Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Нефропатия при инсулинзависимом сахарном диабете (клинико-морфологическое и экспериментальное исследование)

рвя?

министерство здравоохранения российской федерации московская медицинская академия имени и.м.сеченова

На правах рукошн и

ПОНОМАРЕВ АНДРЕЙ БОРИСОВИЧ

НЕФРОГ1АТИЯ ПРИ ИНСУЛИНОЗАВИСИМОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

(клиннко-морфологическос н экспериментальное исследование)

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москпа -1992

Работа выполнена в Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, член-корреспондент

Российской АМН, профессор М.А.ПАЛЬЦЕВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель

науки России, профессор Г.Г.АВТАНДИЛОВ

доктор медицинских наук, профессор В.П.БЫКОВА

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: } lay чно-исследовательский институт морфологии человека Российской АМН

Защита состоится" ЦсвиД_1992 г. в

час. на заседании специализированного совета Д.074.05.05 при Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова (Москва, Б.Пироговская ул., д.2-6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан "

■МАЛ,_ 1992 г.

Ученый секретарь си^циализиованного совета, доктор медицинских наук,

профессор В.А.ВАРШ АВСКИЙ

■t.-.KTSHMS

1:

. .. имз

ВВЕДЕНИЕ

- гдел

жертац^»|^альность проблемы. Инсу ли но зависимый сахарный диабет (ИЗСД), или сахарный диабет 1-го типа - хроническое заболевание, которое клинически характеризуется гиперглпкемией со склонностью к кетозу и требует введения экзогенного инсулина для поддержания лизни больного (ВОЗ, I9«I;Mandrup-Poulsen т., 1988 ). Важнейшим компонентой клиничьской картины ИЗСД является поражение сосудов уикроциркуляторного русла, которое и определяет прогноз заболевания. Диабетическая «икроангиопатия имеет генерализованный характер. Сходные изменения развиваются в сосудах почек (Kimmelsti-el Р.,Wilson е., 1936 ), сетчатки глаза ( Addison D.J.е.а.,1970 ), периферических нервов (Powell н.с.е.а., 1985 ), миокарда (х,е-det Т.е.а.1979), КОЖИ (Ajjora Z.S.e.a., 1985 ), скелетных МЫШЦ (Vracko R., 1970).

Диабетическая нефропатия развивается в среднем через IS лет после манифестации ИЗСД у 30-40$ больных (Kofoed-Enevoldsen А.е.а., Krolewski A.s.e.a., 1987 ) и нередко заканчивается

хронической почечной недостаточностью, которая является важнейшей причиной смерти при ИЗСД (Mogenoen С.Е.е.а., 1988). В то же время у 20-25^ больных ИЗСД не выявлены признаки диабетической нефролатии (Raskin Р.е.а., 1986). Эти факты определяют актуальность исследования морфогенеза нефропатии при манифестации ИЗСД.

Развернутой клинической картине диабетической нефропатии предшествует определенный период, в течение которого определяют функциональные сдвиги: увеличение скорости клубечковой фильтрации (Bank N. е.а.,1988; Trevisan R.e.a., 1988) И микроальбуминурия (Mathlesen E.H.е.а., 1984). Большинство авторов считает эти ранние изменения обратимыми при достижении нормогяикемии (Bratush-Uarrain Р.,1988; Selby J.V.e.a., 1990 ). Однако остаются невыясненными структурные основы ранних функциональных

нарушений, так как имеются лишь единичные морфологические исследования почек в доклиническую стадию диабетической нефропатии (Walker J.е.а., 1991 )-

Немногочисленны и противоречивы результаты исследований морфогенеза диабетической нефропатии (ßioodworth J.M.B.,1978; Osterby R. 1974; Klmmelstlel P.e.a., I966). а также количественного анализа структурно-функциональных взаимосвязей на различных стадиях диабетической нефропатии (маиег s.1984 ). Отсутствие четких представлений о механизмах развития поражения почек при ИЗСД термозит разработку эффективных методов ее профилактики и лечения.

Исходя из представлений о ИЗСД как обменно-сосудистом заболевании (Ефимов A.C., 1984), в патогенезе которого важнейшую роль отводят иммунопатологическим механизмам (Nerup J.е.а.,1986 ) можно предположить участие иммунных факторов и в развитии микро-ангиопатии и нефропатии. Непосредственным доказательством участия иммунных факторов в патогенезе поражения почек при ИЗСД являются обнаружение в почечной ткани отложений иммуноглобулинов, компонентов системы комплемента, антител к инсулину (Серов В.В. с соавт., 1985; Westberg м.е.а.,197^» сходство диабетической нефропатии с изменениями, наблюдаюадмися при других формах им-мунокомплексной патологии почек, например, при гломерулонефри-тах (Yum М.е.а.,1984 ). Однако роль иммунных механизмов в пато-и морфогенезе диабетической нефропатии остается невыясненной.

Цель исследования. Цель работы - изучение морфогенеза диабетической нефропатии при ИЗСД.

За :ачи исследования. В соответствии с намеченной целью в работе решались следующие задачи:

I) выявление морфологических изменений, характеризующих последовательные стадии диабетической нефропатии; количественный анализ динамики структурных изменений почек;

'¿) изучение морфогенетических механизмов диабетической нефропатии на биопсийном материале и пр . экспериментальном сахарном диабете;

3) выяснение роли иммунных нарушении в развитии диабетической нефропатии;

4) сопоставление результатов морфологического изучения би-оптатов почек с данными клинического обследования больных ИЗСД.

Научная новизна. С помощью комплекса методов (клинического, гистологического, иммуногистохимического, электронномикроскопи-ческого, иммуноэлектронномикроскопического, морфометрического) изучен морфогенез диабетической нефропатии при ИЗСД.

В ¿„висимости от выраженности изменений почечных структур (степень расширения мезангия за счет увеличения числа и/или гипертрофии мезангиалышх клеток и/или накопления «езангиально-го магрикса, степень утолщения и гиалиноза базельных мембран капилляров клубочков, выраженность субэндотелиальных депозитов, выраженность и распространенность дистрофических и атрофических изменений нефроцитов извитых канальцев, степень утолщения и расслоения тубулярных базальных мембран, степень гиалиноза артери-ол и выраженность склероза интерстиция коркового вещества почек) выделены три степени диабетической нефропатии, отражающие последовательные стадии ее морфогенеза.

Первая степень диабетической нефропатии выявляется, обычно, в течение первых 3-х лет после манифестации ИЗСД и характеризует начальную стадию поражения почек пси ИЗСД.

Результаты морфологического и иммуногистохимического исследований свидетельствуют о развитии на этой стадии своеобразного "диабетического гломерулонефрита". Иммунное воспаление в почечном клубочке проявляется нарушением межклеточных взаимодействий, связанных с торможением синтеза рецепторов CR-I подоцитов.

При второй степени диабетической нефропатии наблюдается прогрессирование склеюотических процессов в почечном клубочке, развивается диабетический гломерулосклероз.

При третье степени диабетической нефропатии склеротические процессы прогрессируют не только в почечном клубочке, но и в интерстиции, поэтому можно говорить о развитии да абетического нефросклероза.

Показвно, что выраженность морфологических изменений почек зависит от продолжительности течения манифестного ИЗСД.

Впервые для морфометрического исследования почечных клубоЧ' ков использовали компьютерную телевизионную микроденситсметри-ческую систему "ДИАМОРФ" (НИИ ФХМ Минздрава России), с помощью которой показано, что прогрессирование диабетической нефропатии ■сопровождается снижением площади фильтрационной поверхности капилляров клубочков, которое в первую стадию компенсируется увеличением площади капилляров клубочков.

Впервые проведено иммуноэлектронномикроскопическое исследо ¡вание почек больных ИЗСД, с помощью которого уточнена локализация отложений иммунных комплексов. Они обнаружены в lamina densi ■базальной мембраны капилляров клубочков и имеют линейный характер, что указывает на формирование иммунных комплексов in situ

Сопоставление данных клинического обследования больных ИЗС с результатами морфологического изучения нефробиоптатов показывает, что у больных ИЗСД без клинических признаков поражения

почек выявляется не только первая, но и вторая степень диабетической нефропатии, а у Сольных с клиническими признаками нефро-патии отмечается как вторая, так и третья степень диабетической нефропатии.

Б работе обоснована адекватность ; одели экспериментального диабета, вызванного малыми дозами стрептозотоцина, для изучения диабетической нефропатии.

Практическая ценность. Выделение морфологических степеней тяжести проявлений диабетической нефропатии при ИЗСД позволяет объяснить механизм развития клинических проявлений, особенности течения и обосновать прогноз, что помогает подобрать адекватное лечение. Наличие морфологических изменений почек у больных с непродолжительным манифестным ИЗСД и без клинических проявлений нефропатии обосновывает необходимость изучения нефробиоптатов у всех бс,.;лшх ИЗСД для уточнения клинического диагноза. Для определения степени диабетической нефропатии необходимо использование клинических данных и результатов светооптического, иммуногистохи-мического и электронномшсроскопического изучения нефробиоптатов.

Реализация практических рекомендаций. Результаты исследования внедрены в ММА им. И.М.Сеченова (кафедра патологической анатомии и прозектура клиник) при изучении нефробиоптатов, а также используются в учебном процессе на кафедре патологической анатомии 1-го лечебного и санитарно-гигиенического факультетов ММА им. И.М.Сеченова.

Апробация работы проведена на совместном заседании кафедры патологической анатомии 1-го лечебного и санитарно-гигиенического факультетов, лаборатории клинической морфологии и лаборатории по изучению межклеточных взаимодействий НИЦ ИЛА им. И.М.Сеченова.

Материалы диссертации доложены на Ш Всесоюзном съезде эндокринологов (Ташкент, 1989), П Всероссийском съезде эндокринологов (Челябинск, 1991), на заседании Московского общества патологоанатомов (1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем реботы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", 3 глав результатов собственного исследования, обсуждения результатов, общего заключения, выводов, библиографии. Текст диссертации изложен на страницах машинописи, иллюстрирован рисунками, в том числе микрофотографиями, электроннограммами, таблицами, в указателе литературы приведены источников, в том числе работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Изучены пункционные нефро-биоптаты 66 больных ИЭОД. Во всех возрастных группах, кроме группы больных в возрасте от 20 до 30 лет, преобладали мужчины (соотношение мужчин и женщин, примерно, 2:1). Возраст больных колебался от 16 до 51 года. Средний возраст больных мужского пола составил (М+т)- 29.9+1.03 лет, женщин - 27.9+1.82 лет. Наибольшее количество больных - 39 (86^) было в возрасте от 20 до 40 лет. Продолжительность ИЗСД до 3-х лет выявлена у 12, от 4 до 8 лет -у 19, от 9 до 15 лет - у 24, свыше лет - у II больных. Продолжительность ИЗСД с момента выявления первых симптомов заболевания до пункционной биопсии почек составляла от I мес. до 26 лет.

Д;. сопоставления данных морфологического исследования с результатами клинического обследования больные разделены на

группы в зависимости от функционального состояния почек (Мамаева Г. Г., 1986). Первую группу составили больных сахарным диабетом без клинических признаков поражения почек (доклиническая стадия диабетической нефропатии). В качестве критериев отбора использованы следующие при' гаки: отсутствие протеин-урии, уровень креатинина крови не более 106 мкмоль/л, скорость клубочковой фильтрации (СКФ) на основании расчета суточного клиренса эндогенного креатинина, отнесенная к стандартной площади поверхности тела (1.73 м2), не ниже 100 мл/мин х 1„73 м2, нормальное артериальное давление (табл. I). Вторую групп у составили больные в стадии малых клинических симптомов нефропатии. У больных этой группы выявляли преходящую или постоянную лротеинурию, уровень СКФ не менее 70 мл/мин х 1.73 м , содержание креатинина крови не более 106 мкмоль/л, артериальное давление в пределах возрастной нормы (табл. I). Третью группу составили больные с выраженными коническими симптомами диабетической нефропатии. Критериями отбора были следующие признаки: наличие постоянной прогеинурии, уровень СКФ ним 100 мл/мин х 1.73 м2, но не' более 40 мл/мин х 1.73 м2, содержание креатинина крови не более 106 мкмоль/л, повышенное артериальное давление (табл. I).

Для исследования биоптатов почек использовали гистологические, гистохимические, иммуногистохимические на светооптичес-ком и электронномикроскопическом уровнях, электронномикроскопи-ческий, морфометрический и статистический методы. Столбик почечного биоптата под контролем лупы делили на 3 части. Одну часть исследовали иммуногистохимическими методами на светооптическом уровне. Вторую часть биоптата использовали для иммуноэлектронно-микроскопического исследования. Оставшуюся часть биоптата фикси-

КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ ИЗСД

Таблица I

Клинич. Число Возраст Продолжит. Среднесут. Среднесут. АД ' Протеин- СКФ

стадии больных (годы) манифест. доза инсу- гликемия (мм рт. урия (ил/мин?

диабет. (м/ж) ИЗСД лина (ммоль/л) ст.) (г/сут) 1*73 ис)

нефропатии (Дд/кг)

1

2 3

27 30.0+1.61 7.4+1.34

(17/10)

СХ7?1)

(10^3)

29.0+1.14 8.9+0.87 28.1+2.50 14.3+1.66

0.7Р+0.051 11.7+0.79 119/76 0.85+0.055 12,6+0.87 124/78 П. 89+0.057 14.5+1.02 137/84

1 - Доклиническая стадия диабетической нефропатии;

2 - Стадия малых клинических симптомов нефропатии;

3 - Стадия выраженных клинических симптомов нефропатии.

нет 125.1+8.21 0.32+0.11 98.5+8.23 0.84+0.22 70.4+5.51

I

со

I

ровали в 1% растворе четырехокиси осмия и заливали в аралдит. Со всех образцов готовили полутонкие срезы, которые окрашивали мети леновым синим-азуром П-фуксином (Humphrey P.,Pittman Р., 1974 )• В результате одномоментной двукратной биопсии почек от 10 больных получено 2 столбика почечной ткани, одг i из которых исследовали иммуногистохимическими методами и в электронном микроскопе, а другой - гистологическими и гистохимическими методами. Для этого почечный биоптат фиксировали в 10^ нейтральном формалине, готовили парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Газону, азаном по Гейденгайну, конго красным, проводили PAs-реакцию. Для иммуно-гистохимического исследования на светооптичеоком и электронноми-кроскопическом уровнях (непрямой метод Кунса) использовали специфические сыворотки против человеческих иммуноглобулинов А, М, G , в т.'-те СЗ и С9 - фракций комплемента, рецепторы сн-1 (Boehring, ФРГ), инсулина (novo, Дания), ano-J липопротеидов низкой плотности (апо-В ЛПНП)*.

Пслутонкие срезы использовали для светооптического изучения, определения морфометрических показателей, а также для прицельной заточки пирамид для электронномикроскопического исследования. Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе Ш-410 (Philips , Нидерланды).

Морфометрическое исследование почечных клубочков проведено с помощью компьютерной телевизионной микроденситометрической системы (КТМС) "ЛВД.ГОРФ", разработанной в лаборатории цитологии

* Приношу глубокую благодарность профессору В. АЛйгорневу за предоставленную сыворотку.

НИИ физикохимической медицины (зав. - проф. Э.М.Коган). При автоматизированном исследовании с использованием КТМО "ДИАМОРФ" определяли следующие основные морфометрические показетели почечных клубочков: площадь почечного тельца, периметр боуменовой капсулы, площадь а периметр мезангия и капилляров гломерул. С помощью методов математического моделирования определяли границы взаимного соприкосновения капилляров и мезангия, после чего измеряли среднюю протяженность этих контактов (ГОШ). Кроме того, рассчитывали среднюю долю фильтрационной поверхности кдубочковых капилляров по формуле:

ФГТ = (PK - пкм) х 100% PK

где ФП - средняя доля фильтрационной поверхности капилляров клубочка, PK - среднее значение периметра капилляров, ПКМ - средняя протяженность контактов "капилляр-мезангий". Далее рассчитывали относительную протяженность фильтрационной поверхности в почечном клубочке по формуле:

ОФП - РКК- кпкм опк

где ОФП - относительная протяженность фильтрационной поверхности в почечном клубочке, РКК - суммарный периметр капилляров клубочке, КПКМ - суммарная протяженность контактов капилляр-мезангий, ОПК - объем почечного клубочка. Количественное исследование почечных кдубочков с г: умощью КТМС "ДИАМОРФ" проводили в группах больных с продолжительностью ИЗСД до 3-х лет и от 9 до 15 дет. Группой сравнения послужили биоптаты больных периодической болезнью, у которых отложение амилоида и ультра структурные изменения в почечных клубочках не найдены.

Для количественной оценки объема паренхиматозных элементов

коркового вещества почек (01Ш) использовали полуавтоматический морфометр "Leitz-asm Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью стандартного пакета программ statgiuphics с использованием IBM РС/АТ.

Для уточнения механизмов развития пиабетической нефропатии изучали почки 16 крыс породы '\vistar" с экспериментальным диа-бето//. Диабет нндугировали интраперитонс льным введением стрепто-зотодина enigma"), разведенного в цитратно-фосфатном буфере в дозе 40 мг/кг I раз в сутки в течение 4-х дней с дополнительным введением адъюванта Фрейнда. Крысам контрольной группы (18 животных) соответствующего пола и возраста вводили только цитратно-фоСфатный буфер и адъюванг Фрейнда. Еивотных (по 5-6 из каждой группы) выводили из эксперимента методом декапитации на 19, 35, 105-е сутки после последнего введения препарата. В те же сроки

опредег'-':! уровень глюкозы крови и иммунореактивного инсулина в

t?s

сыворотке с помощью радиоиммунного набора I-'nsulin RIA KIT (Венгрия). Гистологическое, гистохимическое и электронномикрос-копическое исследование экспериментального материала производилось по той же схеме, что и. биопсийного. Иммуноморфологическоб исследование почек осуществляли прямые методом Кунса. Для этого фиксированные срезы обрабатывали кроличьими сыворотками против ^-глобулина крысы.

Клиническое обследование больных проведено в лаборатории хирургии печени и желчных путей (зав. - проф. Э.И.Лэльперин) при кафедре хирургических болезней й 2 2-го лечебного факультета (зав. - член -корр. РАМН, проф. ГЛ.Соловьев), на кафедрах терапии и профзаболеваний (зав. - проф. Н.А.Цухин) и эндокринологии (зав. - член-корр. РАМН, проф. И.И.Дедов) ММА им. И.;.',.Сеченова.

Результаты исследований и их обсуждение

На основании светооптического, электронномикроскопического, иммуношистохимического и морфометрического анализа нефробиопта-тов 66 больных ИЗСД выделены 3 степени диабетической нефропатии.

Первая степень диабетической нефропатии. При светоолтическом исследовании выявлено слабое расширение мезангия почечных клубочков, незначительное увеличение количества мезангиальных клеток, базальных мембран капилляров клубочков тонкие. В интерстидии почки встречаются очаги склероза, в которых видны утолщенные тубулярные базальные мембраны. В этих же участках нефроциты извитых канальцев уплощены, а просвет их расширен. При иммуногистохимическом исследовании обнаружена фиксация ig с и СЗ-фракции комплемента чаще линейного, реже гранулярного, очэгового или диффузного характера на базальных мембранах капилляров клубочке, в мезангии и на тубулярной базальной мембране. При электронномикроскопическом исследовании выявлено, что увеличение мезангия происходит за счет гипертрофии мезангиалышх клеток. Мезангиальный матрикс представлен мелкими электронноплотными глыбками. В отделышх участках lamina densa базальных мембран капилляров кдубочксв обнаружены участки ее расщепления, различные по протяженности. Толщина базальных мембран капилляров существенно не менялась. Для первой степени диабетической нефропатии характерно появление субэндотелиальных электроннопрозрачных масс. Подоциты, как правило, увеличены в размерах, имели округлое, крупное ядро с равномерным распределением хтюматинот. В цитоплазме обнаружены хорошо развитые гранулярный эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи. Митохонд рии были равномерно распределены по цитоплазме. Малые ножки подо

цитов сформированы правильно. Однако в участках расщепления база льной мембраны капилляров клубочков выделено их распластывание по базальной мембране. Кроме того, найдены неравномерно утолщенные участки тубулярной базальной мембраны. При иммуноэлектронно-микроскопическсм исследовании обнаружена фиксация иммунных комплексов, состоящих H3ig си СЗ-фракции комплемента в lamina densa базальных мембран капилляров клубочков г тубулярной базальной мембране линейного характера. Наблюдалось также локальное исчезновение рецептора ск-I на поверхности подоцитов, что объясняет своеобразие воспалительной реакции на отложение иммунных комплексов в условиях сахарного диабета.

Вторая степень диабетической нефропатии. При светоолтическом исследовании выявлены более выраженные изменения почечных клубочков: диффузное умеренное рас прение мезангия, обусловленное увеличением количества мезангисцитов и накоплением мезангиального матрчкса. В отдельных клубочках найдены участки интерпозиции мезангия. Базальная мембрана капилляров утолщена, однако, и участках аневриаматических расширений просветов капиллярных петель отмечено их истончение. Эксгракапиллярное пространство сужено. Капсула клубочков местами разрыхлена, утолщена. Кроме того, обнаружено увеличение количества участков склероза интерстиция, по сравнению с первой степенью диабетической нефропатии; в них определяется утолщение и расслоение тубулярной базальной мембраны. Большинство нефроцитов извитых канальцев, главным образов в проксимальной части нефр^на находилось в состоянии гиалиново-капельной дистрофии, выявлена атрофия нефроцитов в отдельных канальцах. Обнаружены гиалинизиро-ванние артериояы.

При электронномикроскопическом исследовании почечных клубочков обнаружены изменения мезангия и базальных мембран капил- . ляров клубочков: межкапиляярное пространство расширено как за счетумеренного увеличения числа мезангиальных клеток, так и за счет накопления мезангиального матрикса. Мезангиальные клетки сохраняли клеточную активность. Мезангиальный матрикс представлен мембраноподобным веществом, местами в значительных количествах, где он как бы замуровывал мезангиальные клетки. Расширение ыеэангкя сопровождалось увеличением протяженности контактов "капилляр-мезангпй" и распространением мезангиальных клеток вместе с окружающим их мезангиальным матриксом под эндотелий отдельных петель, что обусловливало сдавление просветов этих капилляров. В мезангиальном матриксе отдельных клубочков встречались коллагеновые волокна с характерней поперечной исчерченностью. Базальная мембрана капилляров клубочков неравномерно утолщено: участки выраженного утолщения чередовались с участками истонченной базальной мембраны капилляров. Казальная мембрана капилляров клубочков в участках утолщения теряла свои ультраструктурные особенности и выглядела однородной, гомогенной. Характерные субэн-дотеливльные отложения хлопьевидного материала были значительно более выраженными, чем при первой степени диабетической нефро-патии. Выявлены значительные изменения эндотелиальных клеток; они резко увеличены в размерах, закрывают просвет отдельных капиллярных петель. Подоциты увеличены в размерах, набухшие. Комплекс Гольдки, гранулярный эндоплазматический ретикулум и митохондрии были расположены, в основном, около ядра, а остальная часть ' итоплазмы - бедна органеллами. В отдельных подоцитах найдет липидные включения.

при электронномикроскопическом исследовании извитых канальцев обнаружены признаки гиалиново-капельной дистрофии нефроцитов, особенно в проксимальных отделах. При этом определяются участки деструкции щеточной каемки. В отдельных нефроцитах извитых канальцев обнаружены липидные включения. Тубулярная базальная мембрана неравномерно утолщена, местами расслоена и расщеплена.

При иммуногистохимическ^м исследовании найдены отложения компонентов иммунных комплексов в разных сочетаниях чаще лик:Й-ного, реже - гранулярного характера. При иммуноэлектронномикро-скопическом исследовании отложения иммунных комплексов выявлены в lamina densa базальной мембраны капилляров клубочков. При этом отложения характеризовались большей распространенностью, a lamina densa была утолщена. Преобладание какого-либо класса иммуноглобулинов или фракции комплемента не обнаружено. Однако частота выявления фиксированных антител к инсулину, апо-В липо-протеидам низкой плотности, иммуноглобулинам А и M на почечных ' структурах были выше, чем при первой степени диабетической нефро-патии (табл. 2).

Третья степень диабетической-нефропатии. При светооптическом исследовании обнаружен диффузный гломерулосклероз, склероз интерстиция, уменьшение объема паренхиматозных элементов органа, т.е. можно говорить о формировании диабетического нефросклероза.

При гистологическом исследовании почечных клубочков выявлено резкое расширение мезангия за счет, главным образом, накопления pas-положительного мезангиального матрикса. Расширение мезангия сопровождалось выраженным диффузным утолщением б~залышх мембран тапилляров клубочка, которые были также резко pas -положительными.

Таблица 2

ГОИУНОГИС ТОХИМЛЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТШ В ЗАВИСИМОСТИ.ОТ ВЫРАЖЕННОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ПОЧЕК *•

Компоненты

ЯМ.'.'УННЫХ

комплексов

Степень диабетической нефропатви

Достоверность разности встречаемости признака

I П Ш

п = 9 п= 21 п= II

4 Б В

абс.(2) абс.(Я) абсЛ%)

А - Б

А - 3 (Р)

Б -

Актите ла К 1Н су ли ну - 14/14,4/ 10/16,1/ СО,001 <0,001 -

Антител? " к апо-В ЛПНП 1/5,4/ 13/13,4/ 10/16,I' 40,02 <0,001 _

7/36, Я/ 15/15,5/ 10/16,1/ - - -

1е А .2/10,V 15/15,5/ 8/12,9/ <0,02 <0,05 -

16 м 2/10,5/ 16/16,5/ 10/16,1/ <0,01 <0,002 -

сз 7/36,8/ 18/1Я.6/ 6/Я.8/ - - <0,1

сз - 6/16,1/ 8/12,9/ <0,П01 <0,001 <0,02

ИТОГО: 13/100/ 97/ЮСу 62/10С/

с--

I

* Пвимечание: Суммарная частота выявления компонентов иммунных комплексов в почечной ткани превышает число наблюдений, так как в большинстве наблюдений имелось сочетание сиксахии различных компонентов этих комп ексов.

Кроме того, найдены экссудативные компоненты диабетического гло-мерулссмереза - "капсульнан капля" и "фибринсвая шапочка", Экстракапиллярное пространство резко уменьшено, появлялись синехии между париетальным листком капсулы клубочка и капиллярными петлями. Капсула клубочков резко утолщена, расслоена. Яольшинство нефрсцитсв извитых канальцев находилось в состоянии гиалиново-капельной дистрофии, выражен^ атрофия нефроцитов. Характерен сегментарный или циркулярный гиалиноз артериол.

При им.муногистохимическом исследовании выявлено отложение антител к инсулину и апо-В ЛПНП, иммуноглобулинам А, М, С, СЗ-фрак1-ции комплемента в почечных структурах с той же частотой, что и при второй степени диабетической нефропатии, а фиксация СЭ-фракиии комплемента в почках встречалась несколько чаше, чем пси второй степени (табл. 2).

При электронномикроскопическом исследовании почечных клубочков основные изменения касались мезангия и базальных мембран капилляров клубочков. Объем межкапиллярного пространства был резко увеличен за счет накопления мезангиального матрикса, который чаще всего представлен гомогенным электроннсплотным материалом. Однако определялись участки разрыхления мезангиального матрт,кса и накопления коллагеновых фибрилл. Мембраноподобное вещество, заполняющее межкапиллярные пространства, сдавливало мезангиаль-ные клетки, В цитоплазме мезангиоцитов найдет липидные включения, слабо развитые канальцы гранулярного эндоплазматического ретикулума, цистерны комплекса Гольджи, рибосомы и полисомы, мелкие митохондрии. Расширение и интерпозиция мезангия обусловливали сужение просветов капилляров клубочков и -меньшение фильтрационной поверхности капилляров. Базальная мембрана капилляров

клубочков было неравномерно утолщена, во многих капиллярных пет- ' лях гомогенизирована, встречались участки неравномерной электронной плотности¿Отмечена характерная отслойка эндотелиальных клеток и накопление в субэьдотелиальном пространстве хлопьевидных элект-роннопрозрачных масс.

Морфометрический анализ был проведен в двух группах больных: с продолжительностью ИЗСД до 3-х лет (первая группа) и более 3-х лет (вторая группа). Причем в первой группе оказались больные с первой степенью, а во второй - со второй степенью диабетической нефропатии. Морфометрический анализ показал, что в обеих группах Ольных достоверно возрастал относительный объем мезангия (13.0+0.82 и 17.4+0.91 соответственно) п^ отношению к группе сравнения (11,6+1,06). При этом у всех больных по мере увеличения продолжительности МЗСД возрастала протяженность контактов "капил-ляр-мезангий" и, соответственно, снижалась доля фильтрационной поверхности капилляров клубочков (ФП). Однако относительная про-1:женность фильтрационной поверхности в почечном клубочке у больных первой группы по отношению к группе сравнения не только не уменьшалась, но и несколько увеличивалась (3.8+0.16 и 3.6+0.26, соответственно), что можно объяснить увеличением объема клубоч-ковых капилляров. У больных второй группы увеличение объема мезангия и соответствующее снижение ФП не компенсировалось увеличением объема клубочковых капилляров, поэтому наблюдалось снижение относительной протяженности фильтрационной поверхности клубочка (3.1+0.15).

С помощью корреляционного анализа у больных И^СД выявлена положительная связь между относительным объемом мезангия и про-дслг-тельностью манифестного ИЗСД ( г = 0.58, р <1 0.002) и отрицательная связь - между относительным объемом мезангия и ФП, и

относительной протяженностью фильтрационной поверхности клубочка ( г =-0.39 и -0.42, при Р<0.05, соответственно), между относительным объемом мезангия и относительным объемом паренхимы ( г = г-0.46, р < 0.02).

Сопоставление данных клинического обследования больных ИЗСД с результатами морфологического исследования нефробиоптатов представлено в табл. 3. Как видни из таблицы, у больных в доклиническую стадию выявляются первая и вторая степень диабетической лефро-патии, что подтверждает показания к производству биопсии почек у больных ИЭСД без клинических симптомов нефропатии. У больных в стадию малых клинических симптомов нефропатии при морфологическом исследовании почек выявлялась обычно вторая или третья степени диабетической нефропатии, а в стадию выраженных клинических симптомов - чаще третья степень диабетической нефропатии.

Таблица 3

КЛИНККО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ

Степень диабетической нефропатии Клинические стадии диабетической нефропатии ' ВСЕГО

доклинич. малых клиническ. симптомов .выраженных клинических симптомов

I 10 I - II

П 17 13 I 31

ш - 12 12 24

ИТОГО: 27 26 13 66

При анализе экспериментальных данных у крыс на 1&-е сутки после последнего введения стрептозотоцина отмеч£ ись постпранди-альная гликемия и падение уровня иммунореактивного инсулина в

сыворотке крови (табл. 4), а при гистологическом исследовании поджелудочной железы выявлен "инсулит", что свидетельствует, соглас-HOLike л. , Roeini А.(1976), о развитии экспериментального диабета, максимально приближенного по патогенетическому механизму к сахарному диабету первого типа у человека. На Я5-е сутки эксперимента при светооптическом исследовании выявлено незначительное расширение мезангия со слабой пролиферацией мезангисцитов в отдельных клубочках, набухание нефроцитов извитых канальцев. При иммунофлюо-ресцентном исследовании обнаружено очаговое гсануляшое отложение иммуноглобулинов на.базальных мембранах капилляров клубочков и в мезангии '-дубочков. С помощью электронномикроскопического исследования выявлено отложение электроннопло: :ого материала под эндотелием и в парамезангиальной области, отмечено расширение мезангия за счет пролиферации мезангиальных клеток и накопления мембра-ноподобного вещества. На 105-е сутки экспериментального диабета при светооптическом изучении выявлено очаговое расширение мезан-пт и фокальное утолщение базальных мембран капилляров клубочков. Нефроциты извитых канальцев выглядели набухшими, вакуолизирован-ными, а при pas -реакции были слабо положительными. Иммуноморфо-логически обнаружено очаговое гранулярное и линейное отложение иммуноглобулинов на базальной мембране капилляров клубочков и в мезангии. Электронномикроскопически выявлены субэндотелиальные и парамезангиальные депозиты, расширение мезангия за счет увеличения его матрикса. Базальная мембрана капилляров клубочков местами расщеплена, имелись участки истончения. с

Таблица 4

Показатели

ПОКАЗАТЕЛИ ГЛИКЕМИИ и ИШУНОРЕАКТИВНОГО ИНСУЛИНА (ИРИ) У КРЫС В РАЗНЫЕ СРОЮ! ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА (М+ м)

19-й день

35-й день

Ю^-й день

контроль диабет п = 6 п = 5

контроль диабет

контроль диабет п -5 п = 6

Гликемия ммоль/л

5.5+0.3 19.7+2.4 5.6+0.3 17.9+4.9 5.7+0.4 22,3+3.2

I

ИРИ, мк ЕД 26,6+5.5 15.4+1.8 37.3+4.8 8.9+0.4 29.1+3.7, 1.5+0.7

Различия с контролем достоверны (р < 0.01)

ЗАКЛЮЧЕНИИ

Результаты морфологического исследования диабетической нефро-патии свидетельствуют о ведущей роли метаболических и иммунных нарушений в развитии структурньк изменений почек, которые ведут к повреждению почечных клубочков и, одновременно, вызывают развитие артериологиалиноза, который, в свою очередь, способствует прогрессировал™) гломерулосклероза.

С помощью гистологического, иммуногистохимического на световом и ультраструктурном уровнях, электронномикроскопического, мор-фометрического методов выделены три степени тяжести диабетическое нефропать.., коррелирующие с клиническими стадиями течения.

В начальную стадию течения ИЗСД в почках нередко развивается своеобразный "диабетический гломерулонефрит". Невыраженная воспалительная реакция в клубочке в ответ на отложение иммунных комплексов обусловлена дефектом рецепторов клеток клубочков, главным образом, мезангиоцитов и подоцитов, связанным с нарушениями белкового синтеза при диабете. Во вторую стадию в результате усиления синтетической функции мезангиальных, эпителиальных и эндотелиаль-ных клеток клубочков формируется диабетический гломерулосклероз, который в дальнейшем прогрессирует в нефросклероз. Такая-же зако-. номерность прослежена и при изучении экспериментального материала. На 35-е сутки экспериментального диабета у крыс наблюдается отложение иммуноглобулинов в клубочках, однако, воспаление не развивается. На 105-е сутки появляются признаки реакции клеток клубочков, главным образом мезангиальь-.х и подоцитов, на фиксированные иммунные комплексы - расширение межкапиллярных областей и утолщение баэальных мембран капилляроЕ клубочков.

".ммуногистохимическое исследование диабетической нефропатии ьыяпило х^яд особенностей фиксации компонентов иммунных комплексов

в зависимости от продолжительности заболевания и степени диабетической нефропатии. Так, у больных с непродолжительным ИЗСД отмечается фиксация преимущественно Ig G и СЗ-фракции комплемента, на базальных мембранах клубочковых капилляров и тубулярных базаль-ных мембранах линейного характера, что объясняется развитием неферментативного гликирования коллагена и формированием иммунных комплексов in situ . При увеличении продолжительности ИЗСД отмечается нарастание метаболических нарушений. При этом в качестве антигенов выступают экзогенный инсулин и гликированные белки плазмы и капиллярной стенки, что проявляется, в частности, увеличени-2м частоты фиксации в почках антител к инсулину и апо-3 ЛИКИ. Получены результаты, указывающие на зависимость степени диабетической нефропатии от качественного состава отложений иммунных комплексов: при первой степени диабетической нефропатии преобладают этложенил Ig G и СЗ-фракции комплемента, а при второй и третьей степенях - увеличивается частота фиксации igA , Л, антител к ин-' :улину и апо-В ЖИ!П.

Результаты морфологического и морфометрического исследования юдтверждают наибольшее значение расширения мезангия в прогрессировать диабетической нефропатии. Расширение мезангия почечных слубочков сопровождается уменьшением доли фильтрационной поверх-юсти капилляров клубочка. Но на начальной стадии диабетической 1ефропатии уменьшение доли фильтрационной поверхности в капилля-)е компенсируется увеличением объема капилляров клубочков и тем :амым сохраняется относительная площадь фильтрационной поверхности в клубочке. Активация коллагенсинтетической функции меэанги-1льпых клеток обусловлена гипергликемией и воздействием мезанги-1льных и субэндотелиальных депозитов. Нельзя исключить активацию :интетической функции клеток клубочка под воздействием гипоксии,

обусловленной нарастанием гиалиноза приносящих артериол.

Содружественное изменение меэангиальных, эндотелиальных и эпителиальных клеток клубочка при сахарном диабете выэьтает нарушение межклеточных взаимодействий и способствует пиогрессирова-нию диабетического гломерулосклероза. Нарастание диабетического гломерулосклероза, в свою очередь, ведет к повреждению канальцево го аппарата, как за счет развивающегося на уровне клубочков блока кровотока, так и за счет увеличения порозности клубочкового фильтра.

ВЫВОДЫ

1. выраженность морфологических изменений почек при диабетической нефропатии обусловлена комплексом метаболических и иммунных нарушений и зависит от продолжительности течения манифестного ИЗСД. Стадии клинического течения диабетической нефропатии коррелируют со степенью морфологических изменений почечных структур.

2. Для первой степени диабетической нефропатии клинически характерны гипергликемия и повышение скорости клубочковой фильтрации. Морфологически обнаруживаются изменения базальной мембраны капилляров клубочков, сегментарное расширение мезангия,-обуслов- . ленное гипертрофией или слабым увеличением числа мезангиальных клеток; иммуногистохимически - фиксация С и СЗ-фракции комп^ лемента на базальных мембранах капилляров слубочков и канальцев линейного характера.

3. Вторая степень диабетической нефропатии клинически характеризуется микроальбуминурией или преход.гцей протеинурией. Морфологически выявляются признаки диффузного диабетического гломерулосклероза: расширение мезангия за ^чет накопления мезангиального матрикса и слабого или умеренного увеличения числа мезангио-

цитов, уплощение нефроцитов извитых канальцев, утолщение и расслоение тубулярной базальной мембраны, сегментарный гиалиноз ар-териол; фиксация иммунных комплексов, антигенами в которых являются инсулин и апо-В ЛПНП, в базальной мембране капилляров клубочка.

4. Для третьей степени диабетической нефропатии клинически типичны преходящая или постойная протеинурия, повышение артериального давления. При морфологическом исследовании выявляются диффузная и смешанная формы диабетического гломерулосклероза. Расширение мезангия обусловлено накоплением мезангиального мат-рикса и слабым увеличением числа мезангиальных клеток; в почечных клубочках определяются экссудативные проявления диабетической нефропатии; характерен диффузный склероз интерстиция, гиалиноз артериол. В почечной ткани фиксируются разнообразные иммунные комплексы, в состав которых входят различные иммуноглобулины и фракции комплемента.

5. Наибольшее значение в прогрессировать диабетической нефропатии имеет расширение мезангия, что, в конечном итоге, приводит к сдавлению капиллярных петель и, соответственно, снижению плоцади фильтрационной поверхности. На начальной стадии разгчтия диабетической нефропатии уменьшение площади фильтрационной поверхности в капиллярах компенсируется увеличением относительного объема капилляров клубочков.

6. Последовательные морфологические изменения почек при сахарном диабете тлеют различные иммуногистохимические особенности. Нарастание иммунных нарушений коррелирует с продолжительностью заболевания.

7. Иммуноэлектронномикроскопическое исследование позволило^ уточнить, что иммунные отложения на базальной мембране капилляров

клубочков локализуются, главным образом, в lamina densa и

имеют линейный характер, что указывает на формирование иммунных комплексов in situ. Отсутствие cr-I-рецепторов на поверхности подоцитов свидетельствует о нарушении их синтеза.

8. Результаты иммуноморфологического исследования почек крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом подтвердили данные, полученные при анализе биопсийного материала, о важной роли иммунопатологических механизмов на начальной стадии развития диабетической нефропатии.

Автор выражает глубокую признательность за методическую и практическую помощь в работе сотрудникам лаборатории по изучению межклеточных взаимодействий НИЦ ММА им. И.М.Сеченова с.н.с. Э.С.Севергиной и в.н.с. А.А.Иванову, а также сотрудникам кафедры патологической анатомии 1-го лечебного и санитарно-гигиеническогс факультетов ММА им. И.М.Сеченова проф. В.А.Варшавскому, к.б.н. Е.П.Проскурневой;.лаборатории цитологии НИИ физико-химической медицины Минздрава Российской Федерации проф. Э.М.Когану, с.н.с.

A.В.Кукоцко^, Н.И.Якубовой; Всероссийского эндокринологического научного центра РАМН к.м.н. Я.Ю.Кондратьеву, к.м.н. Ю.М.Кеда,

B.А.Горсковой.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЫЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пато- и морфогенез сахарного диабета и ранней диабетической нефропатии /в соавт. с Э.С.Севергиной/. Архив патологии, 1988, в.4, с.80-85.

2. "Диабетическая почка" /патогенез, диагностика и лечение/ /в соавт. с В.Г.Спесивцевой, Г.Г.Мамаевой, Л.К.Старосельцевой, А.А.Карелиным, ¿i.А.Варшавским, С.Б.Шапиро, А.В.Базаровой, 3.0.Ге-

оргадзе/. Сб.тез.докл. Ш Всесоюзного съезда эндокринологов, Ташкент, 1989, с.341-342.

Л

3. Функциональные почечные резервы у больных сахарным диабетом /в соавт. с Н.А.Мухиным, И.И.Дедовым, М.В.Шестаковой,

М.А.Пальцевым, В.А.Варшавским, Э.С.Севергиной, А.Ю.Николаевым, Д.Ю.Окуневым/. Терапевтический архив, 1990, № 2, с.107-110.

4. Морфология диабетиче кой невропатии при экспериментальном диабете, вызванном низкими дозами стрептозотоцина /в соавт. с В.А.Варшавским, А.В.Базаровой, А.А.Карелиным, Ю.А.Панковым, Я.Ю.Кондратьевым, Ю.М.Кеда, В.А.Горсковой/. Архив патологии,

1990, в.7, с.43-48.

5. Морфологические проявления доклинической стадии диабетической невропатии /в соавт. с Э.С.Севергиной/. Архив патологии,

1991, в.7, с.55-60.

6. Иммуногистохимическая характеристика диабетической неф-ропатии при инсулинозависимом сахарном диабете /в соавт. с

М.А.Пальцевым, Э.С.Севергиной, Т.Г.Дюжевой/. Сб.тез.докл. П Всероссийского съезда эндокринологов, 1елябинск, 1991, с.144-145.

7. Новый метод мор^сметрического исследования почки с использованием компьютерного мор<Тометрического комплекса "ДИАМОРФ" /в соавт. с А.В.Жукоцким, Н.И.Якубовой, Б.А.Пуртовым, М.АГПаль-цевым, Э.М.Коганом/. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1992, № 3.

8. The morphological aspects of insulin-dependent diabetes mellitus /with M.A.Paltaev, E.S.Severgina, T.G.Diuzjeva/. Inter, society for pathophysiology, Moscow, 1991, p.211.

9. The Structural changes of the renal £Догаеги1иа in the

preclinical stage of diabetic nephropathy /with M.A.Paltsev, E.S.Severgina, I.I.Dedov/. Abstr. 13th Eur.Congr.Pathol., Ljubljana, 1991, Pathol.Res. andPract., 1991, v.187,N 6,p.741-742.