода (прогностическую достоверности и клиническую значимость) диагностики и мониториро-вания роста опухолей с помощью галогенизированных производных тимидина и циклических аминокислот в качестве непрямых маркеров опухолевого метаболизма по сравнению с традиционными прямыми и суррогатными методами.

3. Доказать преимущества многофункционального подхода в клинической визуализации противоопухолевой генной терапии, за счет комплексной оценки локализации, степени активности и безопасности применения суицидальных генных систем.

Научная новизна Впервые:

• В доклинических и клинических исследованиях испытаны неметаболизируемые аминокислоты и нуклеозиды в качестве радиомеченных проб для выявления роста опухолей.

• Создан химерный ген, позволяющий получать многофункциональные изображения меченых клеток и проводить параметрическую оценку уровня активности терапевтического гена.

• Разработан метод моделирования опухолевого роста in vitro путем создания сфероидов из опухолевых клеток, меченых химерным флуоресцентным геном, для оценки дозы и эффективности радиотерапии.

• Предложен метод радиогенной терапии опухолей с использованием герпесвирусной ти-мидин-киназы и [ХТ]ФИАУ в качестве радиофармпрепарата

• Проведена количественная оценка эффективности трансфекции растущей опухоли в живом организме литическим вирусом герпеса, введенного непосредственно в опухоль.

• Описан опухолеспецифический контроль экспрессии терапевтического гена, доставленного в опухолевые клетки с помощью аденовирусного вектора.

• Разработан метод визуализации и количественной оценки аденовирусной терапии метастазов рака толстого кишечника в печени.

• Предложено использование двух аналогичных аденовирусов для получения параметрической количественной оценки экспрессии терапевтических трансгенов в тканях опухоли.

• Осуществлено мониторирование распределения в живом организме терапевтических трансгенных бактерий, несущих репортерный ген.

• Проведено длительное неинвазивное наблюдение за распределением и перемещением в опухоль специфических противоопухолевых Т-клеток.

• Разработан радиофармпрепарат ФИАУ, аналогичный по активности тимидину, специфичный только для герпесвирусной тимидин-киназы и не накапливающийся тимидин-киназой 1 млекопитающих.

• Получены изображения процесса приживления трансплантата костного мозга в живом организме в масштабе реального времени.

• Создана система визуализирующий ген - радиоактивно-меченая проба, позволяющая не-инвазивно визуализировать биологические процессы, происходящие в меченых клетках, находящихся в головном мозге за неповрежденным гематоэяцефалическим барьером.

• Получены изображепия связывания и иакоплепия в тканях специфических ингибиторов протеин-киназ ЭГФР и абл.

Практическая значимость

Нуклеозиды - бромо-фторо-урацил арабинозид предложен в качестве альтернативы тимидину для визуализации пролиферативной активности опухоли. Разработаны показания к применению и алгоритм использования наиболее клинически эффективных фторированных и йодированных аналогов тимидина - ФЭАУ и ФИАУ, соответственно. На применении нуклеозидных радиотрейсе-ров основан метод, позволяющий количественно оценивать пролиферацию, определяя скорость накопления нуклеотидов в клетках, путем дифференциального мечения бромо и йодопроизводны-миурацила.

Использование радиомеченных нуклеозидов в качестве репортерных проб для нуклеозид-киназных репортерных генов позволяет производить неинвазивную визуализацию биологических процессов на клеточном и тканевом уровне.

В сочетании с репортерными генами нуклеозиды используются в качестве диагностических систем для молекулярной визуализации внутриклеточных процессов с помощью управляющих элементов, чувствительных к регуляции на транскрипционном уровне.

Обоснованы принципы радиогенной терапии, позволяющей направленно доставлять радиофармпрепарат к клеткам мищеням и их микроокружению Метод доведен до клинических испытаний.

Аминокислоты - проведены исследования распределения неметаболизирующихся аминокислот для получения ПЭТ изображений у пациентов с опухолями мозга. ПЭТ визуализация с помощью

неметаболизируемых циклических аминокислот используется для неинвазивной оценки роста опухоли в ходе исследований противоопухолевой терапии, а также влияния роста опухоли на синтетические анаболические потребности клеток, экспрессию аминокислотных транспортеров и проницаемость ГЭБ.

Вирусы - Разработанный метод визуализации и количественной оценки эффективности транс-фекции метастазов аденокарциномы толстой кишки в печени положен в основу серии клинических исследований, мониторирующих эффективность переноса терапевтического гена. Визуализация действия вирусной противоопухолевой терапии с помощью молекулярных репортерных систем внедрена в лабораторные методы работы с малыми лабораторными животными для оценки распределения введённого вируса в организме, вирусной дозы, накопленной в отдельных органах и тканях. Данная методика позволяет проводить количественную оценку вирусной нагрузки и функциональной экспрессии терапевтических белков, перенесённых вирусным вектором.

Методы визуализации генной терапии необходимы для развития таргет-терашш в онкологии, требующего долговременного неинвазивного мониторирования и регуляции экспрессии перенесенных генов в живом организме с целью предотвращения возможных побочных эффектов от проводимого лечения.

Бактерии - разработана репортерная система, позволяющая проводить наблюдение за эффективностью нового метода в противоопухолевой терапии - бактериальпой терапии опухолей - и следить за распределением используемого при этом терапевтического компонента в организме больного. Неинвазивная визуализация с помощью репортерного гена ВПГ-ТК использовалась для характеристики распределения противоопухолевых терапевтических бактерий с целью оценки бактериальной нагрузки на жизненно-важные органы и системы.

Клетки:

Лимфоциты - На основании разработанной и опубликованной нами методики визуализации Т-лимфоцитов разработан клинический протокол наблюдения за введенными пациенту генетически модифицированными анти-ЭБВ-специфичными цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ)._ Кроме того, неинвазивная молекулярная визуализация антиген-специфичных Т-клеток, введенных животным, несущим специфическую опухоль, используется в исследованиях, изучающих механизмы противоопухолевого и противовирусного Т-клеточного ответа, основпые молекулярные компоненты, участвующие в процессе антиген-специфичной миграции и активации Т-клегок, а также механизмы, с помощью которых опухоли избегают контроля со стороны иммунной системы и становятся резистентными к опухолсспецифичному Т-клеточному ответу.

Костный мозг - использование визуализации ГСК позволяет на ранних этапах прогнозировать состоятельность трансплантата. Интенсивность сигнала и его прирост коррелируют с увеличением числа клеток и, таким образом, восстановлением гемопоэза. Визуализация приживления костного мозга на ранних этапах стала надёжным прогностическим фактором отторжения трансплантата в различные сроки.

Опухолевые клетки - использование флуоресцентных белков позволяет в реальном масштабе времени наблюдать за распределением опухолевых клеток в организме.

Применение многофункциональных визуализирующих систем позволяет выявить в популяции метастатических клеток рака молочной железы наличие субпопуляций, имеющих предопределенную предрасположенность к метастазированию в различные органы и ткани.

Прямые тоейсеры

Разработан метод оценки прогнозирования эффективности лечения препаратами группы ингибиторов протеин киназы рецептора ЭГФР (гефитиниб), применяющихся при лечении немелкокле-точного рака легких, с помощью радиоактивно-меченных структурных аналогов, являющихся ковалентно-связывающимися ингибиторами интересующих протеин-киназ.

Для оценки клинического влияния и выработки показаний к применению ингибиторов аЫ-протеин-киназы (гливек (8Т1-571)) в лечении ОПУД опухолей и ХМЛ разработан метод использования радиофармпрепаратов семейства зге-ингибиторов, позволяющий предсказывать чувствительность опухоли в живом организме и в культуре клеток к определенному виду фармакологических препаратов класса ингибиторов ПК.

Неинвазивный имиджинг с использованием ингибиторов ЭРФ-тирозин кия аз применяется в исследованиях роли различных мутаций ЭРФ в чувствительности опухолей к химиотерапии новым классом фармпрепаратов - ПК-ингибиторами.

Предложено применение визуализации ингибиторов семейства сарк киназ - для скрининга относительной чувствительности новых препаратов данного семейства, а также для косвенной оценки терапевтического эффекта лечения отдельными ингибиторами различных ПК, обладающих кросс-реактивностью с сарк- киназой..

Предложенные подходы с использованием химерных многофункциональных визуализирующих генов могут использоваться для визуализации опухолевых и гемопоэтических клеток в многочисленных исследованиях, оценивающих их расположение и функции клеток крови и иммунной системы.

Мониторирование лимфоцитов, введенных пациентам в терапевтических целях, позволяет проводить контроль и коррекцию проводимой иммунотерапии в масштабе реального времени в

соответствии с наблюдаемым терапевтическим эффектом и предвосхищать развитие возможных побочных реакций, включая РТПХ.

Наблюдение за клетками костного мозга в посттрансплантационном периоде позволяет на ранних этапах оценивать и прогнозировать приживление трансплантата и, в случае наличия данных об отторжении, рассматривать вопрос о повторной пересадке на ранних клинических этапах с возможным сокращением сроков восстановления гематопоэза.

Внедрение в практику:

Стадию клинического внедрения прошли ряд методов, разработанных в ходе описанных ниже исследований:

«Суррогатный» визуализационный подход проходит клинические испытания на базе МСКОЦ. На данный момент в исследования возможности использования радиомеченных циклических аминокислот (ФАЦБК, ФАЦПК) вовлечены 6 пациентов, проведено 9 исследований, включая 3 повторных наблюдения.

В клинических испытаниях 1-2 фазы по накоплению опухолями мозга радиомеченного йодо-уридина был набран 21 больной. Исследования к настоящему моменту завершены.

В совместном исследовании 1-ой фазы по Визуализация вирусной противоопухолевой терапии метастазов рака толстого кишечника на базе Госпиталь Маунт Синай при участии МСКОЦ проведены эксперименты с 4 пациентами.

Результаты исследований, проведенных в рамках данной работы, использованы в Институте Макса Планка, на базе Клинике Университета Кёльна, для проведения серии клинических экспериментов по суицидальной терапии резидуального заболевания после резекции глиобластомы с помощью адено-ассоциированых вирусов, несущих суицидально-визуализационный ген ВПГ-ТК. В ходе 1 Фазы испытаний визуализация [1241]ФИАУ применялась для оценки распространённости трансфекции и уровня экспрессии трансгена у 7 пациентов до начала терапии ганцикловиром.

Визуализация Т-клеток - в непостредственном взаимодействии с клиническими подразделениями МСКОЦ (отделение педиатрии, служба трансплантации костного мозга, отделение гастроэнтерологии, программа рака лёгкого) в ходе обследования пациентов внедрены методы биологической оценки и визуализации эффективности Т-клеточной противоопухолевой терапии аденокар-циномы толстой кишки, немелкоклеточного рака лёгкого и ЭБВ-ассоциированной лимфомы на основе молекулярного анализа.

Результаты, полученные в ходе исследований прямой визуализации внедрены в создание скрн-нинговой системы, позволяющей в ходе анализа полученных при биопсии или резекции опухолевых тканей, устанавливать чувствительность опухоли к терапии препаратами класса необратимых ингибиторов протеин-киназя ЭГФР.

Подготовлены клинические протоколы для внедрения новых трейсеров: ФЕАУ для репортер-ной визуализации ВПГ-ТК и ФБрАУ для «суррогатной» визуализации клеточной пролиферации.

На доклиническом этапе также внедрен широкий диапозон разработок

Разработанный и охарактеризованный ФЕАУ используется для репортерной визуализации лабораторными подразделениями отделов педиатрии, ядерной медицины, радиологии, радиотерапии, химиотерапии и службы трансплантации костного мозга МСКОЦ, а также отделением экспериментальной радиологии М.Д.Андерсон Онкологического Центра и отделением ТГСК НИИ детской гематологии.

Для испытаний противоопухолевых препаратов в Отделении фармакологии МСКОЦ применяется трансфекция клеток линий, используемых для создания моделей опухолей, генной репортерной системой ХШП-70. В отделении радиотерапии для исследований чувствительности и ответа клеточных линий и эндотелиоциюв на лучевую терапию в культурах тканей и животных моделях используется репортерная система р53. Отделением фармакологии используются радиомеченные ингибиторы протеинкиназ для отбора новых терапевтически эффективных препаратов данного семейства с помощью прямой визаулизации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Радиомеченные аналоги тимидина и циклические аминокислоты, используемые в качестве радиофармпрепаратов, позволяют повысить чувствительность неинвазиввой визуа-лизационной оценки локализации и пролиферативного потенциал опухоли в реальном времени и определение границ опухолевой инфильтрации.

2. Транскрипционно-регулируемые генные репортерные системы можно использовать в качестве инструмента визуализации и контроля передачи сигнала молекулярно-биологических процессов, вовлеченных в онтогенез на субклеточном уровне.

3 Совмещение структурной и функциональной информации позволяет повысить специфичность и чувствительность отдельных методов неинвазивной радиологической и молекулярной визуализации в доклинических исследованиях механизмов развития и лечения экспериментальных моделей опухолей.

4 С помощью неинвазивного молекулярного имиджинга можно определять характер движения и перераспределения цитотоксических Т-лимфоцитов в реальном масштабе времени в течение всего периода их существования в организме реципиента адоптивной иммунотерапии.

5 Метод прямой визуализации позволяет оценивать биологический эффект при разработке противоопухолевых препаратов группы необратимых ингибиторов протеин-киназ.

6. Накопление радиомеченных аналогов тимидина и циклических аминокислот позволяет повысить достоверность диагноза распространенности опухоли и клиническую значимость метода позитро-эмиссионной томографии у пациентов с опухолями головного мозга

7. Неинвазивная визуализация генов с двойной репортерно-суицидальной функцией (ВПГ-ТК) позволяет осуществить контроль за распределением вирусного вектора, локализацией и уровнем активации терапевтического гена при генной суицидальной терапии метастазов рака толстой кишки в печень с помощью аденовирусного вектора.

8. Определения показаний к назначению препаратов группы ингибиторов тирозин киназ может быть осуществлено при помощи радиомеченных аналогов данных фармацевтических соединений, применяемых для прямой неинвазивной визуализации опухоли в организме в целом.

Место выполнения работы

Экспериментально-теоретическая часть выполнена на базе Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического Центра, Нью-Йорк, США. Исследования проводились в отделениях педиатрии, нейро-онкологии, трансплантации костного мозга, радиологии, ядерной медицины и терапии. Часть экспериментально-теоретических исследований также проводилась при участии отделения экспериментальной радиологии М.Д.Андерсон Онкологического Центра, отделения гастро-эятерологии Ггоспиталя Маунт Синай и программы генетики Университета Нью Джерси, США. В исследованиях использованы материалы совместных разработок с компаниями Авантис и Вион Фармасью-тикалс, США.

Клиническая часть работы, включая ретроспективный анализ популяций онкологических и гематологических пациентов и клинические испытания, проводилась на базе отделений педиатрии МСКОЦ и Нью-Йоркского Пресвитерианского Госпиталя, нейро-онкологии и терапии МСКОЦ, а также отделений гастроэнтерологии МСКОЦ и Больницы Маунт Синай, Нью-Йорк, США, и научно-клинического отделов ФГУ НИИ ДГ МЗ РФ, Москва, РФ.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из следующих частей - введение (включающее цели и задачи диссертации, актуальность, практическое значение и внедрение), главы 1 обзор научной литературы по теме диссертации, главы 2. материалы и методы, Первой части, описывающей результаты экспериментально-теоретических исследрваний в составе: главы 3, непрямой «суррогатный» имиджинг, главы 4, разработки репортерного генетического имиджинга, главы 5, прямой визуализации; Второй части, посвященной клиническим результатам: главы 6, клинические испытания функциональ-

ного имиджинга опухолей, главы 7, клиническая визуализация генной противоопухолевой терапии, главы 8, применение визуализации ЦТЛ в клинических исследованиях, главы 10, возможности прямой визуализации, и главы 10, Обсуждения результатов - и Заключения, содержащего выводы исстедований Притагается список использованной литературы и сокращений Общий объйм диссертации составляет_страниц печатного текста и_страница списка читературы сопровождаемого 89 иллюстрациями и 19 таблицами

Апробация работы

Материалы и основные положения работы доложены на VI, VII и VIII Всероссийских Конгрессах «Человек и Лекарствол (Москва, 2001, 2002 и 2003 гг), на 47, 49 и 50 Ежегодном съездах Общества Ядерной Медицины (Ст Луис, 2000, Лос-Анджелес, 2003 и Новый Орлеан, 2004), Съезде по Экспериментальной Биологии Американской Анатомической Ассоциации (Вашингтон, 2004), Совещании Национального Института Неврологии «Визуализационные маркеры Эпилептогенеза Новые Направления Исследований») (Вашингтон. 2004), Высокогорной Конференции по Ядерной Медицине (Вейл, 2003), научно-практических конференциях сотрудников МСКОЦ и НИИ ДГ (2001-2005г.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Экспериментально-теоретические исследования

Генетические конструкции

В основе большинства разработанных методик непрямого молекулярного имиджинга лежало создание репортерных генетических конструкций, несущих, помимо кДНК репортерного гена, ряд регуляторных и служебных элементов, обеспечивающих заданную, постоянную или контролируемую транскрипторными факторами, экспрессию в клетках эукариотов. Конструкции также включали элементы, позволяющие реплицировать генетический материал в компетентных бактериальных клетках и проводить положительную селекцию экспрессирующих клеток.

В Таблице 1 приведены генные репортерные конструкции, использованные в данной работе.

Таблица 1. Генные репортерные конструкции.

Обозначения Состав Функция

ВПГ-ТК Тимидин-киназа Вируса Простого герпеса Общий клинический репортер

ЦЦ-ТК Цитозин-деаминаза/ВПГ-ТК Сочентание двух суицидальной и репортерной систем

ТК-ЗФБ ВПГ-ТК/Зеленый Флуоресцентный белок Многофункциональная визаули-зация

КсПРТ-Крас Кзантин-фосфорибо-трансфераза/Красный белок дискосомы Многофункциональная визуализация за ГЭБ

р53-ТК-ЭФБ ТК-ЗФБ под контролем р53-чувствительного промотера х8 Визуализация апоптоза

ЯФАТ-ТК-ЗФБ ТК-ЗФБ под контролем промотера чувствительного к ЯФАТ хб Визуализация активации Т-клеток

ЭРГ-ТК-ЗФБ-ЦМВ-КсПРТ-Крас Энхенсер эритропоетина ТК-ЗФБ и КсПРТ-сиЯе«! Визуализация гипоксии

чНАТ Человеческий нор-адреналиновый транспортер Человеческий многофункциональный репортерный ген

чНИС-ЗФБ Человеческий натрий-йодидный симпортер/ЗФБ Многофункциональная система с человеческим геном

ХШП70-чНИС-ЗФБ чНИС-ЗФБ под контролем промотера гена ХШП70 Визуализация терапии анзиноми-цинами

ТК-ЗФБ-Люк-ДГФР ВПГ- ТК/ЗФБ/Люцифераза/ДГФР Визуализация костного мозга

/ - подразумевает химерный ген Клеточные линии

Перевиваемые коммерчески доступные опухолевые линии (АТСО: мышиного происхождения - RG2, Сб - глиобластомы, 4Т1- аденокарцинома кишечника (Avantis), L1- рак лёгкого (Avantis), Walker 256, MOD, МСА-26 - рак молочной железы; человеческого происхождения - U87MG, А-172, А-234 - мультиформные глиобластомы, ВТ-474 - рак молочной железы, НСТ-8 - рак толстой

кишки, SaOS-2 - остеогенная саркома - использовались для испытания свойств репортерных систем в культурах клеток и тканей и в экспериментальных моделях опухолей.

Первичные опухоли:

Нами были выделены клетки первичной опухоли аденокарциномы толстого кишечника для исследования ее молекулярно-биологического профиля и метастатического потенциала.

Первичные лейкемические клетки были получены от больных с различными видами лейкоза.

Рост и размножение первичных опухолевых и лейкемических клеток, неспособных к пролиферации и выживанию в культуре, поддерживались путем перевивания в иммунодефицитных животных в виде подкожных опухолей.

Культуры нормальных тканей использовали для оценки влияния на нормальные ткани различных аспектов противоопухолевой терапии. В частности изучались лёгочные фиброб ласты HFL-1.

Трансформированные лимфоциты нормальных доноров, полученные путем культивирования в среде, содержащей литический Эпштейн-Барр вирус (ЭБВ). ЭБВ-содержащий супернатант был собран с материнской клеточной линии В95.8

Нативные нормальные ткани: костный мозг мышей, мышиные эмбриональные клетки, человеческие Т-лимфоциты нормальных доноров,

Вирус-продуцируюшие клеточные линии:

Ретровирусы. в качестве продьюсерных линий для ретровирусов нами были использованы коммерчески доступные линии АМ-12 и PG-13 (АТСС), основанные на модификации МоМЛВ (Вирус мышиного лейкоза Молони) и ГАЛВ (вирус лейкоза обезьян-гиббонов), соответственно. В качестве основной лабораторной линии для массового производства СФГ псевдотипированных МоМЛВ-основанных ретровирусов использовалась ранее описанная линия ГРГ-29 (Н29) любезно предоставленная д-ром Саделайном (Мемориал Слоан-Кетеринг Раковый Центр).

Аденовирусы для испытания в ходе совместных исследований были произведены и доставлены компанией РПР (Авангис) а также медицинским центром Маунт Синай.

Герпесвирусы производились путем перевивания культур клеток, зараженных герпесвирусом, и способных производить новые вирионы.

Терапевтические бактерии - в качестве лечебного сальмонельного вектора был использован ат-тенуированый штамм Salmonella typhimurium VNP20009 (YS 1646), который был создан из purl", xyl" линии путём частичной делеции гена msbB, что привело к потере миристиловой кислоты в молекуле липополисахарида клеточной стенки. Данная модификация была необходима для устранения токсического эффекта эндотоксина (липополисахарида - ЛПС), что было доказано на экспериментальных животных моделях, где наблюдалось снижение ответа у животных па бактерии, практически исключая эффект токсического шока [14]. Безопасность данного штамма была также показана в доклинических испытаниях у приматов.

Молекулярно-биологические методы:

Выделение мРНК, ДНК

Приготовление образцов клеточных культур проводилось путем трипсинизации в течение 5 мин с последующей нейтрализацией средой с сывороткой и отмыванием Выделение РНК проводилось стандартным набором РНЕази (Квиаген).

Полимеразная цепная реакция проводилась согласно стандартному протоколу с предварительным нагревом до 95°С для денатурации ДНК и ингибирования ферментов за исключением термостабильной полимеразы (Так). После инициации первой цепи в течение около 5 мин проводилось циклическое нагревание/охлаждение образцов с целью прерывания синтеза и его инициации путем выстраивания праймеров комплиментарно к специфическому участку Температура выравнивания подбиралась соответственно компьютерному дизайну и спецификациям праймеров

Обратная реакция ставилась в 2 этапа с предварительным нагревом по методу, описанному компанией-производителем Амбион с препаратами из набора РТ (Амбион).

Градиентная ПЦР служи i для определения наиболее эффективной температуры связывания праймеров, в особенности в случае значительного расхождения расчётных температур связывания, использовался метод градиентной реакции амплификации, при которой в каждой индивидуальной лунке или в ряду лунок устанавливалась температура выравнивания

Саузерн блот' данный стандартный молекулярно-биологический метод использовался для получения подтверждения правильности включения стабильно трансфецируемого генетического материала путём ретровирусной трансфекции, а также для количественного определения числа копий генетического материала на клетку, перенесенного в результате трансфекции.

Вестерн блот:

Проводится с использованием электрофореза в стандартном денатурирующем буфере в акри-ламидном геле с полужидкостным переносом на мембрану на установке Биорад. Проявка мембран после окрашивания специфическим первичными и видоспецифичными вторичными антителами осуществлялась наборами Вектор Елайт с люминесцентной окраской.

ELISA

Проводилась с использованием коммерческих наборов (РэнД) для интерлейкина-2 (ИЛ-2), Г-КСФ (в соответствии с протоколом производителя).

Иммуногистохимия

Проводилась в соответствии со стандартным протоколом Вектор Елайт путем проявления вторичных антител с помощью ДГФР с противоокраской толуеновым синим.

Культуры клеток и тканей

Клетки в культуре поддерживались в увлажненных инкубаторах при 5% С02 и температуре 37оС в клеточных средах (Gibco).

Экспериментальные модели опухолей

Подкожные опухоли - создавались путем введения от К^-бхЮ6 клеток (для мышей) до 107 клеток (для крыс) путбм инъекции в кожную складку различпой локализации в зависимости от проводимых исследований.

Боковые опухоли создавались путем введения опухолевых клеток в физиологическом растовре. Это наиболее типичная локализация для модели опухоли, позволяющая визуально и механически (с помощью измерителя) оценивать рост опухоли, снизить вероятность системного метастазирова-ния, уменьшить повреждающее действие опухоли за счет прорастания внутренних органов, сокращающее продолжительность жизни.

На конечностях опухоли создавались путём введения опухолевых клеток под кожу тыльной поверхности лапы.

Имплантация опухолей головного мозга - проводилась под общей анестезией путем высверливания отверстия в теменной кости на расстоянии 3 мм от лобно-теменного сочленения и 2 мм от средней линии.

Системное метастазирование клеток опухолей наблюдалось после их внутривенного введения либо через дорзальную вену полового члена, либо через внутрисердечную инъекцию в полость левого желудочка в точке 4 межреберья на 2 мм слева от грудины у мышей

Линии животных

Для проведения экспериментов по изучению функций разработанных репортерных систем в живом организме, биораспределения радиофармпрепаратов, воспроизведения комплексных системных механизмов взаимодействия нормальных и опухолевых клеток использовались малые лабораторные животные. Иммунодефицитные линии животных применялись для создания ксено-трансплантированных моделей опухолей, полученных из человеческих клеток. Особенно важно было их использование при моделировании адоптивной иммунотерапии, требовавшей введения человеческих Т-лимфоцитов. В иммунокомпетентных животных исследовались модели роста син-генных опухолей, созданных путем введения мышиных опухолевых клеток, в естественных условиях организма.

Мыши: наиболее часто использовались в качестве животной модели исследования в связи с хорошим воспроизведением условий человеческого организма, возможностью получить надёжные статистические показатели на большом числе особей при относительной простоте ухода. Модели роста опухолей и распределения веществ создавались как в иммунокомпетентных, так и в иммуно-компрометированных мышах.

Иммунокомпетентные мыши линии ВАЬВ-С использовались в исследованиях аденовирусной противоопухолевой терапии. Модель печёночных метастазов создавалась в 2 этапа: на первом -клетки опухолевых линий МОЭ, МС8-26, характеризующиеся различной степенью экспрессии

СБА (расшифруй), были введены подкожно в боковые области спины. После формирования опухоли неопластическая ткань была вырезана и перенесена под капсулу печени здоровых животных этой же линии. Все хирургические манипуляции, описанные в этой части и ниже выполнялись под общей анестезией. Аденовирусы, несущие репортерный ген ВПГ1-ТК под контролем постоянного, или CRA- индуцируемого промотера в цис-позиции или с использованием транс-активационной системы, состоящей из VP-активатора и 6GAL ДНК-связывающих элементов, вводились непосредственно в область роста опухоли.

Крысы: основным преимуществом крыс является больший размер тела, позволяющий решить ряд проблем визуализирующих исследований, возникающих для мышей: повысить объём биораспределения, увеличить пространственное разрешение между отдельными анатомическими структурами, увеличить срок наблюдения за опухолью, получить возможность более точного ортотопи-ческого введения опухолевых клеток в тонкие структуры. Для проведения исследований использовались 2 линии крыс имму но дефицитные - NIH атомические rnu/muf и иммунокомпетентные животные (Fisher).

Аппаратура

Микроскопия

Пороговая микроскопия осуществлялась с фазовым контрастным фильтром на инвертированных микроскопах Найкон Эклипс ТС-100 и ЕС-50 с применением фотооптической регистрации изображений и обработкой программами НТИ-имидж 1.3 и М-кит 6.0.

Флуоресцентная микроскопия осуществлялась на микроскопе Найкон Эклипс ТС-100 с наборами светофильтров для ФИТСИ (480нм/525нм) и Родамина (535нм/580нм).

Конфокальная микроскопии проводилась на микроскопе Цейс Аксиоверт-100 с установкой глубины 3-стака в 150мкм.

Флоуцитометрия

Анализ - проводился на машинах ФАКСКалибур (Бектон-Дикенсен).

Сортировка - осуществлялась на аппарате МоФло (ЦитоНейщн) с использованием до 3 лазеров.

Флуори-/люмино-/спекшоФото-метрь1

Фотооптический анализ проводился на машинах Термолюкс/Атари/Шимадзу соответственно.

Эпифлурресцешшя

Кодак - осуществлялась на универсальном имиджинговом центре Кодак Р-2000 в режимах флуоресценции, биолюминесценции и сцинтиграфии.

Нюанс - использовался в сочетании с системой для чрескожной флуоресценции Лайттулз-2000 - для спректрального анализа испускания флюоресцентных репортерных белков.

Биолюминесценция

Для регистрации сигнала биолюминесцентных репортерных систем (люциферазы) использовался аппарат ИВИС (Ксеноген) с люцифериновым субстратом ХР-0001 той же компании.

Гамма-камеры

Использовались клинические камеры Филипс-АДАК Форте и Аксиоверт. Обработка изображений осуществлялась на стандартном компьютерном обеспечении камер

ПЭТ

Philips PET-Advance использовался для ранних исследований, а также для получения изображений больших групп животных одновременно, позволяя повышать статистическую значимость получаемых результатов исследований.

МикроПЭТ

Проводился на аппарате МикроПЭТ (Конкорд биосистемс)

СПЕКТ

Проводился на аппарате Х-СПЕКТ компании Аваи Медика

ЯМР

Использовались аппараты Дженерал Электрик 1,7 Т для клинического имиджинга, ЗТ и 4,7Т для визуализации животных с большим разрешением.

Электронное совмещение изображений

Осуществлялось программным обеспечением Кобра и Амнра 5.0

Характеристика групп больных

Основу клинической части работы составляет анализ данных, полученых в ходе клипических испытаний 1-2 фазы различных репортерных систем и ретроспективных исследований, проведенных на 271 пациенте. В состав исследований входили: изучение использования прямой визуализации ПК опухолей с помощью радиомеченых ингибиторов с целью определения показаний к проведению ПКИ терапии и её мониторинга, оценка клинической корреляции анализа опухолей в лабораторных условиях с течением и прогнозом заболевания, сравнение диагностической и прогностической значимости стандартных методов молекулярной визуализации опухолей юловного мозга, а также клинические испытания радиомеченных йододеоксиуридина (ЙУдР) и фтораминоциклобу-тановой (ФАЦБК) кислоты для визуализации опухолей головного мозга, и визуализация суицидальной генной терапии метастазов рака толстого кишечника в печень.

В исследовании были проанализированы пациенты с опухолями головного мозга, ХМЛ, неход-жкинской лимфомой, раком лёгкого, аденокарциномой толстого кишечника (Таб. 2). Демографическая характеристика больных характеризовалась преобладанием пациентов старше 21 юда (82%), так как ряд протоколов 1-2 фазы по испытанию радиомеченых препаратов не предусматри-

ват включения пациентов детского возраста. Распределение по признаку пола было относительно равпомерным, включая 143 мужчины и 128 женщин (р>0,1). Было проанализировано 271 историй болезней пациентов, проходивших лечение в МСКЦЦ (таб. 2), включая 57 больных с опухолями головного мозга, 85 пациентов с ХМЛ и 38 случаев неходжкинских лимфом. В клинические испытания 1-2 фазы были вовлечены 27 пациентов с опухолями головного мозга, включая 21 мульти-формную глиобластому,

Таблица 2. Распределение наблюдаемых больных по нозологвям.

Заболевание Количество случаев

ХМЛ 85

Мултиформные глиобластомы 46

Анапластические астроцитомы 20

ПНЕТ 8

Олигодендроглиома 9

Неходжкинская лимфома 38

Рак лёгкого 33

Рак толстой кишки 27

Репортерные системы испытывали«, на основании клинических протоколов, утвержденных комиссией МСКЦЦ и Медицинскою Центра Маунт Сайнай для ограниченных клинических испытаний 1 фазы. Для получения изображений применялся ПЭТ сканер ПЭТ-Адванс (Дженерал Электрик).

Клинические испытания

Визуализация с помощью «суррогатных» репортерных систем.

В исследование были включены пациенты с опухолями внутричерепной локализации. Из 27 пациентов рассмотреных в данном исследовании 19 были диагносцированы с астроцитомами различной клинической степени , 6 пациентов - с олигодендроглиомами, и 2 пациента с опухолями примитивного нейроэктодермального происхождения (ПНЕТ). Распределение пациентов по полу и возрасту отражено в таблице 1 и характеризуется равным участием больных обоего пола. В данные клинические испытания 1-2 фазы не включались пациенты педиатрической группы (до 21 года), учитывая исследовательское использование радиомеченных фармпрепаратов.

Исследование проводилоь как проспективное совмещенное клиническое испытание 1-2 фазы Критериями включения пациентов в исследование были наличие ранее диагносцированной опухоли головного мозга, проведение до начала испытаний комплексного клинического обследования

опухоли, включая визуализацию с помощью КТ и ЯМР, а также определение морфологии опухоли по анализу биопсии. Вовлечение пациентов проходило на добровольной основе с получением им-формированного согласия на проведение клинических испытаний радиофармпрепарата с целью получения изображения опухоли.

Протокол и документация исследования были утверждены бюро МСКОЦ по исследовательским проектам. Для применеия радиофармпрепаратов [1241]ЙУдР и [18Р]ФАЦБК были получены разрешения на ограниченное применение от FDA. Приготовление радиофармпрепаратов осуществлялся в лаборатории радиохимии МСКОЦ в соответствии с нормативами правильной медицинской практики (ПМП) с использованием циклотронного ускорителя МЦ-1 в качестве источника радиоизотопов. Конечный продукт радиохимического синтеза приготовлялся в стерильных условиях и подвергался двойному независимому контролю на качество и соблюдение технологии.

Радилогическое исследование пациентов проводилось на аппарате ПЭТ -Адванс (Дженера Электрик) Изображения реконструировались программой ПЭТ сканнера в фильтрованой обратной проекции Для поправки на аттенуацию, после каждой из эмиссионых регистраций без изменения положения объекта визуализации проводилась трансмиссионная регистрация с помощью вращающегося по периметру детекторов германиевого исочника излучения в течение 3 минут.

Вводимая пациенту доза рассчитывалась в соответствии с протоколом исследований 1-2 фазы и представляла собой ступенчато повышающуюся дозу у первых 4 пациентов с 0,01 до 0,05 мКи.кг. Дальнейшая эскалация дозы была сочтена нецелесообразной в связи с техническими ограничениями производства радиофармпрепарата Точная доза введенного радиофармпрепарата учитыалась путём измерения общей активности, содержащейся в шприце с радиофармпрепаратом до и после введения.

Визуализация распределения препарата в головном мозге осуществлялось регистрацией пози-тронной эмиссии в одном поле зрения глубиной 14 см, смещенном на 146см от нулевой отметки в течение 20 мипут через 2, 4 (для [18F]) и 24 и 48 часов (для [1241]) после введения радиофармпрспа-рата.

Для анализа биораспределения и фармакокинегаки радиофармпрепарата проводился забор образцов плазму крови через 30 минут, 1,2,4, и 24 часа. Сбор образцов мочи больных проводился каждый час в течение первых 4 часов и через 24 часа после введения радиофармпрепарата Образцы радиоактивных сред были замерены на сцинтилляционном счётчике. Для нормализации по отношению к различиям введенной дозы все дозиметричские показатели выражались в относительных единицах (%дозы/г) Результаты исследования сопоставлялись с изображениями опухоли мозга, получеными у того же пациента с помощью ЯМР и [18Р]ФДГ ПЭТ не более чем за 2 недели до визуализации с ЙУдР.

Исследования визуализации с применением двух короткоживущих изотопов: 18Р (т1/2=111 мин) и ещб более короткий для 11С (т 1/2=20 мин), - для большей сопоставимости результатов проводились в течение одних суток. При этом первым проводилось исследование с короткоживущим (т1/2=20мин)1 'С-Метионином.

Визуализация аденовирусной суицидальной генной терапии

Суицидальная геная терапия осуществлялась с использованием гена ВПГ-ТК, который переносился делегированным по Е1 аденовирусом в качестве вектора. Популяция пациентов была представлена 4 больными с опухолями толстого кишечника, имевшими ранее диагносцированные метастазы в печень, резистентные к химиотерапии. Набор больных проводиося в соответствие с информированным согласием.

Анализ образцов опухолей в лабораторных условиях с применением молекулярной визуализации

Анализ степени взаимодействия с аналогами ингибиторов протеин киназ.

Были рассмотрены 86 случаев ХМЛ. Из них 82% находились в хронической фазе, Ретроспективный анализ историй заболевания был проведен во всех случаях. Лабораторно-экспериментальный анализ осуществлен для 37 пациентов, чьи образцы костного мозга хранились в банке тканей. Критерем включения в лабораторно-экспериментальную группу было наличие образца до начала лечения и после окончания терапии.

Хронич. Ускоренная Властный криз

До 10 4 1

10-21 6 2

22-35 13 3 1

36-50 20 2 2

Старше 50 27 2 3

В рассматриваемой иопуляции мужчины и женщипы были представлены равномерно (46 и 40 соответственно). Возрастное распределение характеризовалось преобладанием взрослой группы больных (таб. 3). Детская группа была представлена 13 случаями с возрастом пациентов от 5 до 19 лет.

Лечние, полученное пациентами, приведено в следующей таблице (таб. 4). Мопотерапию интерфероном альфа прошли 37 человек. Трансплантация костного мозга была проведена 28 пациентам, включая 4 детей.

Таблица 4. Предыдущее лечение, полученное пациентами с ХМЛ.

Вид лечения Количество пац.

Иматиниб 44

Интерферон альфа 37

Трансплантация костного мозга 28

Гидроксимочевина 19

тс-Аьь 2

В состав исследуемой группы больных, ретроспективно оцениваемых для определения показаний к назначению ингибиторов ПК ЕГФР входили пациенты с опухолями толстого кишечника (п=27) и легких (п=33). Распределение пациентов по полу и стадиям заболевания приведены в таблице 5. Преобладание мужского пола в группе пациентов с раком лёгкого отражает общую тенденцию в популяции Критерием включения в данное исследование являлась доступность образца опухоли для исследования через банк ткани Для 3 пациентов с раком толстой кишки и 2 пациентов с аденокарциномой лёгкого размер образца позволил получить первичные клетки для поддержания в перевиваемых культурах в экспериментальных моделях и лабораторных условиях.

Химиеотерапевтический протокол для пациентов с аденокарциномой толстой кишки включал 5-фторурацил, лейковорин и иринотекан. Данное лечение проводилось Для пациентов легкого с продолженным ростом рака лёгкого после резекции применялась химиотоерапия 5-фторцрацилом.

Таблица 5. Пациенты с раком лёгкого и толстой кишки.

Показатель Рак легкого Аденокарцинома кишечника

Женщин 8 (22%) 15(58%)

Мужчин 25 (78%) 13 (42%

П 19 (58%) 7 (26%)

III 12 (35%) 15 (56%)

IV 2 (7%) 5(18%)

Диагностическая значимость ПЭТ со стандартными пробами

Исследование проводилось как ретроспективый анализ с использованием даных историй болезни пациентов Исследование осуществлялось на 83 пациентах с опухолями мозга и 38 нбольных с неходжкинской лимфомой (Таб.2)

Статистический анализ

Данные обрабатывались программным обеспечением СтатВью, Эксселл (Микрософт), Призма, Калейдаграф. В каждой группе однородных данных рассчитывалось среднее значение и стандартная девиация Сравнение между парными данными и наблюдениями в одних и техже объектах наблюдения осуществлялись с помощью метода Стьюдента. Сравнение областей непарных данных осуществлялось путем метода Уилкокса. Для определения выживаемости пациентов использовались кривые Каплан-Майера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОКГУЖ/ПШИГ -

1. Разработка проб для непрямой визуализации

Нуклеозиды

Нами рассматривались структурные аналоги тимидина, обладающие более длительным периодом полураспада и менее активным метаболизмом, способные фосфорелироваться человеческой тимидин-киназой первого типа (чТК1) и включаться в структуру ДНК.

В качестве доклинических исследований проводилась оценка накопления [14С] ЙУдР в крысах, несущих модель глиобластомы мозга. С помощью авторадиографии с [14С] ЙУдР были показаны соотношения накопления радиофармпрепаратов опухолью, нормальными тканями и органами, забранными от животных, умерщвленных-в разные временные точки. Максимальное накопление радиофармпрепарата в опухоли наблюдалось через 24 часа после введения и составило 0,075%дозы/г в активно пролиферирующих опухолях мозга и 0,011%дозы/г - в медленно пролифе-рирующих. Накопление препарата в периферических опухолях в 5-7 раз превышало накопление в опухоли мозга, указывая на препятствие для свободного распространения радиофармпрепарата в виде ГЭБ.

Данные исследования показали, что ЙУдР может использоваться для адиологических ислледова-ний в качестве радиомеченной пробы, специфически накапливающейся в тканях с повышенным уровнем пролиферации клеток - опухолях и количественно отражает уровень пролиферативной активности.

Аминокислоты

В качестве альтернативных метионину радиомеченных аминокислот, сохраняющих способность накапливаться в опухолевых тканях, но не подвергающихся метаболизму, были предложены синтетические циклические аминокислоты: циклоаминобутановая (ЦАБК) и циклоаминопентано-вая (ЦАПК), - которые путём фторирования могут быть помечены радиоактивным изотопом 18Р.

Наши исследования профиля накопления аминокислот в линия крысиных глиом 1Ю2 и С6 показали, что в следовых концентрациях их транспорт в клетку описывается логарифмической функцией (рис 1 А). Была отмечена зависимость активности транспорта аминокислот от типа клеточной линии, истощенности среды и плотности роста клеточной культуры. Так в культуре клеток, содержавшейся в среде обедненной глюкозой и сывороткой по сравнению с клетками, содержащимися в свежей среде отмечено 3,5 кратное увеличение скорости накопления ФАЦБК (рис 1Б).

Рисунок 1. График накопления аминокислот в клеточных линиях.

Оценка возможности использования циклических синтетических альфа-аминокислот для получения изображений опухоли проводилась на животных с помощью МикроПЭТ. Иммунодефицит-яым крысам были подкожно введены клетки опухолевых линий ранее испытанные в культурах клеток. Визуализация различными типами аминокислот проводилась последовательно. Получение изображения иС-Метионина осуществлялось в течение 30 минут с момента введения. Спустя 2 часа после метионина проводилось введение [18Р]ФАЦБК На томограммах отмечается специфическое накопление обоих радиотрейсеров в опухолях Исследования образцов тканей забранных у животных посмертно (рис 2) подтвердили данные ПЭТ. Неспецифическое накопление аминокислот наблюдалось в проекциях поджелудочной и слюнных желез, печени

Данные эксперименты доказали возможность использования фтор-циклических аминокислот в качестве радиофармпрепаратов, позволяющих неинвазивно оценить метаболическую активность ткани опухоли.

Оп мозга Поджожн Плазма Мшцы Мж оп

Рисунок 2. Накопление аминокислот в тканях животного 120 минут после введения.

Таким образом, в серии культуральных и доклинических исследований на животных нами была доказана возможность применения ряда новых радиофармпрепаратов групп яуклеозидов (ЙУдР) и аминокислот ([18Р]ФАЦБК) в качестве радиологических проб для неинвазивного наблюдения за пролиферативной и метаболической активностью опухоли. При этом преимуществом в специфичности сигнала обладают неметаболизируемые соединения.

Молекулярные генные репортеры

Перед нами стояла задача определить возможность повышения специфичности и расширения функционального потенциала противоопухолевой терапии с помощью непрямых визуализирующих методов с использованием генных репортерных систем регулируемых на транскрипторном и посттранскрипционном уровне передачи биологического сигнала.

Транспортеры

чНАТ

В основу выбора транспортерных протеинов был положен принцип возможности их применения в клинической практике. Для этого использовались два дополнительных критерия: 1) человеческая природа белка и 2) наличие клинически разрешённого и используемого радиомеченного субстрата-пробы. Нами испытаны два человеческих транспортера, отвечающие этим критериям человеческий нор-адреналиновый транспортер (чНАТ) и натрй-йодидиный симпортер (чНИС).

В качестве первого кандидата был рассмотрен человеческий нор-адреналиновый транспортер (чНАТ). Он привлёк наше внимание в качестве потенциального визуализирующего репортера, так как имеет давно разработанный клинически используемый радиофармпрепарат ([1231]-метайодобензилгуанидин (МИБГ) - [1231]-М1ВО).. Исследования в ЭБВ-специфичных чНАТ-трансфецированных Т-клетках (чНАТ-ЦТЛ) показали накопление радиофармпрепарата [1231]-МШО, достигающее насыщения на уровне 60 мл/г через 90 минут от начала экспозиции (рис 3), которое может быть описано экспоненциальной функцией с максимумом 40%дозы/г.

чНАТ-ЦТЛ были введены животным, несущим четыре вида подкожных опухолей, две из которых являлись специфическими мишенями для вводимых Т лимфоцитов и были представлены ЭБВ лимфо-мами, которые экетгрессировали НЬА-аллель, доминантный для противоопухолевого цитотоксиче-

о>

1

Ё з

1 £

I

О т

Время(мин)

К1=1.8+0.5 мл/г*мин К1/К2-58 6+6.8 мл/г

Рисунок 3. Накопление [1231]-ШВС в культуре ЦТЛ-чНАТ.

ского действия вводимых эффекториых клеток. Две другие опухоли являлись негативным контролем. Введенные чНАТ-ЦТЛ накапливались в ЭБВ-положительных опухолях, экспрессирующих доминантный НЬА-аллель. Данный эффект наблюдался с помощью гамма камеры через 8 часов после введения [ШГ]-М1В0 и позволял проводить многократное повторное неинвазивное монито-рирование введеных чНАТ-ЦТЛ в организме одних и тех же животных с помощью гамма-камеры (рис 4А). Для подтверждения результатов визуализационного наблюдения ткани животных были собраны по окончании эксперимента. Подсчет радиоактивности, накопленной в тканях, показал специфичность накопления радиофармпрепарата в опухолях, инфильтрированных Т-клетками (рис 4Б).

н

4 НЬ Несовм ЭВВБЛКЛ (ТЗ)

Адлогепная НЬА-А0201 Совм. ЭБВ БЛКЛ (Т2)

НЬА-А0201

Совм.

не-ЭБВ

В-ОЛЛ

(Т4)

ш

л"

«Л ¿г ^

Рисунок 4. Визуализация ЦТЛ-чНАТ с помощью [1М1]-ШВС и гамма-камеры.

Относительно высокие концентрации радиофармпрепарата (1 и 0,8 %дозы/г) наблюдались также в надпочечниках и миокарде, где естественным образом экспрессирован транспортер. Таким образом, описанная методика доказывает возможность многократной визуализации клеток с помощью транспортеров и может быть применима в клинике для долговременого мониторирования введенных опухоле- или вирус-специфических Т-лимфоцитов с целью оценки их пролиферативной и противоопухолевой активности, специфичности локализации и длительности циркуляции в организме. Учитывая еще одну важную особенность выбранного нами транспортера вызывать апоптоз в клетках, несущих этот ген, под воздействием терапевтических доз [1311]-М1ВО, чНАТ может

26

одновременно использоваться как «суицидный ген», позоляюший в случае развития побочных эффектов от проводимой Т-клеточной терапии специфично удалять введенные чНАТ-трансфецированные клетки из организма больного.

Рисунок 5. Исследование чНИС со [ш1] в культуре

чНИС

Нами также был испытан в качестве репортерного гена человеческий натрий-йодный сим-портер, экспрессирующийся в нормальном организме в клетках щитовидной железы и отвечающий за транспорт йодида. Активность экспрессии чНИС в клеточной линии 1Ю2, стабильно трансфецированной чНИС с

по

___Время(мин)_

Рисунок 6. Визуализация чНИС в животных.

8 1 « « а а > >

Время(мин)

) была определена в исследовании накопления радиофармпрепаратов йодида. Параллельно производилась оценка эффективности транспортера в отношении пространственно гомологичного аниона пертехнетата ("ТсОд") по сравнению с естественным субстратом - йодидом (рис5).

Испытания в животных проводились с использованием обоих изотопов последовательно. Накопление в опухолях, трансфецированных чНИС, отмечалось в течение всех 60 минут наблюдения (рис 6) Продолженное накопление наблюдалось при повторной визуализации животных через 2 и 4 часа после введения радиоизотопа. Основными органами, накапливавшими йодид и пертехнетат помимо опухоли экспрессирующей чНИС, были желудок и щитовидная железа. В течение первых часов наблюдения, скорость накопления радиофармпрепаратов в опухолях, экспрессирующих чНИС, превышала скорость их накопления в щитовидной железе и была меньше скорости накопления в желудке (рис 6). Через 24 часа повторная визуализация не определила наличия ТСО4" радиофармпрепарата в специфической опухоли, позволяя делать вывод о возможности повторного имиджинга. Вместе с тем, щитовидная железа за 24 часа накопила до 4% дозы (рис 6).. Необходимо подчеркнуть невозможность, в данном случае, применения блокирования щитовидной железы перхлоратом или нагрузкой нерадиоактивным йодом, так как оба эти способа также блокируют репортерный транспортер необратимым связыванием в первом случае и обратной регуляцией - во втором.

Накопление пертехнетата в животных протекало аналогично йодиду, однако, так же, как и в культуре тканей, скорость накопления пертехнетата в опухолях с чНИС превышала скорость накопления йодида в 2,5 раза (рис б) Предпочтительность пертехнетата в качестве пробы для данной репортерной системы имеет положительное значение, как для дозовой нагрузки, так и из экономических соображений Таким образом, чНИС может являться вторым клинически применимым репортерным геном человеческой природы, позволяющим визуализировать чНИС-трансфецированные клетки многократно через очень короткие промежутки времени Наличие двух клинически применимых репортерных систем открывает возможности проведения мониторирова-ния различных клеточных популяций одновременно в организме больного.

Радиогенная терапия.

Специфическое накопление радиофармпрепаратов в клетках, экспрессирующих репортерный ген, привело к идее использования данной системы в лечебных целях для специфической доставки терапевтических доз радиоактивности к опухолям. Изучение возможности использования системы ВПГ-ТК в качестве репортерного гена и ФИАУ - в качестве радиоактивно меченой пробы в радиотерапии злокачественных опухолей проводилось на модели крысиной глиобдасгомы И02 Перед исследованием стояли задачи- 1) показать, что клетки глиобластомы, песущие репортерный ген, накапливают радиофармпрепарат в количестве достаточном для эффективной радиотерапии; и 2)

что введение терапевтических доз ФИАУ не вызовет существенной системной токсичности у жи-

- крыса 3 RG2TK+ НЛ

- крыса 4 RG2TK+ НЛ

- крыса 6 RG2TK+ Н. 1 --'"крыса 8 RG2TK+ НЛ

10

'крыса I RG2TK+.1«

- крыса 2 RG2TK+ Леч

- крыса 5 RG2TK+ Леч

О 5 10 15 20 25

А Дни после введения опухоли

5 10 15 20 25

Дни после введения опухоли

10 15 20 25

Дни после введения опухоли

5 10 15 20 25 3

Дни после введения опухоти 0

Рисунок 7. Радио! ениая терапия глиобластомы. (А-ген+/лечение-; Б-r ен+/лечение+; В-плацебо; В-ген—/лечение+).

Группе р&циогенной терапии вводился ['311]ФИАУ в дозе 30 мКи/кг Аналогичная доза радяо-иодида вводилась контрольной группе. Распределение радиофармпрепарата группе радиогенной терапии оценивалось через 24 часа после введения с использованием гамма камеры с коллиматором высокой энергии высокого разрешения Единственным местом накопления [Ш1]ФИАУ была опухоль RG2-TG (рис 7).

Спустя 3 дня от введения радиофармпрепарата в группе животных радиогенной терапии отмечалось снижение скорости роста опухоли RG2-TG (100 ± 17 мм3/сут) с последующей полной инволюцией опухолей (рис 7). Контрольные опухоли RG2 в этих животных, а также RG2-TG и RG2 опухоли в крысах обеих контрольных групп продолжали прогрессировать до наступления необходимости эвтаназии. Радиогенная терапия статистически достоверно оказывала противоопухолевый эффект в эктопической модели глиомы.

Расчет дозовых нагрузок на ткани и органы проведенный дозиметристами показал, что доза, накопленная в ТШ2-ТО опухолях превышала таковую в нетрансфецированных глиомах в 70 раз и достигала 4,7 Гр/мКи введенного радиофармпрепарата, что в данном исследовании составило 117,5 Гр на опухоль Максимальная неспецифическая нагрузка в процессе выведения радиофармпрепарата приходилась па мочевой пузырь и желудок Облучение костного мозга было незначительным и не отличалось от такового при введении эквивалентных количеств радиоиодида.

Таким образом, представленные данные позволяют сделать заключение о терапевтической эффективности направленной радиогенной терапии опухолей как нового метода лечения злокачественных образований, позволяющего существенно снизить токсическое воздействие высоких доз облучения на здоровые ткани организма. Проведенные исследования могут лечь в основу разработки рекомендаций для клинического применения радиогенной терапии, основываясь на визуализации распределения фармпрепарата.

Соответствующие рекомендации для клинического применения радиогенной терапии могут бьггь предложены, основываясь на визуализации распределения радиофармпрепарата.

Таким образом, репортерные гены позволяют осуществлять не только неинвазивное наблюдение за активацией перенесенного генетического материала, но и осуществлять контроль за жизнедеятельностью клетки, в том числе опухолевой, трансфецированной генной конструкцией, при необходимости уничтожая клетку путем активации суицидального механизма или специфического накопления радиотерапевтического изотопа

Индуцируемые репортеры Без лечения

(ВСРГО 40 мг/кг)

Рисунок 8. Визуализация аткивации апоптоза в модели химиотерапии глиобластомы.

Ключевыми моментами в регуляции путей передачи биологических сигналов являются активация и управление экспрессией структурных и функциональных белков на транскрипцион-

ном и посттранскриптионном уровне Используя искусственное размещение энхенсеров в про-мотерах репортерных генов мы создали ряд систем для отслеживания процессов онкогенеза.

Визуализация апоптоза при лечении модели глиобластомы ломустином.

Для исследования активации р53 репортерной системы в животных были созданы подкожные модели глиобластом, несущих репортерную систему подкотролем р53-чувствительного про-мотера, под контролем постоянного промотера и без репортерной системы - для положительного и отрицательного контроля соответственно (рис 8).

Данные визуализирующего исследования были подтверждены анализом радиоактивности в образцах забранных тканей, а также анализом экспрессии белков, вовлеченных в путь передачи сигнала р53 Нарастание экспрессии р53, фосфорелированной формы белка и репортерного протеина была продемонстрирована для и87-р53ТК/ЗФБ опухолей. Оценка активации р53 каскада, проведенная в нетрансфецированных тканях леченной группы также показала наличие экспрессии р21 и фосфоформы р53.

Это исследование послужило первым доказательством возможности неинвазивного мони-торирования транскрипторной активности с помощью молекулярных репортерных систем в живом организме.

Поперечная проекта

Фронтальная проекта

Рисунок 9. Визуализация гипоксии в модели глиобластомы.

Визуализация гипоксии в модели глиобластомы.

Гипоксия в опухолях распространенный процесс и, используя созданные нами репортерные системы м ы изучали этот феномен на модели глиобластомы. На превом этапе мы доказывали специфичность системы для выявления тканевой гипоксии.

ПЭТ исследования показали существенные различия в накоплении радиоактивности в малой и большой опухолях. Для доказательства того, что различие накопления не обусловлено эффектом объема были произведены заборые образцов ткани из опухолей для подсчета радиоактивности, нормализований} повесу. Исследование выявило, что накопление активности в малой опухоли составило 0,135 % дозы/г, что в 2,5 раза превышало фоновый уровень в нетрансфецио-ванных репортерной системой тканях, в то время как большая опухоль накапливала в среднем 1,27 ± 0,18 %дозы/г (рис. 9А).

При макроскопическом исследовании замороженных срезов опухолей с помощью системы флуоресцентной визуализации отмечена зелёная флуоресценция в центре большой опухоли и красная флуоресцкнция по периферии (рис 9Б). Опухоль размером менее 0,5 смЗ оставалась равномерно красной. В препаратах, полученых при микроскопии различных зон опухоли отмечено наличие активации системы в большинстве клеток макроскопически зеленой зоны и отсутс гвие активации в хорошо перфузированной красной зоне. Отмечена также пролиферация сосудов в зеленой зоне вблизи с границей красной зоны (рис 9Б).

Оценка эффективности репортерной системы ХШП-чНИСиЗФБ

Репортерная система хит-шок протеина направленно разрабатывалась для оценки влияния отдельных видов противоопухолевого лечения, вызывающих активацию системы белков теплового шока «Хит-шок» протеины массой 90 и 70 кДа, являясь центральным звеном данной системы, принадлежат к более широкой группе белков-чаперонов, участвующих в сворачивании белков в третичную и четвертичную структуру

Данные, полученные на культурах клегок, были использованы в эксериментальной модели I пиобластомы, несущей репортерную систему В исследовании были две группы - подвергающиеся химиотерапии препаратом группы анзамицинов 17ААГ и контрольная ПЭТ и СПЕКТ исследования с [1241] и "мТс, соответственно, проводились спустя 24 часа после лечения животных 17ААГ в дозе 150мг/кг.

Исследования показали существенные различия в накоплении радиотрейсеров как на Мик-роПЭТ (рис 10), так и СПЕКТ в опухолях, экспрессирующих репортерную систему у животных группы подвергавшейся химиотерапии, в то время как различий в накоплении в контрольных опухолях в обеих группах не наблюдалось.

На следующем этапе нами исследовалась дозовая и временная зависимости ответа репортерной системы в зависимости от лечения 17ААГ.

1«»ОС НАЦИОНАЛЬНА* БИБЛИОТЕКА ( С. Петербург {

< 09 ЭО» I

■

До индукции

24 часа после введения 17-

AAG (150мг/кг)

RG2/hsp70-NIG

Желудок

RG2/NIG (положительный контроль)

Фронтальные проекции

BB^HHI ИН RG2/NIG

^ (положительный

Поперечные проекции

Рисунок 10. Мониторировянне эффекцтя анзамицина на модели глнобластомы.

В экспериментах с культурами клеток отмечалось постепенное нарастание ответа на дозы от 30 мг/кг до 300 мг/кг м помледующей ингибицией ответа за счет существенного нарастания цитот окичности препарата. На ПЭТ исследованиях в животной модели ответ нарастал от 50 мг/кг 17ААГ до 150 мг/кг и держался неизменным придальнейшем повышении, в то время как в группах 10 и 30 мг/кг ответ не отличался от контрольных животных, получавших плацебо. Временная зависимость показала максимум активности репортерной системы через 24 часа после лечения 17ААГ (рис 11).

RG2-PQHNK370 Кплш лечены* 17AAG Криаы* Гошюртца

610'

410'

110'

210»

-•в-.ОпМ

-л- -30пм --Д-.100ПМ ■-.ЭООпМ -О-ЮООпМ

___о

' д-'^ - *" ......

м-

V . -

о-

040*

£

в 10 20 30 40 50 00 70 80

Рисунок 11. Количественное влияние 17AAG на эксперссию репортера ХШП.

Приведенные выше исследования с транскрипционно регулируемыми системами, такими как: р53, ГИФ, ТШП, ЯФАТ и КЭА - послужили доказательством концепции использования промотерных элементов, контролирующих экспрессию репортерных генов, для непрямой неин-вазивной визуализации биологических процессов в живом организме на субклеточном уровне.

ЗЧМиогофункциональный подход

Арсенал репортерных генов с различными функциями позволяет осуществлять гибкий подход для визуализации биологических процессов на разных этапах исследования от клеток до организма пациента. Для поддержания корреляции между результатами различных репортерных систем, импользуемых на разных этапах эксперимента, было предложено создать химерные протеины, позволяющие осуществлять эквимолярную экспрессию репортерных доменов.

Клетки:

Лимфоциты

Опыт, накопленный при визуализации векторной терапии, был использован при переходе к мониторингу клеточных терапевтических векторов - адоптивной терапии. Оценка количественных изменений, происходящих с введенными в целях адоптивной терапии клетками в организме реципиента, является критически важной для понимания биологических механизмов, лежащих в основе взаимодействия трансплантата и организма реципиента, ю'. ...

'/•дозы Введенные ЦТЛ

1*107

3*10« ПО6

0.31

0.27

3*10=

ПО6

0 0000 0.0001 00010 0.0010 0 0020 0.0020 0.0000 0.0013

Рисунок 12. Количественная оценка накопления ЦТЛ в модели ЭБВ-В-лимфомы.

Количественная оценка с помощью ПЭТ проводилась с использованием системы внутренней калибровки ПЭТ, осуществленной изготовителями, и наружней стандартизации. Стандартизация проводилась на двух уровнях. На первом уровне в мышиные подкожные модели лимфом

прямой инъекцией вводились ЦТЛ-ТК/ЗФБ в различных градуированных дозах (от 104 до 107) для создания шкалы интенсивности. Данное исследование позволило также определить минимальную дозу клеток, видимую с помощью ПЭТ визуализации в объёме опухоли 1 см3 - 105 клеток (рис 12).

Для облегчения комплексной пространственной оценки расположения сигнала получаемого в результате неинвазивной визуализации репортерных генов в структурах тела и орагнов животного и человека было предложено использовать многосистемный подход. При таком методе обработки данных функциональная информация сопоставляется со структурной, получаемой от методов КТ для костной системы и ЯМР для паренхиматозных органов (рис.16). В данном исследовании мы независимо наблюдали распределение двух субпопуляций Т-клеток, экспрессирукмцих различные репортерные системы (ТК и Люп). Была продемонстрирована содружественная инфильтрация опухолей специфичными ЦТЛ CD4 и CD8 (рис 13).

Комбинация методов визуализации [l8F]FEAU МикроПЭТ (С08-ТКЗФБ) и БЛВ (С04-ЛюкНео) ЦТЛ. Т1-аутологичная опухоль; T2-HLA-совместимая опухоль

Рисунок 13. Комбинированная оценка распределения ЦТЛ.

Реакция трансплантат против хозяина.

Первым исследованием, потребовавшим количественного подхода, стала модель реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) в мышах. Для исследования роли Т-лимфоцитов в РТПХ, СОЗ положительные клетки были выделены из костного мозга и трансфецированы репортерной системой, содержащей Ф-люциферазу. Анализ показал, что только 3% клеток были трансфецированы, тем не менее, Т-клетки были добавлены в костный мозг и трансплантированы мышам аллогенной линии, получившим смертельную дозу облучения (9Гр). В качестве контроля использовалась аутологичная система трансплантации.

Наблюдение за клетками с помощью биолюминесцентной визуализации проводилось ежедневно в течение первых трёх дней с последующим переходом на исследования раз в 48 часов, что позволило выявить их миграцию из лёгких, первичного места расположения клеток, введенных внутривенно, к органам кроветворения (рис 14). Рост сигнала, наблюдавшийся в животных, трансплантированных аллогенным КМ, стал наблюдаться на 7 день в проекции области печени и

36

кишечника (рис 13). Повышение биолюминесценции предшествовало первым клиническим проявлениям РТПХ на 4-5 дней В дальнейшем рост сигнала коррелировал со степенью клинической выраженности и течением РТПХ. Смерть наступила у животных, имевших наивысший сигнал Было отмечено, что раннее нарастание сигнала в проекции брюшной полости (день 3) являлось положительным прогностическим фактором неблагоприятного исхода (рис 14),

Рисунок 14. Визуализация РТПХ.

Трансплантация костного мозга

Как было описано выше, наблюдение за приживляемостью костного мозга осуществлялось с помощью биолюминесцентного анализа. Для определения прогностической значимости срока начала гематопоэза и количественного прироста сигнала, были проведены количественные измерения в каждой отдельно взятой мыши в течение эксперимента. Сравнение скорости прироста сигнала в условиях анатомической идентичности объектов в последующие дни, позволило оценить прогностическое значение прироста костномозгового сигнала для определения вероятности приживления костного мозга (рис 15). В нашем исследовавыживаемость животных со скоростью прироста сигнала выше, чем в 2 раза за 3 дня на 39 ± 12% (р<0.01). первышала таковую для группы с маныпим показателем (рис 15). Срок начала гематопоэза в длинных трубчатых костях в группе приживления статистически отличался от группы отторжения и составил 3 против 14

дней Оценка выживаемости в группах с началом гемопоэза ранее 7 дней и позднее 7 дней показал статистически значимое (р<0,05) различия в выживаемости в 25 ±7%.

Эти исследования доказали преимущества и возможности использования молекулярного имиджинга в трансплантации костного мозга, включая предсказание приживления трансплантата и начала гемопоэза. Концепция параметрического анализа изображений позволяет осуществлять количественную оценку экспрессии репортерных генов и отображаемых ими биологических процессов.

Рисунок 15. Визуализация приживления трансплантированного костного мозга.

4) Клеточная миграция

Одним из ближайших к клиническому воплощению применений неинвазивной репортерной генетической визуализации является наблюдение за перемещением и судьбой генетически меченых клеток. Двумя основными причинами высокой клинической применимости данного подхода являются: во-первых, процесс переноса генетического материала, который в клинических протоколах, связанных с данными клетками, обусловлен первично необходимостью суицидального контроля за перенесенными клетками, а не изолированными интересами ваизуализации; во-вторых, наличие встроенного механизма наблюдения за расположением и деятельностью клеток, облегчающее решение вопросов контроля, зачастую являющихся камнем преткновения в процессе утверждения клинических протоколов. Нами были разработаны подходы и методы наблюдения за двумя основными группами клеток, представляющих клинический интерес в противоопухолевой терапии: цитотоксическими лимфоцитами и стволовыми гематопоэтическими клетками.

Цитотоксические Т-лимфоциты

В нашей работе мы проводили исследования по наблюдению за перемещением и пролиферацией как антиген-специфичных Т лимфоцитов, полученных путем экстракорпоральной активации в присутствии специфического антигена, представленного с помощью аутологичных антиген-презентирующих клеток, так и неспецифичных аллореактивных Т лимфоцитов, попадающих в организм больных при пересадки костного мозга вместе со стволовыми клетками и являющихся отвественными за развитие РТПХ (см. выше).

Визуализация антиген-специфических Т лимфоцитов на животной модели адоптивной клеточной противоопухолевой иммунотерапии.

Антиген-специфические Т-лимфоциты были получены из периферической крови нормальных доноров путем специфической стимуляции в клеточной культуре аутологичными антиген-презентирующими клетками в присутствии IL2. В наших исследованиях путей перемещения ЦТЛ мы использовали ранее разработанный метод мечения клеток химерным белком герпесвирусной тимидин-киназы и зелёного флуоресцентного белка (ТК/ЗФБ) [108]. Репортерным субстратом для радиологической составляющей этой двойной системы являются 2-замещенные производные ти-мидин-2'фтор-арабинозида: 2-иодо (ФИАУ) и 2-этил- (ФЭАУ) [109].

Радиологическое наблюдение за ЦТЛ-ТК/ЗФБ с помощью ПЭТ начиналось через 24 часа после введения клеток с введением [1341]ФИАУ. Изображения регистрировали спустя 4 и 24 часа после введения радиофармпрепарата в течение 10 мин/животное. Последующее наблюдение через 48 часов и 7 дней использовалось для определения выведения предыдущей дозы радиотрейсера, которое как было установлено для [1241]ФИАУ в мышиной модели было завершено к 7 дню после введения.

Рисунок 16. Длительная визуализация специфичной миграции ЦТЛ-ТК/ЗФБ к модели ЭБВ-В-лимфомы.

Специфическая миграция ЦТЛ-ТК/ЗФБ, направленная к опухоли, экспрессирукяцей заданный антиген в контексте совместимого иммунодоминантного аллеля, начала наблюдаться через сутки после введения клеток (рис.30). Нарастание сигнала в специфических опухолях и селезёнке наблюдалось до 8 дня от начала наблюдения В более поздние сроки отмечалось перераспределение клеток из селезёнки, нарастание сигнала в аллогенной НЬА-совместимой опухоли и по прежнему отсутствие накопления ФИАУ в НЬА-несовместимой или ЭБВ-неэкспрессирующей опухолях. Сигнал в нижней части туловища соответствовал интестинальному пути экскреции [1241]ФИАУ и свободного 1241. Результаты специфического накопления радиофармпрепарата соответствовали данным ПОТ Данное исследование впервые доказало возможность неинвазивного мониторинга специфической миграции Т-клеток в течение длительного срока.

В последующих исследованиях концепция использования неинвазивного имиджинга для изучения миграции ЦТЛ бала развита и дополнена работами по оценке цитотоксичности ЦТЛ-ТК/ЗФБ, воспитанных против опухолей, экспрессирующих другие антигены. Были также проведены доклинические испытания постоянно-экспрессируемой репортерной системы дфрн-ТК, предназначенной для применения в клинике в качестве суицидальной для выведения, Т-клеток, вовлеченных в РТТТХ, и репортерной для ПЭТ анализа их миграции, подтвердили возможность наблюдения за приготовленными для введения пациентам ЦТЛ с помощью нуклеозидных радиотрейсеров: как [1241]ФИАУ, так и [18Р]ФЕАУ - и ПЭТ в течение 28 дней (рис 17)

МикроПЭТ МикроКТ ЯМР

Рисунок 17. Доклинические испытания комбинированной визуализации ЦТЛ.

Данные эксперимены доказали, что возможно осуществлять ниенвазивное наблюдение за ци-тотоксическими лимфоцитами используя различные, в том числе клинически применимые, генные репортерные конструкции в сочетании с различными репортерными пробами в зависимости от задач исследования. Также было доказано что экспрессия репортерных генов и накопление радиоактивных проб.

Исследования миграции опухолевых клеток:

Существенным компонентом в прикладных исследованиях онкогенеза, дающим выход в виде разработки лечебных стратегий, является изучение потенциала и механизмов метастазиро-вания опухолей Неинвазивный репортерный подход, предложенный нами для этой цели, стал одним из основных методов изучения биологии метастазирования. Учитывая простоту и экономичность использования, наибольшее применение в данных исследованиях нашли оптические репортерные системы.

Для исследования вариантов миграции клеток аденокарциномы в корреляции с определенным молекулярио-биологическим профилем клетки МВА-МВ-231 были стабильно трансфециро-ваны тройной репортерной системой ТК-ЗФБ-Люц Наблюдения за 105 клеток введенных бесшерстным атимическим мышам начиналось при помощи биолюминесцентной системы на первый день после введения (рис 18) При этом наблюдалось равномерное распределение с преобладанием в органах с наибольшим кровоснабжением, включая головной мозг, печень и селезёнку. Однако, уже к концу первых суток большая часть диффузного сигнала исчезала, оставляя только очаги оседания опухолевых клеток В течение первой недели эти очаги росли по числу и интенсивности в особенности в задних конечностях, где в 89% случаев остеогенные метастазы выявлялись на день 14 ± 3. При измерении интенсивности сигнала от задних конечностей отмечалось его постепенное нарастание.

д День 0 День1 День 8 День 35

3 *

«0400

/

✓

/

>

а м » » «о 1 День после введения

Рисунок 18. Визуализация модели системного метастазирования аденокарциномы.

41

Для определения точных костных координат расположения метастазов 2-мерные изображения биолюминесценции были совмещены с 2-мерными рентгенограммами скелета, что позволило предварительно оценить соотношение метастатических очагов со структурами тела (рис 18). Для компенсации двухмерности, изображений были также получены боковые проекции животных как с помощью рентгена, так и биолюминесценции. Данный метод показал высокую частоту костной локализации очагов (69%).

Однако, ни один из этих двух видов визуализации не мог дать реального трехмерного анализа расположения метастазов в соответсвтвии с расположением внутренних органов. В связи с этим были использованы возможности, предоставляемые наличием ПЭТ репортерного гена ТК в составе трансгенной конструкции. ПЭТ изображения, полученные 24 часа спустя после введения [1241]ФИАУ, были скоординированы со скаяограммами, полученными на МикроКТ скаинере без изменения положения животного (рис 18). Большая часть сигнала репортерной системы совпадала со структурами костной ткани, включая дистальнюу часть бедреной/проксимальную больше-берцовой костей, костный таз, лопатки, позвоночник и кости черепа. При сравнении результатов БЛИ и морфологических изменений кости, детектируемых на рентгенограммах и КТ томограммах, костные дефекты были обнаружены только в 20% случаев, что указывает на репортерную визуализацию, как на более чувствительный способ определения метастазов Помимо костных метай аюв комбинация ПЭТ-КТ позволила выявить животных с метастазами в надпочечниках (рис 19)

Рисунок 19. Использование совмещения информации для повышения разрешающей способности на модели метастазов аденокарциномы

Флуоресцентная часть репортерного гена использовалась после эвтаназии животных для получения морфологического подтверждения радиологическим находкам. С этой целью на криогенном микротоме готовились коронарные срезы через тело животного и анализировались под флуоресцентным микроскопом. На срезах наблюдался иифильтративный рост опухоли в ткани кости, замещение опухолевой тканью нормальной ткани надпочечника. Клетки в очагах метаста-

4Г

зирования экспрессировали ЗФБ, что подверждало их происхождение. С помощью флуоресцентной микроскопии был выявлен метастаз в поджелудочную железу, расположений слишком глубоко для эффективной диагностики биолюминесцентным методом.

В целом исследование показало преимущества применения неинвазивных генетических ре-портерных систем для наблюдения за распространением метастатических клеток. Была доказана необходимость комбинированного трёхмерного изображения для правильной интерпретации результатов распределения клеток в организме.

Мониторинг клеточной миграции с помощью молекулярной визуализации позволяет неин-вазивно в реальном масштабе времени изучить механизмы пермещения опухолевых клеток, в том числе метастазирования, а также действие противоопухолевой клеточпой иммунной системы, включая Т-и НК- клетки.

Прямая визуализация - меченые пробы

Прямая визуализация, как было упомянуто выше, предполагает непосредственное вовлечение радиофармпреперете в ход исследуемомго биологического процесса в качестве субстрата.

Визуализация ингибиторов протеин киназ

ЭРФР

Учитывая вовлеченность пути передачи биологических сигналов через рецептор ЭГФР в онко-гепез и выживание многих типов злокачественных новообразований, предпринимаются настойчивые попытки создать специфическую противоопухолевую терапию, нацеленную на ЭГФР Фарма-цефтическими компаниями разработан целый ряд малых молекул, ингибирующих тирозин киназу ЭГФР, однако, оценка специфичности их действия ограничена культуральными исследованиями, биопсией или определением общего клинического эффекта. Предлагаемое нами использование радиомеченных аналогов ингибиторов протиен-киназ позволит мониторироватъ лечение неинва-зивно.

Из большого семейства структурных аналогов ингибиторов протеинкиназы, созданных с помощью компьютерного анализа блокирования аллостерического центра протеин киназ (ПК), специфически связывающего АТФ, проводился отбор оптимальной по функции молекулы. Для этого анализировался фармакодинамический эффект препарата на рост культур клеток опухолей с различным уровнем экспрессии ЭГФР. При этом сравнивалась эффективная концентрация препаратов, сокращающая число клеток в опухоли на 50% (ЭК50). Было обнаружено, что максимальный тормозящий эффект (минимальную ЭК50) проявляет препарат [*1]АГ, обладающий необратимым ингибиторным эффектом за счёт ковалетного связывания с молекулой ПК в аллостерическом центре.

Благодаря предсказанной компьютерным анализом необратимости связывания радиомечен-ного [1311]АГ с ПК-ЭГФР, удалось уникальным образом доказать специфичность действия ингибитора на ПК. Для этого использовались стандартные условия СДС денатурирующего электрофореза белков, полученных из лизата клеток различных опухолей, предварительно инкубированных с [Ш1]АГ. После переноса белков на мембраны осуществлялось последовательное окрашивание с помощью антител к ЭГ'ФР и экспонирование неокрашенной мембраны на радиочувстительной пленке для получения ауторадиограммы. В результате исследования показано, что расположение накопления радиомеченного субстрата совпадает с расположением, окрашиваемым антителами к ЭГФР. Уровень интенсивности полосы накопленной радиоактивности пропорционален экспрессии ЭГФР клетками и является самым сильным для А431 и практически отсутствует для К562 (рис 20).

Отобранный необратимый ингибитор [1311]АГ был в дальнейшем использован для получения неинвазивных изображений экспрессии ЭГФР опхолями На этапе исследований в культурах клеток определялась чувствительность и специфичность данного прямого репортера для определения различных уровней ЭГФР в линиях с известной экспрессией рецептора. Было доказано, что уровень накопления [Ш1]АГ зависит от уровня экспрессии рецептора в клетках и обладает экспоненциальной скоростью роста, замедляющейся и достигающей равновесия в пределе 20-40 мин. При этом достигаемая максимальная концентрация коррелирует с экспрессией рецептора. Так в линии А431 с гиперэкспрессией рецептора, уровень накопления достигал 150 ± 37 мл/мг, в то время как в опухолях с низким уровнем экспрессии и препаратах фибробластов уровень не превышал 40 мл/мг (рис 21).

Изображения накопления радиофармпрепарата в крысах, несущих те же опухоли, которые ис-пытывались в культурах показали, что наивысшее накопление происходило в линии А431 со скоростью 0,0053 ± 0,0005 достигая значения 0,72 ±12%дозы/г за 60 мин. Соотношение накопления радиофармпрепарата в опухоли к мышцам и плазме крови составляло 4 52 и 3.75 соответственно. В контрольной опухоли К562, не экспрессирующей ЭГФР, накопление не повышалось с течением времени, составляя 0,20 ± 0,03%дозы/г , и не отличаясь существенно от уровня в мышцах и плазме крови -1,25 и 1,04 соответственно (рис 22).

Авторадиограмма Вестерн блот

Рисунок 20. Авторадиограмма [Ш1]АГ, связанного с ЭГФР-ПК.

Рисунок 21. Оценка накопления { 1]АГ в культурах клеток. А Аксиальные

а431 км2 л431 км2 а411 км2 а431 ки2 м31 kms/u11 ки2

%Д01Ы/г

О 10 20 30 40 50 60 70 | 0 10 20 30 40 50 00 70 ^ Время (мин) х Время (мин)

Рисунок 22. Визуализация [1311]АГ в доклинических экспериментах.

Неивазивные исследования позволили также оценить фармакокинетику препаратов в условиях следовых концентраций, что дает общее представление о биораспределении радиофармпрепарата. Наиболее выраженным феноменом была быстрая секвестрация препарата в печени по типу эффекта первого прохождения. В связи с этим уровень радиоактивности в крови в течение первых 3 мин падал до 1%дозы/г в то время, как в печени достигал 12 ± 4,6%дозы/г. Таким образом, для большинства органов и тканей кинетика распределения радиофармпрепарата оказывалась двухфазной. Первая фаза гепатобилиарного выведения происходила в течение первых 30 мин с пониженеим концентрации радиоактивности в печени и повышением в тонком кишечнике. Почечная фракция выведения достигала пика на 15-20 минуте с быстрым нарастанием концентрации в мочевом пузыре в течение 7 минут после пика в паренхиме почек (рис 22).

Сарк семейство

Вместе с семейством ПК, связанных с ЭГФР рецепторами, подход неинвазивной прямой визуализации рассматривался для ещё одной группы ПКИ, показавшей свою высокую эффективность в лечении лейкозов, в частности ХМЛ, экспрессирующих высокие концентрации абл-ПК. Препараты, аналоги гливека, были рассмотрены в качестве потенциальных носителей радиометки для визуализации. По описанной выше технологии, после предварительного отбора в ходе компьютерного моделиорвания исследовалось влияние фарм-препаратов на замедление роста опухоли (таб. 7). Данные исследования позволили остановиться на выборе сочетания опухолевых линий, обладавших наибольшей разницей в экспрессии абл - К562 и А431, но в обратном соотношении по сравнению с ЭГФР, и фармпрепарата ДВ032-7.

Таблица 7. Фармакологическое действие ПКИ семейства яге в культурах клеток.

Клеточная линия\ препарат А-431 К-562 РС-3 ВТ-474 А-172

ЕС50 20пМ 9пМ 1659иМ 2452пМ 2208лМ

Иееуес 22иМ 532 вМ 3.958 иМ 15.49 иМ 13.00 иМ

РБ 173955 0.666 пМ 0.2657 вМ 1.067 иМ 0.5738 иМ 0.7642 иМ

Рй 166326 0.612 пМ 0.1129 пМ 0.006 пМ 0.128 иМ 0.251 иМ

РБ 173952 1.660 иМ 3.893 пМ 0.027 иМ 0.025 пМ 0.045 пМ

РБ 173956 0.403 иМ 2.94 пМ 3.568 иМ 1.034 иМ 2.651 оМ

РБ 173958 0.269 иМ 0.553 пМ 1.09 пМ 2.05 пМ 2.235 иМ

РО 180970 22 пМ 0.764 пМ 0.394 иМ 0.17 иМ 2.208 иш

0У2-37В.З 20 пМ 9.5 пМ 1.659 иМ 2.452 иМ 2.208 иМ

ОУ2-115 0.2837 пМ 0.2753 иМ 0.7804 иМ 0.4724 иМ

Накопление радиомеченного [Ш1]ДВ в культурах клеток подтвердило две основные концепции: 1) накопление радиофармпрепарата происходит по логарифмической кривой с достижением рав-

новесия через 20-30 минут и 2) специфичность препарата для накопления в клетках с высоким уровнем абл - К562 с концентрацией по отношению к среде на 60 мин 120 ± 37 мг/мл.

В экспериментах с крысами из-за высокой липофильности радиофармпрепарата отмечалось первичное попадание препарата в печень в течение первых 3 минут после введения с последующим его выведением через кишечник. Высокое накопление препарата в печени стало основным препятствием успешного проведения экспериментов на мышах в связи с высоким сигналом от печени, не позволявшим надежно регистрировать радиоактивность в опухолях из-за относительно малого пространственного разрешения. Для преодоления этой же проблемы на крысах в эксперименте с микроПЕТ использовалась малая доза препарата, что находит свое отражение на изображениях (рис 22). Почечный клиренс препарата был незначительным, составляя, судя по концентрации в почках на 20 мин и мочевом пузыре на 70 мин эксперимента (2%дозы/г и 5%дозы/г, соответственно), не более 10% выведения. При этом наблюдалась медленная вторая фаза экскреции из плазмы крови с длительной циркуляцией около 0,5%дозы/г через час после введения. По оценкам математического моделирования экскреции Т\п второй фазы могло достигать 3,4 часов. Несмотря на 3,5-кратную разницу для культуры клеток в животных накопления в опухолях А431 и К562 различалось существенно Динамика накопления [124Т]ДВ в опухолях демонстрировала продолженное накопление в течении всего наблюдения с достижением плато к 30 минуте от начала эксперимента. В А431 накопление радиофармпрепарата не превышало 0,09%дозы/г, что мало отличалось от уровня в мышцах - 0,04%дозы/г.

Рисунок 23. Визуализация накопления [|241]ДВ в модели ХМЛ.

Таким образом, применение прямой визуализации с помощью радиомеченных аналогов ингибиторов ПК позволяет осуществить определение специфичности опухолей к данной терапии.

Клинические исследовании методов молекулярной визуализации Поиск показаний к назначению ингибиторов протеин киназ в качестве противоопухолевой терапии

Перед нами стояла задача разработать клинически применимую систему прямой визуализации для определения показаний к назначению ингибиторов протеин-киназ, позволяющую определить чувствительность опухоли к противоопухолевой терапии, специфичность терапии по отношению к здоровым тканям и мониторировать ход лечения.

Для определния групп пациентов, имеющих показания к проведению терапии ингибиторами протеин-киназ и её мониторирования нами были ретроспективно рассмотрены следующие группы пациентов: Резистентные ХМЛ - для препаратов, ингибирующих ПК семейства сарк (в частности абл-) и карциномы лёгких и толстого кишечника - для препаратов группы ингибиторов ПК-ЭГФР.

ХМЛ

Исследовательский протокол, включавший использование иматиниба, предполагал включение пациентов ранее получавших другие виды терапии. Из 37 случаев, проанализированных с использованием лабораторно-экспериментальных методов 34 пациента получали терапию има-тинибом (Гливек). Образцы для лабораторно-экспериментального исследования были доступны от 10 педиатрических пациентов, из них терапию иматинибом получали 5 человек.

На первом этапе исследования мы проводили ретроспективную сравнительную оценку чувствительности цитогенегического и ПЦР метода для определения экспрессии Филадельфийской хромосомы/Ьсг-аЫ, соответственно.

На следующем этапе были рассмотрены возможности использования принципа прямой визуализации с ранее разработанным нами радиомечным аналогом иматиниба для повышения чув-ствительнотси определения присутствие гиперэкспрессии Ьсг-аЫ в клетках ХМЛ. С этой целью из образцов тканей, полученныхе от пациентов, была получена белковая фракция, подвергнутая электрофорезу в соответствие с технологией Вестерн блота. Перенесенные на мембрану белки были инкубированы с радиофармпрепаратом. Результаты регистрировались авторадиографическим методом на пленке, чувствительной к [1311] В качестве отрицательного контроля были использованы клетки 10 здоровых доноров. Чувствительность и специфичность метода сравнивались со стандартными диагностическими технологиями (цитогенетика и ПЦР).

Для определения механизма резистентности к терапии иматинибом и изучения корреляции сежду ПК функцией и клиническим прогнозом течения заболевания были проведены исследования возможности количественной функциональной диагностики ПК активности путем прямого

48

визуализирующего метода. Для сравнения выживаемости пациенты были ретроспективно разделены по уровню иненсивности сисгнала накопления на 2 группы: с сигналом не превышающим средний более чем на Уг стандартной девиации (1) и остальных (2). Исследование показало статистически значимую разницу в выживаемости благоприятную для группы низкого сигнала.

100%-

80%-

60%

40% -

20% -

1 группа, 91%

(Х0.01

2грулла, 68%

Время, годы

Рисунок 24. Выживаемость в зависимости от степени экспрессии абл-.

Возможность использования метода прямой визуализации для мониторинга лечения ПКИ была изучена в следующем исследовании. Для изучепия корреляции между сигналом прямой визуализации и ответом на терапию ХМЛ ингибиторами ПК была проведена стратификация больных на три группы в зависимости от результата реакции накопления образцом опухоли радиофармпрепарата К первой группе больных, «условпо-благоприятного» прогноза, относились пациенты, имевшие положительное накопление в начальных образцах ткани, с отсутствием накопления после окончания лечения ПКИ. Ко второй, «условно-негативной» группе, относились пациенты, в образцах которых до лечения не обнаруживалось накопления радиофармпрепарата. Образцы пациентов «условно-негативной» группы, забранные после терапии, также были иссле-довпы на накопление радиофармпрепарата, однако, ни в одном из них накопления не обнаружено. К третьей, «условно-резистентной», группе были отнесены больные с начальным положительным сигналом накопления, который не менялся в результате терапии ПКИ. Распределение пациентов в данных группах отражено в (таб. 8)

Группа Количество Хрон.фаза Ускор.фаза Бластн.криз

1 21 19 1 1

2 2 2 - -

3 11 7 2 2

Анализ данных обращает внимание на неравномерность распределения пациентов с различными стадиями заболевания среди групп накопления радиофармпрепарата ПКИ Наблюдается преобладание пациентов с прогрессирующей стадией заболевания в 3я группе, что может указы-

вать на необходимость проведения дополнительной терапии пациентам с ускоренной пролиферацией клеток. 100%-

80%-

¡5 60% -

8 а

ш

1 40% -

20%

Чгруппа, 85% р<0,01

Зфуппа, 62 %

-,-!-!-

и 1 2 Время, годы

Рисунок 26. Выживаемость пациентов, прошедших курс ПКИ, в зависимости от накопления прямого радиотрейсера.

При общей выживаемости в группе пациентов, леченых ПКИ, превышающей 80%, наблюдается существенное различие в группах, отражающих эффективность терапии ПКИ. Для 1 группы 2-летняя выживаемость существенно выше средней и приближается к 95%. Для второй группы статистический анализ мало достоверен. Дтя третьей группы выживаемость существенно ниже первой группы и средней выживаемости в рассматриваемой популяции

Исследования возможности использования прямой визуализации у пациентов с ХМЛ показали, что реакция накопления радиофармпрепарата обладает чувствительностью, сравнимой с ПЦР и превосходящей цитогенетический метод. Мониторинг терапии позволяет непосредственно определить наличие взаимодействия ПКИ с целью в клетках ХМЛ и выявить наличие остаточного накопления после лечения, указывающего на необходимость и возможность повторного курса. После утверждения радиофармпрепарата для введения пациентам, станет возможным не-инвазивный мониторинг лечения ПКИ в реальном масштабе времени.

Резистентные карциномы

Для оценки клинической значимости иммуногистохимческого анализа экспрессии образцами опухолей антигенов, вовлеченных в онтогенез рассматривался коэффицент риска развития рецидива для каждого из показателей. Анализ, приведенный в таблице 20 показал, что наивысшим коэффициентом обладают проангиогенетические факторы. Так, экспрессия ФРСЭ стромой опухоли имела наивысший коэффициент корреляции 3,2.

Таблица 9. Факторы прогрессии аденокарциномы.

Фактор Степень влияния

УЕйР(ФРСЭ) 3,2

УШМ 2,1

БОБ 1,8

РЕЮР 1,6

ЮТ-альфа 1,4

Из неангиогенетических факторов, играющих роль в прогрессии опухоли наиболее выраженным был риск , связанный с экспрессией ЭГФР. Для определения возможности использования прямой визуализации для определения чувствительности опухоли к терапии ПКИ (гефети-ниб) нами проводился анализ взаимодействия образцов протеинов, полученных из опухоли, и радиомеченного аналоги ЭГФР-ПКИ [Ш1]АГ. Для независимого контроля присутствия мутаций, чувстивтельных к действию ингибиторов ЭГФР-ПК использовался ПЦР. В 96% случаев накопление радиофармпрепарата совпадало с результатами анализа ПЦР.

Рисунок 27. Влияние ЭГФР-ПК активности на выживаемость.

Для изучения корреляции клинического течения заболевания с активностью ЭГФР-ПК, определенной с помощью метода прямой визуализации радиомеченными аналогами ЭГФР-ПКИ [ШЦАГ, был проведен ретроспективный анализ выживаемости пациентов в зависимости от ЭГФР-ПК активности. В качестве группы высокого риска были выбраны пациенты с активностью ЭГФР-ПК, превышающей среднюю на Уг стандартной девиации (рис 26) В данной группе, содержавшей 12 пациентов с опухолями л8гких и 7 больных с аденокарциномой толстой кишки, выживаемость была на 15% ниже выживаемости у остальных пациентов (р=0,05).

Таким образом, прямой визуализацией могут быть неинвазивно выявлены показания к назначению терапии ЭГФР-ПКИ (гефитиниб). Мониторирование экспрессии ПК рецептора является пр01 ностаческим фактором выживаемости при аденокарциномах кишечника и лёгкого.

Оценка возможностей повышения специфичности и улучшения чувствительности метода (прогностическую достоверности и клиническую значимость) диагностики и мониторирования роста опухолей с помощью галогенизированных производных ти-мидина и циклических аминокислот в качестве непрямых макреров опухолевого метаболизма по сравнению с традиционными прямыми и суррогатными методами.

А. Анализ прогностической достоверности и клинической значимости традиционных прямых и суррогатных методов

Учитывая труднодоступность и высокий ассоциированный риск инвазивных исследований опухолей мозга (Биопсии) существенное внимание было уделено развитию и внедрению методо-ва неинвазивной визуализации именно при данпой патологии. Для определения сравнительной доступности мы выбрали популяции пациентов с диссеминированными неходжкинскими лим-фомами, включавшей периферическую и ЦНС локализацию. В качестве дополнительной группы рассматривалась популяция больных с глиобластомой. Ретроспективный анализ частоты получения диагностического материала из опухоли путём инвазивной биопсии в 7 раз выше для опухолей локализующихся не в ЦНС по сравнению с группой глиобластом (р=0,01) ив 11,2 раза выше для лимфомы (р=0,01). Статистически достоверная разница между частотой биопсии в группе лимфомы и глиобластом отражает различия в диагностической целесообразности вмешательства при налиции экстрацеребрального заболевания. Для популяции пациентов с первичной ЦНС лимфомой (п=1 б) не было отмечено статистически значимой разницы в частоте получения диагностического материала путём биопсии (9,8, р=0,12).

Для определения распространённости опухолевой инфильтрации и дифференциальной диагностики с воспалением стандартными методами неинвазивной функциональной диагности-ки.опухолей являются ПЭТ с использованием [18Р]ФДГ или [пС]-метионина. Дли обоснования необходимости внедрения новых методов неинвазивной функциональной визуализации мы ретроспективно рассмотрели ряд параметров, определяющих диагностическую значиность стандартных радиологических диагностических методов.

При рассмотрении корреляции характера сигнала и дифференциальной диагностики типов опухоли проводилось сравнение пациентов с глиобластомой, олигодендроглиомой, нейроэкто-дермальными опухолями и рабдоидными опухолями головного мозга (п=). Для ПЭТ с ФДГ гомогенное повышение сигнала отвечалось (таб 10) в 89% случаев, гетерогенность сигнала в 11% В

данном исследовании не былозарегестрировано случаев НЭТ с понижением сигнала или сигналом эквивалентным здоровому мозговому веществу Для глиобластом и олигодендроглиом более типичным было наличие гетерогенного сигнала (1 или более обласгей пониженного или эквивалентного сигнала) (таб 10). При глиобластомах гетерогенный сигнал отмечался в 67% случаев по сравнению с 54% при олигодендроглиомах.

Вид опухоли Равномерность сигнала

Мультиформная глиобластома -

ПНЕТ -

Олигодендроглиома +

Лимфома +

Нами были рассмотрены 45 пациентов с опухолями мозга, которым проводилось диагностическое ПЭТ сканирование с [пС]-Метинином. В данной группе мы рассматривали сравнение диагностической достоверности и прогностической значимость ПЭТ сканирования между [иС]-мсгионином и [18Р]-ФДГ. Было отмечено повышенная чувствительность [пС]-метионина к периферическому инфильтративному росту, но снижение разрешающей способности, связанное с особенностями 11 С, как изотопа. 100%"

-Г!.

т 1—

"'и *.......п

- -1 1...............—

■-......-Ь____________,

ФДГ-станд.групла, ! 46%

ФДГ-выс группа. 44%

6

Время, мес

12

Метионин-

выс группа, 54 '

Р=0,07

Метионин-

станд группа, 43 %

12

3 6 9

Время, мес

Рисунок 28. Выживаемость в группах с различной интенсивностью ПЭТ сигнала, полученного с [пС]-мегионином и [18Р] ФДГ.

Исследуемая популяция независимо подразделялась по двум категориям: повышенный сигнал метинина и повышенный сигнал ФДГ. Изучение взаимосвязи высокого сигнала и выживаемости не показало существенной разнизы ни для метионина, ни для ФДГ. Определенная, не достигающая статистической значимости, тенденция к повышению краткосрочной выживаемости у пациентов с ярким сигналом 11С-метионина может быть связана с улучшением результатов хирургического вмешательства.

Преимущество ФДГ заключается в его стабильности и отсутствии неспецифического фона продуктов биодеградации. Преимуществом метионина является более высокая чувствительность к инфильтрирующей периферии Таким образом, можно сделать вывод о диагностическом преимуществе метионина перед ФДГ, хотя чувствительность обоих методов к инфильтирующей части опухоли требует улучшения, составляя 72% для ФДГ и 89% для метионина. Таблица 11. Объем хирургической резекции опухлей мозга, локализованных различными

Метод ПР ЧР

ЯМР 69 25

ФДГ 73 18

Метионин 87 9

Б. Клинические испытания

В качестве превого этапа внедрения вновь разработанных суррогатных проб для ПЭТ визуализации проводились исследования совмещенной первой-второй фазы с рассмотрением фар-макокинетики радиофармпрепаратов в чловеческом организме.

При исследованиях йодоуридина было отмечено специфическое накопление препарата в области расположения опухоли (рис 29). Средне накопление радиофармпрепарата [1241]ЙУДР в популяции больных с глиобластомой, оцениваемое по расчётам с использованием РИ, включающего опухоль составляло 1,7 ± 0,6 %дозы/г через 24 часа и 0,07 ± 0,05 %дозы/г через 48 часов. Соотношение сигнала к фону составляло 12,1 через 24 часа и 1,6 через 48 часов, что отражает наличие биолгичского распада и выведения радиофармпрепарата.

Фармакокинетическое исследование образцов биологических жидкостей, полученных у па-цинетов показало наличие быстрого почечного выведения радиофармпрепарата, благодаря его высокой гидрофильности с периодом полувыведения 37 ± 16 минут. Вместе с тем жидкостный хроматографический анализ образцов как плазмы так и мочи показал быстрое появление пика свободного йодида, указывающего на деградацию ЙУдР К 24, а в особенности 48 часам большинство циркулирующей в плазме активности представлено йодидом. Данный результат ставил под сомнение специфичность накопленной активности в опухоли, однако, исходя из описанных ранее доклипических данных, более 90% активность, содержащейся в клетках, выделенных из опухоли через 24 часа после введения [1241]ЙУдР былдо связано с ДНК, предполагая наличие

встроенных молекул радиомеченного нуклеозида. Важно также отметить, что высокая гидро-фильность йодида способствовала повьппению его концентрации в плазме, а также быстрой экскреции почками. В связи с коротким временем полувыведения йодида из плазмы крови т1/2 = мин., его влияние на сигнал считается незначительным.

ЯМР ПЭТ с [18П ФДГ ПЭТ с [1241]ЙУдР

Рисунок 29. ПЭТ визуализации опухоли мозга с [1241)ЙУдР.

Парное сравнение ПЭТ изображений, полученных у одного и того же пациента с использованием в качестве пробы [18Р]ФДГ или [1241]ЙУдР, показало сопоставимое определение локализации опухоли (рис 29). Изображения глиобластом [1241]ЙУдР также отличались гетерогенностью, однако, структура опухоли и расположение очагов накопления различалось (рис 29).

Время, мес

Рисунок 30. Соотношение накопления и выживаемости.

Данное являение объяснсется различием механизмов накопления радиофармпрепаратов. Можно предположить, что ФДГ накапливался в областях с активацией гликолитического пути, благодаря нарастанию опухолевой гипоксии, что должно соответствовать снижению темпов про-

лиферации, в то время как ЙУдР максимально накапливался по периферии опухоли и в областях удовлетворительного кровоснабжения, поддерживающего кислородный метаболизм и активную пролиферацию.

Для определения возможности использования результатов ПЭТ сканирование с [1241]ЙУдР в качестве прогностического критерия оценки течения заболевания был проведен анализ выживаемости пациентов, вовлеченных в исследование. Учитывая малое количество субъектов в выборке рассматривались 2 группы стратификации, основанные на интенсивности сигнала, оцениваемой по соотношению к фону. В группе из 5 пациентов, имевших интенсивность сигнала ниже одной стандартной девиации от среднего (12,1 ± 3,4) по всей популяции отмечалось статистически достоверное повышение выживаемости в течение 12 месяцев до 40% (р=0,05) (рис 30).

При предварительном блокировании накопления йода в тканях с естественно высоким уровнем иодидных симпортеров с помощью перхлората или насыщенного раствора иодида калия (НРИК)., не отмечалось появления неспецифического сигнала накопления в щитовидной и слюнных железах и желудке.

В. Сравнение ["Х^ФАЦЕК и [иС]Метионина в качестве ПЭТ радиофармпрепаратов.

Клиническое сравнение использования двух аминкислотных радиофармпрепаратов для ПЭТ визуализации проводилось на популяции из 6 пациентов с ранее диагносцированной мульти-формной глиобластомой головного мозга, представленной 4 мужчинами и двумя женщинами в серии из 9 исследований. 3 пациента в течение 2 лет наблюдения прошли повторное обследование комбинацией радиологических методов в связи с продолженным ростом опухоли. 4 пациента имели полушарную локализацию опухоли, У 2 пациентов глиобластома поражала ствол мозга. У 3-х пациентов по результатам ЯМР сканирования было выявлено лептоменингеальное распространение заболевания. У всех 6 больных на предварительном [18Р] ФДГ сканировании отмечался гетерогенный повышенный сигнал в области новообразования головного мозга У 2-х больных при повторном сканировании отмечалось наличие изоактивной зоны в области опухоли по сравнению с окружающим мозговым веществом.

Для повышения достоверности сравнения протокол исследования предусматривал проведение обоих исследований в течение 24 часов. Учитывая более короткий период распада [ПС]-исследование проводилось первым, что позволяло достичь полного радиологического клиренса введенной активности в течение 3,5 часов. В связи с этим у 3 пациентов, которым проводилось повторное исследование, оба сеанса визуализации были запланированы в течение одного дня

Результаты ПЭТ сканирования с [11С]-метнонином показали наличие гетерогенного накопления метионина в области головного мозга, описанной по предварительному ЯМР сканированию, как содержащая объемное образование во всех 9 случаях, включая 2 случая с ФДГ-

изоактивностью. При повторном сканировании с [,8Р]ФАЦБК отмечалось сохранение общего характера активности и распределим зон максимального накопления в опухолях

в 111111»—1«»«» . СВ|

□ * тщт „./А □■нмтамм но

¡^И^^ИИ 45МИИ Н^мИ ЯМР.РШг!

Рисунок 31. ПЭТ визуализация с ["Р]ФАЦБК.

Вместе с тем, был отмечен ряд существенных различий (рис 31). 1) Соотношение сигнала к фону улучшилось при повторных сеансах сканиорвания у пациентов после ["Б] ФАЦБК, проводившихся через 1 час и 4 часа после введения радиофармпрепарата, используя его преимущества как более долгоживущего. 2) Повысилась разрешающая способность ПЭТ сканнера. Последнее наблюдение объясняется визуализационными характеристиками изотопа [18Р] по сравнению с [ИС]. Во-первых, имеет оптимальное для ПЭТ детекторов соотношение энергии испускания (511кэВ), что предотвращает увеличение спонтанного фона. Во-вторых, более длительные период полураспада позволил вводить пациенту большую дозу активности и увеличить на 50% время сканирования, получая более достоверные данные.

Оценка пространственной точности определим границ опухоли с помощью рассматриваемого ПЭТ метода проводилась путём определения наличия резидуального заболевания на исследовании, проведенном через 1 месяц после хирургической резекции - корреляция с резидуаль-ным заболеванием (таб.12). Для повышения достоверности исследования проводилось непарное сравнение с историческим контролем, из числа рассмотренных ранее случаев.

Таблица 12. Частота ризидуальньп заболеваний при различных методах ПЭТ втзуали-зации.____

Метод Процент полных резекций Частота резидуальных заб.

ФДГ 65 56

Метионин 78 32

ФАЦБК 84 16

Исследование показало существенное снижение частоты резидуальных заболеваний у пациентов после проведения визуализации [18Р]ФАЦБК. Данный результат был достигнут путем улучшения хирургической ореинтации, несмотря на то, что различия в частотеполных резекций не достигли статистически значимого уровня, возможно в связи с ограниченностью выборки.

Учитывая определяющую роль объёма оперативного вмешательства в прогнозе течения опухоли мозга, нами была проведена оценка влияния ПЭТ визуализации с [18Р]ФАЦБК на выживаемость (рис. 32). Анализ показал, что у пациентов, прошедших предхирургическую диагностику локализации опухоли с помощью [18Р]ФАЦБК и ПЭТ краткосрочная выживаемость (12 мес.) существенно отличается от пациентов из исторического контроля. К сожалению в связи с коротким сроком наблюдения данные о долгосрочной выживаемости пока не доступны в статистически значимом объёме.

Время, мес

Рисунок 32. Сравнение краткосрочной выживаемости пациентов диагносцированных с помощью ПЭТ при использовании стандартных проб и

В завершении клинической оценки ['®Р]ФАЦБК было проведено исследование фармакоки-нетики радиофармпрепарата в организме человека (рис. 32), выявившее наличие быстрого биораспределения в течение первых 10 минут. В течение этого времени препарат активно накапливался в мышечной ткани (рис. 32), что являлось существенным отличием фармакокинетики в организме человека по сравнению с доклиническими исследованиями.

Выведение, пересчитанное с поправкой на радио-распад, характеризовалось двухфазной кривой концентрации [18Р]ФАЦБК в палзме крови с короткой первой фазой полувыведения (40 минут) и длительной второй фазой, что может быть вызвано, как постепенным выведением препарата из псансй, так и наличием устойчивого связывания с белками плазмы крови. Длительность

циркуляции радиофармпрепарата сыграла положительную роль, так как профиль накопления пробы в опухоле имеет более пологий характер, чем в нормальных тканях. Таким образом, наблюдение за накоплением [18Р]ФАЦБК в более длительные сроки позволяет улучшить соотношение специфического сигнала к фону.

1 40

1.» ■ * :

100 ■

0 80

0 80

0 40

0 20 ■

0 00 1

[18Р]ФАЦБК

■ » — опухоль —» - против мозг —А - плазма - " саг синус —«—мягктк. черепа

-^¿1- -ТТТТТТТТТТГТГГГгг-:____

100 150

Время поем вмдмшя (МИН)

Рисунок 33. Распределение ['^ФАЦБК в тканях н органах организма человека.

Л Клинические испытания новых «суррогатных» проб дня ПЭТ ви-

Ж&Я8Ч

> " /

«у*?.

Рисунок 34. ПЭТ визуализация генной терапии опухоли с помощью суицидального гена ВПГ-ТК, доставляемого аденовирусным вектором

зуализации опухолей мозга показали повышение чувствительности и разрешающей способности метода, которое для [18Р]ФАЦБК имело существенное клиническое значение, повышая выживаемость пациентов с опухолями головного мозга.

Количественная оценка генной терапии опухоли с помощью ПЭТ.

Перед исследованием стояла задача доказать преимущества генного репортерного подхода в клинической визуализации противоопухолевой генной терапии, за счет комплексной оценки локализации, степени активности и беопасности применения суицидальных генных ч систем.

3* Супернатант, собранный с культуры клеточной линии, продуцирующей аденовирусы, содержащие геном модифицированный экспрес-сировать ВПГ-ТК в качестве суицидального гена, был приготовлен и характеризован согласно требованиям вМР. Вирус вводился непосредственно в область очага метастазирования карциномы толстого кишечника в печени с использованием направленной пункции под КТ контролем в дозе 1012 пфе

Визуализация проводилась с помощью ПЭТ, используя в качестве радиофармпрепарата [1241]ФИАУ. Предварительная визуализация за неделю до введения вируса показала пониженное накопление радиофармпрепарата в очагах метастазирования по сравнению с нормальной тканью печени. Накопления [1241]ФИЛУ в других нормальных тканях и органах не выявлено. Накопление радиофармпрепарата в проекции костного мозга не достигало статистически значимого различия со средним уровнем фона.

После инъекции вируса в опухоль и последующего введения [1241]ФИАУ наблюдение через 24 часа показало появление положительного сигнала в проекции опухоли с минимальным под-капсульным рапространением сигнала в месте утечки вируса по ходу инъекционного канала (рис 34). Степень накопления и коэффициент взаимоотношения сигнала к фону (х19) позволяли начинать проведение суицидальной терапии опухоли путём системного введения ганцикловира.

На следующем этапе оценивалась чувствительность метода ПЭТ визуализации с [124Т]ФИАУ для мониторирования суицидальной терапии опухоли, трансфецированной ВПГ-ТК, с использованием ганцикловира. Исследования с повторным введением [1241]ФИАУ через 24 часа после ганцикловира показалисущественное снижение сигнала в проекции опухоли с понижением максимальной интенсивности в 14 ± 3,2 раза, что соответствовало терапевтическому эффекту ганцикловира.

Данные исследования показали, что генная терапия опухоли с помощью суицидального гена ВПГ-ТК, доставляемого аденовирусным вектором может быть монигорирована с помощью генной репоргерной системы, использующей ВПГ-ТК в качестве репортсрного гена и [1г41]ФИАУ в качестве репортерного субстрата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования, представленные в данной работе объединены общей идеей создания возможности доступной зрительному восприятию и приборному измерению качественной и количественной оценки биологических процессов в организме пациента и лабораторных условиях путем сочетания клинических радиологических и оптических лабораторных методов визуализации. Широта спектра исследований не случайна. Она отражает развитие всех направленй молекулярной визуализации, позволяющих иметь арсенал научных инструментов для выбора одного или сочетания наиболее соответствующих целям и задачам терапевтического вмешательства или исследования.

Возможности, предоставляемые молекулярной визуализацией охватывают все аспекты гематологии-онкологии от оценки развития костного мозга до формирования опухоли и развития противоопухолевого иммунного ответа. Гибкость разрабатываемых репортерных систем позволяет создавать модификации специфические для изучаемого объекта или лечебного протокола. Также существует возможность выбора в зависимости от технического оснащения клиники или научного института. Экономическая эффективность исследований варьирует от ресурсоёмкого синтеза

60

эмиттеров позитронов до экономичных гамма изотопов (""Тс). Таким образом, внедрение технологии молекулярной визуализации доступно и уже происходит во многих лечебных и научных центрах.

Учитывая непосредственную направленность описываемого комплекса исследований на разработку клинически применимых методов изучения онкогенеза, молекулярный имиджинг приобретает особую социальную значимость Визуализирующие методы, позволяя достичь раннего выявления пациентов с первичными и рецидивирующими новообразованиями, провести выделение групп пациентов, чувствительных к определенным видам терапии, наблюдать за ходом лечения, помогут снизить стоимость, сократить продолжительность и повысить эффективность лечения. Подобный подход может повысить экономическую эффективность лечения онкологических пациентов.

ВЫВОДЫ:

1. В серии культуральных и доклинических исследований на животных нами была доказана возможность применения ряда новых радиофармпрепаратов групп нуклеозидов (ЙУдР и [76Br]-BrFAU) и аминокислот ([18Р]ФАЦБК) в качестве радиологических проб для неинвазивного наблюдения за пролиферативной и метаболической активностью опухоли. При этом преимуществом в специфичности сигнала обладают неметаболизи-руемые соединения.

2 Генные репортерные системы для непрямой визуализации биологических процессов позволяют проводил, количественную радиологическую и оптическую регистрацию ре-портерного сигнала для неинвазивной визуализации приживления трансплантата костного мозга, апоптоза, опухолевой гипоксии, взаимодействия Т-клеток и опухоли и других процессов вовлеченных в онко, в реальном масштабе времени.

3 Многофункциональные репортерные генные системы и использование различных методов визуализации позволяют с помощью молекулярного имиджинга мониторировать взаимодейстие CD4 и CD8 Т-клеток Сочетание стуктурной и функциональной информации повышает разрешающую способность при анализе микрометас!азов аденокарци-номы по сравнению с индивидуальными методами и обеспечивает достоверность интерпретации результатов визуализации.

4 Визуализация противоопухолевого иммунного ответа в ходе адоптивной Т-клеточной терапии ЭБВ-лимфомы позволило не только мониторировать необходимую дозу клеток и их специфические и неспецифичесие реакции на опухоль и нормальные ткани организма, но также наблюдать за механизмами действия лимфоцитов и определить необходимость введения повторной дозы ЦТЛ.

5. Методы, основанные на принципе прямой визуализации радиомеченными аналогами ингибиторов протеин-киназ [13,1]ЛГ иДВ, позволяют оценивать биологический эффект при разработке противоопухолевых препаратов групп ЭГФР и абл-сарк ингибиторов, соответственно.

6. Прямая визуализация с применением радиомеченных ингибиторов ПК позволяет путем биологического анализа клинических образцов опухоли определить чувствительност ХМЛ к терапии иматинибом, и аденокарциномы - к лчечнию гефитинибом и монитори-ровать терапию препаратами данной группы.

7. Клинические испытания 1-2 фазы показали возможность использования [ш1]ЙУдР и [18К1 ФЛЦБК для повышают разрешающую способность «суррогатного метода» молекулярной визуализации с помощью ПЭТ для неинвазивного мониторирования пролифера-тивных и метаболических характиристик опухоли по сравнению со стандартными радиофармпрепаратами. [18Р]ФАЦБК имеет преимущество в выявлении инфильтратявного роста опухоли. Повышение накопления [1241]ЙУдР коррелирует с ухудшением выживаемости пациентов.

8. Неинвазивное наблюдение за генной противоопухолевой терапией с помощью гена двойного суицидально-визуализационного применения ВПГ-ТК и его специфичного субстрата [1241]ФИАУ позволяет осуществлять контроль за локализацией и уровнем экспрессии терапевтического гена в метастазах рака толстой кишки в печень

9. Репортерные системы позволяют контролировать процессы иммуно, гемато и онкогене-за и являются основой для дифференциальной терапии.

Практические рекомендации

• Для повышения точности предхирургической диагностики опухоли и определения терапев-тическиих возможностей для опухолей мозга рекомендуется исользовать оценку локализации и активности метаболических потребностей опухолей головного мозга с применением ПЭТ с [18Р]ФАБЦК. По интенсивности накопления радиофармпрепарата можно определять интенсивность метаболизма опухоли и эффективность применения цитостатических препаратов группы антиметаболитов.

• При необходимости оценку и мониторинг активности пролиферации опухоли следует использовать неинвазивной ПЭТ визуализацию с [1241]ЙУдР или [76Вг]БрФАУ. Для получения оптимального соотношения опухоль/фон нормальных тканей при минимальном распаде радиофармпрепарата оценку изображения обоих нуклеозидных радиотрейсеров следует проводить через 4 часа после введения.

В качестве клинически применимого метода для радиологической визуализации гена ВПГ-ТК в составе репортерных систем для мониторирования вирусных и бактериальных векторов для противоопухолевой терапии следует использовать [,241]ФИЛУ для получения изображений с низкой фоновой активностью и частотой наблюдений реже 8 дней. [18Р]ФЕАУ в сочетании с ВПГ-ТК позволяет добиться высокой частоты наблюдений. Выбор радиофармпрепарата должен зависеть от задач исследования.

[13|1]ФИАУ можно использовать для проведения специфической радиогенной терапии тканей трансфецированных ВПГ-ТК.

В случае необходимости использования репортерных генов человеческого происхождения в исследовательских и клинических протоколах неинвазивную молекулярную визуализацию следует проводить с чНЕТ и [*1]МИБГ и/или чНИС и [*Г] (йодидом). Молекулярный имидасинг обеспечивает контроль за клетками введенными реципиенту в ходе адоптивной терапии опухолей Т-лимфоцитами, генетически модифицированными для экспрессии ВПГ-ТК. В контроль включена как возможность наблюдения, так и управления клепсаим за счет суицидального эффекта ганцикловира.

Репортерные гены следует использовать для мониторинга трансплантации генетически измененного костного мозга. Они позволяют на ранних этапах неинвазивно оценить скорость и успешность приживления трансплантата.

Экспериментальное наблюдение за опухолевыми метастазами эффеткивно, экономно и биологически безопасно проводить, используя оптические визуализирующие системв, не требующие дорогого оборудования и расходных материалов (радиоизотопов) Использование активационных систем в гипоксичных опухолевых тканях позволит не только специфически оценивать уровень оксигенации тканей, и, соответственно, уровень протекания окислительно-восстановительных реакций, образования проангиогенных биологически активных веществ и свободных радикалов, но и специфически влиять на гипоксичные ткани опухолей.

Применение селективной активации генов, вовлеченных в р53-опосредованную регуляцию клетки, позволяет контролировать процессы апоптоза опухоли и противоопухолевых терапевтических лимфоцитов.

Оценка активации ЦТЛ с помощью транскрипционно регулируемой репортерной системы необходима для наблюдения за их противоопухолевым эффектом с одной стороны, и инактивации возможной реакции трансплантат против хозяина, с другой. Для определения чувствительности к ингибиторам ПК следует испепользовать метод прямой визуализации активации протеин киназного пути передачи сигнала в опухолевых клетках с помощью радиомеченных ПКИ анало1 ов.

• Ин виво мониторинг терапии ингибиторами ПК может успешно осуществляться путем использования прямой ПЭТ визуализации после введения следовых концентраций радиоме-ченных аналогов.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Jacobs A.. Dubrovin М., Hewett J., Sena-Esteves М., Tan C.-W., Slack M., Sadelain M., Breakfield X. and Tjuvajev J.G. (1999) Functional coexpression of HSV-1 Thymidine Kinase and Green F luorescent Protein: Implications for Noninvasive Imaging of Transgene Expression. Neoplasia 1:154-161.

2. Дубровин M.M.. Тюваев Ю.Г., Румянцев А.Г., Радиогенная терапия - новый метод лечения злокачественных новообразований. Материалы II Всероссийского съезда детских гематологов/онкологов. Москва, 2001, стр. 59.

3. Дубровин М.М.. Тюваев Ю.Г., Румянцев А.Г., Возможности специфической терапии опухолей, экспрессирующих канцер-эмбриональный антиген. Материалы П Всероссийского съезда детских гематологов/онкологов. Москва, 2001, стр. 60.

4.Doubrovin М- Ponomarev V, Beresten Т, Balatoni J, Bommaim W, Finn R, Humm J, Larson S, Sadelain M, Blasberg R, Gelovani Tjuvajev J Imaging transcriptional regulation of p53-dependent genes with positron emission tomography in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 2001 Jul 31 ;98(16):9300-9305.

5.Ponomarev V, Doubrovin M. Lyddane C, Beresten T, Balatoni J, Bornman W, Finn R, Akhurst T, Larson S, Blasberg R, Sadelain M, Tjuvajev JG. Imaging TCR-Dependent NFAT-Mediated T-Cell Activation with Positron Emission Tomography In Vivo. Neoplasia. 2001 Nov-Dec;3(6):480-8.

6.Bennett JJ, Tjuvajev J, Johnson P, Doubrovin M. Akhurst T, Malholtra S, Hackman T, Balatoni J, Finn R, Larson SM, Federoff H, Blasberg R, Fong Y. Positron emission tomography imaging for herpes virus infection: Implications for oncolytic viral treatments of cancer. Nat Med 2001 Jul;7(7):859-863.

7 Jacobs A, Tjuvajev JG, Dubrovin M. Akhurst T, Balatoni J, Beattie B, Joshi R, Finn R, Larson SM, Herrlinger U, Pechan PA, Chiocca EA, Breakefield XO, Blasberg RG. Positron emission tomography-based imaging of transgene expression mediated by replication-conditional, oncolytic herpes simplex virus type 1 mutant vectors in vivo. Cancer Res 2001 Apr 1;61(7):2983-2995.

8.Дубровин M.M.. Дубровина E.C., Румянцев А.Г. Развитие иммунной системы плода. Детская больница, 2001, №4, стр. 67-72.

9.Gelovani Tjuvajev J, Doubrovin M. Akhurst T, Cai S., Balatoni J, Alauddin M., Finn R., Born-man W, Conti P., Blasberg R, and Thaler H. Comparison of Radiolabeled Nucleoside Probes (FIAU, FHBG, and FHPG) for PET Imaging of HSV-tk Gene Expression. JNucl Med 2002 Aug 43(8): 1072-1083.

10. Mayer-Kuckuk P, Baneijee D, Malhotra S, Doubrovin M. Iwamoto M, Akhurst T, Balatoni J, Bommann W, Finn R, Larson S, Fong У, Gelovani Tjuvajev J, Blasberg R, Bertino JR. Cells exposed to antifolates show increased cellular levels of proteins fused to dihydrofolate reductase: A method to modulate gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Mar 19;99(6):3400-5.

11. Qiao J, Doubrovin M. Sauter BV, Huang Y, Guo ZS, Balatoni J, Akhurst T, Blasberg RG, Tjuvajev JG, Chen SH, Woo SL. Tumor-specific transcriptional targeting of suicide gene therapy Gene Ther. 2002 Feb;9(3): 168-75.

12. Hackman Т., Doubrovin M.. Balatoni J., Beresten Т., Ponomarev V., Beattie В., Finn R., Bornmann W., Blasberg R. and Gelovani Tjuvajev JG. Imaging expression of cytosine deaminase - herpes virus thymidine kinase fusion gene (CD/TK) expression with [124I]FIAU and PET. Molecular Imaging 2002 Jan-Mar; l(l):36-42.

13 Doubrovina ES, Doubrovin MM. Vider E, Sisson RB, O'Reilly RJ, Dupont B, Vyas YM Evasion from NK cell immunity by MHC class I chain-related molecules expressing colon adenocarcinoma. J Immunol. 2003 Dec 15;171(12):6891-9.

14 M Doubrovin. V Ponomarev, I Serganova, S Soghomonian, T Myagawa, T Beresten, L Ageyeva, M Sadelaine, J Koutcher, R G. Blasberg and J G. Gelovani Tjuvajev Development of a new reporter gene system -dsRed/XPRT - xanthine for molecular imaging of processes behind the intact blood brain barrier. Molecular Imaging 2003, Apr;2(2):93-112..

15. M Doubrovin. E Doubrovina, G. Koehne, A Ivanova, V Ponomarev, J Balatoni, A Shavrin, В Beattie, T Beresten, J Guerrero, W Bornmann, R Finn, G Koehne, S M. Larson, M Sadelain, R G Blasberg, R J. O'Reilly, and JG Gelovani Tjuvajev Long-Term Monitoring of Migration and Targeting of Genetically Modified Antigen Specific Cytotoxic T-Lymphocytes with Positron Emission Tomography. Nat Biotechnol 2003 Apr;21(4):405-13.

16 V Ponomarev, M. Doubrovin. I Serganova, T. Beresten, J Vider, A. Shavrin, L Ageyeva, J. Balatoni, R. Blasberg, and J. Gelovani Tjuvajev Cytoplasmically retargeted HSVl-tk/GFP reporter gene mutants for optimization of non-mvasive molecular-genetic imaging. Neoplasia, 2003. May-June 5(3):245-54.

17. P Mayer-Kuckuk, M Doubrovin. NJ Gusani, T Gade, J Balatoni, T Akhurst, R Finn, Y Fong, JA Koutcher, S Larson, R Blasberg, J Gelovani Tjuvajev, JR Bertino and D Baneijee. Imaging of drug-modulated transgene expression in xenografts of human liver metastases of colorectal cancer in living rats Eur JNucl Med 2003 Sep;30(9): 1281-91.

18. Дубровин MM., Дубровина E.C., Пнлларсетти H, Румянцев А.Г. О'Рейли Р., Количественная оценка инфильтрации цитотоксическими лимфоцитами в живом организме с помощью визуализации Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии, 2004, т.3„№4, стр.99.

19. Дубровин ММ., Дубровина Е.С , Пилларсетти Н, Румянцев А.Г. О'Рейли Р , Дифференциальная визуализация клинических субпопуляций цитотоксических Т-лимфоцитов в экспериментальных моделях, 2004, т.3„№4, стр.99.

20. Doubrovin М. Serganova I, Mayer-Kuckuk Р, Ponomarev V, Blasberg RG Multimodality in vivo molecular-genetic imaging. Bioconjug Chem. 2004 Nov-Dec;15(6):1376-88.

21. Doubrovina ES, Doubrovin MM Lee S, Shieh JH, Heller G, Pamer E, O'reilly RJ.In vitro Stimulation with WT1 Peptide-Loaded Epstein-Barr Virus-Positive В Cells Elicits High Frequencies of WT1 Peptide-Specific T Cells with In vitro and In vivo Tumoricidal Activity. Clin Cancer Res. 2004 Nov 1;10(21):7207-7219.

22. M Doubrovin. V. Ponomarev, R. Blasberg, PET-based Reporter Gene Imaging: Assessment of Endogenous Molecular-Genetic IEEE Eng Med Biol Mag 2004 Jul-Aug;23(4):38-50.

23. Minn AJ, Kang Y, Serganova L, Gupta GP, Giri DD, Doubrovin M. Ponomarev V, Gerald WL, Blasberg R, Massague J. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. JClinlnvest. 2005 Jan;115(l):44~55.

24. Soghomonyan SA, Doubrovin M. Pike J, Luo X, Ittensohn M, Runyan JD, Balatoni J, Finn R, Tjuvajev JG, Blasberg R, Beimudes D.Positron emission tomography (PET) imaging of tumor-localized Salmonella expressing HSV1-TK. Cancer Gene Ther. 2004 Oct 22.

25. T.P.F. Gade, W.M. Spees, H.C. Le, K.L. Zakian, V. Ponomarev, M. Doubrovin. J.G. Gelovani, J. A Koutcher In vivo 5-fluorouracil and fhioronucleotide T\ relaxation time measurements using the variable nutation angle method. Magnet Reson Med 2004; 52(1): 169-173.

26. V. Ponomarev, M. Doubrovin. I. Serganova, J. Vider, A. Shavrin, T. Beresten, A. Ivanova, L. Ageyeva, V. Tourkova, J. Balatoni, W. Bornmann, R. Blasberg, and J. Gelovani Tjuvajev A Novel Triple Modality Reporter Gene for Whole Body Fluorescent, Bioluminescent and Nuclear Non-invasive Imaging. European Journal ofNuclear Medicine 2004; 31(5). 740 - 751.

27 I Serganova, M Doubrovin. J. Vider, V. Ponomarev, S. Soghomonyan, T. Beresten, L. Ageyeva, A. Serganov, S. Cai, J. Balatoni, R. Blasberg, and J Gelovani Molecular imaging of spatial heterogeneity and temporal dynamics of hypoxia-induced HIF-la signal transduction activity in tumor cells and in living mice. Cancer Research 2004.

28. Дубровин ММ, Дубровина Е.С, Румянцев А.Г. и соавт Визуализация генетически измененных лимфоцитов. Гематология и переливание крови. В печати.

Тезисы докладов:

I РоиЬгоущ М. Doubrovma Е., Zanzonico P., Blasberg R. Use of №г-Ершер^|п'пд ТгаТТОДег Gene as a Reporter for Non-Invasive Molecular Imaging Society of Molecular Imaging, Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 209.

2. V. Ponomarev, M. Doubrovin. I. Serganova, T Beresten, J. Vider, S Cai, A. Shavrin, L. Ageyeva, V Tourkova, R. Finn, J. Gelovani Tjuvajev, R Blasberg, A Novel Triple Modality Reporter Gene-Reporter Probe Combination for Whole Body Fluorescent, Rinhimmescent and Nuclear Non-Tgyayiys Imaging Society of Molecular Imaging, Annual Meetmg, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 69

3. TA Beresten, M. Doubrovin. A. Glekas, J. Gelovani. Towards the Development of a Specific Radiotracer for Non-Invasive Imagine of theBCR/Abl Expression and Activity tu Tumors Society of Molecular Imaging, Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 63,139.

4. I.S Serganova, M. Doubrovin. V В Ponomarev, R. Blasberg, J. Gelovani A Novel Reporter System For Multi-modality

AbSct#^8,337^?athWaV «•У 8,

5 ТА Beresten, D Veach, M. Doubrovin. J. Gelovani Towards the Development of a Specific Radiotracer for Non-Invasive Imaging pf the EGFR Expression and Activity tu Tumors Society of Molecular Imaging, Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 140

6. M Doubrovin. S. Cai, J. Balatoni, V. Ponomarev, R. Finn, R.G. Blasberg, J.G. Tjuvajev Gelovani, Comparison of 18F-Radiolabeled Fluoronucleotites for Thymidine-Kinase Reporters Basedlmaging Society of Molecular Imaging, Annual Meetmg, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 144

7 IS. Serganova, MM Doubrovin. V.B. Ponomarev, S Soghomonian,LI Ageyeva, S Cai, R Blasberg, J. Gelovani Tjuvajev, WffVlg PffK-Akt-Forkhead Transcription Factor Signal Transduction Pathway Activity with PET Using a Novel Reporter System Society of Molecular Imaging, Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 199.

8 J Che, M Doubrovin. I.Serganova, L Ageyeva, N. Rosen, J. Gelovani Tjuvajev, R. G. Blasberg, pHSP70-hNIS-IRES-GFP Dual Reporter Gene Expression after Heat Shock anH 17АЛП treatment Society of Molecular Imaging, Annual Meetmg, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 200.

9. S. R. Choi, Zh.-P. Zhuang, P.D. Acton, J. Tjuvajev-Gelovani, M Doubrovin. D С Chu, H.F. Kung. Comparison of D-and L-FIAU in Detecting HSVl-tk Gene Expression Society of Molecular Imaging, Annual Meetmg, San-Francisco, CA, 2003, Abstrae« 212

10 V Ponomarev, M Doubrovin. I Serganova, T. Beresten, J. Vider, A. Shavrin, L Ageyeva, V Tourkova, S Cai, R Finn, I Gelovani Tjuvajev, R. Blasberg "Beacon-and-Sensor" Multi-Reporter Gene System For Imaging The Location And Activity Of Different MolecyljT-Bifllflpcal Processes In Vivo With Nuclear And Opriral . Snriptv of

Molecular Imaging, Annual Meetmg, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 217.

II V. Ponomarev, M. Doubrovin. I Serganova, T. Beresten, J. Vider, V. Tourkova, J Gelovani Tjuvajev. Imagine of T-Cell Activation Mediated bv Artificial Chimeric T-Cell Receptor Society of Molecular Imaging, Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 227.

12 P Mayer-Kuckuk, M Doubrovin. T. Budak-Alpdogan, L Bidaut, S Cai, V. Ponomarev, R.G Blasberg, M.R. van den Bnnk, J R Bertmo, D Baneijee, Jun Gelovani, M.D., Ph.D5. Non-Invasive Functional and Structural Imaging of Bone Marrow Cell Transplantation in Living Mice Society of Molecular Imaging, Annual Meeting, San-Francisco, CA, 2003, Abstract* 94.

13 P Mayer-Kuckuk, M Doubrovin. T. Budak-Alpdogan, V Ponomarev, R Blasberg, D. Banerjee, J. Gelovani (Tjuvajev) Non-invasive imaging of the transplanted bone marrow progenitor cells transfected with a triple gene reporter system in fusion with metotrexate resistant DHFR in vivo. Society of Nuclear Medicine, 50ft Annual Meeting, New Orleans, IL, 2003 Abstract #.

14. Doubrovin M.. Doubrovma b., Zanzonico P., Blasberg R Monitoring human cytotoxic T-lymphocytes transfected with a reporter human nor-epmephnne transporter gene Society of Nuclear Medicine, 50" Annual Meeting, New Orleans, EL, 2003 Abstract*.

15 Doubrovin M. Mayer-Kuckuk P , Budak-Alpdogan T, Ponomarev V, Baneijee D , and Gelovani Tjuvajev J. Optical imaging of bone marrow progenitor cells' early post-transplant destiny in mice. ASBMT Annual Meetmg Keystone, CO, 2003 Abstract

16. V. Ponomarev, M. Dpubrovin, I. Serganova, T Beresten, J. Vider, A Shavrin, L. Ageyeva, V. Tourkova, and J. Gelovani (Tjuvajev), Imaging of T cell Activation Mediated by Artificial Chimeric anti-CEA Receptor. Bordeaux, France 2003.

17 V Ponomarev*, M. Doubrovin. I Serganova, L Ageyeva, T Beresten, J. Vider, S Soghomonian, A. Shavrin, J Balatoni, R Finn, R Blasberg and J Gelovani Tjuvajev A Novel Triple Modality Reporter Gene For Whole Body Fluorescent, Biolummescent And Nuclear Non-Invasive Imaging. Bordeaux, France 2003.

18 M Doubrovin. V Ponomarev, I Serganova, T Beresten, J Vider, A Shavrin, L Ageyeva, V Tourkova, S Cai, R Finn, W. Bornmann, R. Blasberg, and J. Gelovani (Tjuvajev), Synthesis and Production of 18F-labeled Radiotracers

FIAU and FEAU for Imaging of Triple Modality Reporter Gene nesHSVl -tk/GFP/Luciferase Expression In Vivo Bordeaux, France 2003.

19 P. Mayer-Kuckuk, M Doubrovin. T. Budak-Alpdogan, V. Ponomarev, R. Blasberg, D. Baneijee, J Gelovani (Tjuvajev) Noninvasive Imaging of the Transplanted Bone Marrow Progenitor Cells Transacted with a Triple Gene Reporter System m Fusion with Metotrexate Resistant DIIFR In Vivo 6th annual ASGT Meeting, Washington, DC 2003 Abstract # 277

20 J. Che, M. Doubrovm, J Osborne, I. Serganova, L. Ageyeva, J Gelovani (Tjuvajev), R. G. Blasberg. hNIS-IRES-GFP Dual Reporter Gene Imaging б4 annual ASGT Meeting, Washington, DC 2003 Abstract # [322]

21 V Ponomarev, M Doubrovin. I. Serganova, L. Ageeva, T. Beresten, J. Vider, V Tourkova, S. Soghomonian, A. Shavrin, J. Balatom, S. Cai, R Finn, R. Blasberg, J Gelovani Tjuvajev. "Beacon-and-Sensor" Multi-Reporter System for In Vivo Imaging of the Location and Activity of Different Molecular-Biological Processes with Nuclear and Optical Techniques 6* annual ASGT Meeting, Washington, DC 2003 Abstract # [370]

22 V Ponomarev, M. Doubrovin. I. Serganova, L. Ageeva, T Beresten, J. Vider, S Soghomonian, A. Shavrin, J. Balatom, R. Finn, R. Blasberg, J Gelovani (Tjuvajev). A Novel Triple Modality Reporter Gene for Non-Invasive Fluorescence, Bioluminescence and Nuclear Imaging <> annual ASGT Meeting, Washington, DC 2003 Abstract # [1170].

23 J Che*, M Doubrovin. I Serganova, L Ageyeva, and R Blasberg Stress-response reporter gene imaging' HSP70-hNIS-IRES-EGFP 51" Annual SNM Meeting, 2004, Philadelphia, PA, Abstract #.

24. N Pillarsetty, S Cai. R. Finn. M Doubrovin. T Miyagawa,L Ageyeva and R Blasberg Synthesis of ["F]-2'-deoxy-2'-fluoro-5-propyl-l -p-D-arabinofuranosyl uracil (['*F]-FPAU) and its evaluation as a potential PET imaging agent for gene expression. 51" Annual SNM Meeting, 2004, Philadelphia, PA, Abstract #

25 Doubrovin. M„ Mayer-Kuckuk, P., Budak-Alpdogan, Т., Bidaut, L., Cai, S., Ponomarev, V., Blasberg, R., van den Brink, M., Bertino, J., Benaijee, D., Gelovani, J. 3-Dimentional multi-modality non-invasive imaging of the bone marrow engraftment model. ASBMT annual meeting 2004, Orlando, FL, Abstract #224

26. Doubrovina, E.S., Doubrovin. M.M. Shieh, J H., Bierwiaczonek, A., Heller, G, Pamer, E., O'Reilly, R.I. Characterization of the tumor-specific activity of WT-1 specific T-cells generated in vitro from normal individuals by sensitization with WT-1 peptide loaded autologous EBV-transformed B-cells ASBMT annual meeting 2004, Orlando, FL, Abstract #33.

Список сокращений:

МСКОЦ - Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологический Центр

ФИАУ - фтор-йодо-урацил арабинозид

ЭГФР - рецептор фактора роста эндотелия

ФЭАУ- фтор-этил урацил арабинозид

ПЭТ - позитрон-эмиссионная томография

ГЭБ- гематоэнцефалический барьер

ВПГ-ТК - тимидин-киназа вируса простого герпеса

ЭБВ - вирус Эшптейн-Бара

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

ГСК - гемапоэтические стволовые клетки

ХМЛ - хронический миелолейкоз

ПК- протеин-киназа

ФАЦБК - фторамино-циклобутановая кислота

ФАЦПК - фтораминошклопентановая килота

УТТГП - белок теплового шока

ЗФБ - зеленый флуоресцентный белок

ДГФР - дегидроксифолатредуктаза

ЦМВ - цитомегаловирус

СБА - канцер-эмбриональный антиген

СПЕКТ - компьютерная томография с регистрацией одиночных фотонов

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ПНЕТ - примитивная нейро-эктодермальная опухоль

FDA - food and drug administration (США)

ЙУдР - йододеоксиуридин

чНАТ - человеческий нор-адреналиновый транспортер чНИС - человеческий натрий-йодидный симпортер МИБГ - метайодобензил-гуанидин

1517?

РНБ Русский фонд

2006-4 11686

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 11.07.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл.ЗДТираж 100 экз. Заказ 418 Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Актуальность проблемы.

Развитие методов молекулярной визуализации клеток-мишеней в гематологии и онкологии продиктовано требованиями современного уровня развития медицины, ориентированного па применение лечения, специфически влияющего на патогномоничные биологические механизмы, лежащие в основе патологического процесса [Qiao J, с соавт. 2002, Pao W, с соавт. 2004]. Поиск биологических путей и подходов обусловлен необходимостью преодоления ограничений в терапевтических возможностях, связанных с лекарственной резистентностью [Shah NP, с соавт. 2004] и системной токсичностью, развивающейся при повышении терапевтических доз [S.F. Gardner, с соавт. 1993]. С одной стороны, применение узко-специализированных методов лечения требует тщательного отбора пациентов, с нарушениями именно в данном физиологическом звене. С другой, попытки влиять на гомеостаз организма на более тонком регуляторном уровне требуют тщательного контроля за функциями на клеточном и субклеточном уровне как с научной, так и с этической точки зрения [G.D. Demetri, с соавт. 2002]. Последнее отражается в ужесточении требований к разрабатываемым препаратам и биологическим компонентам, в особенности связанным с использованием рекомбинантного генетического материала и переноса донорских или аутологичных экстракорпорально выращенных клеток [Rooney СМ, с соавт. 1995].

Подобный контроль чаще всего подразумевает забор биологических проб для контроля на определенных временных интервалах [Bonini С, с соавт.1997]. Одним из недостатков такой тактики контроля являются ограниченность возможностей инвазивиого вмешательства, связанного с риском повреждения. Примером подобных ограничений могут служить необходимость повторных биопсий жизненно важных органов: головного мозга, печени или миокарда - после применения вирусной или клеточной терапии [А. Jacobs, с соавт. 2001, J.M. Hill, с соавт. 2003, Qiao J, с соавт. 2002,]. Другим недостатком является ограниченная достоверность результатов, полученных в данном образце по отношению ко всему органу или организму в целом.

Наиболее адекватным подходом для мопиторирования биологической терапии является не-инвазивная молекулярная визуализация. Методы визуализации прочно вошли в арсенал современных средств академической науки, позволяя в масштабе реального времени, наглядно и, в некоторых случаях, количественно оценить процессы, протекающие в биологических системах при минимальном вмешательстве в условия их протекания [Л. Rehemtulla, 2000, G. Koehne, 2003]. Последнее обстоятельство является одним нз решающих при выборе систем для хмолеку-лярной визуализации.

Основы развития молекулярной визуализации были заложены на стыке молекулярной биологии, ядерной медицины, фармакологии, биохимии и клеточной биологии [Gelovani Tjuvajev J, 2003]. Разработанные ещё на заре ядерной медицины принципы использования следовых концентраций радиофармпрепаратов [Sokoloff L., 1979], прямых и непрямых подходов к визуализации получили дальнейшее развитие при использовании последних достижений генной инженерии [Wang Y, 2005] и протеиномики [G.D. Luker, 2002, Piwnica-Worms D, 2005]. Вклад молекулярной визуализации, как в область породивших её базовых наук, так и в практическую или клиническую науку неоценим. Существенная часть биологических исследований в целом и большая часть экспериментальных работ по изучению биологических механизмов на животных моделях используют на различных этапах генные репортериые конструкции, позволяющие получать неинвазивным образом информацию о физиологических и патологических процессах на клеточном уровне [P. Mayer-Kuckuk, 2002].

Именно онкология и гематология стали основными областями приложения достижений молекулярной визуализации, так как в основе патологических процессов гемопоэза и онкогенеза лежат нарушения на молекулярном уровне, приводящие к расстройствам системной регуляции и тяжелым последствиям для всего организма [X. Wang, 2003, Miller VA, 2004]. Наблюдение за этими процессами становится первым шагом к созданию и проведению патогномоиичпой терапии опухоли [Lynch TJ, 2004]. Молекулярная визуализация играет также важную роль на этапах доклинических испытаний, выполняя функцию контрольного инструмента, мои итерирующего биологический эффект лечения [Qiao J, с соавт. 2002,]. В данный момент отдельные методы молекулярной визуализации начали проходить клинические испытания.

Таким образом, внедрение в клиническую практику достижений биотехнологий требует осуществления строгого контроля за используемыми в лечении препаратами и агентами. Возможности, предоставляемые в этом отношении молекулярным имиджингом (визуализацией), делают его незаменимым инструментом биомедицинской науки.

Цель исследования.

Разработать и внедрить в практику диагностическую технологию, объединяющую визуальное наблюдение и количественную оценку биологических процессов, вовлеченных в гемо-, иммуно- и онкогенез, для контроля эффективности проводимой терапии опухоли на уровне клетки-мишени, межклеточного взаимодействия и организма в целом с минимальным вмешательством, не способным повлиять на течение процесса.

Задачи:

Экспериментально-теоретические доклинические исследования:

1. Доказать преимущества использования «суррогатных» радиомеченных фармпрепаратов, имитирующих существенные (ключевые) компоненты, участвующие в регуляции гемо-поэза, опухолевом метаболизме, позволяющих количественно оцепить распространенность и характер роста опухоли с диагностической и терапевтической целями.

2. Определить возможность повышения специфичности и расширения функционального потенциала противоопухолевой терапии с помощью непрямых визуализирующих методов с использованием генных репортерных систем регулируемых на трапскрипторном и посттранскрипционном уровне передачи биологического сигнала.

3. Доказать необходимость комплексного подхода к использованию молекулярного имид-жипга и количественной оценки изображений для повышения чувствительности и специфичности визуализирующих методов исследования биологии опухолей и противоопухолевого ответа для усиления их диагностической значимости

4. Обосновать использование неинвазивной молекулярной визуализации для мониториро-вания миграции опухолевых и нормальных клеток организма на различных этапах гемо-, иммуно- и оикогенеза и противоопухолевой терапии, включая трансплантацию гемопо-этичсских стволовых клеток и адоптивную иммунотерапию.

5. Оценить применимость прямого имиджинга для определения показаний и мониториро-вания лечения опухолей с помощью биологически направленной терапии ингибиторами протеин-киназ, являющихся фармакологической мишенью для подавления функции рецепторов, поддерживающих опухолевый рост.

Клинические испытания методов молекулярной ризуализации:

1. Разработать и внедрить в клиническую практику систему прямой визуализации опухолевых клеток для определения показаний к назначению препаратов группы ингибиторов протеин-киназ, позволяющую определить чувствительность опухоли к противоопухолевой терапии, специфичность терапии по отношению к здоровым тканям и мониториро-вать ход лечения больных.

2. Оценить возможность повышения специфичности и улучшения чувствительности метода (прогностическую достоверности и клиническую значимость) диагностики и монито-рирования роста опухолей с помощью галогенизированных производных тимидина и циклических аминокислот в качестве непрямых маркеров опухолевого метаболизма по сравнению с традиционными прямыми и суррогатными методами.

3. Доказать преимущества многофункционального подхода в клинической визуализации противоопухолевой генной терапии, за счет комплексной оценки локализации, степени активности и безопасности применения суицидальных генных систем.

Актуальность

Использование прямых трейсеров, отражающих метаболизм опухолей, позволяет сделать новый шаг в биологической диагностике опухолей, повышая чувствительность и специфичность неинвазивных визуализирующих методов

Предложенные подходы с использованием химерных многофункциональных визуализирующих генов могут использоваться для визуализации опухолевых и гемопоэтических клеток в многочисленных исследованиях, оценивающих их расположение и функции

Радиогенная терапия является перспективным методом, позволяющим направленно доставлять радиофармпрепарат к клеткам мишеням и их микроокружению и проходящим клинические испытания.

Методы визуализации генной терапии необходимы для развития данного направления, требующего долговременного неинвазивного мониторирования и регуляции экспрессии перенесенных генов в живом организме с целью предотвращения возможных побочных эффектов от проводимого лечения.

Мониторирование лимфоцитов, введенных пациентам в терапевтических целях, позволяет проводить контроль и коррекцию проводимой иммунотерапии в масштабе реального времени в соответствии с наблюдаемым терапевтическим эффектом и предвосхищать развитие возможных побочных реакций, включая РТПХ.

Наблюдение за клетками костного мозга в посттрансплантационном периоде позволяет на ранних этапах оценивать и прогнозировать приживление трансплантата и, в случае наличия данных об отторжении, рассматривать вопрос о повторной пересадке на ранних клинических этапах с возможным сокращением сроков восстановления гематопоэза.

• Визуализация фармакокинетики и фармакодинамики малых биологически активных молекул, в частности, ингибиторов протеин киназ открывает возможности, как выбора препаратов, так и отбора пациентов для специфической противоопухолевой терапии.

Научная новизна Впервые:

• В доклинических и клинических исследованиях испытаны неметаболизируемые аминокислоты и нуклеозиды в качестве радиомеченных проб для выявления роста опухолей.

• Создан химерный ген, позволяющий получать многофункциональные изображения меченых клеток и проводить параметрическую оценку уровня активности терапевтического гена.

• Разработан метод моделирования опухолевого роста in vitro путем создания сфероидов из опухолевых клеток, меченых химерным флуоресцентным геном, для оценки дозы и эффективности радиотерапии.

• Предложен метод радиогенной терапии опухолей с использованием герпесвирусной тимидин-киназы и [Х1]ФИАУ в качестве радиофармпрепарата

• Проведена количественная оценка эффективности трансфекции растущей опухоли в живом организме литическим вирусом герпеса, введенного непосредственно в опухоль.

• Описан опухолеспецифический контроль экспрессии терапевтического гена, доставленного в опухолевые клетки с помощью аденовирусного вектор.

• Разработан метод визуализации и количественной оценки аденовирусной терапии метастазов рака толстого кишечника в печени.

• Предложено использование двух аналогичных аденовирусов для получения параметрической количественной оценки экспрессии терапевтических трансгенов в тканях опухоли.

• Осуществлено мониторирование распределения в живом организме терапевтических трансгенных бактерий, несущих репортерный ген.

• Производилось длительное неинвазивное наблюдение за распределением и перемещением в опухоль специфических противоопухолевых Т-клеток.

• Разработан радиофармпрепарат ФИАУ, аналогичный по активности тимидину, специфичный только для герпесвирусной тимидин-киназы и не накапливающийся тимидин-киназой 1 млекопитающих.

• Получены изображения процесса приживления трансплантата костного мозга в живом организме в масштабе реального времени.

• Создана система визуализирующий ген - радиоактивно-меченая проба, позволяющая неинвазивно визуализировать биологические процессы, происходящие в меченых клетках, находящихся в головном мозге за неповрежденным гематоэицефалическим барьером.

• Получены изображения связывания и накопления в тканях специфических ингибиторов протеин-киназ ЭГФР и абл.

Практическая значимость

Настоящая работа отражает серию уникальных исследований по разработке прямых и непрямых трейсеров и параметрического имиджа. Результаты исследований отражены в ряде публикаций и научных сообщений, положены в основу патентов и клинических протоколов.

Непрямые трейсеры

Нуклеозиды - бромо-фторо-урацил арабииозид предложен в качестве альтернативы тими-дину для визуализации пролиферативной активности опухоли. Разработаны показания к применению и алгоритм использования наиболее клинически эффективных фторированных и йодированных аналогов тимидина — ФЭАУ и ФИАУ, соответственно. На применении пуклеозид-ных радиотрсйсеров основан метод, позволяющий количественно оценивать пролиферацию, определяя скорость накопления нуклеотидов в клетках, путем дифференциального мечения бромо и йодопроизводными урацила.

Использование радиомеченных иуклеозидов в качестве репортерных проб для нуклеозид-киназных репортерных генов позволяет производить неинвазивпую визуализацию биологических процессов на клеточном и тканевом уровне.

В сочетании с репортерными генами нуклеозиды используются в качестве ренортерных систем для молекулярной визуализации внутриклеточных процессов с помощью управляющих элементов, чувствительных к регуляции на транскрипционном уровне.

Обоснованы принципы радиогенной терапии, позволяющей направленно доставлять радиофармпрепарат к клеткам мишеням и их микроокружению. Метод доведен до клинических испытаний.

Аминокислоты — проведены исследования распределения неметаболизирующихся аминокислот для получения ПЭТ изображений у пациентов с опухолями мозга. ПЭТ визуализация с помощью неметаболизируемых циклических аминокислот используется для неинвазивной оценки роста опухоли в ходе исследований противоопухолевой терапии, а также влияния роста опухоли на синтетические анаболические потребности клеток, экспрессию аминокислотных транспортеров и проницаемость ГЭБ.

Параметрическая визуализация

Вирусы - Разработанный метод визуализации и количественной оценки эффективности трансфекции метастазов аденокарциномы толстой кишки в печени положен в основу серии клинических исследований, мониторирующих эффективность переноса терапевтического гена. Визуализация действия вирусной противоопухолевой терапии с помощью молекулярных ре-портерных систем внедрена в лабораторные методы работы с малыми лабораторными животными для оценки распределения введённого вируса в организме, вирусной дозы, накопленной в отдельных органах и тканях. Данная методика позволяет проводить количественную оценку вирусной нагрузки и функциональной экспрессии терапевтических белков, перенесённых вирусным вектором.

Методы визуализации генной терапии необходимы для развития таргет-терапии в онкологии, требующего долговременного неинвазивного мониторироваиия и регуляции экспрессии перенесенных генов в живом организме с целью предотвращения возможных побочных эффектов от проводимого лечения.

Бактерии - разработана репортерная система, позволяющая проводить наблюдение за эффективностью нового метода в противоопухолевой терапии - бактериальной терапии опухолей - и следить за распределением используемого при этом терапевтического компонента в организме больного. Неинвазивная визуализация с помощью репортерного гена ВПГ-ТК использовалась для характеристики распределения противоопухолевых терапевтических бактерий с целью оценки бактериальной нагрузки на жизненно-важные органы и системы.

Клетки:

Лимфоциты - На основании разработанной и опубликованной нами методики визуализации Т-лимфоцитов разработан клинический протокол наблюдения за введенными нациенту генетически модифицированными анти-ЭБВ-специфичными цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ). Кроме того, неинвазивная молекулярная визуализация антиген-специфичных Т-клеток, введенных животным, несущим специфическую опухоль, используется в исследованиях, изучающих механизмы противоопухолевого и противовирусного Т-клеточного ответа, основные молекулярные компоненты, участвующие в процессе антиген-специфичной миграции и активации Т-клеток, а также механизмы, с помощью которых опухоли избегают контроля со стороны иммунной системы и становятся резистентными к опухолесиецифичному Т-клеточному ответу.

Предложенные подходы с использованием химерных многофункциональных визуализирующих генов могут использоваться для визуализации опухолевых и гемопоэтических клеток в многочисленных исследованиях, оценивающих их расположение и функции клеток крови и иммунной системы.

Мониторирование лимфоцитов, введенных пациентам в терапевтических целях, позволяет проводить контроль и коррекцию проводимой иммунотерапии в масштабе реального времени в соответствии с наблюдаемым терапевтическим эффектом и предвосхищать развитие возможных побочных реакций, включая РТПХ.

Костный мозг - использование визуализации ГСК позволяет на ранних этапах прогнозировать состоятельность трансплантата. Интенсивность сигнала и его прирост коррелируют с увеличением числа клеток и, таким образом, восстановлением гемопоэза.

Наблюдение за клетками костного мозга в посттрансплантационном периоде позволяет на ранних этапах оценивать и прогнозировать приживление трансплантата и, в случае наличия данных об отторжении, рассматривать вопрос о повторной пересадке на ранних клинических этапах с возможным сокращением сроков восстановления гематопоэза.

Опухолевые клетки - использование флуоресцентных белков позволяет в реальном масштабе времени наблюдать за распределением опухолевых клеток в организме.

Применение многофункциональных визуализирующих систем позволяет выявить в популяции метастатических клеток рака молочной железы наличие субпопуляций, имеющих предопределенную предрасположенность к метастазированию в различные органы и ткани.

Прямые трейсеры

Разработан метод оценки прогнозирования эффективности лечения препаратами группы ингибиторов протеин кииазы рецептора ЭРФ прессой и тарсивой (гефитиниб/имитиниб), применяющихся при лечении немелкоклеточного рака легких, с помощью радиоактивно-меченных структурных аналогов, являющихся ковалептно-связывающимися ингибиторами интересующих протеип-киназ.

Для оценки клинического влияния и выработки показаний к применению ингибиторов аЫ-протеин-киназы (глнвек (8Т1-571)) в лечении ОПУД опухолей и хронических миело-лейкозов разработан метод использования радиофармпрепаратов семейства эгс-ингибиторов, позволяющий предсказывать чувствительность опухоли в живом организме и в культуре клеток к определенному виду фармакологических препаратов класса ингибиторов ПК.

Неинвазивныи имиджинг с использованием ингибиторов ЭРФ-тирозин киназ применяется в исследованиях роли различных мутаций ЭРФ в чувствительности опухолей к химиотерапии новым классом фармпрепаратов - ПК-ингибиторами.

Предложено применение визуализации ингибиторов семейства сарк киназ - для скрининга относительной чувствительности новых препаратов данного семейства, а также для косвенной оценки терапевтического эффекта лечения отдельными ингибиторами различных ПК, обладающих кросс-реактивностью с срк- киназой.

Внедрение в практику:

Стадию клинического внедрения прошли ряд методов, разработанных в ходе описанных ниже исследований:

Суррогатный» визуализационный подход проходит клинические испытания на базе МСКОЦ. На данный момент в исследования возможности использования радиомеченных циклических аминокислот (ФАЦБК, ФАЦПК) вовлечены б пациентов, проведено 9 исследований, включая 3 повторных наблюдения.

В исследованиях 1-2 фазы по накоплению опухолями мозга радиомеченного йодоуридина был набран 21 больной. Исследования к настоящему моменту завершены.

В совместном исследовании 1-ой фазы по визуализации вирусной противоопухолевой терапии метастазов рака толстого кишечника на базе Госпиталь Маунт Синай при участии МСКОЦ проведены эксперименты с 4 пациентами.

Результаты исследований, проведенных в рамках данной работы, использованы в Институте Макса Планка, на базе Клинике Университета Кёльна, для проведения серии клинических экспериментов по суицидальной терапии резидуального заболевания после резекции глиобласто-мы с помощью адено-ассоциированых вирусов, несущих суицидально-визуализационный ген ВПГ-ТК. В ходе 1 Фазы испытаний визуализация [1241]ФИАУ применялась для оценки распространённости трансфекции и уровня экспрессии трансгена у 7 пациентов до начала терапии ганцикловиром.

Визуализация Т-клеток - в непосредственном взаимодействии с клиническими подразделениями МСКОЦ (отделение педиатрии, служба трансплантации костного мозга, отделение гастроэнтерологии, программа рака лёгкого) в ходе обследования пациентов внедрены методы биологической оценки и визуализации эффективности Т-клеточиой противоопухолевой терапии аденокарциномы толстой кишки, немелкоклеточного рака лёгкого и ЭБВ-ассоциированной лимфомы на основе молекулярного анализа.

Результаты, полученные в ходе исследований прямой визуализации, внедрены в создание скрининговой системы, позволяющей в ходе анализа полученных при биопсии или резекции опухолевых тканей, устанавливать чувствительность опухоли к терапии препаратами класса необратимых ингибиторов протеин-киназа ЭГФР.

Подготовлены клинические протоколы для внедрения новых трейсеров: ФЕАУ для репор-терной визуализации ВПГ-ТК и ФБрАУ для «суррогатной» визуализации клеточной пролиферации.

На доклиническом этапе также внедрен широкий диапазон разработок.

Разработанный и охарактеризованный ФЕАУ используется для репортерной визуализации лабораторными подразделениями отделов педиатрии, ядерной медицины, радиологии, радиотерапии, химиотерапии и службы трансплантации костного мозга МСКОЦ, а также отделением экспериментальной радиологии М.Д.Андерсон Онкологического Центра и отделением ТГСК НИИ детской гематологии

Для испытаний противоопухолевых препаратов в отделении фармакологии применяется трансфекция клеток линий, используемых для создания моделей опухолей, генной репортерной системой ХШП-70. В отделении радиотерапии для исследований чувствительности и ответа клеточных линий и эндотелиоцитов на лучевую терапию в культурах тканей и животных моделях используется репортерная система р53. Отделением фармакологии используются радиоме-ченные ингибиторы протеин-киназ для отбора новых терапевтически эффективных препаратов данного семейства с помощью прямой визуализации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Радиомечепные аналога тимидина и циклические аминокислоты, используемые в качестве радиофармпрепаратов, позволяют повысить чувствительность неинвазивной визуализационной оценки локализации и пролиферативпого потенциал опухоли в реальном времени и определение границ опухолевой инфильтрации.

2. Транскрипционно-регулируемые генные репортерные системы можно использовать в качестве инструмента визуализации и контроля передачи сигнала молекулярно-биологических процессов, вовлеченных в онкогенез на субклеточном уровне.

3. Совмещение структурной и функциональной информации позволяет повысить специфичность и чувствительность отдельных методов неинвазивной радиологической и молекулярной визуализации в доклинических исследованиях механизмов развития и лечения экспериментальных моделей опухолей.

4. С помощью неинвазивного молекулярного имиджинга можно определять характер движения и перераспределения цитотоксических Т-лимфоцитов в реальном масштабе времени в течение всего периода их существования в организме реципиента адоптивной иммунотерапии.

5. Метод прямой визуализации позволяет оценивать биологический эффект при разработке противоопухолевых препаратов группы необратимых ингибиторов протеин-киназ.

6. Накопление радиомеченных аналогов тимидина и циклических аминокислот позволяет повысить достоверность диагноза распространенности опухоли и клиническую значимость метода позитро-эмиссионной томографии у пациентов с опухолями головного мозга

7. Иеинвазивпая визуализация генов с двойной репортерно-суицидальной функцией (ВПГ-ТК) позволяет осуществить контроль за распределением вирусного вектора, локализацией и уровнем активации терапевтического гена при генной суицидальной терапии метастазов рака толстой кишки в печень с помощью аденовирусного вектора.

8. Определения показаний к назначению препаратов группы ингибиторов тирозин ки-наз может быть осуществлено при помощи радиомеченных аналогов данных фармацевтических соединений, применяемых для прямой неинвазивной визуализации опухоли в организме в целом.

Место выполнения работы

Экспериментально-теоретическая часть выполнена на базе Мемориал-Слоан-Кеттеринг Онкологического Центра, Нью-Йорк, США. Исследования проводились в отделениях педиатрии, нейроонкологии, трансплантации костного мозга, радиологии, ядерной медицины и терапии. Часть экспериментально-теоретических исследований также проводилась при участии отделения экспериментальной радиологии М.Д.Андерсон Онкологического Центра, отделения гастроэнтерологии Больницы Маунт Синай и программы генетики Университета Нью Джерси, США. В исследованиях использованы материалы совместных разработок с компаниями Авантис и Вион Фармасьютикалс, США.

Клиническая часть работы, включая ретроспективный анализ популяций онкологических и гематологических пациентов и клинические испытания, проводилась на базе отделений педиатрии МСКОЦ и Нью-Йоркской Пресвитерианской Больницы, нейроонкологии и терапии МСКОЦ, а также отделений гастроэнтерологии МСКОЦ и Больницы Маунт Синай, Нью-Йорк, США, и научно-клинического отделов ФГУ ФГНЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, Москва, РФ.

Апробация работы

Материалы и основные положения работы доложены на VI и VIII Всероссийских Конгрессах «Человек и Лекарство» (Москва, 2001 и 2003 гг.), на 47, 49 и 50 Ежегодном съездах Общества Ядерной Медицины (Ст.Луис, 2000, Лос-Анджелес, 2003 и Новый Орлеан, 2004), Съезде по Экспериментальной Биологии Американской Анатомической Ассоциации (Вашингтон, 2004), Совещании Национального Института Неврологии «Визуализационные маркеры Эпи-лептогенеза: Новые Направления Исследований» (Вашингтон, 2004), Высокогорной Конференции по Ядерной Медицине (Вейл, 2003), клинических конференциях Отеления Радиологии Медицинского центра Университета Пенсильвании (Филадельфия, 2003) и Детского Отделения Нью-Йоркской Пресвитерианской Больницы (Нью-Йорк, 2005), научно-практических конференциях сотрудников МСКОЦ и ФНКЦ ДГОИ Росздрава (2001-2005г.).

ВЫВОДЫ:

1. В серии культуральных и доклинических исследований на животных нами была доказана возможность применения ряда новых радиофармпрепаратов групп нуклеозидов (ИУдР и [76Br]-BrFAU) и аминокислот ([18Р]ФАЦБК) в качестве радиологических проб для неинвазивного наблюдения за пролиферативной и метаболической активностью опухоли. При этом преимуществом в специфичности сигнала обладают неметаболизируемые соединения.

2. Генные репортерные системы для непрямой визуализации биологических процессов позволяют проводить количественную радиологическую и оптическую регистрацию репортерного сигнала для неинвазивной визуализации приживления трансплантата костного мозга, апоптоза, опухолевой гипоксии, взаимодействия Т-клеток и опухоли и других процессов, вовлеченных в онкогенез, в реальном масштабе времени.

3. Многофункциональные репортерные генные системы и использование различных методов визуализации позволяют с помощью молекулярного имиджинга мониторировать взаимодействие CD4 и CD8 Т-клеток. Сочетание структурной и функциональной информации повышает разрешающую способность при анализе микрометастазов аденокарциномы по сравнению с индивидуальными методами и обеспечивает достоверность интерпретации результатов визуализации.

4. Визуализация противоопухолевого иммунного ответа в ходе адоптивной Т-клеточной терапии ЭБВ-лимфомы позволило не только мониторировать необходимую дозу клеток и их специфические и неспецифические реакции на опухоль и нормальные ткани организма, но также наблюдать за механизмами действия лимфоцитов и определить необходимость введения повторной дозы ЦТЛ.

5. Методы, основанные на принципе прямой визуализации радиомеченными аналогами ингибиторов протеин-киназ [ 1]АГ иДВ, позволяют оценивать биологический эффект при разработке противоопухолевых препаратов групп ЭГФР и абл-ерк ингибиторов, соответственно.

6. Прямая визуализация с применением радиомеченных ингибиторов ПК позволяет путем биологического анализа клинических образцов опухоли определить чувствительность ХМЛ к терапии иматинибом, и аденокарциномы - к лечению гефитинибом и мониторировать терапию препаратами данной группы.

7. Клинические испытания 1-2 фазы показали возможность использования

1 " 18 [ т]ИУдР и [ Р] ФАЦБК для повышают разрешающую способность «суррогатного метода» молекулярной визуализации с помощью ПЭТ для неинвазивно-го мониторирования пролиферативпых и метаболических характеристик опухо

• о ли по сравнению со стандартными радиофармпрепаратами. [ Р]ФАЦБК имеет преимущество в выявлении инфильтративного роста опухоли. Повышение на

124 т *"* копления [ 1]ИУдР коррелирует с ухудшением выживаемости пациентов.

8. Неипвазивное наблюдение за генной противоопухолевой терапией с помощью гена двойного суицидально-визуализационного применения ВПГ-ТК и его специфичного субстрата [,241]ФИАУ позволяет осуществлять контроль за локализацией и уровнем экспрессии терапевтического гена в метастазах рака толстой кишки в печень

9. Репортерные системы позволяют контролировать процессы иммуно, гемато и опкогенеза и являются основой для дифференциальной терапии.

Практические рекомендации Для повышения точности предхирургической диагностики опухоли и определения терапевтическиих возможностей для опухолей мозга рекомендуется использовать оценку локализации и активности метаболических потребностей опухолей головного мозга с применением ПЭТ с [,8Р]ФАБЦК. По интенсивности накопления радиофармпрепарата можно определять интенсивность метаболизма опухоли и эффективность применения цитостатических препаратов группы антиметаболитов. При необходимости оценку и мониторинг активности пролиферации опухоли следует использовать неинвазивной ПЭТ визуализацию с [1241]ЙУдР или [76Вг]БрФАУ. Для получения оптимального соотношения опухоль/фон нормальных тканей при минимальном распаде радиофармпрепарата оценку изображения обоих нуклеозид-пых радиотрейсеров следует проводить через 4 часа после введения. В качестве клинически применимого метода для радиологической визуализации гена ВПГ-ТК в составе репортерных систем для мониторирования вирусных и бактериальных векторов для противоопухолевой терапии следует использовать [1241]ФИАУ для получения изображений с низкой фоновой активностью и частотой

1 Я наблюдений реже 8 дней. [ Р]ФЕАУ в сочетании с ВПГ-ТК позволяет добиться высокой частоты наблюдений. Выбор радиофармпрепарата должен зависеть от задач исследования.

1311]ФИАУ можно использовать для проведения специфической радиогенной терапии тканей трансфецированных ВПГ-ТК.

В случае необходимости использования репортерных генов человеческого происхождения в исследовательских и клинических протоколах неипвазивную молекулярную визуализацию следует проводить с чНАТ и [*1]МИБГ и/или чПИС и [*Г] (йодидом).

Молекулярный имиджинг обеспечивает контроль за клетками, введенными реципиенту в ходе адоптивной терапии опухолей Т-лимфоцитами, генетически модифицированными для экспрессии ВПГ-ТК. В контроль включена как возможность наблюдения, так и управления клетками за счет суицидального эффекта ганцикло-вира.

Репортерные гены следует использовать для мониторинга трансплантации генетически измененного костного мозга. Они позволяют на ранних этапах неинвазивпо оценить скорость и успешность приживления трансплантата.

Экспериментальное наблюдение за опухолевыми метастазами эффективно, экономно и биологически безопасно проводить, используя оптические визуализирующие системы, не требующие дорогого оборудования и расходных материалов (радиоизотопов)

Использование активационных систем в гипоксичных опухолевых тканях позволит не только специфически оценивать уровень оксигенации тканей, и, соответственно, уровень протекания окислительно-восстановительных реакций, образования про-ангиогенных биологически активных веществ и свободных радикалов, но и специфически влиять на гипоксичные ткани опухолей.

Применение селективной активации генов, вовлеченных в р53-опосредованную регуляцию клетки, позволяет контролировать процессы апоптоза опухоли и противоопухолевых терапевтических лимфоцитов.

Оценка активации ЦТЛ с помощью транскрипционно регулируемой репортерной системы необходима для наблюдения за их противоопухолевым эффектом с одной стороны, и инактивации возможной реакции трансплантат против хозяина, с другой.

Для определения чувствительности к ингибиторам ПК следует использовать метод прямой визуализации активации протеин киназного пути передачи сигнала в опухолевых клетках с помощью радиомеченных ПКИ аналогов.

In vivo мониторинг терапии ингибиторами ПК может успешно осуществляться путем использования прямой ПЭТ визуализации после введения следовых концентраций радиомеченных аналогов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Внедрение новых методов молекулярной неинвазивной визуализации призвано сыграть важную роль в развитии биологически-направленной медицины. В настоящей работе нами предложен широкий диапазон методов, позволяющий осуществить всесторонний подход к изучению физиологии гемопоэтических и опухолевых клеток в живом организме.

Разработка «суррогатной» визуализации была направлена на преодоление недостатков современных стандартных методов визуализации. Для правильного понимания предложенных подходов, необходимо рассмотреть недостатки каждого метода. Наибо

1 Я лее распространенным является ПЭТ визуализация с [ Р]ФДГ. Интерпретация результатов данного исследования основана на концепции кинетического уравнения, описывающего метаболизм радиофармпрепарата. Исходя из двухкамерной модели распределения при необратимом связывании ФДГ, как это происходит в тканях головного мозга, лимитирующей скорость реакцией является транспорт внутрь клетки. Таким образом, визуализация опухолей мозга с ФДГ отражает активность транспортеров глюкозы. Экспрессия данных транспортеров повышается в некоторых опухолевых тканях в ответ на гипоксию и энергетический дефицит. Регуляция экспрессии транспортеров осуществляется широким диапазоном транскрипторных факторов стресса, включая ГИФ-1. Таким образом, визуализация с ФДГ отражает неспецифические стрессорные процессы, протекающие в опухоли. Гетерогенность и непостоянство процессов, протекающих в опухоли, обуславливают трудности с интерпретацией ФДГ сигнала. Эти трудности еще более очевидны для опухолей немозговой локализации, где вступают в действие фосфорилазы, дефосфорелирующие субстрат. Для таких тканей ФДГ-накопление косвенно отражает активность глюко-гексокиназы.

Проведенное нами сравнительное исследование прогностической значимости визуализации с ФДГ доказало субоптимальную достоверность положительного сигнала накопления ФДГ. Вторым биологически обусловленным недостатком данного метода «суррогатной» визуализации является стрессовая природа индукции сигнала. Положительное накопление возможно только в тканях, испытывающих кислородно-метаболическую недостаточность. Периферия опухоли, в особенности зона инфильтра-тивного роста, не находятся в состоянии метаболического стресса, так как адекватно обеспечиваются за счёт кровоснабжения нормальных тканей. Таким образом, опухолевая инфильтрация оказывается невидимой на ФДГ сканограммах, что снижает, в соответствие с полученными нами данными, достоверность предоперационной диагностики с помощью ПЭТ.

Опыт метаболической визуализации опухолей, накопленный ранее, показал преимущества визуализации с помощью аминокислот. Возможность использования в качестве радиофармакологических проб для «суррогатной» визуализации неметаболизируе-мых аминокислот, таких как рассматриваемый нами ФАЦБК, позволяет избежать основных недостатков метаболического имиджинга. Испытания ФАЦБК для ПЭТ визуализации опухолей головного мозга подтвердили специфичность препарата, накапливающегося в опухоли. ПЭТ с ФАЦБК позволил улучшить процесс планирования хирургического удаления опухоли, что имеет особое значение для опухолей мозга, так как полная резекция является ключевым условием достижения полной ремиссии.

В терапии ряда опухолей, таких как астроцитома, помимо точной топической диагностики критическое значение имеет определение стадии и атшшзма опухоли, поскольку тактика лечения различается для опухолей низкой и высокой степени злокачественности. Стандартом проведения подобной диагностики является получение биопта-та опухоли с последующим морфологическим анализом, включающим количество мито-тических ¡слеток, как показатель пролиферативной активности. В клинической практике во многих случаях при планировании лечения астроцитом объем материала доступного для морфологического анализа, ограничен нункционной биопсией. Астроцитомы также часто характеризуются гетерогенностью, при которой тип пролиферации биоптата может не отражать адекватно ситуацию в других частях опухоли. В связи с этим возможность неинвазнвно мониторировать опухолевую пролиферацию, используя ПЭТ с помощью ИУдР, представляет определенные преимущества. Для большинства рассмотренных больных с высокой степенью атипизма опухоли высокая пролиферация коррелировала с активацией гексокиназного пути метаболизма глюкозы. Вместе с тем отмечались участки гетерогенного накопления. ИУдР, который также играл важную роль в дифференциации лресистирующей опухоли и пострадиационных изменений в облученной ткани, так как в результате любой терапии объем «плюс-ткани» может не сокращаться, в то время как большая часть объёмного образования будет представлена некротической тканыо.

Описанное в данной работе использование синтетических радиомечепиых нук-леотидов и циклических аминокислот позволяет косвенно оценивать скорость пролиферации и метаболическую активность опухоли, соответственно. В ряде медицинских центров в мире при проведении «суррогатной» визуализации предпринимаются также попытки использования для пеметаболизируемых аминокислот и нуклеозидов. Проведенные нами клинические испытания принципиально подтверждают возможность подобного подхода. В ходе испытаний были также определены условия, позволяющие добиться оптимального соотношения сигнала к фону, учитывая сочетание факторов биологической стабильности радиопробы- и ее фармакокинстики.

Оба рассмотренных метода « суррогатной» визуализации занимают свою нишу в диагностике опухолей, улучшая ранее описанные методы радиологии.

Внедрение прямой визуализации ИПК является вариантом использования хорошо известного подхода имиджинга с использованием радиомеченных лекарственных препаратов. Особую клиническую значимость данный метод приобретает с быстрым прогрессирующим развитием специфических ПК ингибиторов как класса противоопухолевых препаратов. Учитывая их специфичность, единственное, что может обеспечить повышение эффективности терапии ИПК, является точная и адекватная диагностика опухолей и определение индивидуальной чувствительности опухолей к ИПК. Использование прямой визуализации позволило нам не только проводить отбор пациентов или подбор индивидуальной терапии для отдельно взятого больного, но и мониторировать процесс терапии, определяя ответ опухоли. Прямая визуализация аналогами ИПК может иметь также важную роль в диагностике опухолей, резистентных к лечению определенным типом ИПК, которые могут оказаться чувствительными к другим препаратам данной группы, как это было показано ранее.

В основе дальнейшего прогресса специфической биологической противоопухолевой терапии лежит более полное понимание путей передачи биологических сигналов, вовлеченных в опкогенез. Использование регулируемых генных репортерных систем обеспечивает универсальный подход к моииторированшо активации отдельных механизмов злокачественной трансформации. Исследование упомянутых механизмов, включая рассмотренные в данной работе ГИФ, р53, ХШП и пр., позволяет, как разработать новые специфические подходы к блокированию данных путей, так и использовать их активацию в опухолевых клетках для положительной регуляции противоопухолевых терапевтических подходов. Транскрипторно активируемые терапевтические гены позволяют либо доставить специфическую терапию в клетку, экспрессирующую активированную систему, либо скорректировать экспрессию гена.

Другой областью, где находят широкое применение методы молекулярной визуализации, является противоопухолевый иммунитет. Наблюдение за лимфоцитами позволило не только определить оптимальное сочетание и дозу различных компонентов противоопухолевого ответа, но и наблюдать за распределением лимфоцитов в организме. Наблюдение за лимфоцитами позволяет заранее прогнозировать развитие нежелательных реакций с участием трансплантированных генетически модифицированных лимфоцитов, а также, при необходимости, устранять их, используя суицидальные свойства таких репортерпых систем, как ВПГ-ТК/ганцикловир или вновь разработанных нами чНАТ/метайодобензилгуанидип. Подобные генетические модификации трансплантируемых лимфоцитов уже давно внедрены в клиническую практику. Таким образом, разработанный нами метод визуализации дополнит и расширит диапазон клинических возможностей.

Трансплантация генетически модифицированного костного мозга внедряется в клинику как для коррекции генетических дефектов кроветворения (талассемии, СКИД и т.п.), так и с целью возможной профилактики РТПХ. Добавление возможностей визуализации обеспечивает как контроль приживления трансплантата, так и возможность длительного наблюдения за развитием клеток, происходящих из трансплантированного костного мозга.

Развитие молекулярной визуализации обогащает арсенал средств клинической и базовой науки, изучающей развитие опухолей и ответ организма на опухолевый процесс.

Исследования, представленные в дайной работе, объединены общей идеей создания возможности доступной зрительному восприятию и приборному измерению качественной и количественной оценки биологических процессов в организме пациента и лабораторных условиях путем сочетания клинических, радиологических и оптических лабораторных методов визуализации. Широта спектра исследований не случайна. Она отражает развитие всех направлений молекулярной визуализации, позволяющих иметь арсенал научных инструментов для выбора одного или сочетания наиболее соответствующих целям и задачам терапевтического вмешательства или исследования.

Возможности, предоставляемые молекулярной визуализацией, охватывают все аспекты гематологии-онкологии от оценки развития костного мозга до формирования опухоли и развития противоопухолевого иммунного ответа. Гибкость разрабатываемых репортерных систем позволяет создавать модификации, специфические для изучаемого объекта или лечебного протокола. Также существует возможность выбора визуализирующей методики в зависимости от технического оснащения клиники или научного института. Экономическая эффективность исследований варьирует от ресурсоёмкого синтеза эмиттеров позитронов до экономичных гамма изотопов (99мТс). Таким образом, внедрение технологии молекулярной визуализации доступно и уже происходит во многих лечебных и научных центрах.

Учитывая непосредственную направленность описываемого комплекса исследований на разработку клинически применимых методов изучения онкогенеза, молекулярный имиджинг приобретает особую социальную значимость. Визуализирующие методы, позволяя достичь раннего выявления пациентов с первичными и рецидивирующими новообразованиями, провести выделение групп пациентов, чувствительных к определенным видам терапии, наблюдать за ходом лечения, помогут снизить стоимость, сократить продолжительность и повысить эффективность лечения. Подобный подход может повысить экономическую эффективность лечения онкологических пациентов.