Автореферат и диссертация по медицине (14.01.20) на тему:Повреждение клеток крови при травме и кровопотере.

На правах рукописи Мягкова Екатерина Алексапдровпа '— ^

ПОВРЕЖДЕНИЕ КЛЕТОК КРОВИ ПРИ ТРАВМЕ И КРОВОПОТЕРЕ

14.01.20- анестезиология и реаниматология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

31 ИЮЛ 2014

Москва-2014

005551450

005551450

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского» Российской академии медицинских наук.

Научные руководители

Мороз В.В. доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заслуженный деятель науки РФ.

Решетник В.И. доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Решетник Виталий Кузьмич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией общей патологии нервной системы Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии».

Замятин Михаил Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой анестезиологии и реаниматологии Института усовершенствования врачей, Российского национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Защита состоится «_» _ 2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 001.051.01, созданного при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского» Российской академии медицинских наук по адресу: 107031 г. Москва ул. Петровка, д.25, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИОР» РАМН по адресу: 107031 г. Москва ул. Петровка, д.25, стр.2 и на сайте хуичу.шюггатп.ги. Автореферат разослан «_»__2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Решетняк В. И.

Актуальность исследования Согласно данным ВОЗ, черепно-мозговая (ЧМТ) и тяжелая скелетная травмы (ТСТ) причиняют вред здоровью и приводят к смерти более пяти миллионов людей в год во всем мире [Ермаков С.П., 1995]. Массивная кровопотеря, связанная с травмой, приводит к гипоксии - кислородному голоданию тканей [Рябов Г.А. 1988, Решетняк В.И. 2010; Loiacono L. А. 2010]. Повреждающий эффект гипоксии проявляется в первую очередь на уровне мембран клеток, приводя в дальнейшем к расстройству функций всех органов и систем организма, вызывая каскад патологических процессов [Мороз В.В. 2003].

Гипоксия и вызываемые ею нарушения клеточного метаболизма сопровождаются повреждением мембранных структур клеток и нарастанием процессов апоптоза и некроза. При травме или длительном воздействии патологических факторов может наступать необратимое повреждение клеток. При массивной кровопотере происходят изменения в структуре и составе красных клеток крови. Изменение структуры мембраны эритроцита влияет на выполнение им основной функции - доставка кислорода [Мороз В. В. 2012, Голубев A.M. 2012, Brückner U.B. 1990], что может приводить к усилению гипоксии. Для исследования форм и размеров красных клеток крови в настоящее время широко используются оптическая и атомно-силовая микроскопии (АСМ), [Черныш A.M. 2008; Hekele О. 2008, Kozlova Е. К. 2012, Wegerhoff R. 2008]. Изучение наноповерхности мембран эритроцитов с помощью агомно-силовой микроскопии позволяет получать информацию о состоянии их наноструктуры. [Kozlova E.K. 2013, TakeuchiM. 1998]

На сегодняшний день нет четких представлений влияния гипоксии на повреждения ДНК, процессы апоптоза, некроза белых клеток крови, изменение наноструктуры мембран эритроцитов при развитии критического состояния, в частности, у пострадавших с тяжелой травмой [Мороз В. В. 2008]. Знание закономерностей развития повреждений ДНК белых клеток крови и изменения наноструктуры эритроцитов при тяжелой травме с массивной кровопотерей позволит расширить представления о влиянии гипоксии на развитие патологического процесса при критических состояниях.

Цель исследования:

Выявление механизмов развития повреждений клеток крови, обусловленных тяжелой травмой и кровопотерей, путем исследования повреждений ДНК белых клеток крови и наноструктуры мембран эритроцитов.

Задачи исследования: 1. Выявить виды повреждений ДНК и механизмы разрушения белых клеток крови у пострадавших с травмой и кровопотерей.

2. Изучить повреждения ДНК, показатели некроза и апоптоза, а также изменение содержания каспаз в плазме крови пострадавших с травмой и кровопотерей в первые две недели.

3. Выявить предикторную значимость показателей повреждения ДНК, апоптоза и некроза в развитии осложнений у пострадавших с травмой и кровопотерей.

4. Исследовать содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина (суммарного показателя окислительного дистресса) и уровень супероксиддисмутазы в плазме крови пострадавших с травмой и кровопотерей.

5. Выявить динамику изменений наноструктуры мембран эритроцитов у больных с тяжелой травмой и массивной кровопотерей в первые две недели после травмы.

Научная новизна

Впервые выявлена взаимосвязь различных видов повреждений ДНК от степени выраженности гипоксии. Количество некротических ДНК-комет, значения интегрального показателя, а также суммарный показатель (одно-, двунитевые разрывы ДНК + апоптотические ДНК кометы + некротические ДНК кометы) на третьи сутки после травмы у пострадавших с выраженной гипоксией могут быть использованы в качестве прогностических признаков развития инфекционных осложнений.

Установлены различия в уровнях повреждений ДНК, апоптоза и некроза в клетках крови пострадавших с травмой и кровопотерей, обусловленные видом, объемом и тяжестью травмы.

Показана возможность использования 8-гидрокси-2-дезоксигунозина и супероксиддисмутазы для обоснования назначения ангиоксидантной терапии.

Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии у пострадавших с травмой показано возрастание показателя высоты первого порядка (Ь[), характеризующего изменение состояния фосфолипидного бислоя мембран эритроцитов, что является компенсаторной реакцией эритроцита в ответ на гипоксию и сниженное содержание кислорода в плазме.

Впервые с помощью аггомно-силовой микроскопии у пострадавших с различными видами тяжёлой травмы выявлено около 8% дискоцитов с аномальным углублением пэллора и выростом в центре (мишеневидные клетки). Отмечена взаимосвязь их появления с рН, ВЕ, уровнем напряжения кислорода и содержанием лактата в крови пострадавших.

Выявлены и показаны механизмы развития посггравматических изменений клеток крови.

Практическая значимость Количество некротических ДНК-комет белых клеток крови на 3-й сутки после травмы может использоваться в качестве прогностического признака возможного развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и гипоксией: ниже 9.8% может служить прогностически неблагоприятным фактором риска развития инфекционных осложнений; выше 9.8% - могут служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений, не смотря на наличие гипоксии у пострадавших сразу после травмы

Значения интегрального (одно-, двунитевые разрывы ДНК) показателя белых клеток крови на 3-й сутки после травмы может использоваться в качестве прогностического признака возможного развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и гипоксией: ниже 18.6% может служить прогностически неблагоприятным фактором риска развития инфекционных осложнений; выше 18.6% - могут служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений, не смотря на наличие гипоксии у пострадавших сразу после травмы.

Значения суммарного показателя повреждений ДНК лейкоцитов (одно-, двухнитевые разрывы ДНК+апоптотические повреждения ДНК+некротических повреждений ДНК), выявляемых на третьи сутки после травмы может использоваться в качестве прогностического признака возможного развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и гипоксией. Чувствительность показателя составляет 100%, специфичность 75%. Значения суммарного показателя повреждений ДНК лейкоцитов ниже 47,3 % (точка «сШ-ой») свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и кровопотерей.

Количество 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина может служить биомаркером «окислительного дистресса», у пострадавших с травмой и кровопотерей и использоваться для обоснования целесообразности назначения антиоксидантной терапии этим больным

Динамика изменений параметров наноповерхности эритроцитов у пострадавших с травмой и кровопотерей может быть использована для оценки процессов восстановления красных клеток крови в постгравматическом периоде.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При тяжелой травме наблюдаются изменения динамики повреждений ДНК, процессов апогггоза и некроза белых клеток крови и их зависимость от объема потери крови и

гипоксии, что может использоваться для прогноза и диагностики развития инфекционных осложнений.

2. Снижение концентрации 8-гидрокси-2-дезоксигунозина в плазме крови пострадавших с травмой, сопровождающееся и, возможно обусловленное, увеличением количества супероксидцисмутазы может использоваться для обоснования целесообразности назначения антиоксидантной терапии этим больным.

3. Установлена динамика изменения уровня каспаз 3 и 9, а также содержания sAPO-1/Fas у пострадавших с травмой и массивной кровопотерей и их взаимосвязь с развитием апоптотических механизмов альтерации белых клеток крови.

4. Атомно-силовая микроскопия может использоваться наряду с оптической микроскопией для оценки формы и размеров эритроцитов, а также для изучения наноструктуры мембран красных клеток крови у пострадавших с тяжелой травмой.

5. При тяжелой травме выявлено влияние объема потери крови и гипоксии на форму, размер и наноструктуру мембраны эритроцитов у пострадавших с тяжелой травмой и массивной кровопотерей в первые две недели после травмы, что, вероятнее всего, связано с компенсаторно-приспособительными механизмами в ответ на снижение уровня кислорода в плазме крови пострадавших. Выявленные изменения направлены на обеспечение жизнедеятельности самих эритроцитов и выполнения ими газотранспортной функции.

Апробация работы

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей реаниматологии имени В.А. Неговского» Российской академии медицинских наук.

Результаты работы были представлены на Российско-испанском инновационном

Бизнес-форуме, 12-14 мая, 2011, Испания, Мадрид; на IX, X, XII научно-практических

конференциях «Безопасность больного в анестезиологии и реаниматологии», 2011, 2012,

2014, Москва, Россия; на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и

лекарство», 23-27 апреля, 2012, Москва, Россия; на Научно-практической конференции

«Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины», Харьков, Украина, 18-19

октября 2012; на 10-м международном симпозиуме «Критические состояния: патогенез,

диагностика, лечение» в рамках 19 конгресса Словацкого общества анестезиологии и

интенсивной медицины, 12-19 мая, 2012, Москва-Вена-Пиепггяны, Россия-Австрия-

Словакия; на симпозиуме "Жизнеобеспечение при критических состояниях" в рамках XII

6

Международного медицинского конгресса EURO MEDICA, июнь, 2013, 2014, Ганновер, Германия; на Европейском конгрессе «Клиническая наномедицина и целевая медицина», Clinam, ETPN Summit, 24-26 июня 2013, Базель, Швейцария; на 1-ой конференции российского общества по изучению шока, 3 октября, 2013, Москва, Россия; на IV Съезде анестезиологов и реаниматологов Узбекистана «Современные технологии в анестезии и интенсивной терапии критических состояний», 24-25 октября, 2013, Ташкент, Узбекистан; на Научно-практической конференции молодых ученых 13 декабря 2013 «Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии», Москва, Россия.

Структура работы

Диссертация представляет собой том машинописного текста объемом 98 страниц машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных методов и материала исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает 182 источника, из которых 95 отечественных и 87 иностранных.

Материалы и методы исследования

Для исследования процессов апоптоза, некроза, повреждений ДНК было обследовано 95 пострадавших (59 выживших, 36 умерших) (67 мужчин, 28 женщин) в возрасте 40,6±16,5 лет (от 20 до 79 лет), 72,8±6,6 кг (от 60 до 95 кг), перенесших тяжелую механическую травму с различными объемами потери крови (от 100 до 4000 мл) и нарушениями гемодинамики. С учетом веса больных среднее значение потери крови составило 21,5±16,5 мл/кг (от 1,4 до 61,5 мл/кг). Пострадавшие поступали в реаниматологическое отделение через 9,1±5,1 (2-13) часа после травмы.

В зависимости от вида травмы, пострадавшие были разделены на три группы: ТСТ (тяжелая скелетная травма) — 17 пострадавших; ТСТ+ЧМТ (сочетание тяжелой скелетной и черепно-мозговой травм) - 35 пострадавших; ЧМТ (изолированная черепно-мозговая травма) - 43 пострадавших. В зависимости от объема потери крови пострадавшие были разделены на четыре группы [Gutierrez R., 2004]: КП I СТ (кровопотеря I степени тяжести) - 26 пострадавших, объем потери крови (ОПК) составил меньше 750 мл (5,93±2,41 мл/кг); КП II СТ (кровопотеря II степени тяжести) - 23 пострадавших, ОПК составил 750-1500 мл (11,5±1,5 мл/кг); КП III СТ (кровопотеря III степени тяжести) -23 пострадавших, ОПК составил 1500-2000 мл (23,8±4,0 мл/кг); КП IV СТ (кровопотеря IV степени тяжести) - 23 пострадавших, ОПК составил более 2000 мл

(45,6±10,1 мл/кг). В зависимости от развития инфекционных осложнений пострадавшие были разделены на две группы: инфекция «+» - 69 пострадавших, у которых на 5-е - 7-е сутки после травмы развились инфекционные осложнения; инфекция «-» - 26 пострадавших.

Для оценки влияния гипоксии на повреждения ДНК, процессы апоптоза и некроза белых клеток крови общая группа пострадавших с травмой была разделена на 2 подгруппы с учетом значений 4-х показателей, изменения которых отражают наличие или отсутствие гипоксии: рОг в капиллярной крови, уровень лактата, рН и BE плазмы крови. Гипоксия «+» - 18 из 95 пострадавших у которых при поступлении в реаниматологическое отделение были изменены все 4 показателя (р02 в капиллярной крови, уровень лактата, рН и BE плазмы крови). Гипоксия «-» - 10 из 95 пострадавших у которых при поступлении в реаниматологическое отделение все 4 показателя (р02 в капиллярной крови, уровень лактата, рН и BE плазмы крови) были в пределах нормы.

Для анализа эритроцитов с помощью атомно-силовой и оптической микроскопии было включено в исследование 18 из 95 обследованных больных (9 мужчин, 9 женщин) в возрасте 48.6±16.1 лет, перенесших тяжелую травму с различными объемами потери крови (от 300 до 3000 мл) и нарушениями гемодинамики. С учетом веса больных среднее значение потери крови составило 23.5±15.9 мл/кг (от 3.3 до 46.1 мл/кг). Время от получения травмы до госпитализации в стационар составило 7.1±2.2 (4-10) часа.

Все больные в зависимости от степени кровопотери [Gutierrez R., 2004] были разделены

на две группы: 1-я группа - 7 пострадавших (4 - выживших, 3 - умерших; 5

пострадавших с черепно-мозговой травмой (ЧМТ), 1 пострадавший с тяжёлой скелетной

травмой (ТСТ), 1 пострадавший с ТСТ+ЧМТ). Объем потери крови < 750 мл (5.7±1.9

мл/кг) - кровопотеря (КП) I степени тяжести (СТ) [Gutierrez R., 2004], APACHEII 22,5±3,3

б.; длительность респираторной поддержки составила 11,8±6,7 суток; 2-я группа - 11

пострадавших (5 - выживших, 6 - умерших; 5 пострадавших с ТСТ, 5 пострадавших с

ТСТ+ЧМТ, 1 пострадавший с ЧМТ). Объем потери крови > 2000 мл (37.5±5.1 мл/кг) - КП

IV СТ [Gutierrez R., 2004], APACHEII 23,0±3,0 б.; длительность респираторной поддержки

составила 11,6±5,8 суток. Всем больным с тяжелой травмой и кровопотерей, поступившим

в реаниматологическое отделение, после оценки тяжести пострадавших и состояния

витальных функций проводили комплексную терапию согласно основным принципам

лечения острой кровопотери и травматического шока, предложенным профессором В В.

Морозом, 2003. В группу контроля вошли 8 доноров в возрасте 28,5±3,4 (от 25 до 35) лет.

Со слов добровольцев, до взятия анализа, они не принимали никаких препаратов,

8

алкогольных напитков и отрицали факт наличия каких-либо заболеваний. Лабораторно-инструментальные исследования осуществляли при поступлении пострадавших в реаниматологическое отделение, на 3-й, 5-е, 7-е и 15-е сутки. Забор 20 мл венозной крови в группе пострадавших проводили из катетеризированной центральной вены на этапах исследования; в группе контроля - однократно из локтевой вены.

Исследование поврежаений ДНК Концентрацию внеклеточной ДНК в плазме крови определяли флуориметрически, с использованием набора Quant-iT™ HS DNA Assay Kit (Invitrogen, США).

Повреждения ДНК, уровень апоптотических и некротических клеток крови пострадавших с тяжелой травмой оценивали методом гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») [Dhawan А. 2006].

Содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в плазме крови определяли с помощью иммуноферментиого метода с использованием набора 8-hydroxy-2-deoxyGuanosineEIAKit (CaymanChemical, USA).

Изучение наноструктуры мембран эритроцитов Для изучения состава красных клеток крови десять микролитров цельной крови наносили на предметное стекло и готовили монослои эритроцитов с помощью прибора «V-sampler» (Vision, Австрия).

Анализ клеток крови проводили методом оптической микроскопии (Olympus СХ 41, Япония) и атомно-силовой микроскопии («NTEGRAprima» (NT-MDT), Россия).

Для получения информативных характеристик изучаемых процессов из исходной поверхности мембраны были выделены поверхности трёх порядков. Для этого использовали пространственное Фурье-преобразование исходного профиля поверхности эритроцита [Kozlova E.K. 2013].

Концентрация супероксиддисмутазы, sAPO-1/Fas, каспазы-9 и каспазы-3 определялась с помощью иммуноферментиого метода с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (Австрия).

Всем пострадавших проводили гематологическое (гематологический анализатор - АВХ Micros 60, Heriba АВХ Diagnostics, Франция) исследование крови: эритроциты, гемоглобин, гематокрит, лейкоциты. Концентрацию глюкозы и лактата в плазме крови определяли электрохимическим методом на анализаторе Biosen-S-Line (EKF Diagnostics, Германия) с использованием чип-сенсоров (EKF Diagnostics, Германия). Определение биохимических показателей плазмы крови (общий белок, мочевина, креатинин,

аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ)), производили на биохимическом анализаторе SAPPHIRE-400 (Tokyo Boeki, Япония).

Статистический анализ Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 10.0 с использованием современных принципов математического анализа медико-биологических исследований и согласно современным требованиям к обработке медицинских данных [Гланц С. 1999, Bohm G. 2010, Hastie Т, 2001]. Статистически значимыми считали показатели при вероятности ошибки р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПОВРЕЖДЕНИЕ КЛЕТОК БЕЛОЙ КРОВИ У ПОТРАДАВШИХ С ТЯЖЕЛОЙ ТРАВМОЙ II КРОВОПОТЕРЕЙ

Свободная внеклеточная ДНК в плате Повышенное содержание свободной ДНК в плазме крови пострадавших с тяжелой травмой относительно контроля держится на всем протяжении первых двух недель наблюдения, что обусловлено поступлением ДНК из клеток, поврежденных в результате травмы тканей. [Хубутия М.Ш., 2013]

Некротические ДНК-кометы

некротические ДНК-кометы -гипоксия есть, инфекция есть

некротические ДНК-кометы -гипоксия есть, инфекции нет

Рисунок 1. Уровень некротических ДНК-комет в общей группе пострадавших (а), в группе пострадавших гипоксия «+» и гипоксия «-» (б), в группах гипоксия есть инфекция «есть» и инфекции «нет» (в). ROC -анализ по количеству некротических ДНК-комет в группе пострадавших гипоксия «есть» в зависимости от развития вторичных гнойных осложнений (г).

У здоровых доноров в крови не выявляются некротические ДНК-кометы. В первые 5 дней после травмы отмечается почти двукратное увеличение количества некротических ДНК-комет относительно первых суток (рис. 1а).

В дальнейшем отмечается постепенное снижение количества некротических ДНК-комет. Появление некротических ДНК-комет сопряжено, скорей всего, с повышенной альтерацией лейкоцитов по некротическому механизму, в результате активного их участия в процессах фагоцитоза в зоне травмированных тканей.

Количество некротических ДНК-комет в первые сутки [ТСТ - 5,49±5,0%; ЧМТ -6,4±6,2%; ТСТ+ЧМТ - 6,35±5,94%] и первые две недели после травмы не зависело от вида травмы.

Для оценки влияния гипоксии на динамику течения некротической гибели клеток был выполнен анализ уровня некротических ДНК-комет в группах пострадавших

гипоксия «+» и гипоксия «-» (рис. 16).

Количество некротических ДНК-комет в первые сутки после травмы не зависело от наличия или отсутствия признаков гипоксии [гипоксия «+» - 3,40 (2,30; 5,80)%; гипоксии «-» - 4,55 (2,33; 5,83)%]. Отмечено, что на 3-й и 5-е сутки после травмы более интенсивно происходит альтерация белых клеток крови по некротическому механизму у пострадавших из группы гипоксия «+» [8,70 (5,10; 13,70)% (п=17) на 3-й и 8,80 (6,18; 13,45)% (п=16) на 5-е сутки], по сравнению с группой без гипоксии [7,40 (6,80; 10,25)% (п=6) на 3-й и 7,20 (4,50; 7,30)% (п=5) на 5-е сутки]. На 7-е сутки после травмы отмечено уменьшение количества некротических ДНК-комет [5,70 (2,55; 11,25)%] в группе пострадавших гипоксия «+», и незначительное увеличение [7,70 (4,60; 8,00)%] - в группе гипоксии «-».

В связи с тем, что в группе пострадавших с гипоксией на 3-й и 5-е сутки уровень некротических ДНК-комет несколько выше, была произведена оценка взаимосвязи уровня некротических ДНК-комет с развитием инфекционных осложнений (рис. 1в).

В группе гипоксия «+» у пострадавших без инфекционных осложнений количество некротических ДНК-комет на 3-7 сутки после травмы было в 1,5-2 раза больше, чем в той же группе с инфекционными осложнениями.

ROC-анализ по количеству некротических ДНК-комет на 3-й день после травмы в

группе пострадавших гипоксия «+» выявил: значение площади под ROC кривой,

построенной по количеству некротическим ДНК-комет на 3-й день после травмы,

составило 0.760 (чувствительность - 69,2%, специфичность - 75,0%). Точка отсечения

(cut-off point) составила 9,8% некротических ДНК-комет. Количество некротическим

11

ДНК-комет ниже 9,8% свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с гипоксией. Уровень некротических ДНК-комет выше данной точки может служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений (рис. 1г).

Апоптотические ДНК-кометы В первые сутки после травмы у пострадавших с травмой отмечается достоверное почти трёхкратное увеличение в плазме крови количества апоптотических ДНК-комет [3,40 (0,88; 7,78) %] по сравнению с контрольной группой [1,0 (0,5; 1,1)%, р<0,05]. В первые сутки после травмы у пострадавших с травмой отмечается достоверное почти трёхкратное увеличение в плазме крови количества апоптотических ДНК-комет по сравнению с контрольной группой (рис. 2а). В динамике отмечается постепенное увеличение количества апоптотических ДНК-комет более чем в 2 раза к 15 дню наблюдения. В первые 5 дней после травмы происходит увеличение повреждений ДНК лейкоцитов как по некротическому, так и по апоптотическому пути. С 5 по 15 день наблюдения происходит увеличение повреждений ДНК белых клеток крови по апоптотическому механизму и снижение по некротическому. Количество апоптотических ДНК-комет в первые две недели после травмы не отличалось в группах с различными видами травмы.

Для оценки взаимосвязи гипоксии и альтерации лейкоцитов по апоптотическому механизму был произведен анализ динамики уровня апоптотических ДНК-комет в группе пострадавших гипоксия «+» и гипоксия «-». (рис. 26)

Динамика уровня апоптотических ДНК-комет в группе гипоксия «+» и гипоксии «-» имеет разнонаправленный характер: получены достоверные различия по апоптотическим ДНК-кометам между группами пострадавших с и без гипоксии на 1-е [2,30 (0,80; 3,80)% -гипоксия «+», 10,8 (2,75; 12,03)%, р<0,05 - гипоксии «-»] и 7-е [8,20 (5,67; 13,45)% -гипоксия «+», 4,10 (3,40; 5,10)%, р<0,05 - гипоксии «-»] сутки после травмы; у пострадавших с гипоксией в первую неделю после травмы отмечается постепенное увеличение количества апоптотических ДНК-комет, в то время как в группе пострадавших гипоксия «-» происходит снижение значений апоптотических ДНК-комет с 3-го дня после травмы. В связи с тем, что в группе пострадавших без гипоксии на 1-е, 3-й и 5-е сутки уровень апоптотических ДНК-комет несколько выше, была произведена оценка взаимосвязи уровня апоптотических ДНК-комет с развитием инфекционных осложнений (рис. 2в).

В группе гипоксия «+» у пострадавших без инфекционных осложнений количество апоптотических ДНК-комет на 3-5 сутки после травмы было в 2-3,5 раза больше, чем в той же группе с инфекционными осложнениями.

Согласно проведённому ЯОС-анализу по количеству апоптотических ДНК-комет на 3-й и 5-й день после травмы в группе пострадавших гипоксия «+» не выявлено высокой прогностической значимости количества апоптотических ДНК-комет в развитии инфекционных осложнений в этой группе (рис. 2г).

-•-алшготчесш ДНК-кометы - некротические ЛНК-кометы

Гуптя кятрта 1.0(0.?. М >4

3 5 7 Эгапы лсслеаоваш. емки

гипоксия есть гипоксии нет

апоптотические ДНК-кометы

Гр>ша гстпраи 1.0(0.5:1.1)

апоптотические ДНК-кометы -гипоксия есть, инфекция есть

апоптотические ДНК-кометы -гипоксия есть, инфекции нет

">тапы исследован! и, сугсп

100 80 60 40 20 0

ЗепзПР/Ау: 30.8 ЭреоПСЙу 54,8 Сп1епол : 52 8429

20 40 60 80 1ОО-Бре^Псйу

100 Г

Рисунок 2. Уровень апоптотических и некротических ДНК-комет в общей группе пострадавших (а), уровень апоптотических ДНК-комет в группе пострадавших гипоксия «+» и гипоксия «-» (б), уровень апоптотических ДНК-комет в группе пострадавших гипоксия есть в зависимости от развития инфекционных осложнений (в), ЯОС -анализ по количеству апоптотических ДНК-комет в группе пострадавших гипоксия «есть» в зависимости от развития вторичных гнойных осложнений (г).

Сразу после травмы запускается интенсификация процесса апоптоза, за счет активации эффекторной каспазы 3 через СО-95 (зАРСЫ/Таз). На 5-е и 7-е сутки после травмы в активацию процесса апоптоза белых клеток крови вовлекается каспаза-9.

Одно-, двунитевые разрывы в молекуле ДНК

Альтерация клеток осуществляется по апоптотическому и некротическому пути, что связано с одно-, двунитевыми разрывами. В группе пострадавших с травмой и кровопотерей на всех этапах исследования имеет место достоверное повышение в 2-3 раза значений показателя одно-, двунитевых разрывов ДНК (интегральный показатель) относительно группы контроля (рис. За).

Повышенное значение интегрального показателя у пострадавших с травмой и кровопотерей в первые две недели наблюдения свидетельствует об увеличении гидролиза ДНК белых клеток крови по механизму одно-, двунитевых разрывов в процессе их гибели по апоптотическому и некротическому механизмам. В группе пострадавших с различными видами травмы различий по интегральному показателю между группами не выявлено.

У пострадавших в группе гипоксия «+» количество одно-, двунитевых разрывов ДНК в 1-й, 3-й и 15-й день после травмы составило соответственно 12,90 (11,53; 16,40) %, 13,52 (11,44; 24,76) % и 14,34 (9,80; 16,20) %, что было меньше, чем в группе гипоксии «-» [18,35 (12,78; 19,77) %, р<0,05 - 1-й день; 20,42 (19,11; 22,36) % - 3-й день; 22,14 (19,07; 25,20) % - 15-й день] (рис. 36).

В группе гипоксия «+» у пострадавших без инфекционных осложнений количество одно-, двунитевых разрывов ДНК на 3 сутки после травмы было в 2 раза больше, чем в той же группе с инфекционными осложнениями (рис. Зв).

ROC-анализ по показателю количества одно-, двунитевых разрывов ДНК на 3-й день после травмы в группе пострадавших гипоксия «+» выявил (рис. Зг):

1. Значение площади под ROC кривой, построенной по интегральному показателю разрывов ДНК на 3-й день после травмы, составило 0.788 (чувствительность - 83,3%, специфичность - 75,0%). Точка отсечения (cut-off point) составила 18,6% одно-, двунитевых разрывов ДНК.

2. Количество одно-, двунитевых разрывов ДНК ниже 18,6% свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с гипоксией.

3. Уровень одно-, двунитевых разрывов ДНК выше данной точки может служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений

На 3-й день после травмы у пострадавших с травмой, кровопотерей, выраженной

гипоксией без инфекционных осложнений, значения показателей некротических ДНК-

комет, апоптотических ДНК-комет и одно-, двунитевых разрывов ДНК были более

14

высокие, чем те же значения показателей в группе пострадавших с травмой, кровопотереи, выраженной гипоксией, но с инфекционными осложнениями (рис. 4 а).

*1

Группа сраЕжни 6.S? (7,7?; 4.J) ••

Ьолео-. двушпевые рз^ызы ДНК обпк! группа

гипоксия есть гипоксии нет

Зтапы ПССЛООКЕМ. СМИ

в

-О-группа П1ПОКСПЯ естъ+ннфе кипя есть -О-группа ПГПОКС1И

естъ^пнфе кщш нет

1 3 5 7 15 Этапы исследования, супсп

Рисунок 3. Уровень одно-, двунитевых разрывов ДНК в общей группе пострадавших (а), в группе пострадавших гипоксия «+» и гипоксия «-» (б), в группе пострадавших гипоксия есть в зависимости от развития инфекционных осложнений (в), ROC - анализ по уровню одно-, двунитевых разрывов ДНК в группе пострадавших гипоксия «есть» в зависимости от развития вторичных гнойных осложнений (г).

В связи с чем значения всех трёх показателей у каждого пострадавшего были суммированы для проведения ROC-анализа, с целью выявления значимости суммарного (некротические ДНК-кометы + апоптотические ДНК-кометы + одно-, двунитевые разрывы ДНК) показателя в качестве прогностического признака вероятности развития инфекционных осложнений. ROC-анализ суммарного показателя, полученного на 3-й день после травмы в группе пострадавших гипоксия «+» выявил (рис. 4 б): 1. Значение площади под ROC кривой, построенной по суммарному показателю на 3-й день после травмы, составило 0.923 (чувствительность - 100%, специфичность — 75,0%). Точка отсечения (cut-off point) составила 47,3% суммарного показателя

а

Суммарный показатель гипоксия есть, инфекция есть

Суммарный показатель гипоксия есть, инфекции нет

80

- 60'

Si л

5 40*

t Sensithiity. 100.0 БресИсйу 75.0 1 Crierai : 47.3

20

<П: . L'C. - Lï г.-ХЙ

о-

о

20 40 60 80 100 100-Specifidty

Рисунок 4. Суммарный показатель в группе пострадавших гипоксия есть в зависимости от развития инфекционных осложнений (a), ROC - анализ суммарного показателя в группе пострадавших гипоксия «есть» в зависимости от развития вторичных гнойных осложнений (б).

2. Уровень суммарного показателя выше данной точки может служить хорошим прогностическим признаком, позволяющим предположить, малую степень вероятности развития инфекционных осложнений.

3. Значения суммарного показателя ниже 47,3% свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой и выраженной гипоксией

Двунитевые разрывы в молекулах ДНК белых клеток крови У пострадавших из группы гипоксия «+» при поступлении в реаниматологическое отделение показатель двунитевых разрывов ДНК был в пределах нормальных значений [4,60 (2,29; 7,90) %, р<0.05] и был достоверно ниже, чем в группе пострадавших гипоксии «-» [8,18 (3,40; 11,41)%]. НаЗ-и сутки уровень двунитевых разрывов ДНК увеличивается в обеих группах, но остаётся выше в группе гипоксии «-». Динамика изменения показателя двунитевых разрывов ДНК в группе пострадавших гипоксии «-» в первую неделю после травмы напоминает изменения показателя апоптотических ДНК комет в той же группе.

Корреляционные зависимости. Концентрации внеклеточной ДНК в плазме пострадавших с тяжелой скелетной травмой (ТСТ) в первый день после травмы имела слабую степень положительной корреляции с некротическими ДНК-кометами (г=0,41) и двунитевыми разрывами в молекуле ДНК

(г=0,39). В свою очередь некротические ДНК-кометы имели среднюю степень (г=0,56) положительной корреляции с двунитевыми разрывами в молекуле ДНК (таблица 1).

Полученные данные свидетельствуют о том, что повышение количества внеклеточной ДНК сразу после травмы при ТСТ обусловлено не только попаданием ДНК из клеток травмированных тканей, но и отчасти вкладом ДНК белых клеток крови, разрушаемых по механизму некроза. При этом распад ДНК клеток травмированных тканей и белых клеток крови при ТСТ идет преимущественно по механизму двунитевых разрывов.

Таблица 1

Корреляционные зависимости между показателями повреждений ДНК у пострадавших с

травмой

Повреждения ДНК ДНК в плазме крови Двунитевые разрывы ДНК Одно- и двунитевые разрывы ДНК Апоптотические ДНК-ко меты Некротические ДНК-кометы

ТСТ

ДНК в плазме крови г-0,39 (1-е сутки) г= 0,34 (5-е сутки) г= 0,41 (1-е сутки); г= 0,57 (5-е сутки)

Некротические ДНК-кометы г= 0,41 (1-е сутки); г= 0,57 (5-е сутки) г— 0,56 (1-е сутки) р<0,05 г=0,39(1-е сутки)

Апоптотические ДНК-кометы г= 0,34 (5-е сутки) г- 0,46 (5-е сутки) г-0,65 (5-е сутки) р<0,05 г=0,39( 1-е сутки)

ЧМТ

ДНК в плазме крови г--0,60 (15-е сутки) г= 0,70 (15-е сутки) г=-0,60 (15-е сутки)

Апоптотические ДНК-ко меты г= 0,55 (15-е сутки)

Некротические ДНК-ко меты г-0,71 (15-е сутки) р<0,05

ЧМТ+ТСТ

ДНК в плазме крови г-0,31 (7-е сутки) г= 0,32 (7-е сутки); г= 0,59 (15-е сутки) г=0,42 (15-е сутки) г— 0,36 (15-е сутки)

Апоптотические ДНК-кометы г= 0,53 (7-е сутки) р<0,05; г-0,58 (15-е сутки) р<0,05 г= 0,53 (3-е сутки) р<0,05 г-0,39 (15-е сутки)

Некротические ДНК-кометы г-0,73 (15-е сутки) р<0,05 г-0,39 (15-е сутки)

Одно-и двунитевые разрывы ДНК г= 0,66 (3-е сутки) р<0,05; г= 0,61 (7-е сутки) р<0,05

Повреждения ДНК ДНК в плазме крови Двунитевые разрывы ДНК Одно- и двунитевые разрывы ДНК Апоптотические ДНК-ко меты Некротические ДНК-ко меты

Наряду с этим, в первые сутки после травмы отмечена слабая степень (г=0,39) положительной корреляции между процентным содержанием некротических и апоптотических ДНК-комет в плазме крови пострадавших, что свидетельствует об одновременном апоптотическом и некротическом путях альтерации белых клеток крови в этот период. Повышение количества внеклеточной ДНК в плазме крови пострадавших с ТСТ на 5-е сутки после травмы имело среднюю степень корреляционной зависимости с некротическими ДНК-кометами (г=0,57) и слабую степень положительной корреляции с апоптотическими ДНК-кометами (г=0,34). Это свидетельствует об одновременном апоптотическом и некротическом механизмах альтерации белых клеток крови на 5-й день после травмы и их значительном вкладе в повышение уровня внеклеточной ДНК в плазме при ТСТ.

При этом отмечена высокая степень корреляции (г=0,65) между апоптотическими ДНК-кометами и интегральным (одно-, двунитевые разрывы ДНК) показателем и средняя степень корреляции (г=0,46) между апоптотическими ДНК-кометами и двунитевыми разрывами, что может свидетельствовать о том, что гидролиз ДНК белых клеток крови при ТСТ на 5-е сутки после травмы идет по механизму одно- и двунитевых разрывов. В отличие от пострадавших с тяжелой скелетной травмой, у больных с ЧМТ в первую неделю после травмы не отмечено корреляционных зависимостей по внеклеточной ДНК, что может быть связано с малым объемом травмированных тканей и локальным закрытым видом черепно-мозговой травмы. В конце второй недели наблюдения у пострадавших с ЧМТ выявлена средняя положительная степень корреляции (г=0,55) между процентным содержанием апоптотических ДНК-комет и интегральным (одно-, двунитевые разрывы) показателем, а также высокая положительная степень корреляции (1=0,70) между внеклеточной ДНК и интегральным показателем. Представленные данные свидетельствуют о том, что образование внеклеточной ДНК и апоптотических ДНК-комет белых клеток крови на 15 день наблюдения сопряжено с одно- и двунитевыми разрывами. При этом ДНК белых клеток крови, погибших по апоптотическому пути, даёт определенный вклад в количество внеклеточной ДНК в плазме пострадавших в этот период. На 15 сутки после травмы у пострадавших с ЧМТ отмечена высокая отрицательная корреляционная связь между внеклеточной ДНК и некротическими ДНК-кометами (г=-0,60), а также между внеклеточной ДНК и двунитевыми разрывами (г=-0,60). При этом процент некротических ДНК-комет имел высокую положительную степень корреляции (г=0,71) с двунитевыми разрывами.

Полученные данные свидетельствуют о том, что повышенное содержание внеклеточной ДНК в плазме крови пострадавших с ЧМТ на 15 сутки обусловлено вкладом ДНК белых клеток крови, погибших по апоптотическому, а не по некротическому механизму. В этот период у пострадавших с ЧМТ образование некротических ДНК-комет белых клеток крови осуществляется по механизму двунитевых разрывов. У пострадавших с ТСТ+ЧМТ корреляционные зависимости между исследуемыми показателями повреждений ДНК выявлены на 3-й, 7-е и 15-е сутки. На 3-й сутки после травмы выявлена средняя степень корреляционной зависимости (г=0,53) между апоптотическими ДНК-кометами и одно-, двунитевыми разрывами, а также между двунитевыми и одно-, двунитевыми разрывами (г=0,66). На 7-е сутки после травмы отмечена слабая корреляционная зависимость показателей свободной ДНК в плазме и двунитевыми разрывами (г=0,31), а также между свободной ДНК в плазме и одно-, двунитевыми разрывами (г=0,32). В этот же период отмечена средняя степень корреляционной зависимости (г=0,53) между апоптотическими ДНК-кометами и двунитевыми разрывами.

При сочетании ТСТ и ЧМТ альтерация белых клеток крови в первую неделю после травмы происходит по апоптотическому механизму. А повреждение ДНК при этом идёт в первые 3-е суток по механизму одно-, двунитевых разрывов, а в дальнейшем преимущественно по механизму двунитевых разрывов. У пострадавших с сочетанной ЧМТ+ТСТ на 15 сутки наблюдения повышенный уровень внеклеточной ДНК имел слабую степень положительной корреляции с некротическими (г=0,36) и апоптотическими (1=0,42) ДНК-кометами и среднюю положительную степень корреляции (г=0,59) с интегральным (одно-, двунитевые разрывы) показателем. Наряду с этим отмечена высокая положительная степень корреляции двунитевых разрывов с некротическими (г=0,73) и средняя корреляционная зависимость с апоптотическими (г=0,58) ДНК-кометами. Полученные данные свидетельствуют о том, что повышенное содержание внеклеточной ДНК обусловлено на 15-е сутки как за счёт попадания ДНК из клеток травмированных тканей, так и за счёт значительного вклада ДНК белых клеток крови, разрушаемых по некротическому и апоптотическому механизмам.

Гидролиз ДНК белых клеток крови происходит по механизму одно- и двунитевых разрывов одновременно. При этом ДНК белых клеток крови дают значительный вклад в высокий уровень внеклеточной ДНК при ЧМТ+ТСТ на 15 сутки наблюдения. Образование некротических и апоптотнческих ДНК-комет белых клеток крови сопряжено с двунитевыми разрывами.

В этот же период отмечена средняя степень корреляционной зависимости (г=0,53) между апоптотическими ДНК-кометами и двунитевыми разрывами.

У пострадавших с сочетанной ЧМТ+ТСТ на 15 сутки наблюдения среднюю положительную степень корреляции (г=0,58) с интегральным (одно-, двунитевые разрывы) показателем. Наряду с этим отмечена высокая положительная степень корреляции двунитевых разрывов с некротическими (г=0,73) ДНК-кометами.

Гидролиз ДНК белых клеток крови происходит по механизму одно- и двунитевых разрывов одновременно. При этом ДНК белых клеток крови дают значительный вклад в высокий уровень внеклеточной ДНК при ЧМТ+ТСТ на 15 сутки наблюдения. Образование некротических и апоптотических ДНК-комет белых клеток крови сопряжено с двунитевыми разрывами.

8-гидрокси-2-дезоксигуанозин и супероксиддисмутаза (СОД) в плазме крови

пострадавших.

Выявлено трехкратное снижение концентрации 8-гидрокси-2-дезоксигунозина (суммарного показателя окислительного дистресса) в плазме крови пострадавших с травмой, сопровождающееся и, возможно обусловленное, увеличением количества супероксиддисмутазы. Сниженное содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина у пострадавших с травмой и кровопотерей предполагает необходимость учитывать его количество при обосновании целесообразности назначения антиоксидантной терапии этим больным.

РАЗМЕР, ФОРМА II НАНОСТРУКТУРА МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ У ПОСТРАДАВШИХ С ТЯЖЕЛОЙ ТРАВМОЙ Группа контроля. Размеры и формы эритроцитов. Оптическая микроскопия и АСМ.

Количество различных по размерам эритроцитов достоверно не отличалось при подсчете методом оптической и атомно-силовой микроскопии в поле 100x100 мкм (-100 клеток).

В группе контроля при оптической микроскопии и АСМ в поле 100x100 мкм выявили следующие формы эритроцитов:

• дискоциты имеют двояковогнутую форму, диаметром от 7,0 до 8,2 мкм, толщиной от 350 до 550 нм, с углублением в центре (пэллор) от 10 до 270 нм (ОМ - 97,9±1,5%; АСМ - 95,0±5,0%).

• эхиноциты имеют форму шиловидных дисков диаметром от 5,5 до 14 мкм, толщиной от 280 до 840 нм, без углубления в центре (ОМ - 2,0±0,9%; АСМ - 3,0±1,0%).

• плоские клетки имеют форму дисков с гладкой ровной поверхностью диаметром от 8,5 до 9,5 мкм, толщиной от 300 до 390 нм, без углубления в центре (ОМ -0,10±0,02%; АСМ - 1,0±0,5%, р<0,05).

• стоматоциты - это эритроциты, у которых центральное просветление имеет не округлую, а линейную форму, что напоминает ротовое отверстие, средняя высота 456 нм, максимальный диаметр 5800 нм, минимальный диаметр 2400 нм (ОМ -0,90±0,01%; АСМ - 0,88±0,03%).

Высокая разрешающая способность метода АСМ позволила выявить на порядок большее количество плоских клеток у здоровых добровольцев, чем при оптической микроскопии.

Группа пострадавших. Размеры и формы эритроцитов.

Оптическая микроскопия и АСМ.

Исследование мазков крови пострадавших с травмой методом АСМ и оптической микроскопии в поле 100x100 мкм при поступлении в реаниматологическое отделение показало, что количество эритроцитов на 42,6±11,8% меньше, чем в группе контроля. При атомно-силовой микроскопии в поле 100x100 мкм мазков крови пострадавших с травмой в день поступления в реаниматологическое отделение выявили достоверные отличия относительно контроля в количестве различных по форме эритроцитов: дискоцитов. эхиноцитов, стоматоцитов, плоских клеток.

Количество дискоцитов в группе пострадавших с травмой на 5-е сутки уменьшалось при одновременном увеличении количества плоских клеток. С 5 по 15 сутки отмечается постепенное увеличение количества дискоцитов при одновременном уменьшении количества плоских клеток.

Рисунок 5. Процентное распределение макроцитов и плоских клеток, полученное с помощью атомно-силовой

микроскопии, у пострадавших с травмой.

Характер кривых, отражающие динамику изменения

содержания плоских клеток и макроцитов (считающихся

разновидностью молодых форм эритроцитов), имеет одинаковую

13 5 7

пины исследования, сутки

,<<, -*-макропшы

"•"11.10СКИС K.TCIKH

I ¡1]! I и <|)авШ'И11ч

чикрсшты- 1X2)21). 4: !6.0)°V «и- 1.0(0.5:1Д».

направленность (рис. 5). Размеры плоских клеток (8.5-9.5 мкм) и увеличение их

количества в период компенсаторного активирования эритропоэза в ответ на кровопотерю

(5-е сутки) в результате травмы [Леонова Е.В., 2009] позволяют с большой долей

вероятности отнести их к разновидности молодых форм эритроцитов. В динамике число

плоских клеток и дискоцитов различалось у пострадавших с кровопотерей 1 степени

тяжести (в основном пострадавшие с ЧМТ) и КП IV СТ (в основном пострадавшие с ТСТ).

Увеличение количества плоских клеток при кровопотере 1 степени тяжести начинается с

3-х суток и достигает максимума к 5 суткам наблюдения, отражая, по всей видимости,

усиление процессов эритропоэза. На 7-е и 15-е сутки количество плоских клеток линейно

уменьшалось, при одновременном увеличении количества дискоцитов, что, по-видимому,

отражает переход молодых форм эритроцитов в дискоциты.

98(98.98) Рисунок 6. Процентное

распределение плоских 5 (49;9<t) клеток и дискоцитов,

полученное с помощью АСМ, у пострадавших с травмой на этапах исследования, в зависимости от объема потери крови: а-КП 1 СТ; б- КП IV СТ.

ш-цисюикты КЛ I СТ Hopui 96±5Ч •■плоские »легки КП 1 СТ норил 1 ,fcO.S%

■-плоские клетки КП IV СТ кориа 1.0=0,5%

В группе пострадавших в первые сутки после травмы в поле 100x100 мкм методом

АСМ было выявлено около 8% дискоцитов с углубленным пэллором и выростом в центре (мишеневидные клетки, target cells) (рис. 7).

Вероятно, в связи с гипоксией (снижение напряжения кислорода и увеличение уровня лактата в плазме крови), вызванной травмой и кровопотерей, происходит компенсаторное изменение формы эритроцита (появление выроста в центре пэллора), направленное на увеличение его поверхности. Увеличение поверхности дискоцита способствует более эффективному захвату кислорода из обеднённой кислородом плазмы. Происходит компенсаторное изменение формы дискоцитов, направленное на эффективное выполнение им газотранспортной функции и обеспечение жизнеспособности самого эритроцита в критической ситуации.

Нормализация напряжения кислорода на 3-й сутки после травмы за счет ИВЛ сопровождается уменьшением числа дискоцитов с углубленным пэллором и выростом в центре (мишеневидные клетки) (рис. 8).

Рис. 7. Изображение эритроцитов в АСМ здорового донора (А) и пострадавшего от тяжелой травмы (Б) в формате 30 в поле 100x100 мкм. Структура одиночного эритроцита с углубленным пэллором и выростом в центре (В) и его профиль в поле 10x10 мкм пострадавшего от тяжелой скелетной травмы.

Отмеченная в динамике обратная зависимость между количеством дискоцитов с углубленным пэллором и выростом в центре и ВЕ крови, а также прямая зависимость от уровня лактата крови может служить косвенным доказательством высказанного предположения.

Наноструктура мембран дискоцитов в группе пострадавших. АСМ.

При поступлении пострадавших в стационар с различными видами травмы отметили значительные изменения наноструктуры мембран эритроцитов: среднее значение высоты первого порядка у всей группы пострадавших возрастало по сравнению с контролем почти в 8 раз, высоты второго порядка (Ь[) ~ в 1.5 раза, высоты третьего порядка (Ьз) ~ в 2,5 раза. Учитывая, что в момент поступления больного в реаниматологическое отделение массивная инфузионно-трансфузионная терапия еще не проводилась, то выявленные изменения являются следствием травмы, массивной кровопотери, гипоксии, гемодинамических нарушений. Возрастание показателя Ь] в первый день после травмы и кровопотери, по-видимому, является компенсаторной реакцией эритроцита в ответ на гипоксию и сниженное содержание кислорода в плазме и направлено на увеличение площади газообмена между обедненной кислородом плазмой крови и дискоцитами. Значения высоты первого порядка зависела от степени кровопотери, выраженности гипоксии и вида травмы: 111 составила 5,74 (3,36: 7.46) нм при КП I СТ (рОз = 57,6 (50,2; 85,6) мм.рт.ст., лактат = 3,2 (1,8: 4,5) ммоль/л) и И, =11,46 (5,80; 12,55) нм при КП IV СТ (рОт = 45,3 (41,5; 59,5) мм.рт.ст., лактат = 4.59 (2.02: 9,55) ммоль/л) могут служить косвенным подтверждением высказанного предположения.

•щШНШ С ШГО.1С111Ш\1 1ШГСр0М I! ШрОСНМ К ||1Ш[Н.*,д.й

•*-шат, мМ :1

этапы юлеаомник, птга

Рисунок 8. Количество мишеневидных клеток в зависимости от изменения уровня напряжения кислорода, уровня лактата, ВЕ.

Высота второго порядка несет информацию о состоянии сиектринового матрикса эритроцита [Ког1оуа Е.К.. 2013]. Форма эритроцитов и наноструктура поверхности их мембран зависят от конформации спектринового матрикса, являющегося цитоскелетом клетки [К.ог1оуа Е.К.., 2013]. Полученные данные свидетельствуют о том, что конформация мало и незначительно меняется в зависимости от гипоксии (Ь2 = 1,38 (1,23; 1,52) нм при КП I СТ: р02 = 57,6 (50,2; 85,6) мм.рт.ст., лактат = 3,2 (1,8; 4,5) ммоль/л иЬ2 = 1.5 (1,3; 1,8) нм при КП IV СТ: р02 = 45,3 (41,5, 59,5) мм.рт.ст., лактат = 4,59 (2,02; 9,55) ммоль/л), вида травмы (Ь2 при ТСТ: 1,40 (1,31; 1,79) нм; Ь2 при ЧМТ: 1,30 (1,20; 1,89) нм)). Изменение параметра Ьз несет информацию об изменениях в белковых структурах мембраны эритроцита [Ког1оуа Е.К., 2013]. Важную роль в осуществлении белками функциональных нагрузок играет их структурное состояние - конформация и внутримолекулярная динамика (ВМД). Различные элементы структуры глобулы непрерывно флуктуируют - совершают тепловые колебательные и вращательные движения вблизи положения равновесия [Галец И. 2008, Кленова Н.А., 2003]. Наблюдаемое почти в 2,5 раза увеличение значения высоты третьего порядка связано с гипоксией и возможно отражает изменение конформации и внутримолекулярной динамики белков мембраны эритроцитов и зависит от объема потери крови. При выраженной гипоксии - КП IV СТ - не происходит восстановление значений 1>з в первые две недели после травмы, что косвенно свидетельствует о значительных изменениях в белковых структурах мембран эритроцитов, вызванных гипоксией. Выявленные нарушения могут отражаться на белок-липидных и белок-белковых взаимодействиях в мембране и на функции эритроцитов. Отмечено, что в группе умерших больных высота третьего порядка при поступлении в отделение была в ~ 2 раза выше [0,77 (0,30; 1.10) нм]. чем в группе выживших [0,34 (0,25; 0,44) нм]. Дальнейшие исследования требуются для выяснения значения изменений высоты третьего порядка и их взаимосвязь с выживаемостью больных.

Таким образом, исходя из представленных данных предлагается следующая схема механизма развития посттравматических изменений клеток крови.

НЕКРОЗ

В

д и к

ТРЛВМЛ

-1 I

КРОВОПОТЕРЯ

ДИК в ПЛАЗМЕ

и

ЛЕЙКОЦИТЫ*- Г ИПОКСИЯ -» 'ЭРИТРОЦИТЫ

I

1

ж

АКТИВАЦИЯ клсплз

ИЗМЕНЕНИЕ! НАНОСТРУКТУРЫ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ

IГ1ММ И-. 11111. ФОРМЫ. РАЗМЕРА ЭРИТРОЦИТОВ

АПОПТОЗ ¡1

я

Рисунок 9. Механизмы развития посттравматических изменений клеток крови. Выводы:

1. Альтерация лейкоцитов после травмы и кровопотери происходит как путем некроза, о чем свидетельствует появление в плазме крови некротических повреждений ДНК (некротические ДНК-кометы), так и путем апоптоза, что подтверждается повышением уровня апоптотических повреждений ДНК (апоптотические ДНК-кометы), сопровождающееся увеличением содержания в плазме каспазы-3 [в 1,5-2 раза (р<0,05) по сравнению с контрольной группой], каспазы-9 [в 2-3 раза на 5-е, 7-е сутки (р<0,05) по сравнению с контрольной группой] и вАРСМ/РаБ. [в 4-6 раза (р<0,05) по сравнению с контрольной группой]. Повреждение ДНК при апоптозе и некрозе белых клеток крови при травме и кровопотере происходит по механизму однонитевых и двунитевых разрывов

2. В первые две недели после травмы в крови пострадавших выявляется увеличение количества апопоптотических повреждений ДНК [в 3-6 раз (р<0,05) относительно контроля], одно-, двухнитевых разрывов ДНК [в 1,5-3 раза (р<0,05) относительно контроля] лейкоцитов, а также повышение в 2-5 раз (р<0,05) по сравнению с контрольной группой содержания свободной ДНК в плазме и появление некротических повреждений ДНК (3-8%), отсутствующих в норме.

3. Прогнозировать риск развития инфекционных осложнений у больных с травмой и кровопотерей, перенесших гипоксию, можно на основании значений суммарного показателя повреждений ДНК лейкоцитов (одно-, двухнитевые разрывы ДНК+апоптотические повреждения ДНК+некротических повреждений ДНК), выявляемых

25

ДНК.

на третьи сутки после травмы. Чувствительность показателя составляет 100%, специфичность 75%. Значения суммарного показателя повреждений ДНК лейкоцитов ниже 47,3 % (точка «cut-off») свидетельствует о высоком риске развития инфекционных осложнений у пострадавших с травмой, кровопотерей и выраженной гипоксией.

4. Выявлено трехкратное снижение концентрации 8-гидрокси-2-дезоксигунозина (суммарного показателя окислительного дистресса) в плазме крови пострадавших с травмой, сопровождающееся и, возможно обусловленное, увеличением количества супероксиддисмутазы. Уровень 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина у пострадавших с травмой и кровопотерей, возможно, необходимо учитывать при обосновании целесообразности назначения антиоксидантной терапии этим больным.

5. С помощью атомно-силовой микроскопии у пострадавших с травмой и кровопотерей обнаружены изменения наноструктуры мембран эритроцитов, проявляющиеся увеличением высоты первого порядка (h|) в 8,9 раза (р<0,05), высоты второго порядка (hi) - в 1,5 раза (р<0,05), высоты третьего порядка (h3) — в 2,8 раза (р<0,05) и выявлены эритроциты с аномально углубленным пэллором и выростом в центре (target cells).

6. Изменение наноструктуры мембран эритроцитов и показателей повреждения ДНК, процессов апоптоза и некроза показывает и обосновывает механизмы развития посттравматических изменений клеток крови.

Публикации:

1. Решетняк В.И., Жанатаев А.К., Мягкова Е.А., Дурнев А.Д., Остапченко Д.А., Мороз В.В.: ДНК-повреждения при критических состояниях.//Материалы научно-практической конференции, Российско-испанский инновационный бизнес-форум, 12-14 мая, Мадрид, Испания, 2011.

2. Решетняк В.И., Остапченко Д.А., Жанатаев А.К., Мягкова Е.А.: ДНК-повреждение при тяжелой травме.//1Х научно-практическая конференция «Безопасность больного в анестезиологии и реаниматологии», материалы научно-практической конференции 29-30 июня, Москва, Россия, 2011, с. 67-69.

3. Moroz V. V., Myagkova Е. A., Sergunova V. A., Ostapchenko D. A., Reshetnyak V. I. The nanostructurc of red blood cell membranes in patients with severe trauma accompanied by massive blood loss. Proceedings of the 10th International Symposium on Critical Conditions: Pathogenesis, Diagnosis, and Treatment. Obshchaya Reanimatologiya 2012 Vol. 8(3). P. 71. Slovensko - Ruskcsympozium, May 14-18, 2012, Pieshtyany.

4. Moroz V.V., Golubev A.M., Sergunova V.A., Myagkova E.A.: The surface structure of erythrocyte membranes during of long-term storage of donated blood. Proceedings of the 10th International Symposium on Critical Conditions: Pathogenesis, Diagnosis, and Treatment. Obshchaya Reanimatologiya 2012 Vol. 8(3). P. 72. Slovensko - Ruske sympozium, May 14-18, 2012, Pieshtyany

5. Сергунова В.А., Назаров Б.Ф., Мягкова Е.А.: Динамика изменения наноструктуры мембран эритроцитов при кровопотере в результате хирургических операций в клинике.//Материалы научно-практической конференции. Актуальные проблемы криобиологии и криомедицины, Харьков 18-19 октября 2012,22, стр. 336.

6. Moroz V.V.; Myagkova Е.А., Sergunova V.A., Ostapchenko D.A., Chernysh A.M., Reshetnyak V.I. The Morphology of red blood cells in patients with severe trauma. Proceeding of the XIII Internationaler Medizinischer kongress "Euromedica", Hannover (Germany), 4-5 June 2013, p. 148-150.

7. Myagkova E.A., Moroz V. V., Sergunova V.A., Gudkova O.E, Ostapchenko D.A. , Reshetnyak V.I. The nanostructure of the erythrocyte membrane in the patient with severe trauma. Proceeding of the European Clinical Nanomedicine and Targeted Medicine (CLINAM) 6/2013, Basel (Switzerland), 30 June-2 Jule 2013, p. 201-203.

8. Мороз В. В., Мягкова Е. А., Сергунова В. А., Гудкова О. Е., Остапченко Д. А., Решетняк В. И. Кровопотеря и изменение мембраны эритроцитов у больных с тяжелой травмой. Материалы 11-й Научно-практической конференции «Актуальные проблемы организации экстренной медицинской помощи», Джизак (Узбекистан), 26 октября 2013. Вестник экстренной медицины 2013; 3: 119-120.

9. Мороз В.В., Мягкова Е.А., Сергунова В.А., Гудкова О.Е., Остапченко Д.А., Решетняк В.И. Наноструктура мембран эритроцитов у пострадавших с тяжелой травмой и шоком//Тезисы докладов. 15 всероссийская конференция с международным участием «Жизнеобеспечение при критических состояниях», 18-19 ноября, 2013, стр.72-73.

10. Мягкова Е.А., Жанатаев А.К., Чайка З.В.: Оценка антител к ДНК и нуклеосомам у больных с травматическими повреждениями. Материалы научно-практической конференции молодых ученых, 13 декабря 2013, Москва, Россия.

И. Мороз В. В., Мягкова Е. А., Сергунова В. А., Гудкова О. Е., Остапченко Д. А., Черныш А. М., Решетняк В. И. Морфологические особенности эритроцитов у больных с тяжелой сочетанной травмой. Общая реаниматология 2013; 9(3): 14-23

12. Мороз В. В., Черныш А. М., Козлова Е. К., Гудкова О. Е., Сергунова В. А., Мягкова Е. А., Кузовлев А. Н. Методика микроскопического анализа мембран эритроцитов. Общая реаниматология 2013; 9(5): 62-67.

13. Moroz V.V.; Myagkova Е.А., Zhanataev А.К., Ostapchenko D.A., Durnev A.D., Reshetnyak V.I. Evaluation of DNA damage and cell death in patients with severe trauma. Proceeding of the XIV Internationaler Medizinischer kongress "Euromedica", Hannover (Germany), 5-6 June 2014, p. 109-110.

14. Мороз ВВ., Мягкова E.A. Сергунова, B.A., Гудкова О.Е., Остапченко Д.А., Решетняк В.И. Динамика изменения наноструктуры мембран эритроцитов у больных с травмой и кровопотерей. Вестник экстренной медицины, 2013, № 4. 37-42.

15. Мягкова Е.А., Гудкова О.Е., Остапченко Д.А., Сергунова В.А., Решетняк В.И.: Морфофункциональные особенности эритроцитов как показатель гипоксии и травматического шока.//ХП научно-практическая конференция «Безопасность больного в анестезиологии и реаниматологии», материалы научно-практической конференции 26-27 июня, Москва, Россия, 2014, с. 56-57.

16. Мороз В.В., Мягкова Е.А., Жанатаев А.К., Остапченко Д.А., Дурнев А.Д., Решетняк В.И. ДНК-повреждения и процессы клеточной гибели лейкоцитов у пострадавших с тяжелой травмой. Общая реаниматология 2014; 10(4): 18-41.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД артериальное давление

АЛТ аланинаминотрансфераза

АСМ атомно-силовая микроскопия

ACT аспартатаминотрансфераза

АТФ аденозинтрифосфорная кислота

ВОЗ Всемирная Организация Здравоохранения

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ивл искусственная вентиляция легких

КП кровопотеря

опк объем потери крови

пон полиорганная недостаточность

сод супероксиддисмутаза

тст тяжелая скелетная травма

ТЭЛА тромбоэмболия легочной артерии

ЧМТ черепно-мозговая травма

чсс частота сердечных сокращений

APACHE II Acute Physiology and Chronic Health Evaluation II

Подписано в печать:

17.07.2014

Заказ № 10123 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru