Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Исследование пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в зависимости от различных способов криоконсервирования и сроков хранения

005010724

На правах рукописи УДК 612.11:618.38:578.089.822]616-092.4/9

КАРПОВА Наталья Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ И СРОКОВ ХРАНЕНИЯ

оЬ

14.0tf.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 0ЕЗ 2012

Санкт-Петербург

2012

005010724

Работа выполнена в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства России

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Кудрат Мугутдинович Абдулкадыров Научный консультант: чл.-корр. РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Евгений Алексеевич Селиванов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Зубаровская Людмила Степановна доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна

Ведущая организация: Федеральное государственное военное образовательное

учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится «27» февраля 2012 г. в ______часов на заседании совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций Д208.074.01 при Российском НИИ

гематологии и трансфузиологии (191024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16) в зале заседаний Ученого Совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «____»_______________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В клинической практике более двадцати лет используются трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), извлеченных из пуповинной крови (ПК) человека для лечения заболеваний системы крови, а также ряда других заболеваний, при которых происходит угнетение гемопоэза. (Karen K. Ballen at al., 2008).

В связи с разработкой методов трансплантаций ГСК пуповинной крови и расширением показаний к клиническому применению гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови проблема создания банков длительного хранения стволовых клеток является весьма актуальной. Получение гемопоэтических клеток-предшественников из костного мозга и периферической крови является сложной и дорогостоящей процедурой, связанной с вмешательством в здоровье донора, которое может приводить к нежелательным осложнениям. Широкомасштабный сбор ПК позволяет быстро формировать банк данных для подбора неродственного донора. Концентрация гемопоэтических стволовых клеток в одном образце ПК может обеспечить надёжную трансплантацию пациентам с массой тела, не превышающей 50 кг. Для пациентов, имеющих вес, превышающий 50 кг, приходится производить трансплантацию двух образцов ПК, что может иногда приводить к развитию осложнений в виде РТПХ или отторжения трансплантата. Поэтому вопросы о сохранности гемопоэтических стволовых клеток ПК на всех этапах их получения, сепарации, криоконсервирования и хранения, а также оценка их пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке in vivo требуют постоянного изучения и совершенствования.

Регенерация кроветворной системы у пациентов после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток зависит не только от их количественного содержания, но и от репликативного потенциала этих клеток, снижение которого коррелирует с потерями теломерных повторов в хромосомах. Гемопоэтические стволовые клетки с фенотипом CD34+ имеют различия в пролиферативной способности. Потенциал самовоспроизведения этих клеток также различен, что свидетельствует о гетерогенности их популяции, которая обусловлена различной степенью зрелости. Поэтому данные о количестве CD 34+ гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови следует интерпретировать с осторожностью. При достаточном для восстановления гемопоэза количестве гемопоэтических стволовых клеток может быть недостаточен их пролиферативный потенциал, что приведёт к отсутствию ожидаемого результата от трансплантации. Это диктует необходимость определения терапевтической дозы

гемопоэтических стволовых клеток, учитывая не только их количество, но и пролиферативный потенциал, зависящий от длины теломер.

Криоконсервирование является неотъемлемой частью процедуры длительного хранения клеточных биоматериалов. Криоконсервирование приводит к повреждению белковых структур клеточной мембраны, ферментов и ДНК и может служить потенциальным механизмом, вызывающим одиночные поломки терминальной теломерной ДНК и уменьшение длины теломер. Это приводит к снижению пролиферативных свойств деконсервированных клеток.

Оценка пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криоконсервирования ПК является дополнительным критерием контроля качества образца и поэтому важным прогностическим критерием успеха трансплантации.

Цель исследования. Оценить исходный пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови как альтернативного источника ГСК для трансплантации и изучить влияние различных способов криоконсервирования и условий хранения при ультранизких температурах на пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

Задачи исследования:

1. Оценить количество ЯСК в образцах пуповинной крови и количество С034+/С045 методом проточной цитометрии. Выявить зависимость количества С034+7С045 в образце пуповинной крови от количества ЯСК

2. Изучить влияние различных акушерских пособий на количественный и качественный состав собираемой пуповинной крови

3. Определить длину теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и оценить их пролиферативный потенциал перед низкотемпературным криоконсервированием и после размораживания

4. Исследовать влияние различных способов криоконсервирования на колониеобразующую способность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и сохранность длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, как один из важных критериев их репликативного и пролиферативного потенциала

5. Выявить зависимость между длиной теломер и колониеобразующей способностью гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

4

6. Изучить влияние различных сроков и условий хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови на длину теломер и колониеобразующую способность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

На защиту выносятся следующие положения:

1. Количество клеток СЭ34+/С045 зависит от количества количества ЯСК в образце пуповинной крови

2. Акушерское пособие, оказываемое в родах при сборе образца пуповинной крови, влияет на качественный и количественный состав клеток образца пуповинной крови.

3. Измерение длины теломер гемопоэтических стоволовых клеток после их криоконсервирования и длительного хранения является высокочувствительным биологическим маркером сохранности пролиферативного потенциала.

4. Сохранность пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови зависит от способа криоконсервирования. При криоконсервировании время от наступления точки эвтектики до кристаллизации должно быть не более 1,5 минут. Увеличение этого времени приводит к разрушению клеток и снижению их репликативного и пролиферативного потенциала.

5. Колониеобразующая способность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови зависит от их длины теломер.

6. Соблюдение условий низкотемпературного хранения необходимо для сохранности пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

Научная новизна. Впервые изучен пролиферативный потенциал гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, определяемый длиной теломер и степенью сохранности клеток-предшественников. Установлено влияние различных анестезиологических пособий во время родов на количество и качество клеток образца пуповинной крови. Выявлена зависимость между длиной теломер и колониеобразующей способностью гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. Определено влияние различных способов криоконсервирования на сохранность длины теломер.

Показано, что условия хранения ПК влияют на сохранность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.

Практическая значимость работы. Установлено, что при отборе образцов пуповинной крови донорскими банками пуповинной крови необходимо учитывать такие факторы, как особенности течения родов, виды анестезиологического пособия, объем взятой пуповинной крови. Изучено влияние условий криоконсервирования и хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови на их сохранность, выявлены факторы, снижающие сохранность клеток.

Внедрение в практику. Основные положения диссертации внедрены в практическую и научно-исследовательскую работу гематологической клиники ФГБУ Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии ФМБА России.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на международной конференции «Сгуо2006», (24-27 июля 2006 года, Гамбург, Германия) и Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (17-19 октября 2006 года, Санкт-Петербург), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы диагностики и лечения опухолевых заболеваний кроветворной и лимфатической ткани» (19 - 20 апреля 2010 года, Санкт-Петербург).

Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно проведена работа по сбору фактического материала; предложена методика и разработаны критерии оценки пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови на всех этапах технологического процесса по сбору, криоконсервированию, хранению и размораживанию пуповинной крови; произведена оценка способов выделения гемопоэтических стволовых клеток и определены оптимальные условия криоконсервирования и хранения. Проведена статистическая обработка результатов исследований.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 6 в научнопрактических журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописи, из них 110 станиц текста, и состоит из введения, обзора литературы, главы посвященной материалам и методам исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, а также списка литературы, содержащего 169

источников, из которых 41 отечественных и 128 зарубежных. Работа иллюстрирована 22 рисунками, 34 фотографиями и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Исследование выполнялось в гематологической клинике Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (руководитель профессор K.M. Абдулкадыров), сбор пуповинной крови осуществлялся в родильном отделении Санкт-Петербургского государственного учреждения здравоохранения «Родильный дом № 13». Сбор ПК производился во время естественных родов или оперативного родоразрешения сразу после рождения доношенного ребенка и пересечения пуповины, до отделения плаценты. Для выделения ЯСК пуповинной крови использовали в качестве седиментирующих препаратов полиглюкин и гидроксиэтилкрахмал (HES 6%).

Для криоконсервирования концентрата клеток пуповинной крови использовались два способа замораживания: спонтанное замораживание в парах жидкого азота и замораживание в программном замораживателе Planer plc с визуальным контролем процесса охлаждения каждого образца клеток. В качестве криопротектора использовался ДМСО в конечной концентрации 10 %.

Размораживание проводилось непосредственно перед использованием пробы для исследования на водяной бане при температуре 38 °С при равномерном покачивании в течение 5 минут (до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу).

Для подсчета сохранности ядросодержащих клеток вычисляли их абсолютное количество в исходном образце пуповинной крови и в том же образце после размораживания.

Абсолютные показатели рассчитывали по формуле:

Абсолютное количество клеток в образце пуповинной крови = количество клеток в мл х объём биоматериала, мл.

Затем вычисляли соотношение абсолютного количества ЯСК в размороженном образце пуповинной крови к абсолютоному количеству ЯСК в исходном образце и результат выражали в процентах.

Колониеобразующая способность (КОС) гемопоэтических стволовых клеток-предшественников пуповинной крови проводилась в полной среде на основе метилцеллюлозы MethoCult® (StemCellTechnoIogies, Канада).

Сохранность КОС клеток после размораживания оценивали в процентах от исходного количества колоний в свежих образцах пуповинной крови, определенных перед замораживанием.

Сохранность колониеобразующей способности вычисляли по формуле:

КОС после размораживания

Сохранность КОС = -----------—----------------------х ЮО (%)

КОС до замораживания

Определение CD34+ и длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови производилось на проточном цитофлуориметре Beckman. Coulter FS-500 Cytomics. Длину теломер определяли с помощью флуоресцентно-конъюгированного пептидно-нуклеиновой кислотой (PNA) зонда. Результаты оценивались с использованием светового фильтра с длиной волны 488 нм.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента. Для качественных параметров применялся точный критерий Фишера. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05. Для выявления связей между явлениями проводили регрессионный, дисперсионный, корреляционный виды анализа, определяли коэффициенты Пирсона (г) и Спирмэна (rs).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Взаимозависимость объема пуповинной крови» исходного количества ЯСК и клеток с Фенотипом CD34+/CD45

Важным показателем пригодности образца пуповинной крови для выделения ГСК и дальнейшего их хранения является объем образца ПК.

Всего исследован 231 образец пуповинной крови. Из них 21 образец объемом до 40 мл, 108 образцов объемом от 40 до 80 мл, и 102 - свыше 80 мл. (рис.1).

В данных образцах подсчитано абсолютное количество ЯСК и абсолютное количество клеток с фенотипом CD34+/CD45. Для установления зависимости содержания ЯСК и клеток CD34+/CD45 от объема образца пуповинной крови нами применялся

дисперсионный анализ данных. Установлено статистически достоверное различие между группами.

Рис. 1 Распределение количества образцов в зависимости от объема

Проведено исследование зависимости количества ядросодержащих клеток образцов пуповинной крови от объема пуповинной крови (рис. 2). Среднее количество ЯСК в полученных нами образцах ПК (п=231) составило 0,86 ± 0,45 х 109 (диапазон от 0,07 х 109 до 2,9 х 109). Установлено, что образцы, объем которых превышал 80 мл, наиболее богаты ЯСК (таблица 1). В образцах, объемом менее 40 мл содержание ЯСК меньше в 2 раза по сравнению с образцами объемом от 40 до 80 мл, и в 2,5 раза по сравнению с образцами свыше 80 мл. В образцах, объем которых был 40 мл и ниже, выявлено достоверно меньше количества ЯСК по сравнению с образцами объемом от 40 до 80 мл. В образцах, объем которых превышал 80 мл, количество ЯСК достоверно выше, чем в образцах меньшего объема.

Зависимость количества ядросодержащих клеток Зависимость количества CD34+/CD45+ клеток от

пуповинной крови от объема образца содержания ЯСК

5 3 . ■■■ 1 :: ...Г. : .../V.T / .. /

о“ 2,5 ' ■ :« * ,«о25 2 “’«20 Si *15 ££S10

о 0,5 ' ■ - - Ш! 5

50 100 150 Объем образца пуповинной крови 200 0.5 1 1,5 2 2.5 3 35 Абсолютное количество ядросопержаицк клеток в образце (х 10*9)

Рис. 2 Зависимость количества Рис. 3 Зависимость количества ядросодержащих клеток от С034+/С045+ от количества ЯСК объема образца пуповинной крови

Таблица 1

Исследование содержания ЯСК в образцах пуповинной крови в зависимости от их

объема

Объем ПК мл) До 40 (п=21) 40-80 (п=108) Свыше 80 (п=102)

Количество ЯСК (х10’| 0,32±0,31 Сот 0.076 до 0,55) 0,72±0,29 (от 0,27 до 1,6) 1,15±0,45 (от 0,52 до 2,9)

Достоверность Р<0,05

При сравнении объема и содержания ядросодержащих клеток в образцах ПК выявлена прямая зависимость между этими показателями (п—231; п=0,79, р<0,05; гз-0,74, р-0,0001).

Таким образом, установлено, что количество ЯСК в образце зависит от его объема.

Для изучения гемопоэтического потенциала ГСК ПК в 163 образцах исходной пуповинной крови и произведен подсчет клеток с имунофенотипом С034+/СЭ45+ (таблица 2), При оценке количества гемопоэтических стволовых клеток с имунофенотипом С034+/С045+ выявлена прямая зависимость между количеством ЯСК и количеством клеток С034+/С045+. (п-163; г=0.45, р<0,05; гз=0,575, р-0,0001).

Таблица 2.

Исследование содержания клеток С034+/С045 в образцах пуповинной крови в зависимости от их объема

Объем ПК (мл) До 40 (п=21) 40-80 (п=108) Свыше 80 (п=102)

Количество СО 34+/С045 (х106) 1,99±1,92 4,22±3,82 6,87±5,47

Достоверность Р<0,05

В образцах, объем которых ниже 40 мл количество ЯСК практически в 2 раза меньше по сравнению с образцами объемом от 40 до 80 мл и в 3 раза меньше по сравнению с образами, объем которых превышает 80 мл. Количество гемопоэтических стволовых клеток с имунофенотипом С034+/С045+ в образце пуповинной крови прямо пропорционально зависит от количества ЯСК, что может быть важным прогностическим критерием для оценки образца пуповинной крови, как материала для трансплантации.

Полученные данные свидетельствуют о том, что хранение образцов пуповинной

крови объемом менее 40 мл является не целесообразным, так как количество ЯСК

практически в 2 раза меньше по сравнению с образцами объемом от 40 до 80 мл и в 3 раза

меньше по сравнению с образами, объем которых превышает 80 мл. Количество

гемопоэтических стволовых клеток с имунофенотипом С034+/С045+ в образце

10

пуповинной крови прямо пропорционально зависит от количества ЯСК, что может быть важным прогностическим критерием для оценки образца пуповинной крови, как материала для трансплантации. Образцы с низким количеством ЯСК должны выбраковываться до проведения других лабораторных тестов. При накоплении образцов пуповинной крови такая процедура позволит снизить расходы на заготовку и хранение образцов, не пригодных или недостаточных для полноценной трансплантации.

Влияние анестезиологических пособий во время подов на количественный и качественный состав клеток получаемого образца пуповинной коовн

Сбор образцов достаточного объема и клеточности - лимитирующий момент для проведения успешной трансплантации ГСК ПК. Объем пуповинной крови является основным фактором при окончательном принятии решения о сохранении образца и НЬА типировании. При достаточном объеме пуповинной крови может быть снижено количество ЯСК в образце. Снижение количества ЯСК в образце пуповинной крови может быть вызвано медицинскими манипуляциями во врем родов. Проанализированы образцы пуповинной крови, полученные во время физиологических родов и во время оперативного родоразрешения: во время операции кесарева сечения с применением эпидуральной анестезии и с применением общего наркоза

Таблица 3

Сравнение содержания ЯСК и СВ34+/СЭ45+ клеток в образцах, полученных при разных вариантах течения родов

Вид акушерского пособия п Абсолютное количество ЯСК, х 109 М±т Абсолютное количество CD34+/CD45+, х 10 6 М±га

Обычные физиологические роды 68 1,01±0,54 (0,35 - 2,3) 8,03±9,5 (2,41 - 46)

Оперативное родоразрешение -кесарево сечение с применением эпидуральной анестезии 27 1,08±0,63 (0,36-2,7) 7,5±7,3 (1,1-39,1)

Оперативное родоразрешение -кесарево сечение под общим наркозом 18 0,83±0,37 (0,24- 1,2) 5,6±4,09 (0,24- 14,7)

Достоверность Р<0,05

Как видно из таблицы 3, абсолютное количество ЯСК и С D34 * клеток в образцах пуповинной крови, собранных во время физиологических родов составило 1,01±0,54 х 10 и 8,03±9,5 х I06 соответственно. При сборе пуповинной крови во время оперативного родоразрешения с применением эпидуральной анестезии абсолютное количество ЯСК и CD34+- клеток в образцах пуповинной крови, собранных во время физиологических родов составило 1,08±0,63 и 7,5±7,3 соответственно. Применение общего наркоза существенно отражается на содержании ЯСК и CD34+ клеток в образцах пуповинной крови — 0,83±0,37 и 5,6±4,09 соответственно. Количество гемопоэтических стволовых клеток, полученных из образца ПК, собранного во время физиологических родов и кесарева сечения с эпидуральной анестезией превышает количество ГСК, полученных во время операции кесарево сечение под общим наркозом в 1,5 - 2 раза.

Таким образом, акушерские манипуляции, сопровождаемые сбор образца пуповинной крови, оказывают влияние на качественный состав образца пуповинной крови. При использовании общего наркоза достоверно снижается количество ЯСК и клеток с фенотипом CD34+/CD45+. Это, возможно, объясняется тем, что общий наркоз угнетающе действует на ЦНС и эндокринную системы матери и новорожденного, в то время, как при физиологических родах происходит стресс-мобилизация гемопоэтических клеток пуповинной крови. Снижение количества клеток при эпидуральной анестезии незначительно и практически не отличается от такового при физиологических родах, что можно объяснить тем, что при данном виде анестезиологического пособия не происходит угнетения ЦНС.

Полученные данные имеют важное практическое значение для прогнозирования качества собираемых образцов пуповинной крови государственными банками пуповинной крови для создания резервов гемопоэтической ткани российской популяции и их необходимо учитывать при разработке алгоритмов отбора образцов ПК крупными государственными банками регистрами.

Сравнение длины теломер гемопоэтичесмкнх стволовых клеток пуповинной крови, замороженных разными способами

Выбор режима замораживания клеток имеет большое значение в сохранении их структуры и функции после оттаивания. Основные повреждения клетки наступают между точкой эвтектики и точкой замерзания, так как в этот период образуются

концентрированные растворы солен, которые повреждают клеточные структуры. Этот период не должен длиться более 1,5 минут.

В данной работе изучено два режима замораживания (рис. 4), которые наиболее часто используют в российских банках криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток: замораживание в парах жидкого азота и в программном замораживателе. В парах жидкого азота было заморожено 231 образцов пуповинной крови, из них 115 в парах жидкого азота, и 116 в программном замораживателе. Скорость замораживания-оттаивания является критическим определяющим фактором клеточной жизнеспособности. Увеличение скорости замораживания приводит к недостаточному проникновению ДМСО в клетки. Снижение концентрации ДМСО не может адекватно подавлять стрессы, вызываемые в процессе замораживания.

При замораживании в программном замораживателе время от наступления точки эвтектики и кристаллизации сокращено до 1,5 минут, в то время, как при замораживании в парах жидкого азота это время длится около 5 минут.

Замораживание клеток в парах жидкого азота при достаточно высокой сохранности ЯСК, вызывает большее количество повреждений клеточных функций и снижение пролиферативного потенциала клетки. Так как процесс замораживания в парах жидкого азота происходит спонтанно, мы не можем на него воздействовать. Очевидно, наибольшие повреждения при данном способе криоконсервирования происходят в момент криталлизации, за счет увеличения периода перехода жидкой фазы в твердую.

В отличие от спонтанного замораживания клеток в парах жидкого азота, при замораживании образцов по программе происходит индивидуальное прохождение точки кристаллизации для каждого образца и управление временем кристаллизации.

Сравнение программ замораживания в прораммном замораживателе и в парах жидкого азота

10,00

0,00

я -10,00

£ -20,00

? -30,00 2

g -40,00 -50,00 -60,00

Рис. 4 Сравнение спонтанного и Рис' 3 СРЄДНЯЯ Длина теломер, №. 1 -программируемого замораживания в нативных клетках пуповинной крови, 2 -

образца пуповинной крови 8 кле™3*. замороженных по программе, 3

- в клетках, замороженных в парах жидкого азота

Таблица 4.

Длина теломер гемопоэтических клеток пуповинной крови

Средняя длина теломер нативных клеток, kb Средняя длина теломер клеток, замороженных в программном замораживателе, kb Средняя длина теломер клеток, замороженных в парах жидкого азота, kb

M±m М±ш М±ш

15,35 ±3,85 13,36± 1,87 9,51±0,31

n=79 п=79 3 II -О 40

Таблица 5

Сравнение сохранности клеток и их пролиферативного потенциала при разных режимах замораживания

Показатели п Замораживание в парах жидкого азота Замораживание в ПрОГраМмНОм замораживателе

Сохранность ЯСК, % от исх. 231 95,5 98,2

Сохранность С034+/С045+, % от исх. 231 88,12 96,57

Укорочение длина теломер, % от исх. 79 6233 87,54

Колониеобразующая Способность, % от исх. 82 40,74 98,05

Жизнеспособность, % 231 96,25 99,25

Достоверность Р0.05 Р<0.05

Укорочение длины теломер происходит при обоих спосооах замораживания, однако, как видно из табл. 4, 5 и рис. 5 при криоконсервировании клеток в программном замораживателе, теломеры повреждаются меньше, чем при замораживании в парах жидкого азота.

Укорочение длины теломер при замораживании клеток пуповинной крови связано с процессами повреждения мембраны ядра клетки. Так как теломеры участвуют в формировании скелета клеточного ядра и тесно связаны с ядерной мембраной, эти стурктуры повреждаются вместе с ядерной мембраной в первую очередь. Уменьшение длины теломер клеток пуповинной крови является важным маркером повреждения клеточных структур в процессе криокоисервирования. Таким образом, криоконсервирование индуцирует физиологическое старение клеток. Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что не подходящие условия криоконсервирования могут не только снижать жизнеспособность клеток, но и также индуцировать сенесенс и апоптоз. Полученные нами данные, являются важными для областей медицины, которые используют замороженные клетки, у которых процессы криоконсервирования вызывает, начиная с сенесенса, множество повреждений. Изменение длины теломер и повреждения теломерных белков могут так же вызывать изменения экспрессии генов, что так же сказывается на функции клетки.

Уменьшение длины теломер клеток пуповинной крови является важным маркером повреждения клеточных структур в процессе криоконсервирования.

Взаимозависимость колониеобпазующеи способности и длины________________телпмец

гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови

Результаты проведенных исследований о лучшей сохранности пролиферативного потенциала при замораживании клеток в программном замораживателе подтверждаются также исследованием колониеобразующей способности ГСК ПК. Как видно из таблицы 5, КОС пуповинной крови до замораживания составила 411,75±46,51на 105 ГСК ПК. Средняя длина теломер клеток пуповинной крови до замораживания составила 15,35 ±3,85 кЬ. При замораживании ГСК ПК в программном замораживателе КОС и длина теломер составили 403,75±15,84 на Ю5 ГСК ПК и 13,36± 1,87 кЬ соответственно. Эти показатели практически совпадают с КОС и длиной теломер ГСК ПК до замораживания. В клетках, которые замораживались в парах жидкого азота, наблюдается значительное снижение КОС и уменьшение длины теломер но

сравнению с этим» показателями до замораживания - 167,75±93,20 105 ГСК ПК и 9,51±0,31 кЬ соответственно.

При сопоставлении этих данных видно, что уменьшение длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови приводит к снижению их колониеобразующей способности, а колониеобразующая способность гемопоэтических стволовых клеток является достоверным показателем их пролиферативного потенциала. Таким образом, сохранность длины теломер ГСК ПК после размораживания указывает на сохранность пролиферативного потенциала ГСК ПК.

Таким образом, существует прямая зависимость колониеобразующей способности ГСК ПК от длины теломер этих клеток. Способы криоконсервирования могут существенно влиять на сохранность КОС и длины теломер клеток пуповинной крови. Существует прямая зависимость КОС от длины теломер ГСК ПК. Поэтому при оценке сохранности клеток после размораживания длина теломер является информативным маркером сохранности пролиферативных свойств клеток.

Влнянне условий хранения образцов гемопоэтических клеток пуповинной крови на их пролиферативный потенциал

После охлаждения до температуры - 196 °С наступает полная кристаллизация исследуемых проб, причем основная часть образцов кристаллизуется с образованием крупных кристаллов льда с расположенными между ними канальцами, образуя типичную для защитного агента, в нашем случае ДМСО, структуру замершего раствора. Вода кристаллизуется в виде крупных кристаллов льда, а соли, сахара и другие компоненты первоначального раствора концентрируются в промежутках между растущими кристаллами льда, образуя сеть каиальцсв. Клетки обычно располагаются в канальцах, содержащих на последних этапах кристаллизации жидкой фазы сильно концентрированные растворы солей и сахаров, выкристаллизовывавшиеся во время образования канальцев. Основные повреждения в пробах происходят при образовании внутриклеточного льда. Степень повреждения клеток находится в зависимости от структуры кристаллизованного раствора и характера формирования в них канальцев, причем, чем выше концентрация веществ в канальцах, тем меньше клетки повреждены внутриклеточным льдом. Научно доказано, что при температуре - 130 °С происходит снижение до минимума всех физических и химических процессов. При повышении температуры выше - 130 °С начинаются процессы рекристаллизации, в результате которых происходит повреждение клеток вновь

образующимися кристаллами. Поэтому при длительном хранении необходимо строгое соблюдение температурного режима хранение при — 196 °С в жидком азоте или в газообразной фазе над жидким азотом.

Мы сравнили сохранность ЯСК, клеток С034+/ С045+,

витальности/жизнеспособности, колониеобразующей способности клеток пуповинной крови и оценили длину теломер на различных сроках хранения - 1 мес., 6 мес., 1 год. Значимых отличий в сохранности клеток на различных сроках нами выявлено не было.

Однако, часть образцов (п—69), которые находились на хранении в низкотемпературном морозильнике при - 80 °С, показали низкую сохранность клеток.

Таблица 6

Влияние сроков хранения на сохранность образцов пуповинной крови при температуре 196 °С

Параметры Сроки хранения

30 дней 6 мес 1 год

Сохранность ЯСК, % от исх. 96,61±1,78 94,68±5,39 92,34±8,59

Сохранность клкток С034+/С045+, % от исх. 95,16±4,15 94,17±2,18 92,31 ±2,41

Укорочение длинытеломер, % от исх. 88,35±2,13 87,23±3,18 87±2,16

КОС, % от исх. 86,54±3,25 84,21±2,11 83,16±3,28

Жизнеспособность, % 99,75±2,58 98,68±3,64 98,95±3,94

Достоверность Р<0,05 Р<0,05 Р<0,05

Таблица 7

Сохранность клеток, хранившихся в низкотемпературном морозильнике при температуре -80 °С

Сроки хранения

Параметры 30 дней (п=69) 6 мес (п=69) 1 год (п=69)

Сохранность ЯСК, % от исх. 95,25±2,88 84,68±4,33 62,65±6,69

Сохранность СШ4+/С045+, % от исх. 85,29±3,87 72,71 ±4,22 69,33±1,15

Укорочение длины теломер, % от исх. 54,25±3,32 44,51±2,72 42,44±1,61

КОС, % от исх. 65,22±4,11 58,12±3,51 49,62±5,47

Жизнеспособность, % 98,55±1,99 87,32±4,22 68,99±3,89

Достоверность Р<0,05 Р<0,05 Р<0,05

Таким образом, как видно из таблиц 6 и 7, для наилучшей сохранности образцов пуповинной крови длительное хранение должно осуществляться в диапазоне температур -130 °С - - 196 °С.

Оптимальными условиями длительного хранения образцов пуповинной крови является соблюдение режима низкотемпературного хранения не выше - 130 градусов °С. Нарушение температурного режима хранения выше - 130 градусов °С приводит к снижению пролиферативного потенциала клеток пуповинной крови, выражающегося в потере длины теломер и снижению колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток.

Таким образом, представленные в работе сведения о влиянии способов

криоконсервирования образцов пуповиной крови на их пролиферативный потенциал имеют

большое практическое значение. Длина теломер может служить важным маркером сохранности пролиферативного потенциала ГСК ПК. Дальнейшее изучение длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови позволяют надеяться на получение новых подходов к их применению для трансплантации у больных с заболеваниями системы крови, повышению их выживаемости и качества жизни.

Выводы.

1. Количество гемопоэтических стволовых клеток с имунофенотипом С1)34+/С045+ в

образце пуповинной крови зависит прямо пропорционально от исходного

количества ЯСК. Определение количества ЯСК на начальном этапе заготовки пуповинной крови позволяет оценить пригодность образца пуповинной крови, как материала для трансплантации. Образцы с низким количеством ЯСК должны выбраковываться до проведения других лабораторных тестов. При накоплении донорских образцов такая процедура позволит снизить расходы на заготовку образцов пуповинной крови, не пригодных или недостаточных для полноценной трансплантации.

2. Акушерские манипуляции, сопровождающие сбор образца пуповинной крови, оказывают влияние на качественный состав образца пуповинной крови. При использовании общего наркоза достоверно снижается количество ЯСК и клеток с фенотипом С034+/С045 в образце пуповинной крови. Количество гемопоэтических стволовых клеток, полученных из образца ПК, собранного во время физиологических родов и кесарева сечения с эпидуралыюй анестезией превышает количество ГСК, полученных во время операции кесарево сечение

под общим наркозом в 1,5-2 раза.

3. Криоконсервирование влияет на сохранность длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. Длина теломер клеток пуповинной крови является важным маркером повреждения клеточных структур в процессе криоконсервирования.

4. Уменьшение длины теломер гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови и колониеобразующая способность гемопоэтических стволовых клеток зависит от способа криоконсервирования. Криоконсервирование ГСК ПК, выполняеемое с соблюдением оптимальных условий, режима, скорости замораживания, обеспечивает хорошую сохранность гемопоэтических стволовых клеток ПК и их пролиферативного потенциала.

5. Изменение длины теломер гемопоэтических стволовых клеток коррелирует с их колониеобразующей способностью.

6. Оптимальными условиями длительного хранения образцов пуповинной крови является соблюдение режима низкотемпературного хранения не выше - 130 °С. Нарушение температурного режима хранения выше - 130 °С приводит к снижению пролиферативного потенциала клеток пуповинной крови, выражающегося в потере длины теломер и снижению колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток.

Практические рекомендации.

1. Сбор образцов пуповинной крови необходимо производить во время физиологических родов. Образцы пуповинной крови, полученные во время кесарева сечения под общим наркозом не целесообразно сохранять для дальнейшей трансплантации из-за низкого содержания ЯСК и клеток С034+/С045 в них.

2. Определение длины теломер в гемопоэтических стволовых клетках пуповинной крови после размораживания необходимо для оценки сохранности их пролиферативных свойств.

3. Длительное хранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови должно осуществляться с соблюдением режима низкотемпературного хранения не выше - 130 °С.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Абдулкадыров К. М. Изучение пролиферативного потенциала гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в зависимости от способов фракционирования, криоконсервирования и сроков хранения. / К.М.Абдулкадыров, НС. Карпова. // «Цитология», - 2006. - том 48 - с. 739.

2. Abdulkadyrov К.М. Proliferative potential and telomere length of cord blood derived stem cells depend on the methods of fractioning, freezing, and time of storage. / Kudrat M. Abdulkadyrov, Natalia S. Karpova. // Cryo 2006, Hamburg, Germany. - July 24-27, 2006. -p. 29.

3. Katkov 1.1. Cryobiology for stem cell therapy: research overview. / Igor I. Katkov, Min S. Kimb, Natalia S. Karpova, Ayub G.M. Lulatd, Calvin Cao, Fred Levinea, Alexey V. Terskikh, Jeanne F. Loring, Evan Y. Snyder II Cryo 2006, Hamburg, Germany. - July 24-27, 2006. -p. 154.

4. Katkov 1.1. Cryosensivity of human stem cells of different origin. / I.l.Katkov, M.S.Kim, F.Levine, A.V.Terskikh, J.F.Loring, E.Y.Snyder, N.S.Karpova. // «Цитология». — 2006. — том 48, № 9. - c. 818

5. Katkov 1.1. Cryobiology for stem cell therapy: research overview. /1.1. Katkov, M.S.Kim, Ayub G.M.Lulat, Calvin Cao, Fred Levine, Alexey V. Terskikh, Jeanne F.Loring, EvanY.Snyder, N.S. Karpova. // «Цитология»,- 2006., - том 48, № 9, - с. 818

6. Сурков К.Г. Применение стволовых клеток человека при экспериментальных ишемических нарушениях. / К.Г.Сурков, Н.С. Карпова, JI.A. Белова, В.К. Красняков. Н «Клеточная трансплантология» - 2007. - с. 23 - 24

7. Романенко Н.А. Влияние уровня ФНО альфа на эффективность коррекции анемии при лимфопролиферативных заболеваниях. / Н А. Романенко, К.М. Абдулкадыров, О.Е. Розанова, С.С. Бесемельцев, Н.С. Карпова. // «Онкогематология». - 2010 г. - № 3 - с. 22-28

8. Карпова Н.С. Изучение длины теломер и колониеобразующей способности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови при криоконсервировании. / Н.С. Карпова, К.М. Абдулкадыров, Е.А. Селиванов, В.А. Балашова // «Клеточная трансплантология». - 2011 г. - Том IV, № 4. - с. 1 - 6

9. Карпова Н.С. Современные представления о роли теломер и теломераз в патогенезе гематологических и онкологических заболеваний. / Н.С. Карпова, К.М. Абдулкадыров, Е.А. Селиванов, В.А. Балашова. // «Биомедицинский журнал». - 2012 г. - № 1. - с.

Список сокращений

ГС К - гемопоэтические стволовые клетки

ДМСО - днметилсульфоксид

КОЕ - колониеобразующая единица

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитов/моноцитов КОС - колониеобразующая способность ПК - пуповинная кровь ЯСК - ядросодержащие клетки

ООО «ПЕРЕПЛЕТ» г. Санкт-Петербург, ул. Некрасова дом 41, тел/факс: 579-54-53, 191014

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Таймс». Формат обрезной 145x205. Усл.изд.л.-!,!. Усл.печ.л.-1,05 Тираж 100 экз. Заказ 06-12.