Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Наследственный рак молочной железы и/или яичников: ДНК-диагностика, индивидуальный прогноз, лечение и профилактика.

На правах рукописи

ЛЮБЧЕНКО ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

Наследственный рак молочной железы и/или яичннков: ДНК-диагностика, индивидуальный прогноз, лечение и профилактика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

14.00.14. — онкология 03.00.15 — генетика

2 6 НОЯ 2009

Москва—2009

003484753

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина Российской Академии Медицинских Наук

Директор — академик РАН и РАМН, профессор Михаил Иванович Давыдов

Научные руководители:

доктор медицинских наук, проф. Раиса Федоровна Гарькавцева доктор медицинских наук, проф. Владимир Васильевич Брюзгин

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, профессор Член-корр. РАМН, проф. Доктор медицинских наук, проф.

Николай Павлович Бочков Николай Евгеньевич Кушлинский Одинцов Сергей Владимирович

Ведущая организация: Кафедра генетики

Российской Медицинской Академии последипломного образования

Защита диссертации состоится <«-//»^¿^¿¿2009 года в /С часов на заседании диссертационного (Д.001.017.02) Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан: « »_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Ежегодно в мире регистрируется 10 млн. новых случаев рака и более 6,2 млн. смертей от заболеваний этой группы. От 5 до 40% злокачественных новообразований всех анатомических локализаций имеют наследственную этиологию, и этот процент возрастает в связи с ростом общей заболеваемости.

На сегодняшний день в литературе описано около 200 наследственных онкологических синдромов, для 70 из которых полностью расшифрованы первичные молекулярные дефекты или установлена хромосомная локализация му-тантных генов, а ДНК-диагностика стала рутинным методом исследования в ходе верификации генетического диагноза.

К числу таких заболеваний относятся одно- и двухсторонний рак молочной железы и/или яичников (РМЖ/РЯ). Предметом исследования в этих случаях являются онкогены и гены-супрессоры злокачественной трансформации клеток BRCA1, BRCA2, СНЕК2, ТР53, K1LH1 MSH2, консервативные наследуемые дефекты в которых приводят к парадоксально высокому риску развития рака, достигающему нередко 60-95%.

Выделение генов, ответственных за наследственную предрасположенность к РМЖ/РЯ, создало принципиально новые возможности медико-генетического консультирования — ДНК-диагностика мутаций обеспечивает подтверждение генетического диагноза, расчет риска развития заболевания, возможность ранней диагностики, выбор тактики лечения и профилактики, а также решение проблем планирования семьи и деторождения.

Критериями постановки генетического диагноза наследственных форм рака являются:

- наличие в семье двух и более родственников I-II степени родства, страдающих злокачественными новообразованиями;

- ранний возраст манифестации заболевания;

- двухстороннее поражение парных органов;

- первичная множественность новообразований у пробанда или его родственников, специфические опухолевые синдромы.

Положительный результат формально-генетического анализа является показанием для проведения ДНК-диагностического исследования с целью выявления структурных и функциональных изменений генов, вовлеченных в наследственный канцерогенез.

Наследуемая молекулярная патология является объективным критерием формирования групп риска в отношении развития рака той или иной локализации для динамического наблюдения лиц указанной группы в условиях онкодиспансера.

Ранее выполненные немногочисленные работы по данной тематике включали небольшие выборки пациентов (40-100 человек) и не имели комплексного подхода.

В настоящем комплексном исследовании представлены обширные результаты по формированию специализированного семейного генетического регистра по нозологическим формам и наследственным онкологическим синдромам, изучению молекулярных основ предрасположенности к РМЖ/РЯ, применению клинико-молекулярной дифференциальной диагностики, определению фено- и генотипических корреляций и оценке возможности ранней доклинической и пренатальной диагностики.

Решение фундаментальных и научно-практических проблем онкогене-тики на примере наследственного РМЖ/РЯ обосновывает необходимость и перспективность представленной работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка тактики и стратегии проведения специализированного медико-генетического консультирования и изучение клинико-генетической гетерогенности наследственных форм РМЖ/РЯ на основе ДНК-диагностики наследственной предрасположенности в семьях с онкологически отягощенным анамнезом.

ЗАДАЧИ

1. Создать и расширять специализированный клинико-генетический регистр и систематизировать молекулярно-генетические «паспорта»

пациентов с онкологически отягощенным анамнезом.

2. Создать банк биологического материала (цельной крови, в-окрашенных метафазных хромосом, геномной и тканевой (опухолевой) ДНК/РНК) пациентов и их родственников.

3. Отработать и внедрить в практику ДНК-диагностические методы выявления структурных и функциональных перестроек генов предрасположенности к развитию РМЖ/РЯ.

4. Провести дифференциальную клинико-молекулярную диагностику при наследственном РМЖ/РЯ.

5. Оценить эффективность применяемых методов ДНК-диагностики (конформационно-чувствительный электрофорез, гибридизация на биочипах).

6. Оценить спектр и частоту молекулярной патологии при наследственном и спорадическом РМЖ/РЯ.

7. Изучить клинико-молекулярный патогенез наследственного РМЖ/РЯ.

8. Определить тактику и стратегию медико-генетического консультирования в онкологии на примере наследственного РМЖ/РЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в России разработана тактика и стратегия МГК в онкологии с использованием высокотехнологичных диагностических методик на примере наследственного РМЖ/РЯ. Впервые:

1. Использована комбинация различных ДНК-диагностических методов для выявления терминальной молекулярной патологии для подтверждения генетического диагноза наследственных форм РМЖ/РЯ

2. Проведена клинико-молекулярная дифференциальная диагностика при наследственных онкологических синдромах с целью верификации генетического диагноза.

3. Выполнено популяционное исследование в структуре общей заболеваемости РМЖ и/или РЯ с использованием технологии оли-

гонуклеотидных биочипов (известные частые мутации генов BRCA1/2 и СНЕК2).

4. Представлена сравнительная оценка точности ДНК-диагностических методов.

5. Охарактеризованы спектры и частоты структурно-функциональных перестроек генов-супрессоров у пациентов с наследственным одно-и двухсторонним РМЖ, РМЖ, развившимся на фоне беременности, РМЖ у мужчин, РЯ.

6. Представлены сравнительные фено-генотипические характеристики наследственного и спорадического РМЖ/РЯ с учетом индивидуального BRCA- и СНЕК2- генотипа.

7. Впервые определены фенотипы BRCA- и СНЕК2-ассоциированных РМЖ/РЯ.

8. Описаны клинические и молекулярные характеристики редких наследственных синдромов, включающих РМЖ/РЯ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

При выполнении работы создан и расширен специализированный семейный генетический регистр РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

С использованием методологии и алгоритмов междисциплинарного сотрудничества онкологической, медико-генетической, молекулярно-биологичес-кой и акушерско-гинекологической служб созданы компьютерная база клинико-генетических и молекулярно-биологических данных и банк биологического гено-типированного материала

Для проведения дальнейших перспективных исследований создан банк клеточных линий типированных мезенхимальных и раковых стволовых клеток, полученных от пациентов, страдающих наследственным и спорадическим РМЖ.

На основании проведенного исследования продемонстрирована значимость и внедрено в клиническую практику комплексное клинико-генетическое обследование с применением ДНК-диагностики наследственной предрасположенности при одно- и двухстороннем РМЖ, РМЖ на фоне

беременности и лактации, РМЖ у мужчин, РЯ (гены BRCA1, BRCA2, СНЕК2, ТР53, MLH1 MSH2), результаты которой будут использованы для индивидуализации диагностики, лечения и профилактики с целью снижения заболеваемости и смертности.

По результатам выполненной работы сформирована самая большая на сегодняшний день в России и странах СНГ выборка генотипированных онкологических больных и группа пациентов-носителей мутаций BRCA1/2.

Впервые в России разработан алгоритм медико-генетического консультирования семей с онкологически отягощенным анамнезом в условиях онко-диспансера на примере наследственного РМЖ/РЯ.

Впервые проведена пренатальная диагностика терминальных генетических дефектов, ответственных за возникновения наследственных форм рака. Принципиально новым профилактическим подходом явилась возможность применения методов преимплантационной диагностики.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Организационная модель медико-генетического консультирования в онкологии на примере наследственного РМЖ/РЯ с использованием высокотехнологичных диагностических методов внедрена и успешно используется в клинической практике различных подразделений РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Состоялась 29 мая 2009 года на совместной конференции лаборатории клинической онкогенетики, отделения амбулаторных методов диагностики и лечения (взрослая поликлиника), хирургических отделений опухолей женской репродуктивной системы, гинекологического, опухолей молочных желез, отделения радиохирургии НИИ КО РОНЦ им. НН. Блохина РАМН, лаборатории скрининга канцерогенов и лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов НИИ канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на российских и международных научно-практических конференциях и съез-

дах: VI-IX, XII Российских Онкологических Конгрессах (Москва, 2003-2005; 2008 гг.), III—V Съездах Онкологов и Радиологов стран СНГ (Минск, 2004; Баку, 2006, Ташкент 2008), V Съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (Москва 2006); Научно-практической конференции «Современные проблемы клинической генетики» (Москва, 2008); 4 Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); 1-Й Российских Интернациональных симпозиумах «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека», Москва 2005; 2009), European Human Genetics Conferences 2003-2009 (Бирмингем; Мюнхен; Прага; Амстердам; Сидней; Барселона; Вена), И41 General Meeting of the Breast Cancer Linkage Consortium (Мадрид, 2003); Familial Cancer Conference (Мадрид 2004; 2008); Milan Breast Cancer Conference (Милан, 2005); 30* Conference of American Society of Preventive Oncology (Bethesda, USA, 2006); 30A Annual Sun Antonio Breast Cancer Symposium «Breast Cancer Research and Treatment» (Sun Antonio, USA, 2007); 19lh International Congress of Anti-Cancer Treatment (ICACT) (Paris, France, 2008); IMPAKT Breast Cancer Conference (Brüssels, Belgium, 2009).

По теме диссертации опубликовано 98 печатных работ в российских и зарубежных журналах, из них 27 — в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, 5 оформлены как главы монографий, справочников и учебных пособий.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материала и методов, результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертационная работа изложена на 295 страницах машинописного текста и включает таблиц, рисунков, родословных.

Список цитируемой литературы включает источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинико-генетические данные объединили генеалогические, цитогене-тические, молекулярно-биологические, патоморфологические и клинические характеристики 2 583 членов 1 678 семей. Среди 1 908 родственников из 570 семей больных (в последующем рассматриваемых как контрольные группы) случаев злокачественных заболеваний не было отмечено.

Сбор клинико-генеалогической информации о семье проводился путем перекрестного опроса пробанда и других членов семьи в процессе медико-генетического консультирования на базе отделения амбулаторных методов диагностики и лечения НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (Москва). Родословная составлялась, исходя из данных о 3-4 поколениях, и включала сведения о сибсах, родителях, прародителях и детях.

Для проведения популяционного исследования были сформированы неотобранные выборки пациентов, страдающих РМЖ и/или РЯ, проходивших обследование и лечение в отделении амбулаторных методов диагностики и лечения (взрослая поликлиника), хирургических отделений диагностики опухолей, опухолей женской репродуктивной системы, гинекологического, опухолей молочных желез, отделении клинической фармакологии и химиотерапии, отделении химиотерапии, отделении химиотерапии и комбинированного лечения опухолей НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. У пациентов было получено информированное согласие об участии в исследованиях.

Параллельно была составлена компьютерная база клинико-генеалогических и генетических данных и создан банк биологического материала (цельная кровь, пластины G-окрашенных метафазных хромосом, ДНК/РНК, выделенные из крови и опухолевого материала, а также клеточных линий мезенхимальных и раковых стволовых клеток, полученных от пациентов, страдающих наследственным и спорадическим РМЖ).

Цитогенетический анализ на предмет выявления количественных и качественных хромосомных аберраций проводили на G-окрашенных метафаз-

ных пластинах лимфоцитов периферической крови, культивируемых по стандартной методики (врач-цитогенетик лаборатории клинической онтоге-нетики О.П. Кириченко).

Молекулярно-генетическая диагностика проводилась в лаборатории сложно наследуемых заболеваний Медико-генетического научного центра РАМН (проф. A.B. Карпухин, к.м.н. Н.И. Поспехова) и лаборатории биочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (к.м.н. Т.В. Наседкина, к.м.н. O.E. Громыко).

Культивирование мезенхимальных и раковых стволовых клеток выполнено на базе лаборатории молекулярной генетики Медико-генетического научного центра РАМН (д.м.н. H.H. Вейко, к.м.н. A.B. Ермаков^

Определение структурных вариантов ДНК генов BRCA1, BRCA2, llOOdelC СНЕК2, ТР53, MLH1 MSH2 проводили с использованием электро-форетического метода и молекулярной диагностики с использованием оли-гонуклеотидных биочипов с последующим подтверждением наличия мутации и выявлением ее характеристик путем секвенирования.

Для электрофоретического определения фрагментов ДНК избран кон-формационно-чувствительный электрофорез (CSGE).

В процессе электрофореза проводили анализ гомо- и гетеродуплексных молекул ДНК (стандартный метод).

ДНК-диагностика стандартным методом включала:

- выделение ДНК из образцов крови пациентов,

- амплификацию экзонов изучаемого гена,

- электрофоретический анализ продуктов амплификации,

- секвенирование фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных.

Метод аллель-специфичной ПЦР и гибридизации на РМЖ-биочипе был использован для анализа наиболее частых точковых мутаций генов BRCA1 (185delAG, C61G, 4154delA, 5382insC), BRCA2 (695delT, 6174delT), CHEK2 (1 lOOdelC) в неотобранных выборках пациентов.

Фрагменты ДНК, анализируемые на биочипе, были амплифицированы с использованием двухэтапной мультиплексной ПЦР с флюоресцентно меченными праймерами.

Секвенирование ДНК проводили в межинститутском центре коллективного пользования «Геном» при ИМБ РАН с помощью набора реактивов BigDye Terminator Version 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3 100-Avant, USA.

Дополнительным методом служила молекулярная диагностика с применением ПЦР в реальном времени.

Следующим этапом работы был ретроспективный анализ стационарных историй болезни и амбулаторных карт пациентов, включенных в исследование.

Подбор и пересмотр гистологических препаратов проведен в отделе пато-морфологии РОНЦ им. Н.НБлохина РАМН (проф. МА Шабанов, в.н.с. O.A. Анурова).

Статистическая обработка результатов многофакторного анализа осуществлялась на ПК с помощью комплекса программ медико-биологической статистики "ACTA", разработанного в лаборатории медицинской кибернетики РОНЦ им. H.H. БлохинаРАМН.

Для оценки выживаемости использовался интервальный метод построения таблиц дожития, рекомендованный UICC. Выживаемость больных высчитывалась на 1.03.2009. Дня сравнения таблиц выживаемости использованы тесты Wilcoxon (Breslouw) и Mantel-Cox. Достоверность выявленных различий рассчитывалась по критерию Стьюдента Достоверными считались различия с вероятностью не менее 95%, т.е. р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В 1997-2008 г. нами активно проводился скрининг пациентов, страдающих одно- и двухсторонним раком молочной железы (РМЖ), РМЖ на фоне беременности и лактации, мужским РМЖ, раком яичников (РЯ), раком желудка (РЖ), раком толстой кишки (РТК), раком легкого (РЛ), медуллярным раком щитовидной железы (МРЩЖ), феохромоцитомой надпочечника,

раком почки, гермииогеиными опухолями яичка и яичников, пациентов с первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗО) и др., лечившихся и наблюдающихся в Российском Онкологическом Научном Центре им. H.H. Блохина РАМН, с целью выявления наследственных форм рака и верификации генетического диагноза.

Критериями отбора пациентов в клинико-генетический регистр служили унифицированные критерии идентификации наследственных форм злокачественных новообразований, предложенные Н. Lynch [69]:

- ранний возраст манифестации болезни (до 45 лет);

- наличие в семье 1 и более родственника I-II степени родства с диагнозом «злокачественная опухоль»;

- случаи РМЖ у мужчин;

- двухстороннее поражение парных органов;

- наличие в семье ПМЗН и специфических опухолевых ассоциаций, составляющих синдромальную патологию.

В результате работы создан и расширен специализированный семейный клинико-генетический регистр РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН (рис. 1).

Образцы биологического материала являются основным источником получения молекулярных данных в процессе научно-практических исследованиях, в связи с чем был создан банк биологического материала (цельная кровь, сыворотка крови, лимфоциты периферической крови, пластины G-окрашенных метафазных хромосом, ДНК/РНК, выделенные из крови и опухолевого материала, клеточные линии мезенхимальных и раковых стволовых клеток).

РМЖ 46,1%

Рак подж. железы

Рис. 1. Клинико-генетические данные о 2 583 членах 1 678 семей

Наследственный рак молочной железы

На первом этапе медико-генетического консультирования и проведения формально-генетического анализа у пациентов, страдающих РМЖ, оценивалась вероятность наследственной этиологии заболевания. В результате пациенты были распределены по группам (рис. 2):

- семейный органоспецифичный РМЖ — 687 больных;

- спорадический РМЖ — 214 больных;

- двухсторонний РМЖ — 107 человек;

- РМЖ на фоне беременности — 80 человек;

- синдром сочетанного РМЖ и/или РЯ — 56 пациенток;

- ПМЗН — 11 человек, 1 опухоль из которых РМЖ;

- РМЖ у мужчин — 8 человек;

- злокачественные листовидные опухоли — 9 больных.

РМЖ у мужчин

Органо-специфичный семейный РМЖ 58,7%

Злокач. 1 листовидные олухоли

1%

9,1%

Рис. 2. Распределение больных наследственным и спорадическим РМЖ

Для подтверждения генетического диагноза и наследственной этиологии РМЖ была выполнена ДНК-диагностика с применением следующих молекулярных методов: (табл. 1).

В настоящем исследовании при скринировании гена ВЯСА1 стандартным методом из 687 пробандов — больных РМЖ, 177 пациентов (25,8%) имели значимые «делеторные» мутации ВЯСА1, в 78,5% случаев (139/177) пациенты наследовали мутацию 5382твС в 20 экзоне гена ВЯСА1.

Среди больных НРМЖ впервые выявлены мутации 2297с1е1Т, 3448тэА, 3366с1е1А гена ВЯСА1, не зарегистрированные в других популяциях (рис. 3).

Кроме описанных мутантных вариантов с известной функциональной значимостью в процессе проведения ДНК-тестирования методом СЗвЕ при НРМЖ выявлен наследуемый гаплотип полиморфных вариантов во 2; 8; 9; 11; 13; 15; 16 и 20 экзонах ВЯСА1 у 37, 5% пациентов (258 из 687). Сочетание мутации и полиморфных вариантов обнаружено у 2% пациентов (14 из 687). Однонуклеотидные ПВ выявлены у 34 человек (5%). ВКСА1 «дикого» типа подтвержден у 25% пациентов (171 человек). Частота встречаемости наследуемого гаплотипа полиморфных вариантов во 2; 8; 9; 11; 13; 15; 16 и 20 эк-

по группам

зонах ВЯСА1 в контрольной группе пациентов составила 35%.

Таблица 1

ДНК-диагностика генов ВЯСА, 1100с1е1С СНЕК2, ТР53, МШ1, \iSH2 у больных РМЖ

Метод

Рабочие моменты

Число протестированных человек

ПЦР+СввЕ + секвенирование (ВЯСА 1/2, ПООсЫС СНЕК2, ТР53, МШ1, М8Н2)

Ш 171 Ш

С С к К в Л 5 ). АI С С С II II Е С А 11 II А 4 4 ь 6 8 ! к !

А Т'Ч

ПЦР+олиго-нуклеотидный РМЖ-биочип (частые мутации ВЯСА 1/2, 110(ШС СНЕК2)

ПЦР в реальном

времени

(ВЯСА1)

1 — ген сравнения

19 20 21

Ш

5 6 7 8

11В

11С

110

3366(1е1А

3448тзА 0,60%

2297йе1Т 0.60%

5382тэС 78,50%

185йе!Ав 6,60%

7,40% 1,10%

1,70% 2,30% 0,60%

Рис. 3. Спектр и частота мутаций ВЯСА1

При проведении стандартного скрининга гена ВЯСА2 выявлено 9 различных мутаций у 12 пациенток, которые были распределены по всей кодирующей части гена ВЯСА2 (2,2%). Оказалось, что «горячих точек» — мутаций, встречающихся с высокой частотой — в российской популяции нет, что подтверждает данные международных исследований.

Среди 9 различных мутаций ВЯСА2:

- 3 делеции — 2001с1е1ТТАТ, 3295ш8Т, 6174<1е1Т;

- 2 нонсенс-мутации: <3472Х, (}2894Х;

- 4 миссенс-варианта: Е394А, Ь3101Р, 11808М, 13169У.

Мутации 4816 ¡пев, 3295тзТ и С>2894Х ранее не были представлены в

базе данных В1С и являются новыми, миссенс-мутации ЬЗ101 Р. П808М, 13169У также не были описаны ранее, что подтверждает молекулярную гетерогенность гена ВЯСА2 и разнородность российской популяции.

В плане определения наследственной предрасположенности рекомендован скрининг всей кодирующей части ВЯСА2.

Кроме того, полиморфные варианты, рассматриваемые как низкопенет-

рантные аллели, ассоциированные с незначительным (до 10-15%) повышением риска развития РМЖ и/или РЯ, обнаружены во 2; 3; 10; 11; 14 экзонах. С наибольшей частотой — в 21% случаев — диагностировали известный частый ПВ в 10 экзоне N37211; в 15% — хорошо изученный частый ПВ 203О/А; в 11% — редкий вариант 7470АЛЗ. Наследуемый гаполип из трех ПВ в 10 экзоне №89Н+1593А/(}+№9Ю выявлен у 5% больных НРМЖ Интронные варианты (8; И; 16; и 21 интрон) диагностировали в нашей выборке с частотой 0,8-42%. Наиболее частым изменением была делеция 4 нуклеотидов в 11 интроне — 1У811+80ёе14 — 42%; редким — замена в 25 интроне 1У824-16Т/С — 0,8%.

В неотобранной в соответствии с семейным анамнезом выборке (410 больных РМЖ), протестированной на РМЖ-биочипе, частота 4-х исследуемых мутаций гена ВИСА] (популяционная) составила 5,1% (21 из 410), что согласуется с литературными данными и отражает низкую популяционную частоту мутаций гена ВЯСА1.

Мутации гена В КС А2 — 695 шбС и 6174(1е1Т — выявлены у двух пациенток, страдающих РМЖ из неотобранной выборки, что составило 0,5%. Эти данные не противоречат популяционным частотам мутаций гена ВЯСА2 в европейских странах.

На сегодняшний день это самая большая выборка в России и странах СНГ как генотипированных пациентов, страдающих РМЖ, так и группа носителей мутаций генов ВИСА 1/2.

С учетом полученных результатов по скринингу мутаций гена ВЯСА1 применяя различные методы ДНК-диагностики мы подтвердили, что с наибольшей частотой НРМЖ в российской популяции ассоциирован с мутацией 5382т$С 20экзона гена ВКСЛ1.

Статистически значимой оказалась более высокая частота всех (за исключении мутации 4154ёе1, которая больше характерна для В НС А1-ассоциированного НРЯ) сравниваемых частых мутаций гена ВЯСА1 в группе НРМЖ, отобранного в соответствии с онкологически отягощенным анамнезом при формально-генетическом анализе по сравнению с частотами мутаций

в неотобранной выборке пациентов РМЖ (популяциониыми), что демонстрирует необходимость проведения предварительного МГК с обоснованием целесообразности проведения ДНК-тестирования (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная частота мутаций генов ВЯСА1/2 в неотобранной выборке больных РМЖ (РМЖ-биочип) и в преднамеренной выборке НРМЖ (СБОЕ)

Ген Экзон Мутация Носители мутаций в неотобранной выборке (п=410) НРМЖ (п=687)

ВИСА 1 2 185<1е1АО 2(0,5%) 12 (1,7%)*

ВЯСА1 5 С6Ш 3(0,73%) 13 (1,9%)*

ВЯСА1 11 4154<1е1А 3(0,73%) 2 (0,3%)

ВЯСА1 20 5382т8С 16(3,9%) 139 (20,2%)*

ВЯСА2 5 695твТ 1(0,24%) -

ВЯСА2 11 6174ёе1Т Роипскг-тШа^оп 1 (0,24%) 2 (0,23%)

* — статистически достоверно

Фенотип ВЯСА-ассоциированного и спорадического РМЖ

Для проведения многофакторного сравнительного гено-фенотипи-ческого анализа прогностически значимых признаков были сформированы группы пациентов с учетом индивидуального генотипа:

- больные, страдающие НРМЖ, обусловленным мутациями гена ВНСА1 (гМВЯСА! — 198 человек);

- больные НРМЖ — носители мутаций гена ВЯСА2 (т1ВКСА2 — 16 человек);

- контрольная группа состояла из 270 больных РМЖ, в семьях которых не было отмечено случаев онкологических заболеваний, а при выполнении молекулярно-генетического исследования было подтверждено, что структура генов ВИСА 1/2 не изменена (и^ВЛСЛ-генотип).

Риск возникновения РМЖ, обусловленного терминальными мутациями гена ВЯСА1/2, максимален в более молодом возрасте — 36 лет и 44 года соответственно. Сохранная менструальная функция на момент возникновения

заболевания преобладала у женщин во всех изучаемых группах, однако, в менопаузе находилось большее число женщин из онкологически отягощенных семей, наследовавших мутации гена ВЯСА2 — 33,3%, по сравнению с группой пациенток-носителей мутаций ВЯСА1 — 14,3% и контрольной группой — 28,0%.

Изучение прогностически значимых признаков определило фенотип гтВКСА НРМЖ:

- молодой возраст (36 В КС А1 и 44 ВЯСА2);

- преобладание ИПР (87% ВНСА1);

- медуллярный рак (7% ВКСА1);

- тубуло-дольковая подгруппа (47,9% ВЯСА2);

- высокая степень злокачественности (61,1 % ВЯСА1 и 37,5% ВКСЛ2):

- отрицательный РЭ-, РП-, НЕЯ2/пеи- статус (80,3% ВЯСА1);

- выраженный лечебный патоморфоз опухоли (ВЯСА1/2) (рис. 5).

пиВИСА НРМЖ (п=36) \vtBRCA СРМЖ (п=41)

Рис. 5. Лечебный патоморфоз при наследственном (а) и спорадическом (б) РМЖ Органосохраняющее лечение с последующей лучевой терапией По нашим данным у пациентов, страдающих НРМЖ-ассоцииро-ванными опухолями с т/БЯС4-генотипом, достоверно чаще — в 30% случаев, и в более короткие сроки — в среднем через 3,4 года — возникали ипси-латеральные опухоли в оперированной молочной железе по сравнению с частотой рецедивных и первичных опухолей после радикальной резекции с последующим курсом лучевой терапии у пациентов СРМЖ с \vtBRCA статусом

(10%, р<0,05). Учитывая данные зарубежных работ и статистически значимые результаты данного исследования, т/ВЯСЛ-генотип может быть использован в качестве предиктивного молекулярного маркера при выборе тактики хирургического лечения.

10-летняя выживаемость статистически достоверно лучше в группах больных НРМЖ с т(В/?С/(-статусом по сравнению с таковыми у пациентов ШВКСЛ СРМЖ — 65; 88 и 49% соответственно (рис. 6).

3 20 -

" Ю-

о ц—|—i—i—|—|—i—,—,—|—I—| 01 23456789 10 11 время наблюдения (годы)

Рис. 6. Общая выживаемость при наследственном и спорадическом РМЖ

Двухсторонний рак молочной железы (ДРМЖ): молекулярно-генетические и клинические характеристики

В исследование были включены 83 больных с диагнозом ДРМЖ, проходивших лечение в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в период 2000-2008 гг. Всем пациенткам выполнена ДНК-диагностика генов BRCA1/2, СНЕК2 HOOdelC и TP53 по стандартной методике. В этой группе больных выявлено 32 (38,6%) носительницы терминальных мутаций, при этом 84.3% (27/32) пациенток имели мутацию в гене BRCA1; 12,5% — 4 больных в гене BRCA2 и 3,1% — в гене ТР53 (1 больная). Мутации 1 lOOdelC в гене СНЕК2 у данных больных не обнаружено (рис. 7). Мутации гена BRCA1 3411 delCT, 3448insA и 3747insA ранее в России не описаны. Все мутации гена BRCA2 являются уникальными.

Двухсторонний рак молочной железы (ДРМЖ)

Семейный

п=51 (61,4%)

miBRCAI/2 — 53% ntiTPS3 — 0%

ДНК-диагностика BRCA1/2, СНЕК2, ТР53 83 больных

Мутации генов п=32 (38%)

Спорадический п=32 (38,5%)

I

mtBRCAI/2 —15,6%

miTPS3 — -3,5%

Рис. 7. Дизайн клинико-генетического исследования ДРМЖ Классическим примером наследственного ДРМЖ может служить клинический случай семьи С. (рис. 8).

□-1-

СН

РМЖ

65

30 РМЖ 45 РМЖ

(2)

38

28 РМЖ 38 РМЖ mtBRCAl

18

Рис. 8. Родословная семьи С. Пробанд-пациентка РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН С. лечившаяся и в настоящее время наблюдающаяся по поводу метахронного ДРМЖ. Случаи двухстороннего РМЖ отмечены в двух поколениях семьи. Матери пациент-

ки проведено комбинированное лечение по поводу рака правой молочной железы, диагностированном в возрасте 30 лет и хирургическое лечение по поводу рака левой молочной железы спустя 15 лет. Четко представлен симптом антиципации — более ранний возраст возникновение и агрессивное течение в последуюгцем поколении.

Показано статистически достоверное повышение частоты мутаций среди пациенток с ДРМЖ при семейном накоплении только РМЖ. Возможно, это отражает усиление пенетрантности мутаций в семьях, что приводит к двухстороннему поражению молочных желез. Подобная вариабельность риска заболевания связана и с наследованием дополнительных факторов, модифицирующих риск именно РМЖ.

Средний временной интервал между первичным и контралатеральным РМЖ составил 8,3 года (диапазон 1-34) для больных-носителей мутаций ВЯСА, и был несколько больше для пациентов с м^ВЯСЛ-статусом — 10,6 лет. В 43,8% случаев у носителей т1ВЛСА был диагностирован синхронный ДРМЖ.

Молодые пациентки, возраст которых на момент постановки первого диагноза РМЖ не превышал 41 года, составили 42% (35/83) всех больных. Среди них выявлено 20 (57%) носительниц терминальных мутаций, что значительно превышает частоту мутаций среди пациенток старше 41 года — 25% (12/48) (р=0,0057). Аналогично, доля «молодых» среди всех пациенток с мутацией, достоверно выше, чем среди пациенток без мутаций 62.5% и 29% соответственно (р=0,0057). Учитывая клинико-молекулярные данные, молодой возраст манифестации болезни является достоверным критерием наследственной предрасположенности (табл. 3).

Гистологические и иммуногистохимические характеристики в разном объёме были получены для 93 опухолей (табл. 4).

Таблица 3

Распределение обследованных пациенток по возрасту первого рака

Возраст Все больные N=83 Больные с мутацией N=32 Больные без мутации N=51

Моложе 41 года 35 (42%) 20 (62,5%) 15 (29%)*, р=0,0057

41-50 лет 39 (47%) 10(31%) 29 (57%)* р=0,026

51 год и старше 9(11%) 2 (6%) 7(14%)

* — статистически достоверно

Статистически значимым признаком оказалась более высокая частота ИПР у пациентов НДРМЖ с т(ВКСА-статусом — 80% по сравнению с 47% в группе СДРМЖ обусловленным \vtBRCA (р=0,0014). Отсутствие рецепторов стероидных гормонов также достоверно чаще регистрировалось в опухолях пациентов с т1В1}СА-генотипом — 81% и 77% по сравнению с частотой этого показателя в группе пациентов ДРМЖ с \\tBRCA — 44% и 54% соответственно (р=0,094).

Отрицательный НЕ112-статус статистически достоверно чаще был характерен для НДРМЖ с пиВНСА-генотипом (р=0,091). Мультицентричность, как частый сопутствующий признак ИДР, закономерно и статистически достоверно реже отмечалась в группе НДРМЖ, обусловленного т1ВЛСА 3% и 24% соответственно (р=0,0063).

Полный лечебный патоморфоз после проведения на 1 этапе предоперационного лечения также достоверно чаще отмечали в группе НДРМЖ с /пГВЯСЛ-генотипом — 97% и 12% соответственно (р=0.007) (табл. 4).

Конкордантность по гистологическому типу, рецепторному статусу и степени лечебного патоморфоза между 1-ой и 2-ой опухолями была выше в группе пациенток с т!ВЯСА-генотипом, чем у остальных больных, что может говорить в пользу единой клональности НДРМЖ.

Таблица 4

Гистологические и иммуногистохимические характеристики опухолей

пациентов ДРМЖ в зависимости от ЯЛСЛ-генотипа

Признак Группа с мутацией Группа без мутации

Гистологический тип опухоли:

ИП 80% 47%*, р=0,0014

ИД 5% 26%

медуллярный 7,5% 2%

другие 7,5% 25%

Конкордантность по гистологии 67% 43%

РЭ" 81% 44%*, р=0,004

РЭ+ 19% 56%

Конкордантность по РЭ 82% 70%

РП" 77% 54%*, р=0,094

РГТ 23% 46%

Конкордантность по РП 80% 86%

HER2+ 22% 51.5%

HER2" 78% 48.2%, р=0,091

Конкордантность по HER2 82% 67%

Мультицентричность 3% 24% *, р=0,0063

Степень лечебного патоморфоза

полный 97% 12% р=0.007

частичный 3% 88%

Конкордантность 92% 69%

* — статистически достоверно

Дифференциальная клинико-молекулярная диагностика при НДРМЖ

С целью дифференциальной ДНК-диагностики при наследственном ДРМЖ рекомендован молекулярный скрининг гена ТР53.

Пример накопления ТР53-ассоциированного ДРМЖ в трех поколениях семьи Ф. (мать и дочь лечатся и наблюдаются в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН) подтверждает высокую экспрессивность мутантного ТР53-генотипа и обосновывает необходимость тестирования в группах риска (рис. 9).

О-

64

31 РМЖ

/

65

45 РМЖ 57 РМЖ

48

I 33 РМЖ 35 РМЖ пИТР53

26 РМЖ

27 РМЖ 1ШТР53

□

Рис. 9. Родословная семьи Ф. ТР53 наследственный двухсторонний РМЖ

Рак молочной железы на фоне беременности

По аналогии с наследственным РМЖ изучен вклад молекулярно-генетических факторов в развитие и патогенез РМЖ на фоне беременности у 80 пациенток из семейного регистра РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и у 75 больных РМЖ молодого возраста (до 36 лет) (рис. 10). Время наблюдения составило от 3-х до 360 месяцев. Одна пациентка наблюдалась с 1973 года.

Рис. 10. Дизайн клинико-генетического исследования РМЖ на фоне беременности В группах проводили ДНК-диагностику частых ВЯСА-вариантов и

скрининг кодирующей части гена ТР53. Терминальные функционально-значимые мутации гена ВЯСА1 выявлены у 14 из 80 (17,5%) больных РМЖАБ, тогда как в контрольной группе «молодого» спорадического РМЖ наследуемые мутации обнаружены в 8% случаев (6/75), разница статистически достоверна. В 78,5% случаев (11/14) беременные больные РМЖ-носителей мутаций гена ВЯСА1 имели онкологически отягощенный анамнез, что подтверждает вклад наследственной предрасположенности в развитие РМЖ на фоне беременности, а беременность (гормональные изменения), в свою очередь, возможно запускает процессы наследственного канцерогенеза. Пациентки репродуктивного возраста — носители ВДС4-мутаций должны наблюдаться в условиях онкодиспансера на всем протяжении беременности.

На рис. 11 представлена классическая родословная семьи пациентки Е., страдающей наследственным ВЯСА1-ассоциированным РМЖ, диагностированным на 30-й неделе беременности.

76

□

30

32

0 пИВЯСА1

/

30 РМЖ

1-ая беременность 37 нед. пПВ1?СА1

Рис. 11. Родословная семьи Ё.

В анализируемой группе больных РМЖ на фоне беременности, с т/ВВСА!-генотипом 92% (13/14) составила мутация 5382тзС в 20 экзоне гена ВКСА1\ 8% (1 из 14) — С6Ю в 5 экзоне ВИСА!. Другие делеторные мутации гена ВЯСА1 в данной выборке не встретились.

Вторые первичные опухоли женской репродуктивной системы диагностированы в последующем у 8 из 9 (89%) пациенток наследовавших ВЯСА1-мутации. В одном случае у носительницы мутации гена В11СА1 спустя 23 года после РМЖ на фоне беременности контрлатеральный РМЖ выявлен синхронно с раком поджелудочной железы. Рак яичников диагностирован у 3 из 80 пациенток (3,8%), 2 случая из которых (67%) ассоциировано с мутацией ВЯСА1. У одной больной развился РМЖ и РЯ на фоне беременности, наступившей в процессе ЭКО, подтвердив, что полинеоплазии являются достоверным критерием наследственной этиологии РМЖ, а гормональная стимуляция гестации — фактор риска для женщин с онкологически отягощенным анамнезом.

Фенотип т1ВЛСА1 РМЖ на фоне беременности не отличается от такового при ВЯСА /-ассоциированном РМЖ, не связанном с беременностью и представлен:

- молодым возрастом заболевания 31,7±2,9% лет;

- ИПР (64,2%);

- III степенью злокачественности опухоли — 85,7%;

- отрицательным рецепторным статусом: РЕ — 71,4%, НЕ112 0 — 66,7%;

- полным лечебным патоморфозом после проведенного неоадъювантного лечения —100%;

- лучшими показателями общей выживаемости (5-летняя — 90,8±10,4) (рис. 12).

умерли + живы

120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384

Время наблюдения (мес) Рис. 12. Общая выживаемость больных РМЖ на фоне беременности. 1 — нет мутаций; 2 — BRCA2; 3 — BRCA1

Дифференциальная клинико-молекулярная диагностика НРМЖ на фоне беременности

Наш опыт продемонстрировал актуальность молекулярной ТР53-дифференциальной диагностики у больных РМЖ на фоне беременности:

У пациентки К, 26 лет диагностирован РМЖ на сроке 23 недель первой по счету беременности в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Мать пациентки погибла в возрасте 27 лет от прогрессирования РМЖ, развившегося также на фоне беременности в 26 лет. Для подтверждения генетического диагноза наследственного РМЖ была выполнена ДНК диагностика генов, задействованных в наследственном канцерогенезе РМЖ — ВЯСА1/2, СНЕК2 и ТР53. При скрининге кодируюгцей части исследованных генов мутаций генов BRCAl/2 и СНЕК2 не выявлено. В гене ТР53 в 8 зк-зоне обнаружена значимая герминальная нонсенс-мутация Я308Х, скорее всего унаследованная от матери. Учитывая данные молекулярно-генетического исследования заключительный генетический диагноз — наследственный ТР53-ассоциированный РМЖ на фоне беременности. Риск наследования генного ТР53-дефекта у новорожденной девочки составляет

50% (рис. 13).

27

РМЖ на фоне беременности

26

РМЖ на фоне беременности

wtBRCA1-2

ТР53 R308X

4 мес. ТР53?

Рис. 13. Родословная больной К.

ТР53?

мес.

Редкие наследственные синдромы, включающие РМЖ

К редким наследственным синдромам на фоне которых развивается РМЖ относятся синдромы Ли-Фраумени и Ли-Фраумени-подобный (СЛФ и ЛФП). Предварительный генетический диагноз позволяет избежать ложноот-рицательных результатов при ДНК-диагностике.

При скрининге кодирующей части гена TP53 (10 экзонов) у 22 пациенток молодого возраста (до 30 лет) с онкологически отягощенным анамнезом, страдающих РМЖ, инактивирующие терминальные мутации ТР53 были выявлены у 13,6% (3/22) женщин, что значительно превышает общепопуляционную частоту. В одном случае мутация возникла de novo (33%), что согласуется с литературными данными по высокой частоте терминальных мутаций de novo в популяции (30%) и обосновывает необходимость ТР53-скрининга у молодых женщин в процессе МПС. Известный полиморфизм ТР53 Arg72Pro R72P наследовали 31,5% больных. В изучаемой группе пациенток, страдающих РМЖ, прослеживалось значительное повышение частоты редкого интронного ТР53-варианта Int3dupl6 в гомозиготном состоянии по сравнению с популяционным контролем — 29 и 6% соответственно.

СЛФ и ЛФП также ассоциирован с мутациями гена СНЕК2, скрининг

мутации 1100ёе1С которого мы проводили в неотобранной выборке больных РМЖ (410 пациентов) с использованием РМЖ-биочипа. В ходе проведения исследования выявлено 7 носителей СНЕК2-патологического генотипа. Частота мутаций среди больных составила 1.7%.

При проведении МГК с целью подтверждения и дифференциальной диагностики генетического диагноза пациентов, страдающих НРМЖ, ДНК-тестирование 1100с1е1С СНЕК2 стандартным методом было выполнено у 107 больных РМЖ (преднамеренная выборка). При этом выявлено 2 носителя мутации 1100с1е1С СНЕК2-гена, что составило 1,8%. В 55,5% случаев семейный анамнез носителей СНЕК2-мутщт удовлетворял критериям СЛФ и ЛФПС.

Клинический пример СНЕК2-ассоциированного РМЖ в составе ПМЗН и ЛФПС представлен родословной семьи Т. (рис. 14) с наследованием терминальной мутации только одним ребенком из дизиготной близнецовой пары.

Рис. 14. Родословная семьи Т. Синдром ЛФП: С#£А2-ассоциированный РМЖ

В процессе клинико-генотипического анализа был определен фенотип СЯ£Ж2-ассоциированного РМЖ:

- средний возраст — 51 год;

- ИПР — 66,6%; ПДР — 22,2%;

- II степень злокачественности — 55,5%;

- РЭ+ — 77,8%; РГГ — 55,5%; HER2/neu" — 77,7%;

- 5-летняя выживаемость — 70,1%.

РМЖ у мужчин

С клинико-генетических позиций был изучен РМЖ у мужчин. В 20032008 гг. медико-генетическое консультирование и ДНК-диагностика проведены у 8 мужчин, больных РМЖ, в связи с онкологически отягощенным анамнезом (преднамеренная выборка). Рак молочной железы у родственников I степени родства (мать и/или сестра) отмечали 57,1% больных. О злокачественных новообразованиях ЖКТ, предстательной железы, почки в семейном анамнезе сообщали 42,9% пациентов.

Средний возраст постановки диагноза составил 48,5 лет (от 27 до 73),что на 8 лет раньше, чем в общей выборке больных мужчин — 56 лет. Структурно-функциональные изменения генов, ответственных за возникновение РМЖ, выявлены в 62,5% случаев: мутации BRCA1/2 — у трех пациентов (37,5%), mtTP53 — у одного больного (12,5%), мутация MLH1 — у одного больного РМЖ (12,5%). Все варианты встретились единожды ввиду небольшой выборки. ПМЗН метахронно диагностированы у 25% (2/8) мужчин.

Дифференциальная диагностика представлена на клиническом примере развития 5 первично-множественных опухолей, включая РМЖ, удовлетворяющим критериям синдрома Линч, у пациента А. — носителя терминальной мутации гена MLH1. Аналогичный случай (сочетанный РМЖ и РТК у мужчины) был описан Boyd J. в 1999 г. (рис. 15).

пиМЬН!

Рис. 15. Пример ПМЗН у больного РМЖ в составе синдрома Линч

Мужской РМЖ, ПМЗН, онкологически отягощенный семейный анамнез являются критериями постановки генетического диагноза наследственного РМЖ, требующего проведения ДНК-диагностики с учетом синдромальной патологии.

Наследственный рак яичников

Оценивая вклад наследственной предрасположенности в развитие РЯ, МГК с последующей молекулярной диагностикой было проведено у 223 больных РЯ из числа проходивших лечение в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН за период 1997-2008 гг. В ходе выполнения работы были сформированы 4 группы пациенток с учетом преднамеренности выборки и методов ДНК-диагностики (рис. 16).

Частота В/?С4-мутаций была значительно выше в группе больных РЯ с онкологически отягощенным анамнезом и среди пациентов с ПМЗН, включая РЯ, — 72% и 56% соответственно.

Среди больных, страдающих спорадическим РЯ, эти частоты также значительно превышали общепопуляционные— 11,8 и 16,8% в зависимости от выборки и объема молекулярного исследования, что обосновывает проведение ЯйСЛ-скрининга как диагностического при РЯ в онкологической практике.

Рис. 16. Дизайн клинико-генетического исследования РЯ

Доля мутаций в гене ВЯСА1 составила 85,4% всех выявленных вариантов в обоих генах. Спектр мутаций ВШ2А1 достаточно широк: 60% приходится на мутацию 5382тзС в 20 экзоне гена ВЯСА1. Другими частыми вариантами являются С6Ю и 185(1е1АО (рис. 17). Все мутации гена ВНСА2 были уникальными в выборке, дважды встретилась только мутация 6174ёе1Т.

Для оценки клинико-генотипических корреляций сформированы 2 группы пациентов — больные РЯ, носители ВЯСА /-мутаций (НРЯ т!ВЯСА1\ п=71) и больные РЯ без структурных перестроек в генах ВЕСА 1/2 (\vtBRCA', п=98).

14-2QexDel

5382insC 61,3%

3366delA 1,6%

34

8,1%

185delAG 9.7% 8,1%

Рис. 17. Спектр и частота мутаций гена BRCA1 при наследственном РЯ

Средний возраст возникновения mtBRCAl НРЯ составил 47.9 лег, тогда как в группе СРЯ заболевание диагностировали на 9 лет позже — в среднем в 56 лет. Гистологический тип опухоли при mtBRCAl НРЯ чаще был представлен серозной сосочковой цистаденокарциномой — 70%. Статистически значимым гистологическим признаком оказалось отсутствие муцинозных опухолей при mtBRCAl НРЯ по сравнению с частотой муцинозной аденокарциномы при wtBRCAl СРЯ — 0 и 7.1% соответственно (р<0,05).

Интересным на наш взгляд является высокая частота сосудистой инвазии опухоли — 80% при mtBRCAl НРЯ, что может быть обусловлено ускоренным ангиогенезом.

Неоадьювантное лечение на предоперационном этапе получали 44 пациентки изучаемых групп, чьи истории болезни и послеоперационные гистологические препараты были доступны для анализа и пересмотра: 18 больных mtBRCAl НРЯ (40,9%) и 26 пациенток wtBRCAl СРЯ (59%).

Лечение пациенткам, страдающим РЯ, проводили в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН с применением препаратов платины и таксанов.

Полный эффект от проводимого лечения, подтвержденный полным лечебным патоморфозом опухоли, достоверно чаще отмечали в группе пациенток

с mtBRCAl НРЯ — 50,8%, выраженный лечебный эффект в виде лечебного па-томорфоза III степени с единичными клетками опухоли в поле зрения также чаще отмечали у пациенток этой группы — в 33,3%.

У больных с wtBRCPH после лечения преобладали I (26,9%), II — (34,6%) и III — 26 % степени лечебного патоморфоза примерно в равных долях. Суммарный полный эффект терапии составил 84,1% в группе пациенток mtBRCAl НРЯ и 38,4% у пациенток с wtBRCA СРЯ — разница статистически достоверна (р<0,05).

Высокий лечебный эффект применения цитостатических препаратов в группе mtBRCAl НРЯ может быть объяснен сниженными репарационными возможностями ДКСЛ-мутантного генотипа, что перекликается с немногочисленными работами, посвященным изучению эффективности лечения НРЯ.

Результаты 5-летней выживаемости Д/?СЛ-ассоциированного НРЯ (рис. 18) достоверно лучше по сравнению со СРЯ— 58,9±6,3% и 39,7±4,6 % соответственно (Р=0,012).

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier) о Complete 4- Censored

fr

0,0

-0,1

mtBRCAl wtBRCAl

-1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 О 2 4 6 8 10 12 14 18 18 20 22 24

Time

Рис. 18. Общая выживаемость больных РЯ в зависимости от BRCA -генотипа

Дифференциальная клинико-молекулярная диагностика при НРЯ

Дифференциальную клинико-молекулярную диагностику при НРЯ рекомендовано проводить с учетом предварительного генетического диагноза и тестирования генов, вовлеченных в канцерогенез НРЯ с целью исключения лож-ноотрицательных результатов и подтверждения генетического диагноза.

Клинический пример представлен МЬН1-ассоциированным РЯ в составе метахронных ПМЗН при синдроме Линч (рис. 19).

0-

66 РТМ РТК

38 РМЖ; 44 РЯ; 50 р.желудка; 56 РТК; пиМ1_Н1

¿1"6 ь ¿)1932

РТК РТК

РТК ШtMLH1

1954

■о

18

РТК т!М1.Н1

/

т1М1-Н1

Рис. 19. Родословная семьи В. Медико-генетическое консультирование

Генетическое консультирование сегодня является обязательной составляющей онкологической диагностической и профилактической помощи и решает следующие задачи:

1. Создание семейных онкологических регистров.

2. Проведение медико-генетического обследования пациентов с различной онкопатологией и членов их семей с использованием цито-генетических и молекулярно-биологических маркеров, позволяющих идентифицировать наследственно обусловленные формы рака и предрасположенность к их развитию.

3. Организацию клинико-генетического наблюдения в условиях онко-

диспансера.

4. Решение вопросов репродуктивного поведения, пренатальной и преимплантационной диагностики.

Тактика медико-генетического консультирования с использованием пренатальной ДНК-диагностики (ПД)

- Наследуемая мутация должна быть определена.

- Возможные исходы беременности обсуждены.

- Готовность к ПД подтверждена до зачатия.

- Генетическое консультирование и ДНК-диагностика проводится сер-тифированными специалистами генетиками.

На II этапе МГК при положительном ДНК-тесте плода необходимо учитывать и обсуждать с семейной парой:

- синдромальную патологию;

- неполную пенетрантность генов;

- относительность рисков;

- возраст реализации предрасположенности;

- успехи в лечении и профилактике;

- пол плода.

Собственный опыт МГК с последующей пренатальной и преимплантационной ДНК-диагностикой

.Таблица 5

МГК с пренатальной и преимплантационной ДНК-диагностикой

Вид диагностики Пренатальная Преимпланта-ционная

Число пациентов с известной генной патологией 8 (УНЬ, ВЯСА, ЯЕТ, ЯЬ) 1

Число пациентов с известной хромосомной патологией 1(13я22) -

Число прерванных беременностей 4 -

Число сохраненных беременностей 5 -

Пренатальная ДНК-диагностика известного наследуемого генного дефекта была выполнена у пациентки С., проходившей лечение в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН по поводу РМЖ. Через год после окончания лечения наступила беременность, которую супружеская пара хотела сохранить. При выполнении пренатальной цитогенетической и молекулярной диагностики, хромосомной патологии, ассоциированной с врожденными пороками развития, не выявлено, однако подтверждено наследование герминальной BRCA1-мутации. Учитывая пол плода, неполную пенетрантность гена, сроки реализации предрасположенности, беременность продолжена. Родился здоровый мальчик, который находится под наблюдением онкогенетиков НИИ ДОГ РОНЦ u.M. H.H. Блохина РАМН (рис. 20).

Семья Св. (BRCA1)

56

.0 mtBRCAl

0

32 РМЖ

33 Mts В ГОЛОВНОЙ МОЗГ, i ХЛТ с эффектом у

34 беременность, роды mtBRCAl

44

1 год |-Ч Ж Ю

пренатальная LiJ ч2/ цитогенетическая и ДНК-диагностика

хромосомной патологии на выявлено mtBRCAl

О □

Рис. 20. Родословная семьи Св.

С учетом нашего опыта разработан и внедрен в клиническую практику алгоритм МГК

Алгоритм МГК при наследственной предрасположенности к РМЖ и/или РЯ

Отбор пациентов с высоким риском развития РМЖ/РЯ на основании критериев >РМЖ до 50 лет в личном или семейном анамнезе или РЯ в любом возрасте ^Накопление случаев ПМЗН молочной железы и яичников в личном или семейном анамнезе

*>"['МЖ у мужчин в личном или семейном анамнезе_

Родственники с подтвержденным ноеительством мутаций генов ВЯСАШ, СНЕК2, ТР53, М1ЛИ и др.

1

ДА ДНК —тест Получение информированного согласия

А

Кровь, образцы ДНК для молекулярной диагностики генов В11СА1/2, СНЕК2, ТР53, МЬШ и др.

ВЫВОДЫ

1. В ходе проведения исследования сформирован и расширен специализированный клинико-генетический регистр пациентов и их родственников с онкологически отягощенным семейным анамнезом по нозоло-гиям (2 583 членов из 1 678 семей).

2. На основании общих принципов организации медико-генетического консультирования систематизирована база клинико-генетических данных и создан банк биологического материала (цельная кровь, пластины

О-окрашснных метафазных хромосом, ДНК/РНК, выделенные из крови и опухолевого материала, клеточные линии типированных мезенхи-мальных и раковых стволовых клеток).

3. Разработана стратегия МГК в онкологии. Медико-генетическое консультирование должно проводиться с учетом дифференциальной клинической и молекулярно-генетической диагностики, унифицированных расчетов риска и разработанного алгоритма в отношении больных и здоровых пациентов в зависимости от индивидуального генотипа.

4. В практику МГК наследственных форм рака молочной железы и/или яичников внедрено комплексное клинико-генетическое исследовании с применением ДНК-диагностики генов ВЯСА, ТР53, СНЕК2, МЬН1, М8Н2 и др. с целью верификации генетического диагноза у онкологических больных и членов их семей.

5. Высокая частота значимых делеторных мутаций гена ВЯСА1 у больных НРМЖ (25,8%) а так же значительная доля (23%) вновь выявленных мутаций, не зарегистрированных в других популяциях, обосновывает необходимость молекулярного ВДС4-скрининга с целью выявления наследственной предрасположенности к РМЖ. Вклад генотипических вариантов гена ВКСА2 в развитие НРМЖ характеризуется: низкой частотой (2.2%) значимых делеторных мутаций; отсутствием «горячих точек» гена, индивидуальностью мутаций, высокой долей (30%) вновь выявленных в российской популяции мутаций, что определяет необходимость скрининга всей кодирующей части гена ВКСА2.

6. Фенотип т/ВЛСА-НРМЖ характеризуется: ранним возрастом манифестации; преобладанием ИПР (87.0% ВЯСА1), тубуло-дольковой подгруппой (47.9% ВЯСА2); высокой степенью злокачественности (61,1% ВЯСА] и 37,5% ВКСА2)\ триадой рецептор-негативных опухолей (РП-, РЭ, НЕЯ2/пеи-78.6% ВЯСА1), лучшей общей 10-летней выживаемостью больных — 65+4.1% СВЯСА1), 88+13,1 {ВКСЛ2).

7. ВЯСА-сгатус является прогностическим фактором при НРМЖ: позво-

ляет достичь выраженного терапевтического эффекта, обусловленного полным лечебным патоморфозом в 100% случаев при проведении не-оадъювантного лечения в то время как высокая частота (30%) ипсила-теральных опухолей снижает эффективность органосохранного лечения.

8. В структуре двухстороннего РМЖ высокая частота (57%) мутаций гена ВДС47 преобладает у больных молодого возраста (до 40 лет) в сравнении с частой ВЯСА1 мутаций среди пациенток старше 41 года (25%), Ассоциация заболевания с пиТР53 (1,2%) подтверждает наследственную этиологию двухстороннего РМЖ и обосновывает необходимость медико-генетического консультирования с последующей ДНК-диагностикой.

9. Фенотип т(ЙКСЛ-двухстороннего НРМЖ является типичным «портретом» ВИСА-ассоциированного РМЖ и характеризуется: высокой частотой ИПР (80%), высоким процентом медуллярного РМЖ (7,5%), отсутствием рецепторов стероидных гормонов и гиперэкспрессии гена НЕЮ/пеи, низкой частотой мультицентричных опухолей (3%), полным лечебным патоморфозом (97%), высокой степенью конкордантности признаков.

Ю.Онкологически отягощенный анамнез (78,5%), высокая частота мутаций генов ВКСА1 и ТР53 (18.7 %), ПМЗН (89%) определяют вклад мо-лекулярно-генетических факторов в развитие РМЖ на фоне беременности. Пациентки с /иГВйСЛ-ассоциированным РМЖАБ имеют стандартный ВЯСА/-фенотип: более молодой возраст постановки диагноза (31,7 лет), преобладание ИП (64,2%) низкодифференцированного рака (85,7%), «триаду» рецептор-негативных опухолей, высокую степень лечебного патоморфоза, лучшую общую и безрецидивную выживаемость (90,8%).

11.Вклад мутации 1100с1е1С гена СНЕК2 в развитие НРМЖ (1,7%) определяет необходимость проведения МГК с целью постановки предвари-

тельного генетического диагноза синдрома Ли-Фраумени и Ли-Фраумени-подобного синдрома.

12.РМЖ у мужчин с онкологически отягощенным анамнезом в 62% случаев ассоциирован со структурно-функциональными перестройками генов BRCA1/2 и ТР53. Молодой возраст манифестации заболевания — 4В лет, ПМЗН, онкологически отягощенный анамнез — достоверные критерии BRCA-ассоциированного мужского РМЖ, аналогичные mtBRCA РМЖ у женщин.

13.При наследственном РЯ частота мутаций гена BRCAI является наиболее высокой среди всех наследственных опухолей ЖРС (72%); доля BRCA1 мутаций среди всех больных, страдающих РЯ, так же высока (16.8%), что может рекомендовать BRCA1 ДНК-скрининг в качестве диагностического и профилактического подхода в онкологической практике. Фенотип mtBRCAl НРЯ сходен с таковым при wtBRCAl СРЯ за исключением: более молодого возраста манифестации болезни (на 8 лет) — 47.9 лет, отсутствия муцинозного гистологического типа опухолей, преобладания низкодифференцированных опухолей и опухолей смешанной дифференцировки, высокой частоты сосудистой инвазии (80%), выраженного суммарного терапевтического эффекта, обусловленного высокой степенью лечебного патоморфоза (84%) и лучшими показателями общей выживаемости (58,9%).

14.Разработан алгоритм МГК в онкологии с применением высокотехнологичных диагностических методов на примере наследственного РМЖ/РЯ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Любченко JI.H., Гаръкавцева Р.Ф., Поспехова Н.И., Брюзгин В.В., Карпухин A.B. ДНК- диагностика и медико-генетическое консультирование при наследственной предрасположенности к раку молочной железы. //В сборн. «Возможности современной онкологии в диагностике и лечении злокачественных заболеваний»—М., 2003, С. 44-7.

2. Любченко JI.H., Поспехова Н.И., Портной СМ., Брюзгин В.В., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Наследственные формы рака молочной железы и/или яичников: прогноз, тактика лечения и профилактики//Материалы VII Российского Онкологического Конгресса, М., Издательская группа РОНЦ, 2003 — С. 134-6.

3. Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Будиюв А.В., Гарькавцева Р.Ф., Карпухин А.В. Спектр мутаций в гене BRCA 1 при наследственных формах рака молочной железы и яичников в российских семьях // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, Москва 2003, Т. 136, №9, С. 276-278.

4. Землякова В.В., Жевлова А.И., Стрельников В.В., Любченко Л.Н., Вишневская Я.В., Третьякова В.А., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы // Молекулная Биология — Москва 2003, Т. 37, N. 4 — С. 696-703.

5. Артамонов В.В., Любченко Л.Н., Шабанов М.А., Бабенко О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов CYP19 и CYP17 со спорадическим раком молочной железы. //Молекулярная Биология, Москва, 2003, Т. 37, N. 6, С. 975-82.

6. Цырендоржиева Е.С., Асланян М.М., Тарасов В.А., Гарькавцева Р.Ф., Любченко Л.Н. Генетический полиморфизм человека по предрасположенности к раку молочной железы. // В сборн. «Актуальные проблемы генетики», Москва, 2003, Т. 2 — С. 47-8.

7. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Budilov A. V. Analysis of genetic heterogeneity breast cancer families by BRCA1/2 gene mutations and single nucleotide polymorphisme. // Europ. J. Hum. Genet., 2003, V. 11, Suppl. 1., P. 66.

8. Поспехова Н.И., Логинова A.H., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Гетерогенность семей с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы по встречаемости мутаций в гене BRCA1. //Медицинская Генетика, 2003, Т. 2, № 11, С. 459-63.

9. Тарасов В.А., Асланян М.М., Цырендоржиева Е.С., Гарькавцева Р.Ф., Любченко Л.Н, Алтухов Ю.П. Зависимость вероятности развития рака молочной железы у женщин от их генотипа. //Вестник Российской Академии Медицинских Наук — Москва, 2004, 398, С. 391-4.

10. Любченко Л.Н., Гаръкавцева Р.Ф. Клинико-генетическая гетерогенность семейного рака молочной железы.// Современная онкология 2004,№2, Т. 6—-С. 67-9.

11. Михашенко Д.С., Никитин Е.А., Любченко Л.Н., Зборовская И.Б. Аллельные варианты GCG-повтора и метилирование содержащей его области гена TGFBR1 в норме и при различных типах злокачественных новообразований. //Медицинская Генетика, 2004, Т. 3, № 10 — С.485-9.

12. Михашенко Д.С., Любченко Л.Н., Зборовская И.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Анализ полиморфных вариантов GGG-повтора гена GIPC1 в норме, при раке молочной железы и немелкоклеточном раке легкого. //Генетика 2005, Т. 41, № 9 — С. 1059-63.

13. Тарасов В.А., Асланян М.М., Цырендоржиева Е.С., Гаръкавцева Р.Ф., Любченко Л.Н., Алтухов Ю.П. Мельник В.А. Популяционно-генетический анализ связи полиморфизмов генов BRCA1 и Р53 с развитием спорздгчсского рака молочной железы. //Генеттам 2005, Т.41, № 8 — С. 1115-24.

14. Любченко Л.Н., Гаръкавцева Р.Ф. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование при наследственном раке молочной железы. //В кн. «Рак молочной железы» под ред. Н.Е. Кушлинского, С.М. Портного, К.П. Лактионова — Москва 2005, издательство РАМН, С. 198-209.

15. Kuznetsova £., Lyubchenko L., Zborovskaya I. Differential methylation of LAMC3, SEMA6B, VCIP135 and BIN1 CpG islands in breast cancer identified by metilation-sensitive restriction fingerprinting (MSRF). // Europ. I. Hum. Genet., 2005, V. 13, Suppl. 1 — P. 192.

16. Lyubchenko L., Pospekhova N., Lushnikova A., Portnoy S., Karpukhin A.V., Garkavtseva R.F. Tumor characteristics of BRCAl-associated familial breast cancer from Russian population. //Europ. J. Hum. Genetics, 2005, V. 13, Sup. 1— P. 212.

17. Любченко Л., Поспехова H., Попов A., Карпухин A.B., Гаръкавцева Р.Ф. Наследственные формы рака молочной железы и яичников: ДНК-диагностика, клинико-молекулярная патология и медико-генетическое консультирование. //Медицинская Генетика, 2005, Т.4, №5 — с. 220-1.

18. Землякова В.В., Немцова М.В., Зборовская И.Б., Любченко Л.Н. Исследование метилирования ряда генов, вовлеченных в канцерогенез, в различных типах опухолей. //Медицинская генетика, 2005, Т.4, № 4 —■ С. 147.

19. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин A.B. Молекулярно-генетические аспекты наследственной предрасположенности к раку молочной железы и/или яичников II. Что обуславливает риск при мутациях в гене BRCA1? //Медицинская генетика, 2005, № 1 — С. 23-7.

20. Lyubchenko L., Garkavtseva R. Molecular diagnostics and follow-up care in individuals with an inherited predisposition to cancer. //30th anniversary American Society of Preventive Oncology 2006, Bethesda, USA, P. 34.

21. Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., B.A. Хайпенко, В В., Брюзгин В.В., Портной С.М. Генетическте подходы к ранней диагностике и профилактике рака молочной железы. // В кн. «Диагностика рака молочной железы» под ред. В.А. Хайленко, Д.В. Комова, В.Н. Богатырева -Москва 2005, Издательство «Медицинское информационное агенство», С. 101-113.

22. Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Брюзгин В.В., Летягин В.П. Медикогенетическое консультирование при заболеваниях молочной железы: возможности, проблемы, перспективы. //Маммологияю 2006, №2 — С. 45-50.

23. Лушникова A.A., Крюкова И.Н., Полевая, Любченко Л.Н. MMTV-гомологичные последовательности у мужчин с раком молочной железы и гинекомастией. //Молекулярная медицина 2006, 4,С. 53-56.

24. Любченко Л., Гарькавцева Р., Портной С., Брюзгин В. Наследственный рак молочной железы. // В кн. «Клиническая маммология» под редакцией Е.Б. Камповой — Полевой и С.С. Чистякова, Москва 2006, издательство ГЭОТАР-Медиа, С. 246-259.

25.Любченко Л.Н., Портной С.М., Брюзгин В.В., Гарькавцева Р.Ф. Клинико-молекулярные аспекты наследственного рака молочной железы. //Молекулярная медицина 2007, № 1 — С. 8-15.

26. Федорова O.E., Любченко Л.Н., Паяниди Ю.Г., Казубская Т.П., Амосенко Ф.А., Гарькавцева Р.Ф., Заседателев A.C., Наседкина Т.В. Использование биочипов при изучении распространенных мутаций в генах BRCA 1/2 и СНЕК 2 у больных органоспецифичным раком яичников и первично-множественными злокачественными новообразованиями с поражением яичников (российская популяция). //Молекулярная биология 2007, Т.41,№ 1 — С. 37-42.

27. Смирнова Т.Ю., Любченко Л.Н., Поспехова Н.К, Портной С.М., Жорданиа КИ., Гарькавцева Р.Ф., Карпухин A.B. Рак молочной железы и

яичников. Роль наследственных факторов. //Опухоли женской репродуктивной системы 2007, №4. — С. 90-6.

28. Lushnikova A., Parokonnaya A., Lyubchenko L., Polevaya Е. Mouse mammary tumor virus-related sequence expression in the patients with breast phyllodes tumors. //Breast Cancer Research and Treatment 2007, V. 106 — p. 157.

29. Lyubchenko L., Pospekhova A'., Lushnikova A., Portnoy S., Bryuzgin V., Karpukhin A. V., Garktrvtseva R.F. Prognostic factors for BRCAl/2-assoociated familial breast cancer from Russian population.//Breast Cancer Research and Treatment 2007, V.106 — p. 62.

30. Смирнова Т.Ю., Поспелова Н.И., Любченко Л.Н.,Тюляндин С.А., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Высокая частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при раке яичников. //Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 2007, №144(1) —С. 83-5.

31. Lyubchenko L., Pospekhova N., Parokonnaya A., Loginova A., Lushnikova A. Clinical-genetic characteristics of pregnancy associated breast cancer in Russian patients. //3-th Familial Cancer Conference, Madrid 2008,. 96.

32. Пароконная A.A., Нечушкин М.И., Воротников И.К, Лучиникова А.А., Любченко Л.Н. Неэпителиальная опухоль молочной железы на фоне существующей беременности. Клинико-генетические особенности. //Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 2008, Т. 19, №1 — С. 71-5.

33. Loginova A., Lyubchenko L., Parokonnaya A., Lushnykova А., Garkavtseva К, Pospekhova N. High frequency of BRC1 gene mutations among patients with pregnancy associated breast cancer. //Europ. J. Hum. Gen., 2008, V. 16, Supp 2 — P. 204.

34. Pospekhova A'., Lyubchenko L., Loginova A., Poddubskaya E„ Garkavtseva R„ Karpukhin A. Genetic peculiarities of families with inherited bilateral breast cancer. // Eur. J. Hum. Gen. P. 2008, V. 16, Supp 2 — P. 203.

35. Любченко Л.Н., Поспелова Н.И. Медико-генетическое консультирование онкологических больных молодого возраста. //Материалы XII Российского онкологического конгресса, Москва 2008, Издательская группа РОНЦ, С. 57-59.

36. Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Поспелова Н.И., Карпухин А.В. Медико-генетическое консультирование при наследственном раке молочной железы. //Медицинская генетика 2008, Т. 7, №12 (78), С. 27-31.

37. Пароконная A.A., Лушникова A.A., Любченко Л.Н., Кампова-Полевая Е.Б., Поспехова Н.И. Прогноз и течение рака молочной железы на фоне беременности и лактации: вирусо-генетические особенности. //Сибирский онкологический журнал 2008, №2 (26) — С. 15-20.

38. Пароконная A.A., Нечушкин М.И., Кампова-Полевая Е.Б., Любченко Л.Н. Рак молочной железы и программа экстракорпорального оплодотворения. //Опухоли женской репродуктивной системы 2008, № 4, С. 52-6

39. Пароконная A.A., Нечушкин М.И., Горобец Е.С., Козаченко В.П., Любченко Л.Н., Тютюнник В.А., Тверджов М.А. Макромастия и миастения на фоне беременности. //Проблемы репродукции 2008, № 6, Т. 14 — С. 91-5.

40. Ozolina S., Sinicka О., Jankevics Е, Inashkina I, Lubinski J, Gorski B, Gronwald J, Nasedkina T, Fedorova O, Lyubchenko L, Tihomirova L. //Familial Cancer 2009; 8(1): P. 1-4.

41. Любченко Л.Н., Поспехова H.И., Пароконная A.A., Стенина М.Б., Тюляндин С.А. Брюзгин В.В., Карпухин A.B., Гарькавцева Р.Ф. Редкие наследственные онкологические синдромы. Значение клинико-молекулярной диагностики. //Материалы II Российского симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» — Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 2009, Т. 2, № 1 — С. 93-4.

42. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н. Роль наследственных факторов в развитии злокачественных новообразований. // В справочнике практического врача «Онкология» под редакцией чл-корр. РАМН, проф. И.В. Поддубной — Москва 2009, издательство «МЕДпресс-информ» — С. 18-30.

43. Крюкова И.Н., Лушникова A.A., Любченко Л.Н., Пароконная A.A. MMTV-гомологичные последовательности и их экспрессия у больных раком молочной железы в сочетании с лимфомой. //Молекулярная медицина, 2009, №2 —С. 8-15.

44. Лугиникова A.A., Крюкова КН., Любченко Л.Н., Пароконная A.A. Инфицирование клеток эмбриональных почек человека вирусом рака молочных желез мышей (ММТУ).//Доклады Академии Наук РФ 2009, Т. 424, №1— с. 130-4.

45. Любченко Л.Н., Поспехова H.H., Пароконная A.A., Лушникова A.A., Чевкина Е.М. Рак молочной железы и /или яичников в составе

наследственного онкологического синдрома. //Опухоли женской репродуктивной системы 2009, № 1-2 — С. 59-63.

46. Артамонов В.В., Михайленко Д.С., Любченко Л.Н., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Системы ДНК-маркеров для проспективной диагностики высокого риска развития рака молочной железы. //В кн. «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний» под редакцией М.А. Пальцева и Д.В. Залетаева, Москва 2009, Издательство «Медицина» С. 318-348.

47. Пароконная A.A., Нечучикин М.И., Любченко Л.Н., Кампова-Полевая Е.Б. Беременность у женщин, перенесших рак молочной железы. //Опухоли женской репродуктивной системы 2009, № 1-2, С. 67-71.

48. ЕрмаковА.В., Конькова М.С., Костюк C.B., Ершова Е.С., Смирнова Т.Д., Каменева Л.В., Ефремова Л.В., Любченко Л.Н., Вейко H.H. Реакция стволовых клеток человека на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах. //Радиационная биология. Радиоэкология 2009, Т. 49,№5 — С. 31 -40.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МГК — медико-генетическое консультирование

ПВ — полиморфный вариант

РЖ — рак желудка

PJI — рак легкого

РМЖ — рак молочной железы

РМЖАБ — РМЖ, ассоциированный с беременностью и лактацией

ДРМЖ — двухсторонний рак молочной железы

ИПР — инфильтративно-протоковый рак

ИДР — инфильтративно-дольковый рак

НРМЖ — наследственный рак молочной железы

СРМЖ — спорадический рак молочной железы

РТК — рак толстой кишки

РЩЖ — рак щитовидной железы

МРЩЖ — медуллярный рак щитовидной железы

РЯ — рак яичников

НРЯ — наследственный рак яичников

СРЯ — спорадический рак яичников

ПМЗН — первично-множественные злокач. новообразования

РПЖ — рак предстательной железы

СЛФ — синдром Ли-Фраумени

ЛФПС — Ли-Фраумени подобный синдром

ЖРС — женская репродуктивная система

BRCA — Breast Cancer Antigen

mtBRCA — мутантный ген BRCA (mutant type Breast Cancer Antigen) wtBRCA — ген BRCA дикого типа (wild type Breast Cancer Antigen) mtTP53 — мутантный ген TP53 (mutant type TP53)

Актуальность работы

Ежегодно в мире регистрируется 10 млн. новых случаев рака и более 6,2 млн. смертей от заболеваний этой группы. От 5 до 40% злокачественных новообразований всех анатомических локализаций имеют наследственную этиологию, и этот процент возрастает в связи с ростом общей заболеваемости.

На сегодняшний день в литературе описано около 200 наследственных онкологических синдромов, для 70 из которых полностью расшифрованы первичные молекулярные дефекты или установлена хромосомная локализация мутантных генов, а ДНК-диагностика стала рутинным методом исследования в ходе верификации генетического диагноза.

К числу таких заболеваний относятся одно- и двухсторонний рак молочной железы и/или яичников (РМЖ/РЯ). Предметом исследования в этих случаях являются онкогены и гены-супрессоры злокачественной трансформации клеток BRCA1, BRCA2, СНЕК2, ТР53, MLH1 MSH2, консервативные наследуемые дефекты в которых приводят к парадоксально высокому риску развития рака, достигающему нередко 60-95%.

Выделение генов, ответственных за наследственную предрасположенность к РМЖ/РЯ, создало принципиально новые возможности медико-генетического консультирования — ДНК-диагностика мутаций обеспечивает подтверждение генетического диагноза, расчет риска развития заболевания, возможность ранней диагностики, выбор тактики лечения и профилактики, а также решение проблем планирования семьи и деторождения.

Критериями постановки генетического диагноза наследственных форм рака являются:

• наличие в семье двух и более родственников I-TI степени родства, страдающих злокачественными новообразованиями;

• ранний возраст манифестации заболевания;

• двухстороннее поражение парных органов;

• первичная множественность новообразований у пробанда или его родственников, специфические опухолевые синдромы.

Положительный результат формально-генетического анализа является показанием для проведения ДНК-диагностического исследования с целью выявления структурных и функциональных изменений генов, вовлеченных в наследственный канцерогенез.

Наследуемая молекулярная патология является объективным критерием формирования групп риска в отношении развития рака той или иной локализации для динамического наблюдения лиц указанной группы в условиях онкодиспансера.

Ранее выполненные немногочисленные работы по данной тематике включали небольшие выборки пациентов (40-100 человек) и не имели комплексного подхода.

В настоящем комплексном исследовании представлены обширные результаты по формированию специализированного семейного генетического регистра по нозологическим формам и наследственным онкологическим синдромам, изучению молекулярных основ предрасположенности к РМЖ/РЯ, применению клинико-молекулярной дифференциальной диагностики, определению фено- и генотипических корреляций и оценке возможности ранней доклинической и пренатальной диагностики.

Решение фундаментальных и научно-практических проблем онкогенетики на примере наследственного РМЖ/РЯ обосновывает необходимость и перспективность представленной работы.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка тактики и стратегии проведения специализированного медико-генетического консультирования и изучение клинико-генетической гетерогенности наследственных форм РМЖ/РЯ на основе ДНК-диагностики наследственной предрасположенности в семьях с онкологически отягощенным анамнезом.

ЗАДАЧИ

1. Создать и расширять специализированный клинико-генетический регистр и систематизировать молекулярно-генетические «паспорта» пациентов с онкологически отягощенным анамнезом.

2. Создать банк биологического материала (цельной крови, G-окрашенных метафазных хромосом, геномной и тканевой (опухолевой) ДНК/РНК) пациентов и их родственников.

3. Отработать и внедрить в практику ДНК-диагностические методы выявления структурных и функциональных перестроек генов предрасположенности к развитию РМЖ/РЯ.

4. Провести дифференциальную клинико-молекулярную диагностику при наследственном РМЖ/РЯ.

5. Оценить эффективность применяемых методов ДНК-диагностики (конформационно-чувствительный электрофорез, гибридизация на биочипах).

6. Оценить спектр и частоту молекулярной патологии при наследственном и спорадическом РМЖ/РЯ.

7. Изучить клинико-молекулярный патогенез наследственного РМЖ/РЯ.

8. Определить тактику и стратегию медико-генетического консультирования в онкологии на примере наследственного РМЖ/РЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в России разработана тактика и стратегия МГК в онкологии с использованием высокотехнологичных диагностических методик на примере наследственного РМЖ/РЯ.

Впервые:

1. Использована комбинация различных ДНК-диагностических методов для выявления терминальной молекулярной патологии для подтверждения генетического диагноза наследственных форм РМЖ/РЯ.

2. Проведена клинико-молекулярная дифференциальная диагностика при наследственных онкологических синдромах с целью верификации генетического диагноза.

3. Выполнено популяционное исследование в структуре общей заболеваемости РМЖ и/или РЯ с использованием технологии олигонуклеотидных биочипов (известные частые мутации генов BRCA 1/2 и СНЕК2).

4. Представлена сравнительная оценка точности ДНК-диагностических методов.

5. Охарактеризованы спектры и частоты структурно-функциональных перестроек генов-супрессоров у пациентов с наследственным одно- и двухсторонним РМЖ, РМЖ, развившимся на фоне беременности, РМЖ у мужчин, РЯ.

6. Представлены сравнительные фено-генотипические характеристики наследственного и спорадического РМЖ/РЯ с учетом индивидуального BRCA— и СНЕК2- генотипа.

7. Впервые определены фенотипы BRCA- и СНЕК2-ассоциированных РМЖ/РЯ.

8. Описаны клинические и молекулярные характеристики редких наследственных синдромов, включающих РМЖ/РЯ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

При выполнении работы создан и расширен специализированный семейный генетический регистр РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

С использованием методологии и алгоритмов междисциплинарного сотрудничества онкологической, медико-генетической, молекулярнобиологической и акушерско-гинекологической служб созданы компьютерная база клинико-генетических и молекулярно-биологических данных и банк биологического генотипированного материала.

Для проведения дальнейших исследований создан банк клеточных линий типированных мезенхимальных и раковых стволовых клеток, полученных от пациентов, страдающих наследственным и спорадическим РМЖ.

На основании проведенного исследования продемонстрирована значимость и внедрено в клиническую практику комплексное клинико-генетическое обследование с применением ДНК-диагностики наследственной предрасположенности при одно- и двухстороннем РМЖ, РМЖ на фоне беременности и лактации, РМЖ у мужчин, РЯ (гены BRCAI, BRCA2, СНЕК2, ТР53, MLH1 MSH2), результаты которой будут использованы для индивидуализации диагностики, лечения и профилактики с целью снижения заболеваемости и смертности.

По результатам выполненной работы сформирована самая большая на сегодняшний день в России и странах СНГ выборка генотипированных онкологических больных и группа пациентов-носителей мутаций BRCA1/2.

Впервые в России разработан алгоритм медико-генетического консультирования семей с онкологически отягощенным анамнезом в условиях онкодиспансера на примере наследственного РМЖ/РЯ.

Впервые проведена пренатальная диагностика терминальных генетических дефектов, ответственных за возникновения наследственных форм рака. Принципиально новым профилактическим подходом явилась возможность применения методов преимплантационной диагностики. ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Организационная модель медико-генетического консультирования в онкологии на примере наследственного РМЖ/РЯ с использованием высокотехнологичных диагностических методов внедрена и успешно используется в клинической практике различных подразделений РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

ВЫВОДЫ

1. В ходе проведения исследования сформирован и расширен специализированный клинико-генетический регистр пациентов и их родственников с онкологически отягощенным семейным анамнезом по нозологиям (2 583 членов из 1 678 семей).

2. На основании общих принципов организации медико-генетического консультирования систематизирована база клинико-генетических данных и создан банк биологического материала (цельная кровь, пластины G-окрашенных метафазных хромосом, ДНК/РНК, выделенные из крови и опухолевого материала, клеточные линии типированных мезенхимальных и раковых стволовых клеток).

3. Разработана стратегия МГК в онкологии. Медико-генетическое консультирование должно проводиться с учетом дифференциальной клинической и молекулярно-генетической диагностики, унифицированных расчетов риска и разработанного алгоритма в отношении больных и здоровых пациентов в зависимости от индивидуального генотипа.

4. В практику МГК наследственных форм рака молочной железы и/или яичников внедрено комплексное клинико-генетическое исследовании с применением ДНК-диагностики генов BRCA, ТР53, СНЕК2, MLH1, MSH2 и др. с целью верификации генетического диагноза у онкологических больных и членов их семей.

5. Высокая частота значимых делеторных мутаций гена BRCAI у больных НРМЖ (25,8%) а так же значительная доля (23%) вновь выявленных мутаций, не зарегистрированных в других популяциях, обосновывает необходимость молекулярного BRCA-скрининга с целью выявления наследственной предрасположенности к РМЖ. Вклад генотипических вариантов гена BRCA2 в развитие НРМЖ характеризуется: низкой частотой (2.2%) значимых делеторных мутаций; отсутствием «горячих точек» гена, индивидуальностью мутаций, высокой долей (30%) вновь выявленных в российской популяции мутаций, что определяет необходимость скрининга всей кодирующей части гена BRCA2.

6. Фенотип mtBRCA—НРМЖ характеризуется: ранним возрастом манифестации; преобладанием ИПР (87.0% BRCAl), тубуло-дольковой подгруппой (47.9 % BRCA2); высокой степенью злокачественности (61,1% BRCAl и 37,5% BRCA2); триадой рецептор-негативных опухолей (РП-, РЭ, HER2/neu-78.6% BRCAl), лучшей общей 10-летней выживаемостью больных — 65+4.1% (BRCAl), 88+13,1 (BRCA2).

7. BRCA-статус является прогностическим фактором при НРМЖ: позволяет достичь выраженного терапевтического эффекта, обусловленного полным лечебным патоморфозом в 100% случаев при проведении неоадъювантного лечения в то время как высокая частота (30%) ипсилатеральных опухолей снижает эффективность органосохранного лечения.

8. В структуре двухстороннего РМЖ высокая частота (57%) мутаций гена BRCAl преобладает у больных молодого возраста (до 40 лет) в сравнении с частой BRCAl мутаций среди пациенток старше 41 года (25%), Ассоциация заболевания с mtTP53 (1,2%) подтверждает наследственную этиологию двухстороннего РМЖ и обосновывает необходимость медико-генетического консультирования с последующей ДНК-диагностикой.

9. Фенотип mtBRCA-двухстороннего НРМЖ является типичным «портретом» ДОС4-ассоциированного РМЖ и характеризуется: высокой частотой ИПР (80%), высоким процентом медуллярного

РМЖ (7,5%), отсутствием рецепторов стероидных гормонов и гиперэкспрессии гена HER2/neu, низкой частотой мультицентричных опухолей (3%), полным лечебным патоморфозом (97%), высокой степенью конкордантности признаков.

10.Онкологически отягощенный анамнез (78,5%), высокая частота мутаций генов BRCA1 и ТР53 (18.7 %), ПМЗН (89%) определяют вклад молекулярно-генетических факторов в развитие РМЖ на фоне беременности. Пациентки с mtBR С А -ас со ц и ирован ным РМЖАБ имеют стандартный BRCA /-фенотип: более молодой возраст постановки диагноза (31,7 лет), преобладание ИП (64,2%) низкодифференцированного рака (85,7%), «триаду» рецептор-негативных опухолей, высокую степень лечебного патоморфоза, лучшую общую и безрецидивную выживаемость (90,8%).

11.Вклад мутации 11 OOdelC гена СНЕК2 в, развитие НРМЖ (1,7%) определяет необходимость проведения МГК с целью постановки предварительного генетического диагноза синдрома Ли-Фраумени и Ли-Фраумени-подобного синдрома.

12.РМЖ у мужчин с онкологически отягощенным анамнезом в 62% случаев ассоциирован со структурно-функциональными перестройками генов BRCA 1/2 и TP53. Молодой возраст манифестации заболевания — 48 лет, ПМЗН, онкологически отягощенный анамнез — достоверные критерии BRCA-ассоциированного мужского РМЖ, аналогичные mtBRCA РМЖ у женщин.

13.При наследственном РЯ частота мутаций гена BRCA1 является наиболее высокой среди всех наследственных опухолей ЖРС (72%); доля BRCA1 мутаций среди всех больных, страдающих РЯ; так же высока (16.8%), что может рекомендовать BRCA1 ДНК-скрининг в качестве диагностического и профилактического подхода в онкологической практике. Фенотип mtBRCA 1 НРЯ сходен с таковым при wtBRCA 1 СРЯ за исключением: более молодого возраста манифестации болезни (на 8 лет) — 47.9 лет, отсутствия муцинозного гистологического типа опухолей, преобладания низкодифференцированных опухолей и опухолей смешанной дифференцировки, высокой частоты сосудистой инвазии (80%), выраженного суммарного терапевтического эффекта, обусловленного высокой степенью лечебного патоморфоза (84%) и лучшими показателями общей выживаемости (58,9%).

14.Разработан алгоритм МГК в онкологии с применением высокотехнологичных диагностических методов на примере наследственного РМЖ/РЯ.