Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Наноповерхность эритроцитов при кровопотере и длительном хранении донорской крови

На правах рукописи

Сергунова Виктория Александровна

НАНОПОВЕРХНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ КРОВОПОТЕРЕ И ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ ДОНОРСКОЙ КРОВИ

14.03.03- патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ПАР 2013

Москва-2013

005050229

005050229

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им.В.А.Неговского» Российской академии медицинских наук.

Научные руководители

Мороз В.В. доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки России

Черныш A.M. доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Порядин Геннадии Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой патофизиологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» МЗ РФ.

Решетняк Виталий Кузьмич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заместитель директора Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук.

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» МЗ РФ.

Защита состоится « »_2013г. в __ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.051.01, созданного при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А.Неговского» Российской академии медицинских наук по адресу: 107031 г. Москва ул. Петровка, д.25, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИОР» РАМН по адресу: 107031 г. Москва ул. Петровка, д.25, стр.2 Автореферат разослан « » 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Решетняк Василий Иванович

Актуальность исследования

Одной из важных проблем современной реаниматологии является исследование механизмов развития критических и терминальных состояний на органном, клеточном и молекулярном уровнях [Неговский В.А., 1986, Мороз В. В., 2011]. Особое значение имеет изучение критических состояний связанных с кровопотерей. Кровопотеря во время хирургических вмешательств, а также при тяжелых сочетанных травмах является причиной нарушений мембран красных клеток крови [Girotti A.W, 1984; Skoumalovä А., 2008]. При травмах и критических состояниях часто возникает необходимость переливания донорской крови [Dong А., 2012]. Поэтому проблемы изучения характеристик эритроцитов при кровопотере и при длительном хранении донорской крови является одной из ключевых проблем реаниматологии [Мороз В.В., Голубев A.M., 2012]. Важным направлением развития современной медицины в целом и реаниматологии в частности, является применение новейших физических и биофизических методов исследования наноструктур мембран эритроцитов. Перспективным методом изучения биологических клеток является сканирующая зондовая микроскопия [Binning G., Rohrer Н., 2000; Gadegaard N. 2006; Carvalho F.A., 2012]. Изучению вопросов, связанных с изменением эритроцитов при терминальных состояниях, посвящен ряд исследований, проведенных на клеточном уровне [Кожура B.JI., 1993; Berezina Т., L., Zaets S.,B., 2002], однако, вопрос об изменениях наноструктуры мембран эритроцитов при различных патологических состояниях и в результате экспериментальных воздействий остается открытым. Состояние мембран эритроцитов играет важную роль в сохранении их целостности [Betz Т., Bakowsky U., 2007], и в осуществлении их газотранспортной функции [Cabrales Р., 2007]. В изучаемой проблеме важно найти пути коррекции возникающих нарушений наноструктуры мембран. Поэтому актуальным является исследование результатов применения отечественного препарата «перфторан» [Мороз В.В.,

2011; Иваницкий Г.Р., 2001; Шумаков В.И., 1999; Кармен Н.Б. и др. 2005] для этих целей.

Цель исследования:

Определить закономерности изменений наноповерхности мембран эритроцитов при кровопотере и длительном хранении донорской крови, и предложить возможные механизмы этих изменений. Задачи исследования:

1. Определить собственные параметры наноповерхности мембран эритроцитов и установить их связь с молекулярными структурами мембран.

2. Изучить изменения собственных параметров наноповерхности и локальной жесткости мембран эритроцитов при воздействии мембранных модификаторов (in vitro).

3. Изучить динамику изменения наноструктуры и локальной жесткости мембран эритроцитов при длительном хранении донорской крови.

4. Оценить изменения наноструктуры мембраны при кровопотере в эксперименте и в клинике.

5. Изучить влияние перфторана на наноструктуру и жесткость мембраны эритроцитов при кровопотере и действии мембранных модификаторов.

Научная новизна:

1. Впервые с помощью атомной силовой микроскопии выделены собственные параметры наноповерхности мембран красных клеток крови, которые являются количественными критериями для изучения патофизиологических механизмов нарушений клеточной мембраны.

2. Впервые с помощью атомной силовой микроскопии изучена динамика изменений наноповерхности мембраны эритроцитов и влияние этих изменений на макроструктуру клеток при длительном хранении донорской крови.

3. Впервые показаны изменения наноповерхности мембран эритроцитов при гипотензии в лабораторных экспериментах in vitro.

4. Впервые показаны особенности нарушений наноповерхности мембран эритроцитов в зависимости от объема кровопотери при хирургических операциях. Показана динамика изменений собственных параметров наноповерхности в послеоперационном периоде.

5. Впервые показано корректирующее действие перфторана на наноструктуру красных клеток крови при экспериментальной гипотензии и действии мембранных модификаторов.

6. Впервые показаны изменения локальной жесткости мембран при длительном хранении донорской крови, действии мембранных модификаторов и перфторана.

Практическая значимость:

Показана возможность использования собственных параметров наноповерхности мембран для оценки состояния эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций и тяжелых сочетанных травм. Определена динамика изменений наноструктуры и жесткости мембран эритроцитов на различных этапах хранения донорской крови; показаны пусковые механизмы и оценены деструктивные изменения формы клеток крови при длительном ее хранении. Определен срок хранения донорской крови - 12 - 15 дней, после которого наступают необратимые, деструктивные нарушения мембран. Показана эффективность применения перфторана для коррекции наноструктуры мембран и жесткости эритроцитов, при действии ряда экзогенных факторов, что может быть использовано при разработке методов терапии критических состояний.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Наноповерхность мембран красных клеток крови, регистрируемая с помощью атомной силовой микроскопии, может быть описана набором собственных параметров. Собственные параметры наноповерхности соответствуют физиологическим уровням структурной организации мембран эритроцитов.

2. Длительное хранение донорской крови вызывает различные специфические изменения наноповерхности и локальной жесткости мембран эритроцитов, характерные для разных стадий её хранения.

3. Параметры наноструктуры мембран при хирургических операциях и динамика их изменений в послеоперационном периоде зависят от объёма кровопотери.

4. Перфторан, вводимый в кровь после экспериментальной гипотензии и воздействия мембранных модификаторов, корректирует наноструктуру и жесткость мембран красных клеток крови.

Апробация работы:

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ лаборатории биофизики мембран клеток при критических состояниях Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А.Неговского» Российской академии медицинских наук.

Результаты работы были представлены на 1-й Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» 23-26 ноября 2010 г. Санкт-Петербург; на конференции "Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии", 8 декабря 2010 г., Москва; XIII Всероссийской конференции «Жизнеобеспечение при критических состояниях» и I Всероссийской конференции молодых ученых «Инновации в анастезиологии-реаниматологии», посвященные 75-летию НИИ общей реаниматологии им. В.А. Неговского РАМН, 28-30 марта 2011г., Москва; 18А Meeting European Association for Red Cell Research Wroclaw-Piechowice, May 12-15th, 2011, Poland; XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», 23-27 апреля 2012г, Москва; 19й1 Congress of Slovak Society of Anaesthesiology and Intensive medicine with International Participation 12-19 May 2012, Pieshtyany; на международной конференции «Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины», 18-19 октября 2012г, Харьков.

Структура работы .

Диссертация представляет собой том машинописного текста объемом 165 страниц. Состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных результатов работы и их анализа, выводов, 2 приложений, списка литературы, содержащего 57 отечественных и 120 зарубежных источников. Работа содержит 55 рисунков, 36 таблиц, 41 графиков.

Материалы и методы исследования

Проводили исследования, состоящие из экспериментальной и клинической части. Экспериментальная часть состояла из серии модельных опытов in vitro (мембранные модификаторы), серии опытов проведенных на животных (гипотензия) и серии опытов по хранению донорской крови человека. Клиническая часть включала исследования эритроцитов человека при проведении хирургических операций на спинном мозге и при ТСТ.

Методика опытов с животными. Эксперименты проводили на 27 нелинейных крысах-самцах массой 450 г под нембуталовым наркозом (40 мг/кг внутрибрюшинно). Эксперименты на животных проводились в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным (2006). Для моделирования терминального состояния использовали гиповолемическую гипотензию (АД 40 мм.рт.ст.) в течение шестидесяти минут с последующей реинфузией крови, добавлением перфторана или раствора Рингера (1мл/кг). Кровопотерю проводили из хвостовой или бедренной артерии. На протяжении всего опыта регистрировали артериальное давление «РМ-9000 Express» (Mindray, Китай). Общий объем кровопотери составлял в среднем 15 мл/кг массы тела. Опыт состоял из четырех фаз: первая — контроль, вторая - 5 минут от начала кровопотери, третья - 60 минут гипотензии, четвёртая - 2 часа после реинфузии (через 1 час после реинфузии вводили перфторан 3 мл/кг или раствор Рингера в том же объеме и через 1 час отбирали пробу).

Описание пациентов, операций, объемов кровопотерь. В исследование были включены 17 пациентов, оперированных в центре нейрохирургии

Городской клинической больницы №19 по поводу патологии спинного мозга. Все они дали добровольное согласие на исследование своей крови в соответствии с нормами этического комитета НИИОР. Венозная кровь отбиралась у больных с заболеванием спинного мозга до, во время и после хирургических операций. Характеристика трёх групп (по объёму кровопотери) этих больных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительная характеристика больных в группах, (М±т)

Показатели Значения показателей в группах

1 2 3

Количество (п) 6 6 5

Пол М Ж М Ж М Ж

4 2 3 3 3 2

Средний возраст, 52±12 53±9 47±11

годы

Объем кровопотери, 300±50 600±200 1500±200

мл 3,3±1,2 мл/кг 9,8±2,3мл/кг 15,48±1,2 мл/кг

В исследование вошло 18 больных с ТСТ. Больных разделили на две группы: А - с кровопотерей 1500±200 мл (18±3,2мл/кг) -10 пострадавших, Б -с кровопотерей 2500±500 мл (23±2,4 мл/кг) - 8 пострадавших. На всех этапах наблюдений у каждого пациента изучали не менее 120 клеток.

Методика хранения крови и проведение экспериментов. Цельная кровь отбиралась в отделении переливания крови Городской клинической больницы им. С.П.Боткина у 6 здоровых доноров от 27 до 35 лет и запаковывалась в специализированные контейнеры с консервантом ЦФДА-1.

Кровь хранилась в течение 30 дней при температуре 4°С в герметичной упаковке в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Отбирали пробы 15 мл крови без нарушения герметичности контейнера для проведения общего и биохимического анализов. Содержание активного глутатиона (мкМоль/г НЬ) проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием (Shimadzu Prominence RF-20A) и реагенты фирмы «Chromsystems» (Германия). Пробы отбирали на 1, 2, 5, 6, 8, 10, 12, 16,19, и 30 сутки хранения. Все измерения проводили при 20°С.

Общий анализ крови проводили на анализаторе ADVIA 60 (Bayer, Германия). Измеряли количество эритроцитов, клеточный гемоглобин, гематокрит, средний клеточный гемоглобин, распределение эритроцитов по ширине. На биохимическом анализаторе Cobas Mira Plus (Roche, Швейцария) измеряли билирубин, глюкозу, общий белок. С помощью анализатора i-STAT 300, картридж GG8+ (Abbott, США) и иономера И-510 (Россия) проводили анализ кислотно-основного состояния крови, каталазы (спектрофотометр СФ-46, СССР), спектра гемоглобина (Apel PD-303, Япония). Показатели крови для всех суток хранения сравнивались с контрольными показателями в день отбора.

Методы получения изображения на АСМ.

Изображения наноповерхности мембран эритроцитов получали с помощью атомного силового микроскопа NT-MDT «NTEGRA prima» (РФ). Монослои эритроцитов получали с помощью прибора «V-sampler, Vision Microscopy» (Австрия). Сканирование проводили в полуконтактном режиме. Использовали кантилеверы NSG01-A, с резонансной частотой 87-230 кГц. Радиус зонда - 10 нм. Число точек сканирования 512 и 1024, поля сканирования 100x100 мкм, 10x10 мкм. Область сканирования отображали как в 2D, так и в 3D форматах. В диссертации приведён атлас форм эритроцитов в АСМ (24 изображения).

Измерение жесткости мембран эритроцитов. Для измерения жесткости мембран эритроцитов (Кт) использовали атомно-силовую спектроскопию. Силовые кривые регистрировали в 6 точках на торе эритроцита. Измерения проводили кантилевером SD-R150-NCL-10. Радиус зонда150 нм, резонансная частота 181 кГц, К=36 Н/м. Измерения производили на 6 клетках одного образца. Различные клетки и разные участки мембраны эритроцита имели разброс по величине Кт. Поэтому в работе оценивали среднюю локальную жесткость мембран для 2140 клеток.

Результаты исследования Собственные параметры наноповерхности мембран эритроцитов и их физиологическая интерпретация. Профиль поверхности мембраны является сложной непериодической функцией, которая может быть представлена пространственным преобразованием Фурье. С помощью процедуры фильтрации можно получить пространственный спектр Фурье: = ^¡к' Н]к где: Н - спектральная функция фильтра.

. - ■■ .

w

К М

Ч ¡Мг*?'-

- ч* * А

'До 1

aMij^i

щт 'гз&з ¿¿тш

Рис.1. Пространственное Фурье - разложение поверхности мембраны эритроцита: а) исходное изображение, его профиль; б), в), г) поверхности I, II и III порядка и их профили. Справа представлены соответствующие молекулярные модели

Пространственное преобразование Фурье реализуется программным обеспечением ACM «NTEGRA prima». Исходное изображение фрагмента мембраны представляет собой сложную гетерогенную поверхность (рис. 1 .а).

Размеры структур регистрируются на соответствующих профилях поверхностей. Было выделено три спектральных окна.

Первое спектральное окно - пространственный период - Lj -600-1000 nm (поверхность первого порядка), второе спектральное окно -пространственный период - L2 - 70-300пш (поверхность второго порядка), третье спектральное окно - пространственный период L3 -20-60 nm (поверхность третьего порядка).

Интерпретация изображений I, II, III порядков. Спектральные окна были выбраны в соответствии с физиологическими уровнями структурной организацией мембран эритроцитов. Пространственные периоды первого порядка имеют размеры волн flickering [Park Y. et al., 2010, приложение 1] и представляют собой одномоментную реплику этого явления. Высоты наноструктур h, также близки к этим показателям flickering. Размер Ь2, второго порядка наноповерхности соответствует размерам спектриновых ячеек (80-200) нм. Пространственные периоды L3 близки к размерам белковых структур и их кластеров 10-50 нм. Таким образом, задача интерпретации полученных изображений решается следующим образом: первый порядок - отображает мембранный flickering; второй порядок - несет информацию о состоянии спектринового матрикса; изменения третьего порядка - соответствуют изменениям характеристик белковых молекул и/или белковых кластеров, а также изменениям связей спектринового матрикса при его деструкции.

Нарушение наноструктуры мембран при действии мембранных модификаторов и корригирующие эффекты перфторана. На мембраны эритроцитов действовали модификаторами и регистрировали изменения собственных параметров мембран. Выбранные агенты имели различную физико-химическую природу и разные механизмы действия. Гемин воздействует на протеиновые комплексы связей спектрина с мембраной [Li S.D. et al.,2006]; раствор NaN02 - вызывает окисление липидов; ионы кальция и цинка вызывают кластеризацию протеинов и нарушения

скелетного матрикса [Хайруллина А. Я. и др., 2011, Friederichs Е. et al., 1994]; фуросемид - блокатор транспортной функции белка band 3 [Yang X. et al., 1995]; верапамил - блокатор кальциевых каналов [Stojiljkovicl N. et al,2008]. Выборка для анализа формы клеток при воздействии мембранных модификаторов составляла не менее 1400 клеток для каждого модификатора.

Гемин (солянокислый гематин). Концентрация гемина в крови составляла 0,8 - 1,8 мМ. При малых концентрациях гемина (0,8 - 1 мМ) в монослое преобладали планоциты. При концентрациях 1,3-1,7 мМ в монослое наблюдались клетки с выраженными характерными доменами (рис. 2, синие стрелки). Характерные размеры между зернами в домене составляли 100 - 200 нм. При действии гемина изменялись, прежде всего, параметры поверхности второго порядка.

Рис. 2. Результат воздействия гемина: а) эритроцит, б) поверхность домена, выделенного желтым квадратом на (а); в) профиль поверхности выделенного

домена

Гемин нарушал цитоскелет, что проявилось в изменении параметра /г2. Через 10 минут после воздействия гемина высота Ь2 (п=1600) клеточной мембраны увеличилась по сравнению с контрольным значением в 6 раз

(р<0.05) (рис. 3.)- С ростом концентрации гемина происходило слияние доменов и зерен внутри них. Появление кластеров на поверхности мембраны явилось пусковым механизмом изменения формы клетки: постепенно формировались эхиноциты, а затем и сфероэхиноциты.

При действии ШЬЮг, СаСЬ и ионов цинка наноповерхность мембран имела свои особенности и была специфична для каждого из этих модификаторов: так введение №"Ы02 вызывало изменение параметров Ь| и [ъ, представленное на рис 3. Воздействие цинка увеличивало высоту И| по сравнению с контрольным значением в 10,1 раз (р<0,05), Ь2 в 3 раза (р<0,05), Ь3 в 2,5 раза (р<0,05). Последующее воздействие перфторана возвращало высоты параметра Ь| практически в исходное состояние.

контроль

воздействие NaN02 воздействие NaNO + Пф

Порядки

- р<0,05 по сравнению с контролем

Рис.3. Параметры hi, h2, h3 (нм) клеточной мембраны для контрольноых клеток, клеток последействия NaN02 и после добавления перфторана Изменение локальной жёсткости мембран. При действии указанных модификаторов локальная жесткость мембран увеличивалась (табл. 2). После действия перфторана жесткость возвращалась к исходной (85%). Остальные клетки сохраняли повышенную жесткость (табл.2). Лекарственные модификаторы (in vitro) фуросемид (10 мг/ мл в кровь) и верапамил (2,5 мг/мл в кровь) действовали на мембраны эритроцитов иначе. Фуросемид

вызывал у 90% наблюдаемых клеток характерные концентрические структуры с периодом 80 - 200 нм на поверхности. Верапамил вызывал у 95% наблюдаемых клеток углубления 550±200 нм. При этом достоверных изменений величин Ь; на фрагментах поверхности, где отсутствовали характерные кольца и углубления не регистрировали. После воздействия фуросемида и верапамила средняя жесткость не увеличилась по сравнению с контрольным средним. Таблица 2

Средняя локальная жесткость мембраны после воздействия модификаторов (М±т)

Показатель Контроль гемин (68% измерений) гемин (32% измерений) гемин+ПФ (85% измерений) гемин+ПФ (15% измерений)

К отн.ед. 4,3±2,6 9,1±2" 4±2 4,1 ±2,6 10 ±1*

Контроль ЫаШ2(95% измерений) NaNO: (5% измерений) ЫаЫ02+ПФ (90%) ЫаЫО,+ПФ (10%)

К отн.ед. 4,3±2,6 8,4±1,8* 4,5±1 4,08±1,2 9,5±1*

Контроль СаС12 (92% измерений) СаС12 (8% измерений) СаСЬ +ПФ (67% измерений) СаС1,+ПФ (33% измерений)

К отн.ед. 4,3±2,6 9,2±2,1" 4,5±2,8 4,2±2,18 8,5±1,5*

*-р<0,05 по сравнению с контролем

Наноструктура мвбраны эритроцитов при длительном хранении донорской крови. На протяжении всего периода хранения донорской крови анализировали состояние эритроцитов с помощью общего, биохимического анализа и анализа кислотно-основного состояния. Количество эритроцитов упало с 4,1±0,9х10пл в первый день до 3,1±0,4 х1012л в тридцатый день хранения донорской крови (р<0,05). Клеточный гемоглобин понизился с 12,1 ±2,2 г/дл в первый день хранения до 9,2 ±1,2 г/дл (р<0,05 по сравнению с первым днем хранения). Достоверных различий в изменении гематокрита на протяжении всего периода хранения крови не выявлено.

Показатели активного глутатиона на протяжении всего периода хранения донорской крови падали (рис.4а) и к 30 дню хранения снизились на 18%. Содержание ионов калия увеличивалось от 3,8±0,3 до 21±8 ммоль/л к 30 дню. В 1 день рН был 6,9 ±0,1. К тридцатому дню рН снизился до 6,5±0,1. Наноповерхность мембран существенно менялась к 30 суткам. Наибольшие изменения выражены в параметрах Ь] и 1ъ. Динамика изменений форм

12

эритроцитов и появления на поверхности мембран дефектов различных размеров (от 100 до 750 нм) представлена на рис. 5 и 6.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32

Сутки

*- р<0,05; *** - р<0,001 по сравнению с первым днем хранения крови

Сутки

*-р<0,05 по сравнению с первым днем хранения донорской крови)

Рис. 4. Динамика изменения активного глутатиона а) и внеклеточного К+ б) на протяжении всего периода хранения крови.

*р<0,05 по сравнению с первым днем хранения донорской крови

**р<0,01 по сравнению с первым днем хранения донорской крови

Рис. 5. Динамика изменения количества различных форм эритроцитов (%) в течение периода хранения донорской крови. СЭ - сфероэхиноциты.

По мере уменьшения числа мелких дефектов начинало расти количество крупных выростов на наблюдаемой поверхности мембран. Количество крупных дефектов (500 — 750 нм) имело максимум на 16 сутки хранения крови. Средние и крупные дефекты на шестые - восьмые сутки превращались в многоярусные выросты и на десятые — четырнадцатые сутки формировали эхиноциты, которые к тридцатым суткам деструктировались до сфероэхиноцитов.

32+27."

дисконты ■днсшдпы |т\'боь;он впадиной

■ таноцигы

■ ЭХИНОЦИТЫ

I < I ■ I ■ I ' I ' I 1......I ■ I ' I ' I

3 10 12 и 16 1? 20 22 24 26 28 30 I

*р<0,05 по сравнению с первым днем хранения донорской крови

Рис. 6. Динамика изменения дефектов мембран при хранении донорской крови Синяя кривая - суммарное количество мелких -, красная - крупных

дефектов.

Динамика изменения жесткости мембран эритроцитов в процессе хранения донорской крови. В течение всего периода хранения крови измеряли среднюю локальную жесткость мембраны эритроцитов. Показатели средней локальной жесткости мембраны эритроцитов при хранении донорской крови представлены в таблице 3. Таблица 3

Показатели средней локальной жесткости мембраны эритроцитов при хранении донорской крови

Дни хранения 1 15с (70%) 15с (30%) 30с (84%) 30с (16%)

К (отн.ед.) 4,3±2,6 5,0±1,8 10,42±1,07» 9,2±1,5» 3,5±1,6

*-р<0,05 по сравнению с первым днем хранения крови

Силовые кривые для 1, 15 и 30 дней хранения представлены на рисунке 7.

Жесткость в первый 1 день составила 3-5 отн. ед, к 15 дню - она возросла на 21% (70% клеток), а к 30 дню она увеличилась в 2,1 раза . Такое

увеличение жесткости мембраны красных клеток крови могло приводить к снижению И ~ 27-31%, ухудшению реологических свойств крови.

;1 о , г.

Рис.7. Силовые кривые мембраны красных клеток крови для 1дня а), 15 дня б), 30 дня в) хранения крови.

Динамика изменения наноструктур мембраны эритроцитов животных при гипотензии и последующей реинфузии. В исходном состоянии у наркотизированных, оперированных крыс преобладающей формой клеток являлись стоматоциты 75±6%. В таблице 4 представлено распределение (%) различных форм эритроцитов характерное для разных фаз опытов. Таблица 4.

Распределение форм эритроцитов в эксперименте на животных М±т

форма Этапы опыта

исход 60' гип 2ч п/реин. р-р Рингера 2ч п/реин. Пф

стоматоциты 75±6 93±7* 68±7 64±8

глубокие дискоциты 13±2 0 25±3* 1±0,5*

планоциты 12±1 7±1* 7±1* 35±4*

*-р<0,05 по сравнению с исходом

В таблице 5 представлены показатели средних значений параметра h* наноструктуры эритроцитов в лабораторном эксперименте при добавлении перфторана через 2 часа реинфузии (М±т). Таблица 5.

Показатели средних значений параметра h, для разных фаз опытов

Этапы опыта Число животных Количество исследуемых клеток Параметр hj нм

h, h2 hj

исход 27 5400 1,8±0,3 1,1±0,6 0,10±0,03

5/гип 9 1755 7,8±2,6* 1,8±0,5 0,17±0,08

6(У тип 9 1782 4,7±1,2* 5,1±1,5* 0,3±0,07»

2ч п/реин. Пф 5 1030 1,55±0,3 0,65±0,4 0,19±0,10

*-р<0,05 по сравнению с исходом

Введение перфторана в концентрации Змл/кг через 1 час после реинфузии во всех опытах уменьшало высоты ^ до уровней близких к контрольным. Показатель параметра ^ наноструктуры эритроцитов при добавлении раствора Рингера через 2 часа реинфузии коррегирующего эффекта структуры мембраны эритроцита не показал.

Изменения формы клеток и наноструктуры мембран эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций и ТСТ.

Процентное количество клеток различных форм менялось для разных дней послеоперационного периода. Данные для групп А и Б представлены в таблице 6. Таблица б.

Формы эритроцитов у больных в группах в результате ТСТ (М±ш)

А группа Форма

дискоциты эхиноциты стоматоциты планоциты глубокие дискоциты

контроль 93±1,2% 3,0±0,4% 1,0±0,2% 1,0±0,2% 2,0±0,3%

1 сутки 33,0±4,6%** 15,0±1,7%** 3,0±0,6%** 2,0±0,4%** 47,0±5,1%**

Б группа Форма

дискоциты эхиноциты стоматоциты планоциты глубокие дискоциты

контроль 93,0±1,2% 3,0±0,4% 1,0±0,2% 1,0±0,2% 2,0±0,3%

1 сутки 35,0±3,8%** 17,0±2,1%** 0 0 47,0±4,8%**

*р<0,05 по сравнению со статистическим контролем; -**р<0,01 по сравнению со статистическим контролем

Форма некоторых эритроцитов не изменялась, но на поверхности их мембран появлялись топологические дефекты. Диаметр их изменялся от 40 нм до 280 нм, глубина достигала 25 нм.

Динамика изменения параметров наноструктуры мембран эритроцитов в первые, третьи пятые дни после операции представлена в таблицах 7-9. Таблица 7

Показатель среднего параметра hi у пациентов первой группы после операций на спинном мозге (М±ш)

параметр hf нм контроль на 1 сутки на 3 сутки на 5 сутки

hi 4,8±1,8 12,1±6,2 22,2±2,4»*» 8,4±2,8

hj 1,6±0,6 3,4±0,2"* 1,2±0,4 0,8±0,2«

h, 0,34±0,1 0,4±0,1 0,6±0,2 0,2±0,1

*-р<0,05 по сравнению с контролем; *»-р<0,01 по сравнению с контролем; ♦**-р<0,001 по

сравнению с контролем.

Таблица 8

Показатель среднего параметра И, у пациентов второй группы после операций на позвоночнике (М±ш)

параметр hi нм контроль на 1 сутки на 3 сутки на 5 сутки

h. 4,2±2Д 36,3±5,0**» 26,1±10,3* 12,1±2,3*

h, 1,8±0,2 1,8±0,6 2,0±0,4 2,3±1,4

hi 0,36±0,26 0,4±0,1 0,4±0,1 0,8±0,4

*-р<0,05 по сравнению с контролем; **-р<0,01 по сравнению с контролем; ***-р<0,001 по сравнению с контролем

Таблица 9

Показатель среднего параметра h,y пациентов третьей группы после операций на позвоночнике (М±ш)

параметр Л, нм контроль на 1 сутки на 3 сутки на 5 сутки

h, 3,8±2 12±4" 10,8±4 19,2±2»««

h, 1,4±0,2 1,8±0,6 8±1*** 2±0,6

h, 0,38±0,26 0,6±0,2 2±0,6* 0,2±0,1

*-р<0,05 по сравнению с контролем; **-р<0,01 по сравнению с контролем; +**-р<0,001 по сравнению с контролем

В первой и второй группах на послеоперационный стресс наноструктура эритроцитов отвечала характерной тенденцией: h] в 1 и 3 сутки возрастал в 3-9 раз по сравнению с контролем. К пятым суткам первый порядок уменьшался в 3 раза по сравнению с третьими сутками, но оставался в 1,5 раза выше контрольных значений. При больших кровопотерях (третья группа1500±200 мл) тенденция была иной: на третьи сутки: hi и h2 возрастали в 2,5 и 6 раз соответственно, h3 - в 5,3 раза; flick к пятым суткам еще более возрастал (в 4,7 раза). Для этой группы пациентов характерны максимальные нарушения наноструктуры мембраны. Средний показатель площади спектриновой ячейки (S) у пациентов первой и третьей групп представлен в таблице 14 и на рисунке 8. Таблица 10

Средний показатель площади спектриновой ячейки (S) у пациентов с

различной кровопотерей М±т .

Исход первой группы Исход третьей группы Кровопотеря 300±50мл Кровопотеря 1500±200мл

S усл. ед. 0,020±0,011 0,023±0,012 0,029±0,011 0,05±0,01*

*-р<0,05 по сравнению с исходом

Рис. 8. ACM реплика спектринового матрикса мембраны эритроцитов: а) - исход третьей группы; б) - после кровопотери Представленные тенденции изменения порядков наноструктуры эритроцитов при хирургических операциях зависели от объемов кровопотери и были характерны для каждой группы пациентов. Изучение тенденции нанопараметров эритроцитов при различных объемах кровопотерь может быть использовано для оценки состояния эритроцитов в послеоперационном периоде.

Механизмы нарушений наноповерхности мембран эритроцитов Спектральные окна разложения наноповерхности были выбраны исходя из структурной организации мембран: липидный бислой -спектриновый матрикс (цитоскелет) - соединительные протеиновые комплексы. Показано, что при действии известных модификаторов существенно изменялся параметр h2, то есть наибольшим изменениям подвергалась наноповерхность второго порядка.

Модификаторы образовывали на поверхности мембран топологические дефекты. Особенность таких дефектов заключалась в том, что их кофигурации были специфичны для каждого агента. Специфичность действия каждого агента определялась конфигурацией локальных зон энергии связей цитоскелета. При этом характерный размер этих топологических дефектов был одинаков, и соизмерим с размерами ячеек деструктированного спектрина. Топологические дефекты спектриновой сети могут возникать по двум причинам. Первая - вследствие нарушений

18

протеиновых связей в узлах соединения спектрина с мембраной. Такие нарушения возникают при действии агентов на протеиновые комплексы band 3 и band4.1, например, при действии гемина. Вторая причина -окислительные процессы в самом спектрине, что приводит к деформации и разрыву нитей и изменениям топографии спектриновых ячеек. Это и приводит к изменению параметров h2 и Lj. Метод инфляции экспериментально показал, что при больших кровопотерях спектриновый матрикс нарушался, в результате чего, площадь ячейки увеличивалась. Изменение конформации матрикса влияет на наноповерхность мембраны и, в частности, на flickering , то есть на параметр h,.

Таким образом, основным механизмом, вызывающим топологические изменения наноповерхности мембран эритроцитов является деструкция протеиновых связей спектрина с плазматической мембраной и нарушения фрагментов цитоскелета. Восстановление повреждённой наноструктуры требует, в первую очередь, ликвидации топологических дефектов спектриновой сети. В работе решается и обратная задача: регистрируя изменения наноповерхности мембран, получают информацию о состоянии мембраны. Перфторан восстанавливал форму клеток и среднюю локальную жёсткость мембран. Перфторан мог влиять на конформацию спектринового матрикса непосредственно или через цепь биохимических реакций.

ВЫВОДЫ

1. С помощью спектрального пространственного преобразования Фурье наноповерхности мембран эритроцитов были получены собственные параметры клеточной мембраны Lj и h;, которые являются количественными критериями для изучения патофизиологических механизмов нарушений клеточной мембраны. Изменение величины hj - (I порядок) несет информацию об интенсивности flickering мембраны, изменение параметра h2 (II порядок) - об изменении структуры спектринового матрикса; изменение параметра h3 - (III порядок) несет информацию о процессах агрегации белковых кластеров.

2. С помощью атомной силовой микроскопии в опытах in vitro показано, что мембранные модификаторы (гемин, NaN02, соединения Са, ионы Zn) приводят к возникновению специфических топологических дефектов наноповерхности, увеличивают ее жесткость и меняют форму клеток. Лекарственные модификаторы верапамил и фуросемид (в больших концентрациях) изменяли наноструктуру и форму клетки, не меняя ее средней жесткости. Показанные изменения собственных параметров наноповерхности мембран являются основой для изучения патофизиологических механизмов экзогенных воздействий, различной природы на наноструктуру мембран.

3. Количественно оценена степень деструкции наноповерхности мембран в динамике при длительном хранении донорской крови. При хранении крови в указанных условиях после 12 - 15 суток развивались необратимые деструктивные нарушения наноповерхности мембран, приводящие к появлению сфероэхиноцитов. По мере хранения клеток увеличивалась жесткость мембран в 1,8-2,1 раза.

4. В лабораторном эксперименте на животных (крысах) к 5 минуте гипотензии наблюдались существенные изменения наноструктуры: hi и h2 увеличивались в 2 раза, возрастал flickering и нарушалась структура спектринового матрикса. h3 возрастал 3-6 раз, (изменения структур протеиновых кластеров). К 60 минуте эти нарушения увеличивались.

Введение перфторана через 1 час после реинфузии приводило собственные параметры hi к величинам близким к контрольным значениям.

5. При кровопотере в результате хирургических операций возникали нарушения наноноструктуры мембран красных клеток крови, вызывающие изменения hj параметров. Величины изменений этих параметров зависели от объемов кровопотери, и имели характерную динамику в послеоперационном периоде. При объемах кровопотери до 600±200 мл (9,8±2,3мл/кг) изменения параметров были максимальны в первые сутки после операции. К 5 суткам эти параметры возвращались к значениям близким к контрольным. При

кровопотерях 1500±200 мл (15,48±1,2 мл/кг) наибольшие нарушения всех параметров наноструктуры наблюдались на 3 сутки. К пятым суткам параметр h] оставался в 4 раза выше контрольного.

6. Основным механизмом, вызывающим топологические изменения наноповерхности мембран эритроцитов при действии мембранных модификаторов, при хранении донорской крови, при кровопотере является деструкция протеиновых связей спектрина с плазматической мембраной и нарушения фрагментов цитоскелета. Изучение наноповерхности мембран позволяет решать обратную задачу: получать информацию о состоянии их наноструктуры.

7. Введение перфторана после воздействия мембранных модификаторов (гемин, NaN02, Са С12, верапамил, фуросемид) in vitro, после гипотензии в модельных опытах восстанавливало исходные параметры наноповерхности и форму клеток. Введение перфторана после действия модификаторов восстанавливало жёсткость мембран в 60-90% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты по изучению действии гемина, NaN02, ионов цинка, фармакологических модификаторов мембран могут быть использованы при оценке токсикологического эффекта воздействия различных препаратов на мембраны эритроцитов человека при общих и профессиональных заболеваниях.

2. Закономерности изменения собственных параметров наноструктуры мембран при хранении донорской крови могут быть использованы для оценки функционального состояния эритроцитов и микрореологических свойств крови и выработки рекомендаций по пригодности её для проведения трансфузии.

3. Показанные в работе тенденции и динамика изменений собственных параметров наноповерхности эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций может быть использована для оценки процессов восстановления красных клеток крови в послеоперационном периоде.

Публикации:

1. Козлова Е. К., Черныш А. М., Гудкова О. Е., Федорова М. С., Сергунова В.А. "Сложные поверхности мембран эритроцитов в поле атомного силового микроскопа "FEMTOSCAN" и последующий Фурье-анализ этих поверхностей.// Четвертая международная конференция 15-18 июня 2010 г., Москва, физический факультет МГУ, сборник тезисов. МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва, 2010, с. 64.

2. Мороз В.В., Сергунова В.А., Фёдорова М.С., Козлова Е.К., Черныш A.M. Нарушение наноструктуры мембраны эритроцитов при острой кровопотере и её последующая коррекция перфтораномУ/Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине. Т. 3: сборник трудов Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» 23-26 ноября 2010, Санкт-Петербург.278-280

3. Сергунова В.А., Гудкова O.E., Федорова М.С.: Коррекция перфтораном наноструктуры поверхности мембран при острой кровопотере.// Конференция "Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии", материалы научно-практической конференции 8 декабря 2010 г., Москва, 2010, с. 76-78.

4. Sergunova V.A, Moroz V.V., Fedorova M.S., Kozlova E.K., Chernysh A.M. The distortion of red blood cell membrane nanostructure under acute blood loss and its subsequent correction. //18th Meeting European Association for Red Cell Research Wroclaw-Piechowice, Poland May 12-15th, 2011. P.44-45.

5. B.B. Мороз, A.M. Черныш, E.K. Козлова, В.А. Сергунова, O.E. Гудкова, М.С. Федорова, А.К. Кирсанова, И.С. Новодержкина. Нарушение наноструктуры мембран эритроцитов при острой кровопотере и их коррекция перфторуглеродной эмульсией.//Общая реаниматология 2011, 7(2), с.5-9.

6. Е.К. Козлова, A.M. Черныш, В.В. Мороз, А.Н. Кузовлев, В.А. Сергунова. Действие ионов цинка на мембраны красных клеток крови in vitro.// Медицинская Физика. 2011,4(52), с.43-49.

7. В. В. Мороз, А. М. Голубев, А. М. Черныш, Е. К. Козлова, В. Ю. Васильев, О. Е. Гудкова, В. А. Сергунова, М. С. Фёдорова. Изменения структуры поверхности мембран эритроцитов при длительном хранении донорской крови.// Общая реаниматология , 8(1), Москва, 2012, 5-12.

8. В. В. Мороз, А. М. Голубев, А. В. Афанасьев, А. Н. Кузовлев, В. А. Сергунова, О. Е. Гудкова, А. М. Черныш. Строение и функция эритроцита в норме и при критических состояниях.//Общая реаниматология ,8(1), Москва, 2012,52-60.

9. Chernysh А. М., Kozlova Е. К., Moroz V. V., Sergunova V. A., Gudkova О. Ye., and Fedorova M. S. Reversible zinc-induced injuries to erythrocyte membrane nanostructure.//Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 154(1), 2012, 8488.

10. Elena Kozlova, Alexander Chemysh, Victor Moroz, Victoria Sergunova, Olga Gudkova, Mayya Fedorova, Artem Kuzovlev. Opposite effects of electroporation of red blood cell membranes under the influence of zinc ions.// Acta of Bioengineering and Biomechanics, 14(1), 2012, 3-13.

11. A.M. Черныш, A.M. Голубев, E.K. Козлова, В.А. Сергунова. Структура поверхности мембран эритроцитов при длительном хранении донорской крови. //Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины, Харьков 1819 октября 2012,

12. В.А. Сергунова,Б.Ф. Назаров, Е.А. Мягкова Динамика изменения наноструктуры мембран эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций в клинике.// Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины, Харьков 18-19 октября 2012,

ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯ В РАБОТЕ

1. Наноповерхность — неоднородная по высоте поверхность мембраны. Высоты неоднородностей hj лежат в диапазоне от 0,5 до 100 нм. Пример профиля выбранного сечения наноповерхности мембраны эритроцита представлен на рисунке.

2. Собственные параметры (характеристики) наноповерхности -величины высот Ь; (нм) и пространственных периодов Ь; (нм), которые зависят только от свойств мембраны и полностью описывают топологические свойства её поверхности.

3. Фурье-анализ (спектральное преобразование Фурье) - математический аппарат, с помощью которого сложную поверхность можно разложить на спектральные составляющие.

4. Жёсткость мембраны - характеристика механических свойств мембраны. Это сила, которую надо приложить, что бы вызвать единичную деформацию мембраны (Н/м).

5. Топологические дефекты мембран - несквозные углубления (поры) или выпуклости в структуре мембран диаметром от 10 до 1000 нм и глубиной (высотой) от 0,5 до 200 нм. АФК- активные формы кислорода GSH- глутатион

GSSG- восстановленный глутатион НАД- никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ+ восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида

ВОЗ- всемирная организация здравоохранения

АТФ- аденозинтрифосфат

АСМ- атомный силовой микроскоп

ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота

БФГ-2,3 бифосфоглицерат

ТСТ - тяжелая сочетанная травма

ID- индекс деформируемости

ПОЛ- перекисное окисление липидов

Подписано в печать:

01.02.2013

Заказ № 8124 Тираж - 80 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Актуальность темы.

Одной из важных проблем современной реаниматологии является исследование механизмов развития критических и терминальных состояний на органном, клеточном и молекулярном уровнях (87, 39]. Особое значение имеет изучение критических состояний связанных с кровопотерей. Кровопотеря во время хирургических вмешательств, а также при тяжелых сочетаиных травмах является причиной нарушений мембран красных клеток крови [106, 157]. При травмах и при критических состояниях, часто возникает необходимость переливания донорской крови [92]. Поэтому проблемы изучения характеристик эритроцитов при кровопотере и при длительном хранении донорской крови является одной из ключевых проблем реаниматологии [38]. Важным направлением развития современной медицины в целом и реаниматологии в частности, является применение новейших физических и биофизических методов исследования наноструктур мембран эритроцитов [45]. Перспективным методом изучения биологических клеток является сканирующая зопдовая микроскопия [73, 102, 80]. Изучению вопросов, связанных с изменением эритроцитов при терминальных состояниях, посвящен ряд исследований, проведенных па клеточном уровне [20, 66], однако, вопрос об изменениях наноструктуры мембран эритроцитов при различных патологических состояниях и в результате экспериментальных воздействий остается открытым. Состояние мембран эритроцитов играет важную роль в сохранении их целостности [71], и в осуществлении их газотранспортной функции [79]. В изучаемой проблеме важно найти пути коррекции возникающих нарушений наноструктуры мембран. Поэтому актуальным является исследование результатов применения отечественного препарата «перфторан» [16, 18, 39, 57] для этих целей.

Цель исследования:

Определить закономерности изменеиий папоповерхности мембран эритроцитов при кровопотере и длительном хранении донорской крови, и предложить возможные механизмы этих изменений Задачи исследования:

1. Определить собственные параметры папоповерхности мембран эритроцитов и установить их связь с молекулярными структурами мембран.

2. Изучить изменения собственных параметров папоповерхности и локальной жесткости мембран эритроцитов при воздействии мембранных модификаторов (in vitro).

3. Изучить динамику изменения наноструктуры и локальной жесткости мембран эритроцитов при длительном хранении донорской крови.

4. Оценить изменения наноструктуры мембраны при кровопотере в эксперименте и в клинике.

5. Изучить влияние перфторана на наноструктуру и жесткость мембраны эритроцитов при кровопотере и действии мембранных модификаторов.

Научная новизна:

1. Впервые с помощью атомной силовой микроскопии выделены собственные параметры наноповерхпости мембран красных клеток крови, которые являются количественными критериями для изучения патофизиологических механизмов нарушений клеточной мембраны.

2. Впервые с помощью атомной силовой микроскопии изучена динамика изменения наноповерхпости мембраны эритроцитов и ее влияние на макроструктурные изменениями клеток при длительном хранении донорской крови.

3. Впервые показаны изменения наноповерхпости мембран эритроцитов при гипотензии в лабораторных экспериментах in vitro.

4. Впервые показаны особенности нарушений наноповерхпости мембран эритроцитов в зависимости от объема кровопотери при хирургических операциях. Показана динамика изменений собственных параметров наноповерхности в послеоперационном периоде.

5. Впервые показано корректирующее действие перфторана на наноструктуру красных клеток крови при экспериментальной гипотепзии и действии мембранных модификаторов.

6. Впервые показаны изменения локальной жесткости мембран при длительном хранении донорской крови, действии мембранных модификаторов и перфторана.

Практическая значимость:

Показана возможность использования собственных параметров наноповерхности мембран для оценки состояния эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций и тяжелых сочетапных травм. Определена динамика изменений наноструктуры и жесткости мембран эритроцитов на различных этапах хранения донорской крови; показаны пусковые механизмы и оценены деструктивные изменения формы клеток крови при длительном ее хранении. Определен срок храпения донорской крови - 12 - 15 дней, после которого наступают необратимые, деструктивные нарушения мембран. Показана эффективность применения перфторана для коррекции наноструктуры мембран и жесткости эритроцитов, при действии ряда экзогенных факторов, что может быть использовано при разработке методов терапии критических состояний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наноповерхность мембран красных клеток крови, регистрируемая с помощью атомной силовой микроскопии, может быть описана набором собственных параметров. Собственные параметры папоповерхности соответствуют физиологическим уровням структурной организации мембран эритроцитов.

2. Длительное хранение донорской крови вызывает специфические изменения наноповерхности и локальной жесткости мембран эритроцитов, характерные для разных стадий её хранения.

3. Параметры наноструктуры мембран при хирургических операциях и динамика их изменений в послеоперационном периоде зависят от объёма кровопотери.

4. Перфторан, вводимый в кровь после экспериментальной гипотензии и воздействия мембранных модификаторов, корректирует наноструктуру и жесткость мембран красных клеток крови.

137 ВЫВОДЫ

1. С помощью спектрального пространственного преобразования Фурье наноповерхности мембран эритроцитов были получены собственные параметры клеточной мембраны L, и h;, которые являются количественными критериями для изучения патофизиологических механизмов нарушений клеточной мембраны. Изменение величины hi - (I порядок) несет информацию об интенсивности flickering мембраны, изменение параметра h2 (II порядок) — об изменении структуры спектринового матрикса; изменение параметра h3 - (III порядок) несет информацию о процессах агрегации белковых кластеров.

2. С помощью атомной силовой микроскопии в опытах in vitro показано, что мембранные модификаторы (гемин, NaN02, соединения Ca, ионы Zn) приводили к возникновению специфических топологических дефектов наноповерхности, увеличивали ее жесткость и меняли форму клеток. Лекарственные модификаторы верапамил и фуросемид (в больших концентрациях) могут изменять наноструктуру и форму клетки, не меняя ее средней жесткости. Показанные изменения собственных параметров наноповерхности мембран могут явиться основой для изучения патофизиологических механизмов экзогенных воздействий, различной природы на наноструктуру мембран.

3. Количественно оценена степень деструкции наноповерхности мембран в динамике при длительном хранении донорской крови. По мере хранения клеток увеличивалась жесткость мембран в 1,8-2,1 раза. При хранении цельной крови в указанных условиях после 12 - 15 суток развивались необратимые деструктивные нарушения наноповерхности мембран.

4. В лабораторном эксперименте на животных (крысах) к 5 минуте гипотензии наблюдались существенные изменения наноструктуры: hi увеличивался в 2 раза (flickering мембраны), h2 увеличивался в 1,5 раза (нарушалась структура спектринового матрикса). h3 возрастал 3-6 раз, изменения структур протеиновых кластеров). К 60 минуте эти нарушения увеличивались.

Введение перфторапа через 1 час после реипфузии приводило к коррекции наноструктуры мембран красных клеток крови. Собственные параметры h, были близки к контрольным значениям. Формы клеток были частично обратимы.

5. При кровопотере в результате хирургических операций возникали нарушения наноноструктуры мембран красных клеток крови, вызывающие изменения hj параметров. Величины изменений этих параметров зависели от объемов кровопотери, и имели характерную динамику в послеоперационном периоде. При объемах кровопотери до 600±200 мл (9,8±2,3мл/кг) изменения параметров были максимальны в первые сутки после операции. К 5 суткам эти параметры возвращались к значениям близким к контрольным. При кровопотерях 1500±200 мл (15,48±1,2 мл/кг) наибольшие нарушения всех параметров наноструктуры наблюдались на 3 сутки. К пятым суткам параметр hj оставался в 4 раза выше контрольного.

6. Основным механизмом, вызывающим топологические изменения наноповерхности мембран эритроцитов при действии мембранных модификаторов, при хранении донорской крови, при кровопотере является деструкция протеиновых связей спектрина с плазматической мембраной и нарушения фрагментов цитоскелета. Изучение наноповерхности мембран позволяет решать обратную задачу: получать информацию о состоянии их наноструктуры.

7. Введение перфторана после воздействия мембранных модификаторов (гемин, NaN02, Са С12 , верапамил, фуросемид) in vitro, после гипотензии в модельных опытах восстанавливало исходные параметры наноповерхности и форму клеток. Введение перфторана после действия модификаторов восстанавливало жёсткость мембран в 60-90% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты по изучению действии гемина, ЫаМЭ2, ионов цинка, фармакологических модификаторов мембран могут быть использованы при оценке токсикологического эффекта воздействия различных препаратов на мембраны эритроцитов человека при общих и профессиональных заболеваниях.

2. Закономерности изменения собственных параметров наноструктуры мембран при хранении донорской крови могут быть использованы для оценки функционального состояния эритроцитов и микрореологических свойств крови и выработки рекомендаций по пригодности её для проведения трансфузии.

3. Показанные в работе тенденции и динамика изменений собственных параметров наноповерхности эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций может быть использована для оценки процессов восстановления красных клеток крови в после операционном периоде.

4. Материалы данной работы излагаются в курсе медицинской и биологической физики в Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М.Сеченова.