Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Специфическая адаптивная клеточная иммунотерапия онкогематологических заболеваний и инфекций иммунной системы

Актуальность проблемы.

Данные исследований последних лет показали, что развитие оикогематологических. иммунологических и вирусных заболеваний, как правило, коррелирует со снижением иммунного клеточного ответа на чужеродные антигены [Lucas К. 1996 Collins RH. 1997]. Эффективность лечения этих заболеваний ограничена, с одной стороны, резистентностью опухоли или вируса к проводимой терапии, а, с другой стороны, невозможностью эскалации терапевтических доз в связи с риском развития системной токсичности по отношению к здоровым органам и тканям [Koid HJ, 1990]. Поиск высокоспецифичных биологических методов лечения, базирующихся на естественных механизмах распознавания и удаления чужеродного агента без повреждения здоровых тканей организма, привел к разработке методов адоптивной клеточной иммунотерапии, основанной на введении в организм больного аутологичных или аллогенных клеток иммунной системы, способных специфически распознавать и убивать вирус-инфицированные или опухолевые клетки.

Основы развития адоптивной клеточной иммунотерапии были заложены на стыке иммунологии, гематологии, онкологии, и вирусологии [Walter ЕА. 1995]. В частности, терапевтический эффект пересадки аллогенных стволовых клеток костного мозга при лечении гемобластозов связывали не только с циторедуктивным действием химиотерапии и общего облучения, но также и с дополнительным иммунологическим воздействием Т лимфоцитов донора стволовых клеток. Позже была доказана корреляции между частотой развития РТПХ и сниженным риском развития рецидивов лейкемии после пересадки костного мозга что позволило предположить, что Т лимфоциты, отвечающие за развитие РТПХ. могут являться также медиаторами противолейкемического эффекта, так называемого эффекта «трансплантат-против-лейкемии» (ТПЛ). Подтверждением этой гипотезы являлось повышение частоты развития рецидивов лейкозов при проведении аллогенной трансплантации костного мозга с деплецией зрелых Т лимфоцитов донора [Goldman JM. 1988: Apperley JF.I988]. Более того, было показано, что введение мононуклеарных клеток периферической крови. полученных от донора стволовых клеток, при рецидивах XMJ1 после ТКМ может приводить к гематологической и цитогенетической ремиссии в 70-80% случаев [Kolb HJ. 1990]. В дальнейшем острая необходимость проведения специфической иммунотерапии возникла в результате выявления ЭБВ-ассоциированных лимфопролиферативных заболеваний (ЭБВ-ЛПЗ) у больных с иммунодефицитами различной природы (в том числе после химиолучевой терапии злокачественных новообразований и длительной иммуносуппрессии после пересадки органов и тканей) в корреляции с низким уровнем предшественников ЭБВ-специфичных Т лимфоцитов в крови пациентов [Heslop Н. 1996. Rooney С. 1998]. Введение неселектированных донорских лейкоцитов для лечения ЭБВ. так же как и для лечения ХМЛ. приводило к регрессии опухоли и коррелировало с повышением предшественников антиген-специфичных Т лимфоцитов [O'Reilly RJ. 1997]. демонстрируя, таким образом, перспективность применения адоптивной клеточной иммунотерапии в лечении опухолевых и вирусных заболеваний. Однако, в связи с высоким риском развития РТПХ в результате аллогенного ответа вводимых неселектированных Т лимфоцитов [Mackinnon S. 1995] представляется важным использовать этот подход в направлении поиска биологических мишеней для антиген-специфичного Т клеточного ответа и развития методик экстракорпоральной антиген-специфической стимуляции Т лимфоцитов, позволяющих обогащать вводимую Т клеточную популяцию эффекторными клетками, способными оказывать дифференцированное цитотоксическое воздействие на опухолевые и пораженные вирусом клетки организма, не повреждая при этом здоровые ткани.

Несмотря на корреляцию между частотой развития РТПХ и достижением ремиссии у больных с лейкозами после проведения иммунотерапии неселектированными лейкоцитами донора, исчезновение лейкемических клеток также отмечалось и у больных, не развивающих симптомов РТПХ. что позволило предположить, что ТПЛ и РТПХ не всегда вызываются теми же эффекторными клетками. Проведенные за последние годы исследования позволили выявить целый ряд антигенов, специфически представленных на опухолевых и вирус-пораженных клетках и не экспрессирующихся в достаточном количестве в здоровых тканях организма [Riddell SR, 1991: Kern F. 1999; Ohminami H. 2000]. В результате этого стало возможно разрабатывать методы антиген-специфичной Т клеточной терапии таких заболеваний как ОМЛ. ОЛЛ. ХМЛ, раки толстого кишечника, простаты, яичников. легких. мезотелиомные опухоли. рабдомиосаркомы. десмопластические мелко-круглоклеточные опухоли, опухоль Вильмса, неходжкинские лимфомы. первичные лимфомы головного мозга, а также таких жизнеугрожающих осложнений высокодозной химиотерапии и длительной иммуносуппрессии как ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ [Small Т. 1999].

Исключительно важное значение приобретают данные о том. что эффективность адоптивной клеточной иммунотерапии зависит не только от функциональной активности эффекторных клеток, но и от восприимчивости опухолевых или вирус-инфицированных клеток к их цитотоксическому действию [Knutson К. 2006]. Способность таких аномальных клеток избегать контроля со стороны клеточного звена иммунитета путем изменения своих функционально-морфологических характеристик зачастую приводит к развитию злокачественных заболеваний у иммунокомпетентиых больных [Falkenberg F. 2000]. В связи с этим чрезвычайно актуальным является проведение исследований, направленных на изучение механизмов противовирусного и противоопухолевого клеточного иммунного ответа с целью выявления причин его несостоятельности и разработки методов ее коррекции [Speiser D. 2005]. Проводимые в настоящее время доклинические и клинические испытания безопасности и эффективности адоптивной клеточной иммунотерапии позволяют разработать оптимальный дозо-временной режим проведения такого метода иммунокоррекции для лечения злокачественных и вирусных заболеваний у онкогематологических и иммунологических больных.

Таким образом, адоптивная специфическая клеточная иммунотерапия представляет собой новый прогрессивный и перспективный подход в лечении широкого спектра онкогематологических. иммунных и вирусных заболеваний. позволяющий осуществлять направленное удаление пораженных клеток из организма без повреждения здоровых органов и тканей. Разработка, изучение и внедрение в клиническую практику данного метода лечения является актуальной проблемой, так как его применение способно расширить терапевтические возможности современной медицины в лечении онкогематологических и вирусных заболеваний и повысить эффективность существующих в настоящее время методов лечения этого спектра заболеваний.

Лель исследования.

Обосновать, разработать и внедрить в клиническую практику методы направленной специфической иммунокоррекции клеточного звена противоопухолевого и противовирусного иммунитета для проведения антиген-специфичной биологической терапии онкогематологических, иммунных и вирусных заболеваний

Задачи:

1. Обосновать необходимость дифференцированного использования различных видов антиген-лрезентируюших клеток для направленной экстракорпоральной стимуляции антиген-специфических Т лимфоцитов.

2. Разработать методы селекции Т лимфоцитов для получения популяции эффекторных клеток путем экстракорпоральной антиген-специфичной стимуляции с целью последующего их использования при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии опухолевых и вирусных заболеваний без риска развития РТПХ.

3. Разработать и внедрить в практику методику идентификации новых иммуногенных вирус- или опухолеспецифичных лигандов, позволяющую проводить антиген-специфичную клеточную иммунотерапию широкому спектру больных вне зависимости от их НЬА типа.

4. Изучить факторы Т клеточного ответа, влияющие на эффективность адоптивной клеточной иммунотерапии.

5. Разработать и внедрить в практику методику экстракорпоральной активации аутологичных ЫК клеток, специфичных к опухолевому лиганду М1СА/В. для проведения НЬА-независимой аутологичной адоптивной клеточной иммунотерапии опухолей эпителиального происхождения, не экспресснрующих на своей поверхности Н1А молекулы.

6. Изучить особенности антиген-специфичного Т клеточного ответа, развивающегося у больных после ТКМ в зависимости от интенсивности подготовительного режима циторедукции с целью выявления способности Т клеток донора узнавать опухолевые и вирусные антигены в контексте НЬА типа донора и больного.

7. Исследовать терапевтическую эффективность и безопасность адоптивной клеточной иммунотерапии у больных с онкогематологическими заболеваниями, ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ.

8. Определить прогностические факторы эффективности противоопухолевой терапии -специфичными Т клетками

9. Изучить особенности противоопухолевого клеточного иммунного ответа у онкологических и онкогематологических больных и возможности проведения адоптивной противоопухолевой иммунотерапии аутологичными эффекторными клетками, полученными в результате экстракорпоральной активации.

Научная новизна

Адоптивная иммунотерапия в данной работе представлена составной частью комбинированного лечения больных с онкогематологическими. иммунными и вирусными заболеваниями. Для проведения адоптивной иммунотерапии разработаны эффективные методики специфической экстракорпоральной стимуляции эффекторных клеток, применимые в клинической практике, изучены механизмы их действия, разработаны дозово-временные режимы проведения адоптивной клеточной иммунотерапии и особенности антиген-специфичного клеточного иммунного ответа у групп больных с онкогематологическими. иммунными и вирусными заболеваниями для разработки показаний и наиболее эффективных режимов лечения.

8 связи с этим в данной работе впервые. Обоснована необходимость дифференцированного использования различных видов антиген-презентирующих клеток, которые избирательно экспрессируют требуемый антиген в контексте требуемого HLA аллеля/аллелей на основании комбинированного анализа типа химеризма. развивающегося у больных после трансплантации костного мозга с различными режимами кондиционирования, определения доминантного антигенного эпитопа и рестриктирующего доминантного HLA аллеля цитотоксических антиген-специфичных Т клеток.

Разработана методика избирательной управляемой экстракорпоральной стимуляции антиген-специфичных Т лимфоцитов, позволяющая получить цитотоксические Т лимфоциты, специфичные к субдоминантным эпитопам. таким как LMPI и WT1. для лечения ЭБВ-ЛПЗ и лейкемий соответственно. Показано, что цитотоксические Т лимфоциты, полученные путем избирательной управляемой экстракорпоральной стимуляции опухолевым или вирусным антигеном, обладают специфической противоопухолевой цитотоксичностью в лабораторных условиях и позволяют подавлять рост опухоли в экспериментальной модели адоптивной клеточной иммунотерапии лейкозов и ЭБВ лимфом в условиях живого организма без риска развития РТПХ. Опухолеспецифические Т лимфоциты, полученные путем антиген-специфической управляемой экстракорпоральной стимуляции, не оказывают побочного воздействия на здоровые гемопоэтические клетки костного мозга и пуповинной крови.

Разработаны методы ранней селекции Т лимфоцитов с помощью деплеции NK клеток и избирательной трансдукции ретровирусным вектором, позволяющие получать в короткие сроки ЦТЛ, обладающие высокой антиген-специфичностью и низкой аллореактивностью. Разработана эффективная методика идентификации новых иммуногенных вирус- и опухолеспецифичных эпитопов-мишеней индивидуально для Т клеток конкретного донора с помощью перекрывающихся пентадекапептидов. кодирующих полную последовательность антигенного белка. Такая методика позволяет проводить антиген-специфичную противоопухолевую Т клеточную терапию онкогематологическим больным вне зависимости от их HLA типа.

В условиях живого организма показана корреляция между специфическим противоопухолевым ответом адоптивно введенных ЭБВ специфичных ЦТЛ и их специфической миграцией, инфильтрацией и персистенцией. наблюдаемых в области специфической опухоли-мишени при динамической прижизненной визуализации Т клеток.

Выявлено, что направление миграции ЭБВ специфичных Т клеток в аутологичную ЭБВ-ассоциированную опухоль определяется экспрессией в опухоли специфического антигена ЭБВ и иммунодоминантного рестриктирующего HLA аллеля. С помощью неинвазивного длительного повторного мониторинга введенных ЦТЛ описаны факторы, такие как экспрессия специфического антигена, доминантного HLA аллеля. CCR7 и LFAI молекул, которые влияют на длительность циркуляции антиген-специфичных Т лимфоцитов, направленность их миграции в опухоль-мишень и эффективность противоопухолевого ответа. Снижение экспрессии одного из этих факторов предотвращает специфическую инфильтрацию опухоли цитотоксическими Т лимфоцитами и снижает эффективность проводимой адоптивной клеточной иммунотерапии. Впервые была изучена динамическая роль CD4+ и CD8" субпопуляций Т клеток в противоопухолевом ответе на модели адоптивной иммунотерапии. продемонстрировав предпочтительность использования поликлональной популяции Т клеток, содержащей как CD8*. так и CD4+ Т лимфоциты, необходимые для их сочетанного действия, позволяющего повысить эффективность проводимого лечения.

С помощью неинвазивной визуализации определена эффективная терапевтическая доза ЭБВ-специфичных Т клеток, составившая 4400 клеток на 1см3 опухолевой массы.

Разработана методика активации аутологичных клинически применимых НК клеток больных с аденокарциномой толстого кишечника, способных проявлять цитотоксическую специфическую активность против опухолевых клеток больного в лабораторных условиях и в экспериментальной модели адоптивной иммунотерапии рака толстого кишечника, для иммунотерапии опухолей эпителиального происхождения со сниженной экспрессией молекул HLA 1 класса и повышенной экспрессией NKG2D лиганда (MICA). Продемонстрирована корреляция между типом химеризма, развивающимся у пациентов после пересадки костного мозга, мнелоаблативным режимом и типом HLA рестрикции антиген-специфичных Т клеток донора, развивающихся в микроокружении организма реципиента.

Показано, что доминантные рестриктирующие HLA аллели Т клеток донора, развивающихся в организме реципиента стволовых клеток костного мозга, могут отличаться от доминантных рестриктирующих элементов основного комплекса гистосовместамости Т клеток той же генетической природы, развивающихся в организме самого донора, и являются общими для HLA типа как донора, так и больного при их неполной тканевой совместимости.

Проведенное клиническое исследование по изучению клинической эффективности ЭБВ специфичных и ЦМВ специфичных Т клеток при лечении ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ у иммунокомпрометированных больных после пересадки органов и тканей продемонстрировало терапевтическую эффективность этого метода лечения и приводило к ремиссии заболевания у 76% больных с ЭБВ-ЛПЗ и не вызывало побочных эффектов и признаков РТПХ в 100% случаев. Разработаны прогностические факторы течения заболевания и эффективности адоптивной клеточной иммунотерапии для больных с опухолями, экспрессирующими WTI антиген.

Внутриклеточная экспрессия WTI белка в более чем 20% клеток-мишеней была определена как благоприятный прогностический фактор эффективности ответа антиген-экспрессирующей опухоли на специфическую клеточную иммунотерапию WT1 специфичными Т клетками.

• Описан механизм устойчивости аденокарциномы толстого кишечника к лизису NK клетками, основанный на снижении поверхностной экспрессии их активирующего рецептора NKG2D за счет его интернализации под действием высоких концентраций растворимого лиганда этого рецептора. MICA, секретируемого опухолью

• Продемонстрирована возможность получения аутологичных WT1-специфичных Т лимфоцитов, обладающих противоопухолевой активностью, у больных с WT1-позитивной опухолью для проведения противоопухолевой иммунотерапии.

Научно-практическое значение.

Разработанные виды антигеп-презептирующих клеток позволили создать универсальный банк различных АПК, экспрессирующих один или несколько наиболее распространенных HLA аллелей и заблаговременно прошедших все необходимые тесты. Наличие такого банка АПК дает возможность при первой необходимости использовать эти клетки для производства клинически применимых эффекторных клеток адоптивной иммунотерапии, таким образом экономя время и средства, затрачиваемые для получения конечного продукта. Кроме того, такие АПК могут, путем соответствующей генной модификации. селективно представлять низкоиммуногенные опухолевые или вирусные эпитопы, такие как LMP1. которые зачастую являются единственными потенциальными мишенями для ЦТЛ (например, при ЭБВ* Ходжкинской лимфоме. ЭБВ' леомиосаркоме. ЭБВ" назофаренгиальной карциноме), но в силу своей низкой иммуногенности могут вызывать Т клеточный ответ только в случае обеспечения им преимущественной экспрессии на АПК. Дифференциальное использование различных АПК позволяет также проводить направленную стимуляцию Т лимфоцитов с заданной HLA рестрикцией и эпитоп-специфичностью в зависимости от вида патологии. степени гистосовместимости донора и реципиента и запланированных сроков проведения клеточной иммунокоррекции.

Выбор иммуногенных эпитопов для экстракорпоральной стимуляции опухоле- или вирусспецифических Т клеток проводился до настоящего времени, как правило, с помощью компьютеризированной системы прогнозирования вероятности связывания и скорости диссоциации той или иной аминокислотной последовательности в отношении наиболее распространенных НЬА аллелей. Метод идентификации новых опухоле- ми вирусспецифических эпитопов с помощью пулирования перекрывающихся пентадекапептидов, кодирующих полную белковую последовательность выбранного антигена позволяет выявить индивидуальный иммунодоминантный эпитоп для Т клеток любого донора вне зависимости от его НЬА типа. Благодаря такому подходу предоставляется возможность синтезировать противоопухолевые или противовирусные ЦТЛ не только для реципиентов, экспрессирующих наиболее распространенные НЬА аллели, но и для большой группы больных, имеющих более редкий тип НЬА. Кроме того, наши исследования показали, что определяемые с помощью пулированных пентадекапептидов эпитопы часто являются более значимыми с точки зрения противоопухолевого ответа эффекторных клеток, чем последовательности, выбранные на основании компьютерного алгоритма.

Разработанный метод экстракорпоральной стимуляции антиген-специфических ЦТЛ после предварительной селекции Т лимфоцитов позволяет на ранних этапах культивирования обогащать Т клеточную популяцию антиген-специфичными эффекторными клетками путем негативной селекции неспецифических аллореактивных лимфоцитов. Благодаря такому подходу предоставляется возможность в короткие сроки производить необходимое количество противоопухолевых или противовирусных ЦТЛ для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии без риска развития РТПХ. Сокращение сроков получения таких ЦТЛ критически необходимо при лечении больных с ЦМВ в раннем постгрансплантационном периоде и с фульминантными формами ЭБВ-ЛПЗ, приводящими к летальному исходу в течении 21 дня в отсутствии специфической терапии. Кроме того, деплеция аллореактивных Т лимфоцитов необходима для проведения адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ аллогенными Т клетками больным с длительной иммуносуппрессией после пересадки органов экстрамедулярной локализации, при которой с одной стороны сохраняется собственная гемопоэтнческая система реципиента . а с другой стороны присутствует трансплантат второго донора. Таким образом, при проведении адоптивной клеточной иммунотерапии Т лимфоцитами, содержащими аллореактивную популяцию, повышается риск не только РТПХ, но и отторжения пересаженного органа. Предотвратить подобные осложнения можно путем изначальной деплеции аллореактивных Т клеток, предложенной в данном исследовании.

Проведенные исследования по мониторированию миграции, персистенции и пролиферации адоптивно введенных Т и NK клеток в условиях живого организма позволяют рассчитать дозу и режим введения клеточных препаратов, а также дополнительно использовать компоненты, повышающие экспрессию ключевых молекул взаимодействия эффекторных клеток с их специфическими мишенями. Кроме того, понимание роли различных субпопуляций Т клеток в противоопухолевом ответе способствует разработке критериев качественного контроля вводимых больному ЦТЛ и методов их экстракорпоральной активации.

Идентификация на опухолевых клетках эпителиального происхождения специфического лиганда (MICA), вступающего во взаимодействие с активирующим рецептором на NK клетках (NKG2D), а также описание механизмов их ингибирования позволило разработать адоптивную клеточную терапию с помощью активированных NK клеток для опухолей, не экспрессирующих HLA I и II класса и. соответственно, резистентных к цитотоксическому действию Т клеток.

Изучение типа ЭБВ-специфичного Т клеточного ответа у больных после ТКМ с различными режимами кондиционирования выявило ожидаемый тип рестрикции антиген-специфических ЦТЛ. развивающихся в организме больного. Этот тип рестрикции зависел от химеризма циркулирующих антиген-презентирующих клеток. Полученные данные могут с высокой вероятностью использоваться при планировании профилактической адоптивной клеточной иммунотерапии, выборе донора Т клеток и необходимости дифференцированного применения различных видов АПК при экстракорпоральной стимуляции клеток-эффекторов для получения ЦТЛ, способных распознавать клетки-мишени генетической природы донора или реципиента в контексте соответствующих HLA аллелей.

Проведенные клинические исследования адоптивной иммунотерапии ЭБВ-ЛПЗ продемонстрировали эффективность и безопасность этого метода лечения для различных групп больных, включая пациентов после пересадки костного мозга и органов. Изученные случаи резистентности к терапии ЦТЛ способствовали выявлению факторов, отрицательно влияющих на терапевтический эффект ЦТЛ, что позволит проводить их коррекцию в будущем.

Проведенная в данном исследовании характеристика групп онкологических и онкогематологических больных в зависимости от уровня экспрессии \УТ1 и различных ко-стимуляторных молекул позволила разработать прогностические критерии чувствительности к Т клеточной терапии этих патологий для набора групп пациентов при проведении клинических исследований по изучению эффективности и безопасности лечения \\'Т1 -реактивными ЦТЛ.

Благодаря проведенным исследованиям по выращиванию противоопухолевых Т клеток из образцов МКПК больных с опухолями, экспрессирующими \УТ1, представляется возможным проводить лечение таких пациентов аутологичными Т клетками, которые могут циркулировать в организме дольше чем аллогенные ЦТЛ, и обеспечивать более длительную противоопухолевую защиту, и. одновременно, не создают риск развития РТПХ.

Внедрение в практику:

Разработанный метод определения частоты предшественников антиген-специфических Т клеток с помощью измерения уровня продукции 1Жу широко применяется для характеристики интенсивности специфического ответа различных Т клеточных популяций как на этапах разработки новых подходов к клеточной иммунотерапии, так и для оценки Т клеточного ответа у больных, получающих адоптивную терапию по поводу ЭБВ-ЛПЗ и ЦМВ в МСКОЦ и Пресвитерианском Нью-Йоркском Госпитале .

Метод стимуляции пулом перекрещивающихся пентадекапептидов применятся в лаборатории АКИТ МСКОЦ для определения типа антигенного ответа отдельного взятого донора и его характеристики.

Стадию клинического внедрения прошли ряд методов, разработанных в ходе описанных ниже исследований:

Клинические испытания адоптивной клеточной иммунотерапии с применением Т клеток, полученных из фракционированных МКПК путем экстракорпоральной активации аутологичными В-ЛКЛ при лечении больных с ЭБВ-ЛПЗ после ТКМ и пересадки органов проводится на базе МСКОЦ. На данный момент ЭБВ-специфичные Т клетки были введены 25 больным с клинико-морфологическими и лабораторными признаками ЭБВ-ЛПЗ.

Адоптивная терапия ЦМВ специфичными Т клетками, полученными путем экстракорпоральной стимуляции Т лимфоцитов пулом пентадекапептидов. кодирующих полную последовательность рр65 -иммуногенного белка ЦМВ проводилась в рамках ограниченных клинических испытаний 4 больным после пересадки костного мозга на базе МСКОЦ и Пресвитерианского Госпиталя в Нью-Йорка. Результаты, полученные в ходе данных исследований, легли в основу клинического протокола, подготовленного и одобренного для лечения аналогичной группы больных на базе МСКОЦ.

Результаты исследований по анализу НЬА рестрикции Т клеток донора, развивающихся в микроокружении организма реципиента после гаплотип-идентичной пересадки костного мозга, проведенные на группе из 22 больных на базе МСКОЦ были использованы для разработки клинического протокола по применению искусственных антиген-презентирующих клеток для экстракорпоральной активации опухоле- и вирус-специфических Т клеток, одобренного к клиническому применению в МСКОЦ.

Разработанная система генетической модификации антиген-специфичных Т клеток путем внедрения ретровирусного вектора, кодирующего тимидин киназу вируса герпеса в качестве «суицидального», визуализирующего и «селектирующего» маркера на образцах от 30 доноров, позволила внедрить методы ускоренной селекции и размножения антиген-специфичных Т клеток для лечения больных с фульминантной формой ЭБВ-ЛПЗ. На основании проведенных исследований совместно со службой молекулярной визуализации МСКОЦ внедрены методы биологической оценки и визуализации эффективности Т клеточной терапии путем неинвазивного мониторирования адоптивно введенных Т клеток при лечении

ЭБВ-ЛПЗ. рака толстого кишечника, рака яичников. ОМЛ. и ОЛЛ на основе молекулярного анализа.

Данные, полученные в ходе динамического наблюдения за миграцией и персистенцией адоптивно введенных компонентов Т клеточной терапии, положены в основу доз и режимов клинических протоколов адоптивной клеточной иммунотерапии, проводимой на базе МСКОЦ и Уэйльского Корнельского Университета.

Благодаря данным, полученным в ходе исследований факторов, необходимых для взаимодействия эффекторных клеток с клетками-мишенями. разработана система повышения экспрессии ключевых молекул этого процесса, которая применяется при оценке опухолеспецифической цитотоксичности ЦТЛ к клеткам рака яичника, рака толстого кишечника, раб дом иосарком ы.

На основании результатов исследований по экстракорпоральной активации WT1-специфичных Т лимфоцитов и изучению механизмов их действия были подготовлены и одобрены к применению клинические протоколы 1-2 фазы по лечению ОМЛ. ОЛЛ. ХМЛ. и рака яичников на базе МСКОЦ и Пресвитерианского Нью-Йоркского Госпиталя.

Результаты, полученные в ходе оценки прогностической значимости фенотипической характеристики злокачественных клеток в отношении эффективности адоптивной иммунотерапии и прогноза заболевания были внедрены в создание скрининговой системы, позволяющей в ходе анализа полученных при заборе образцов тканей и клеток устанавливать чувствительность опухоли к цитотоксическому воздействию Т клеток, вероятность их миграции и персистенции в опухоли, а также степень опухолевой активности по подавлению их действия и прогноз течения заболевания в целом.

Благодаря проведенным исследованиям по изучению механизмов ингибирования активности NK клеток у больных с раком эпителиального происхождения разработана и внедрена в практику методика активации NK клеток для проведения адоптивной иммунотерапии опухолей со сниженной экспрессией HLA молекул I класса с одновременным блокированием растворимой формы MICA.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Дифференцированное использование антигенпрезентирующих клеток позволяет осуществлять направленную экстракорпоральную активацию антиген-специфических Т клеток с управляемой рестрикцией по заданному НЬА аллелю с целью их последующего использования для проведения адоптивной клеточной иммунотерапии опухолевых и вирусных заболеваний.

2. Трансдукция антиген-специфичных Т лимфоцитов ретровирусным вектором, кодирующим тимидинкиназу вируса простого герпеса, осуществленная после специфической антигенной экстракорпоральной стимуляции на ранних сроках культивирования обеспечивает быструю селекцию высокоспецифичных ЦТЛ, не имеющих аллореактивности против здоровых тканей больного, и контролируемых при введении пациентам с помощью «суицидальной» функции данного вектора.

3. Неинвазивное мониторирование адоптивно введенных иммунных клеток позволяет изучить механизм и динамику клеточного ответа при проведении клеточной иммунотерапии, коррегировать ее дозово-временной режим в масштабе реального времени и изучать и коррегировать факторы опухолевой резистентности и функциональные особенности вводимых клеточных субпопуляций, снижающие эффективность проводимого лечения.

4. Экстракорпоральная активация Т клеток пулом перекрещивающихся по аминокислотным последовательностям пентадекапептидов дает возможность идентифицировать новые наиболее иммуногенные эпитопы, имеющие наибольшее функциональное значение в противовирусном и противоопухолевом Т клеточном ответе каждого отдельно взятого донора, для проведения более эффективной адоптивной клеточной иммунотерапии этих заболеваний у широкого спектра больных вне зависимости от их НЬА типа.

5. Активация аутологичных ЫК клеток больных с опухолями эпителиального происхождения путем блокирования подавляющих их активность растворимых молекул, выявленных в данном исследовании. предоставляет эффективный инструмент направленной клеточной иммунокоррекции для лечения опухолей со сниженной экспрессией НЬА молекул 1 класса и. следовательно, резистентных к НЬА-зависимоЙ Т клеточной противоопухолевой цитотоксичности.

6. Изучение типов НЬА рестрикции и доминантных эпитопов ЭБВ-специфического Т клеточного ответа, формирующегося у больных после ТКМ на фоне различных видов химеризма и выявляемого для Т клеток той же генетической природы, развивающихся в организме донора. подтверждает необходимость применения разработанного выше метода экстракорпоральной стимуляции Т клеток с управляемой рестрикцией по заданному НЬА аллелю и антигенному эпитопу.

7. Адоптивная Т клеточная терапия ЭБВ-ЛПЗ является эффективным и безопасным методом направленной иммунокоррекции для лечения этих состояний у больных с длительными иммуносуппрессивными состояниями после пересадки костного мозга и органов.

8. Экстракорпоральная активация Т лимфоцитов с помощью пула перекрещивающихся пентадекапептидов. кодирующих полную последовательность белка рр65. позволяет проводить эффективную иммунотерапию тяжелых форм ЦМВ инфекции, развивающейся у больных после ТКМ и резистентной к терапии ганцикловиром.

9. Фенотипический анализ опухолевых клеток, характеризующий экспрессию опухолеспецифического антигена \УТ1 и ко-стимуляторных молекул, необходимых для эффективного взаимодействия ЦГЛ с клетками-мишенями, позволяет прогнозировать терапевтическую эффективность планируемой клеточной иммунокоррекции и течение заболевания в целом.

10. Выявление WT1 специфичных Т лимфоцитов в крови онкологических больных с новообразованиями, экспрессирующими белок-онкоген WT1. делает возможным проведение опухолеспецифической адоптивной клеточной иммунотерапии у этой группы больных с использованием аутологичных Т клеток, активированных экстракорпорально.

11. Характеристика NK-клеточного ответа у больных с опухолями эпителиального происхождения, экспрессирующими MICA/B, и определение уровня растворимого MICA может являться показанием к проведению терапии активированными аутологичными NK клетками в сочетании с антителами, связывающими MICA молекулу.

Место выполнения работы.

Экспериментально-теоретическая часть выполнена на базе Мемориал Слоан-Кетгеринг Онкологического Центра, Нью-Йорк. США. Исследования проводились в отделениях педиатрии, гинекологии, гастроэнтерологии, трансплантации костного мозга, радиологии, ядерной медицины и терапии.

Клиническая часть работы, включая ретроспективный анализ популяций онкологических и гематологических пациентов и клинические испытания, проводилась на базе отделений педиатрии МСКОЦ Пресвитерианского Нью-Йоркского госпиталя и Корнельского Университета, отделений гинекологии, гастроэнтерологии, трансплантации костного мозга и терапии МСКОЦ. и научно-клинического отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава. Москва. РФ.

Апробация работы

Материалы и основные положения работы доложены на VI. VII и VIII Всероссийских Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва. 2000. 2001. 2002 и 2003гг.). на ежегодных конференциях Американского Общества

Гематологов (Майами. 1998; Сан-Франциско. 2000; Филадельфия. 2001. 2002. 2003), Американского общества детских гематологов/онкологов (Чикаго. 1998). Международного общества гематологов (Амстердам. 1998). Сероно симпозиум (США, 1999). Международного общества клеточной терапии (Сан-Диего. 2000; Барселона. 2002), Американского общества Трансплантации костного мозга (Майами. 2002; Колорадо. 2003; Орландо. 2004; Колорадо. 2005; Гонолулу. 2006). Общества Ядерной Медицины (Орландо. 2002; Новый Орлеан. 2003); Общества Молекулярной Визуализации (Сан-Франциско. 2003).

ВЫВОДЫ

1. Дифференцированное использование аутазогнчпых ЭБВ-В-ЛКЛ, аллогетиаи гомозиготных ЭБВ-В-ЛКЛ и H ЛПК, итбиразелыю зкспрессирующих предопределенные антигенные эпитопы и №~А адледи, совместимые е общими HLA аллелями донора Т клеток и реципиента, позволяет в короткие сроки получать от KLA неполностью совместимых доноров Т клетки с задай нов антиген-специфичностью и JILA рестрикцией, способные распознавать заданные низкойнмуногеиные опухолевые или вирусные эпитопы а контексте заданных IILA аллелей. представленных на клетках

2- Селекция вапнгсн-сисцифнчсских Т лимфоцитов на ранних сроках антиген-специфической экстракорпоральной стимул «пин путем деллеоии CD56* клеток нз МКПК донора и трансдукнии ретроаируеным вектором. кодирующим одновременно «сунцндальнои-марксрныЛ и селекционный белки, позволяет проводить 8-кратную лешицню аллорсяктнвиых Т лимфоцитов н получать в короткие сроки (менее 10 дней) контролируемую по «суицидальному» гену популяцию ЦТЛ. обогащенную в 6 раз антиген-специфичными Т клетками и содержащую <1% неещящфичеекгк М1А-иеэавнсимых NK клеток или NK-подобиых Т личфоиигоа. применимую в клинической практике без риска развития РТТ1Х.

3. Метод картирования мини-пудов перекрывающихся пентадекаппгзидов. кодирующих полиузо последовательность специфических опухолевых или вирусных имчуиогсииых белков. выбранных дли атпнген-спсиифичиоП стимуляции ЦТ Л, позволяет идентифицировать новые специфические вирусные н.ти опухолевые зпитопы. являющиеся иммуногеииынн функционалы» значимыми доминантами и противовирусном или противоопухолевом Т клеточном ответе юиивндувяьио подобранного донор» зффекторных клеток и. таким образом, производить, вне зависимости от HLA типа донора и реципиента, ЦТЛ. содержащие как CDS', так it CD4" популяцию Т лимфоцитов и обладающие противоопухолевой или противовирусной активность», для .течения больных с WT1* мокзчсственными заболеваниями и пист-трансплаиацнонной ЦМВ инфекцией

4. Эффективность адоптивной Т клеточной терапии зависит от I) уровня экспрессии специфического антигена н презеитирующего его иммунодоминаитиого HLA аяледя на клетках-мишенях. 2) взаимодействия ко-сгниуляторных молекул (CXCR1. CCR7 н I.FAI), предопределяющих нитрацию Ц'1Л в место локализации опухоли, с их лига идами, 3) соотношения доты азгпнеи-спеиифнчиых Т клеток н размера опухоли (0,0044x10* ЦТЛ на 1см5 опухоли) и 4) соотношения СЕЛ" и CDS" субиооуляиий Т клеток, содержащихся it используемой смешанной нскяоиыыюй популяции антигсн-спеиифичных ЦТЛ и оказывающих кумулятивное цитрлнтичеехос воздействие на опухоль, осуществляемому при вннмодествии с антигенами, представленными в контексте HLA аллелей 1 и I! класса комплекса гютюоймсспгмоспг. и кедперной активности cj» *Т лммфечыгтов.

5. Разработанная методика экстракорпоральной активации аутологичиых NK клеток больных с опухолями эпителиального происхождения в аутологнчной системе путем блокирования подавляющих их активность растворимых молекул MICA'В, выявленных в данном исследовании, даст возмоиоюсть производить ауюлоптчные противоопухолевые NK Клетки больных, способные оказывать специфическое противоопухолевое воздействие на аутологнчные опухолевые клетки и предоставляет эффективны!! инструмент направленной клеточной нммунокоррекцнн для

КЛС1 КаМИ-МИШСНЯ МИ. ПОЗВОЛЯСТ (IpOtHOHIpOBaih ТСраПСВТИЧССКУЮ >ффсКтНпи<>£11, Планируемой к.'ГСТОЧПОЙ ИММуНОКОррСКИИИ И течение заболевания а целом

10. Циркуляция WT1 специфичных Т клеток у больных с раком яичников и толстой кишки определяется у 67% и 80% больных соответственно и коррелирует с экспрессией этого антигена на опухолевых клетккх, выявляемою 60% и 80S случаев данных заболеваний соответственно, позволяя получить вутолотичнис ЦТ Л. обладающие ^политической активностью против ауто логичной WTt* опухоли для 80-90% больных с WTI" злокачественными новообразованиями с целые последующего проведения «утоаогичиой нммуиокоррежпии

11. Сниженная противоопухолевая активность NK клеток выявляется у 100% больных с MICAi'B" адсиокдрциномой толстого кишечника и обуславливается высоким уровнем растворимого MICAi'B, секретируемого опухолевыми клетками. вызывая ннгернализаиию н деградацию активирующего NK клетки рецептора NKG2D, а также друтих важных хсмокиновых молекул, таких как CXCRL блокируя |ффск1инлый противоопухолевый ответ аутологичиых эффекторных клеток больного, подтверждая необходимость их эффективной экстракорпоральной активации для последующей аутологичной иммуиокоррекпии.