Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Морфология лимфатических сосудов и узлов при экспериментальной вторичной лимфедеме

На правах рукописи

КОЛОБОВА ТАТЬЯНА ЛЕОНИДОВНА

МОРФОЛОГИЯ ЛИМФАТИЧЕСКИХ СОСУДОВ И УЗЛОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВТОРИЧНОЙ ЛИМФЕДЕМЕ

14 00 02 анатомия человека

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ярославль — 2007

003062810

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор

Катаев Станислав Иванович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Левин Вячеслав Наумович Шевченко Вадим Павлович

Ведущая организация-

Государственное образовательное

учреждение

дополнительного

профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

9¿7 у//, и У/

Защита диссертации состоится «»¿^ » _2007 г в Т "

на заседании диссертационного совета К 208 119 01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (150000, г Ярославль, ул Революционная, д 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ярославской государственной медицинской академии

Автореферат разослан « » апреля 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Румянцева Т А

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Лимфатические сосуды и узлы, являясь транспортными коммуникациями для лимфы, достаточно хорошо изучены и с морфологической и с клинической точек зрения Хорошо известны и механизмы, обеспечивающие перемещение лимфы Между тем анализу структур, участвующих в этих процессах уделено сравнительно мало внимания Данные о морфологии паховых лимфоузлов и лимфатических сосудов подкожной клетчатки в норме и в условиях экспериментально созданного острого лимфатического отека расширяют и дополняют представления об органных особенностях строения лимфатических структур, а также могу г служить основой для оценки компенсаторно-приспособительных реакций лимфатической системы

Лимфедема относится к группе тяжелых хронических заболеваний и в большинстве случаев имеет обструктивный характер (Поташов А В с соавт , 2000, Абалмасов КГ с соавт , 2001, Бубнова Н А с соавт , 2003, Бардычев MC с соавт, 2003) В патогенезе лимфедемы важную роль играют два основных фактора, влияющих на общие процессы, это функциональный и механический Оба фактора вызывают частичное или полное нарушение лимфатического оттока, что обуславливает развитие новых путей дренирования лимфы (Выренков ЮЕ с соавт 1997) Для приобретенной лимфедемы характерно вторичное поражение лимфатических сосудов и узлов, что приводит к уменьшению транспортной емкости и лимфатического оттока при нормальном объеме образования ультрафильтрата (Foldi М 1993) В последние годы отмечается увеличение числа больных с различными формами лимфедемы Однако современные методы терапии и различные лимфодренирующие операции не всегда оптимальны и сейчас изучаются и разрабатываются различные аспекты этой проблемы (Зербино ДД 2003, Золоторевский В Я с соавт 1999, Малинин А А с соавт 2005)

Исходя из этого, несомненно, необходима научная, а именно морфологическая оценка изменений, происходящих в лимфатических

сосудах и узлах при острой вторичной лимфедеме Тем более актуально изучение структуры, а на основании этого эффективности медикаментозного и физиотерапевтического воздействия на неолимфангиогенез, иммуннокомпетентные системы лимфатического узла, а также на реологические свойства лимфы и сократительную активность миоцитов лимфангионов

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить морфофункциональные изменения паховых лимфатических узлов и сосудов задних конечностей крыс при моделировании острой вторичной лимфедемы в условиях физиотерапевтического и медикаментозного воздействия

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выявить морфофункциональные изменения паховых лимфатических узлов и эндотелия лимфатических сосудов крыс при моделировании острой вторичной лимфедемы задних конечностей

2 Изучить морфофункциональные преобразования лимфатических сосудов задних конечностей крыс с острой вторичной лимфедемой на фоне воздейсгвия вазопростана

3 Оценить пролиферативную и рециркуляционную активность иммунокомпетентных клеток лимфатических узлов при лазерном облучении паховых лимфоузлов крыс с экспериментальной острой вторичной лимфедемой

4 Выяснить характер изменения баланса дыхательных ферментов миоцитов лимфангионов крыс с экспериментальной острой вторичной лимфедемой на фоне электромагнитной и электростимулирующей терапии

5 Проанализировать влияние электромагнитной терапии на динамическую вязкость центральной лимфы крыс при моделировании острой вторичной лимфедемы задних конечностей

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые с помощью комплекса адекватных и современных методов исследования лимфатической системы выявлены структурно-

функциональные преобразования элементов лимфомикроциркуляторного русла при острой вторичной лимфедеме

Впервые научно разработано направление по медикаментозной стимуляции регенерации лимфатических капилляров и увеличению трансэндотелиального массопереноса в целях усиления резорбционной функции лимфатического русла Установленный при этом положительный эффект воздействия вазопростана на лимфатические структуры открывает новые перспективы в лечении лимфедемы и позволяет улучшить результаты хирургического лечения при комбинированном использовании

Впервые изучено воздействие инфракрасного облучения, электромагнитного поля и электростимуляции на структуры лимфатической системы в условиях острой вторичной лимфедемы, способствующие более эффективному протеканию процессов резорбции и транспорта лимфы Это позволяет предполагать возможность их применения в клинике для стимуляции компенсаторно-приспособительных реакций лимфатической системы на ранних стадиях развития вторичной лимфедемы, когда еще морфофункциональные изменения лимфатических структур являются обратимыми

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1 Успешно апробированная модель острой вторичной лимфедемы задних конечностей крыс создает предпосылку для проведения дальнейших исследований в области изучения морфофункциональных особенностей лимфатических узлов и сосудов при лимфедеме различного генеза

2 Более глубокое изучение особенностей воздействия различных методов консервативной терапии на лимфатическое русло при острой вторичной лимфедеме дают практическому врачу новые теоретические

знания в лечении лимфатических отеков, возникающих при этом заболевании

3 Данные об особенностях морфологической организации компонентов лимфатических узлов и эндотелиальной выстилки лимфатических сосудов могут быть использованы в учебном процессе при преподавании анатомии, гистологии, физиологии, иммунологии и хирургии

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1 Созданная модель острой вторичной лимфедемы характеризуется уменьшением относительной плотности лимфатического русла подкожной клетчатки, снижением пролиферативной активности эндотелия лимфокапилляров с уменьшением плотности кавеол в них, подавлением митотической и миграционной активности клеток лимфоидного ряда лимфоузлов, увеличением вязкости лимфы

2 Стимуляция неолимфангиогенеза, усиление пролиферации эндотелиоцитов лимфокапилляров и увеличение плотности кавеол в них на фоне острой вторичной лимфедемы происходит при медикаментозном воздействии

3 При моделировании острой вторичной лимфедемы разнонаправленные физические воздействия вызывают усиление пролиферации и рециркуляции лимфоидных клеток лимфоузлов, изменение баланса окислительно-востановительных ферментов миоцитов лимфангионов в сторону анаэробного типа дыхания и снижение вязкости лимфы

ВНЕДРЕНИЯ

Полученные данные о морфологии лимфатических сосудов и узлов в норме и в условиях экспериментально созданной острой вторичной лимфедемы внедрены в учебную программу кафедры анатомии человека, топ анатомии и оперативной хирургии ГОУ ВПО ИвГМА Оценка

морфологических изменений лимфатических структур на фоне острой вторичной лимфедемы при разнонаправленном лечебном воздействии используется при подготовке хирургов в Ивановской государственной медицинской академии

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2001), XXXV научно — практической конференции врачей ЦВКГ ВВС (Красногорск 2005), XI Всероссийском съезде сердечно — сосудистых хирургов (Москва 2005), II Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва 2006), X ежегодной сессии научного центра ССХ им А Н Бакулева РАМН Всероссийской конференции молодых ученых (Москва 2006 г), I сибирском съезде лимфологов (Томск, 2006 г), VIII Конгрессе Ассоциации морфологов (Орел, 2006 г ), научно — практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА (Иваново 2006), Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф Максименкова АН (С — Петербург 2006), межкафедральной научной конференции ГОУ ВПО ИвГМА Росздрава (Иваново 2007)

ПУБЛИКАЦИИ

По теме исследования опубликовано 8 научных работ, из них 4 публикации в журналах Перечня ВАК РФ

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов исследования (3 раздела), их обсуждения, выводов и практических рекомендаций Список использованной литературы

состоит из 167 источников, из них 65 отечественных и 102 иностранных Работа содержит 7 таблиц и 38 рисунков

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Дизайн экспериментальной работы представлен в таблице 1

Таблица 1

Схема постановки эксперимента___

Серии животных Группы животных при разном воздействии Количество животных Сроки забора биоматериала

I. Интактные 1 Здоровые 6 __

II Группы сравнения - с острой вторичной лимфедемои задней конечности 2 Однократное введение дистиллированной воды (1,0 мл подкожно в переднюю поверхность бедра) 6 Через сутки

3 Курсовое введение дистиллированной воды в течеиие 10 суток 6 После курса через сутки

4 Группа сравнения - животным не проводичось лечебно1 о воздействия 6 Одновременно с экспериментальными животными

III Экспериментальные -с острой вторичной чимфедсмой задней конечноеш 5 Однократное введение вазопроеюна (0,05 мю подкожно в переднюю поверхность бедра) 6 1 сутки

6 3 сутки

6 7 сутки

6 14 сутки

6 Курсовое введение вазопростана (1 раз в день в течение 10 су гок) 6 Посте курса на 1 сутки

6 Посте курса на 3 сугки

6 После курса на 7 сутки

6 После курса на 14 сутки

7 ИК - лазерное обтучение в режиме 150-300 Гц в течение 10 суток 6 После курса на 1 сутки

6 После курса на 3 сутки

6 После курса на 5 сутки

6 После курса на 10 сутки

8 ИК — лазерное обтучение в режиме 1500-3000 Гц в течение 10 суток 6 После курса на 1 сутки

6 После курса на 3 сугки

6 После курса па 5 сутки

6 После курса па 10 сутки

9 Электромагнитная терапия в течение 10 суток А гистохимическое исследование СДГ и ЛДГ 6 Посте курса через сутки

Б исследование вязкости центральной шмфы 6 После курса через сутки

10 Эчектростимуляция в течение 10 суюк 6 Пос 1е курса через су!ки

Общее количество животных 138

Работа выполнена на 138 половозрелых нелинейных крысах - самцах, массой 180 — 220 гр , которые были разделены на десять групп Все животные содержались в виварии с учетом рекомендаций хронобиологии и хрономедицины (Комаров ФИ 1989) и находились на одинаковом рационе питания Крысы первой группы были интактными Животным второй — десятой групп была создана экспериментальная модель острой вторичной лимфедемы задней конечности по методике Лохвицкого С В , Богомолова Л Д , Альбертова И Н с модификацией Ольшевского В и Выренкова Ю Е (1987) Основной смысл проведения эксперимента — выполнение расширенной лимфангиоэктомии пахово-подвздошно-поясничного транспортного пучка с сохранением первого пахового лимфатического узла для дальнейшего его исследования с целью выявления в нем морфологических изменений Через 1-2 суток после проведенной операции сформировался острый лимфатический отек задней конечности крысы Обезболивание и эвтаназия животных проводились эфиром Забор биологического материала осуществлялся между 12 и 14 часами, учитывая то обстоятельство, что в лимфоидной ткани происходят циклические суточные изменения (Смирнова Т С , Ермолина JI В , 1988, Катинас Г С с соавт , 1981, Комаров Ф И , 1989)

В работе были использованы следующие методы исследования

1 Препаровочные С помощью хирургического инструментария были выделены лимфатические сосуды и узлы задних конечностей крыс

2 Интерстиниальная инъекция и импрегнация Препараты, адекватные прижизненной анатомии корней лимфатической системы получали с помощью методов интерстициалыюй и полихромной инъекции (Жданов Д А, Шахламов В А ,1964) суспензии масляных красок, приготовленных на основе методов Gerota D (1896) и Стефаниса Ф А (1902) под кожу первого межпальцевого промежутка задней конечности крысы Подготовка органа для инъекции осуществлялась методом Выренкова Е Я (1968) Импрегнация сосудов ЛМЦР кожи по методу

Куприянова В В (1965, 1969) позволяет изучить контуры капилляров, посткапилляров и сосудов, определить взаимоотношения лимфатического русла с кровеносным, строение стенок исследуемых сосудов, а также проследить окружающие соединительнотканные волокна и клетки, жировую клетчатку Препараты фотографировали и изображение через фотоувеличитель проецировали на клетчатую бумагу

3 Световая микроскопия Биологический материал (кусочки кожи и паховые лимфоузлы) фиксировали в 10% забуференном формалине (для приготовления парафиновых срезов, толщиной 7 мкм и окрашивания гематоксилин-эозином) Срезы изучали с помощью светового микроскопа при увеличении 16x10, 40x10, 100x10 (иммерсия) Для объективизации данных производилась фотосъемка на микроскопе МБИ-15 на пленку Микрат-300

4 Электронная микроскопия. Для морфологического исследования использовалась методика сканирующей электронной микроскопии коррозионных (СЭМКГ1) и нативных препаратов (СЭМНП) Анализ этих препаратов проводили в сканирующем электронном микроскопе Phillips PSEM - 500х со съемкой на коммерческую широко- и узкоформатную пленку

5 Метод криофрактографии: В качестве консерванта был использован 2,5% раствор глютарового альдегида, из которого препарат помещали в криопротектант (25% раствор глицерина) После этого образец погружался во фреон-22, охлаждаемый жидким азотом и находившийся при нормальном атмосферном давлении на грани плавления-замерзания (температура - 160°С) Затем проводилось скалывание. Разломанные поверхности напыляли последовательно платиной и углем Отделение реплики от тканевого материала производилось путем растворения последнего в растворителе (25%-й раствор хромпика) После этого производилось электронно-микроскопическое изучение полученной реплики и фотографирование

6 Метод морфометрии: Качественный анализ лимфатических сосудов и узлов животных верифицировался количественными морфометрическими методами Они складывались из двух этапов Во-первых — подсчет объемной плотности лимфатического русла подкожной клетчатки задней конечности крыс по методу, предложенному Автандиловым Г Г (1972, 1973) с помощью окулярной 100-точечной сетки Во-вторых -количественная оценка двух базовых иммунологических функций лимфоузла иммуноцитопоэтической (вычисление индекса митотической активности) и рециркуляционной (вычисление индекса миграционной активности)

7 Иммуногистохимические. Для подтверждения пролиферации эндотелиоцитов лимфатических капилляров применяли иммуногистохимический метод использования биомаркеров Для этого срезы с парапластовых блоков, полученных на микротоме «Аи1осиЬ> («КеюЬеП-Лигщ,» Австрия) после предварительной обработки окрашивали МКА гипа РСЫА, которые реагируют с белком циклином и доказывают потенцию клеток к делению Полученные препараты изучали в микроскопе «Биолам-И» (Россия) Гистохимические исследования дыхательных ферментов в миоцитах лимфаг ионов проводили по методике с использованием солей тетра-нитро-синего тетразолия (Реагее 1972) Количественная оценка интенсивности этих реакций осуществлялась с помощью микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ, на котором проводили цитоспектрометрические исследования (Автандилов Г Г 2002) с последующей статистической обработкой полученных результатов

8 Методика исследования вязкости лимфы Динамическую вязкость центральной лимфы исследовали по отношению к стандартной ампулированной дистиллированной воде Исследование проводили в стеклянном капиллярном и-образном вискозиметре ВПЖ-4

9 Методы статистической обработки Обработка полученных цифровых данных выполнена по программе на микро-ЭВМ «Электроника

МК-61» и при помощи пакетов прикладных программ «Microsoft Excel 7 О» Для каждого показателя вычисляли среднюю арифметическую и ее ошибку, достоверность отличий оценивали по t-критерию Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ходе исследований созданная нами модель острой вторичной лимфедемы позволила выявить морфофункциональные преобразования лимфатических структур на фоне изучаемой патологии При наличии отека подкожной клетчатки наблюдается расширение лимфатических сосудов, обусловленное чрезмерным давлением лимфы При определении относительной плотности лимфатического русла отмечено незначительное ее снижение до 35,36 ± 1,69 %, т е на 1,3 %

В лимфатических капиллярах подкожной клетчатки задней конечности крыс выявилось достоверное снижение пролиферации эндотелиоцитов на 39% (Р<0,05) с достоверным уменьшением в них плотности кавеол до 0,92 ± 0,01 (Р<0,05), те на 22 %, что свидетельствует о снижении транспортных свойств лимфатического русла и активности трансэндотелиального массопереноса

На фоне острой вторичной лимфедемы задней конечности у крыс появляются морфофункциональные изменения и в структурах лимфатического узла Они характеризуются снижением митотической активности лимфоидных клеток до 11,41 ± 1,13, что признано по критерию Стьюдента недостоверными данными (Р > 0,05) Миграционная активность лимфоцитов через стенки посткапиллярных венул паховых лимфоузлов достоверно снижалась на 14 % (Р < 0,05) и индекс миграции равнялся 2,83 ± 0,09

Исследования центральной лимфы у животных на фоне острой вторичной лимфедемы показали, что при данной патологии наблюдается повышение ее вязкости до 2,7 ± 0,08, т е на 25 % Это, несомненно, ведет к снижению реологических свойств лимфы

Таким образом, мы наблюдаем картину развития острого

лимфатического отека Отсюда становится очевидным, что деблокирование лимфатического стаза обеспечивается увеличением пропускной способности лимфатического русла Этого можно достигнуть путем стимуляции регенерации лимфокапилляров, увеличения пролиферативной и резорбционной активности их эндотелиоцитов и активации скорости продвижения лимфы за счет увеличения частоты и силы сократительнои способности лимфангионов и улучшения реологических свойств лимфы Не менее важно и воздействие на структуры лимфатических узлов для усиления пролиферации и рециркуляции лнмфоидных клеток в них

Воздействия на эти факторы позволяют максимально мобилизовать резервные возможности лимфатической системы Используя принцип комплексного многофакторного воздействия, возможно добиться значительной редукции отека Экспериментальные исследования направлены на более глубокое изучение преобразований морфологических структур лимфатического русла при острой вторичной лимфедсме путем влияния физиотерапевтическими методами и медикаментозными препаратами

Исследование действия вазопростана на лимфатические капилляры Исследование показало (таб 2), что при острой вторичной лимфедеме задней конечности крыс однокрагное введение вазопростана приводило к увеличению (Р<0,05) относительной плотности лимфатического русла, особенно на 7 (на 24%) и 14 сутки (на 22%) эксперимента После курсового введения препарата этот показатель достоверно увеличивался на 64% к 3 суткам, достигая максимальных значений К 14 суткам наблюдалась незначительная тенденция к снижению плотности лимфатического русла

При исследовании была также выявлена потенция эндотелиоцитов к пролиферации (таб 3) После однократного введения вазопростана этот показатель увеличивался только в начале эксперимента и достигал на 3 сутки исследования 3,78+0,41, а затем снижался до 2,07±0,14 к 14 сутками После курсового введения вазопростана наблюдалась более продолжительная пролиферативная активность эндотелия уже с первых суток исследования с

увеличением значений относительно животных групп сравнения более чем в два раза К третьим суткам этот показатель достиг максимальных величин (6,17±0,44), превышая данные группы сравнения в 3 раза К 14 суткам исследования наблюдался спад активности до 3,01+0,17

Таблица 2

Плотность лимфатического русла задних конечностей крыс до и после введения вазопростана (в %%)_

Группы животных Вид эксперимента Сроки забора биомагериала (сугки)

1 3 7 14

Интактиая (1 группа) Здоровые 37,58 ± 1,74

Группа сравнения (2 группа) Однократное введение диет воды 35,36 ± 1,69

Группа сравнения (3 группа) Курсовое введение диет воды 37,14* ±1,71

Экспериментальная (5 группа) Однократное введение вазапростана 36,81 ± 1,41

38,17*±1,89

44 57*±1,91

43,81 *±2 27

Экспериментальная (6 группа) Курсовое введение вазапростана 56,74*±1,31

61,11*±1,53

59,91*±1,41

60,07*±1,21

*Р < 0,05

Таблица 3

Пролиферативная активность эндотелия лимфокапилляров задних

Группы животных Вид эксперимента Сроки забора биоматериала (в сутках)

1 3 7 14

Интактная (1 группа) Здоровые 2,98 ± 0,20

Группа сравнения (2 группа) Однократное введение диет воды 2,12*^0,18

Группа сравнения (3 группа) Курсовое введение диет воды 2,13* ±0,18

Экспериментальная (5 группа) Однократное введение вазопростана 3,11*±0,21

3,78*±0,41

2 01 ±0,02

2,07±0,14

Экспериментальная (6 группа) Курсовое введение вазопростана 4,81*±0,37

6,17*±0,44

5,64*±0,37

3 01*±0,17

С помощью метода криофрактографии проводилось изучение пространственного распределения плазмолеммальных пузырьков эндотелиоцитов и количественная оценка их распределения в клетках эндотелия лимфатических капилляров при медикамеигозпом воздействии Было четко выявлено влияние вазопростана на трансцеллюлярный транспорт эндотелиоцитов лимфокапилляров, на восстановление и даже усиление резорбционной способности лимфатического русла (таб 4)

После однократного введения препарата плотность кавеол возрастала почти в 2 раза, а на третьи, седьмые и четырнадцатые сутки снижалась до цифр группы сравнения Наиболее наглядные результаты получены при курсовом введении вазопростана, где отмечалось устойчивое повышение плотности кавеол Уже на 1 сутки эксперимента этот показатель возрастал до 1,9 ±0,07 На третьи сутки данный показатель соответствовал 1,8 +0,04, а на седьмые он доходил до 1,5+0,03 Даже через две недели плотность кавеол превышала цифры группы сравнения и составляла 1,2 +0,02

Таблица 4

Плотность кавеол эндотелия лимфокапилляров задних конечностей крыс до и после введения вазопростана (в абс единицах)__

Группы животных Вид эксперимента Сроки забора биоматериала (в сутках)

1 3 7 14

Интактная (1 1рупгта) Здоровые 1Л ±0,02

Группа сравнения (2 группа) Однократное введение диет воды 0,0 ¿0,01

Группа сравнения (3 1-руппа) Курсовое введение тис г воды 0,92 *±0,01

Экспериментальная (5 группа) Однократное введение вазопростана 1,7*±0,08

1,4*±0,05

0,93±0,01

0,9А0,02

Экспериментальная (6 группа) Курсовое введение вазопростана 1,9*±0,07

1,8*±0,04

1,5*±0,03

1 2*+0,02

Таким образом, курсовое введение вазопростана активизирует пролиферацию лимфатического эндотелия и увеличивает плотность плазмолеммальных пузырьков в них, стимулирует неолимфангиогенез Все это повышает возможности резорбции и транспортной емкости, тем самым увеличивая пропускную способность коллатерального русла, дополнитечьно решая вопросы преодоления механического блока

Исследование действия лазерного облучения на паховые лимфоузлы Исследование пролиферативной активности клеток лимфоидного ряда лимфоузлов показало, что облучение инфракрасным лазером вызывает эффект стойкой бласттрансформации лимфоцитов Причем, в основном, В-клеток, так как уже на 1, 3 и 5 сутки после курсового облучения регистрировалось выраженное усиление митотической активности в 1,5 раза в корковом и мозговом веществе лимфоузла Особенно показательно это было в зоне центров размножения лимфатических фолликулов (герменативных центрах), в которых большинство клеток имели фигуры митоза Спустя 10 суток после облучения индекс митотической активности снижался до показателей группы сравнения (таб 5)

Таблица 5

Показатели митотической активности клеток лимфоидного ряда паховых лимфоузлов крыс при лазерном облучении_

Объект исследования Сроки забора биомагсриала (сутки) И мит

Режимы излучения (Гц)

150-300 | 1500-3000

Паховые лимфоузлы интактпых животных (1 группа) Здоровые 12,26 ± 1,71

Паховые лимфоузлы животных группы сравнения (4 группа) Через сутки после возникновения отека конечности 11,41 ± 1,13

Паховые лимфоузлы у экспериментальных животных (7 и 8 группы) 14,74* ±0,% 13,11* ±0,83

3 15,40* ± 1,20 14 98* ± 0,9

5 14,23* ± 0,83 14,75* ± 1,02

10 11,92 ±0,63 11,8Г* ± 0,85

При исследовании миграции лимфоцитов выявлено резкое возрастание на 60% индекса миграции через 3 и 5 суток и стабилизация показателя через 10 суток после воздействия лазерного облучения (таб 6) Усиление процессов рециркуляции в основном происходило за счет проникновения лимфоцитов в просвет синусов через стенки посткапиллярных венул, расположенных в паракортикальной зоне лимфатического узла (Т-зависимая зона)

Таблица 6

Показатели рециркуляционной активности лимфоцитов паховых лимфоузлов крыс при лазерном облучении____

Объект исследования Сроки забора биомагериала (сутки) И мигр

Режимы излучения (Гц)

150-300 | 1500-3000

Паховые лимфоузлы иптактных животных (1 группа) Здоровые 3,23 ± 0,08

Паховые лимфоузлы животных группы сравнения (4 ¡руппа) Через сутки после возникновения отека конечности 2,83* ±0,09

Паховые лимфоузлы у экспериментальных животных (7 и 8 группы) 1 3,84» ±0,07 3,95* ± 0 04

3 5,06* ± 0,03 4,79* ± 0,06

5 4,89* ± 0,05 4,11 * ± 0,07

10 3,26* ± 0,08 3,17* ±0,04

* Р < 0,05

Проведенные исследования позволяют считать, что лазерное облучение лимфоузлов не оказывает повреждающего воздействия на структуру их лимфоидной ткани Выявленные изменения свидетельствуют об усилении процессов миграции лимфоцитов через стенки посткапиллярных венул, митотической активности иммунокомпетентных клеток В обеих группах при использовании различной частоты воздействия не было найдено значимого отличия влияния на динамику изменения показателей миграции и пролиферации клеток лимфоидного ряда лимфоузла Это указывает на отсутствие зависимости эффективности воздействия лазерной терапии ог частоты лазерного облучения

Таким образом, лазерное облучение благоприятно влияет на структуры клеточного и гуморального иммунитета, что, несомненно, повышает

защитные свойства организма в условиях изучаемой патологии Этому же способствует и улучшение циркуляции клеток и лимфы в лимфоузле, повышая отток лимфы из тканей, что приводит к уменьшению их отека

Исследование воздействия электростимуляции и электромагнитной терапии на баланс дыхательных ферментов в миоиитах лимфангионов и на реоюгические свойства лимфы Показатели активности СДГ и ЛДГ свидетельствуют о том, что электростимуляция и электромагнитная терапия независимо от параметров воздействия влияют на баланс окислительно-восстановительных ферментов миоцитов (таб 7), составляющих сократительный аппарат лимфангионов Так, в условиях электростимуляции количество СДГ снижалось и заметно нарастала активность ЛДГ, что свидетельствует о переходе миоцитов с аэробного на анаэробный тип дыхания Динамика данных, полученных при электромагнитной терапии была аналогичной Однако наиболее выраженные результаты были выявлены при электрической стимуляции

Таблица 7

Показатели активности ферментов углеводного обмена в стенке лимфососудов задних конечностей крыс в условных единицах

Ферменты Интактпые животные Животные группы сравнения Виды воздействия

Электромагнитная терапия Электростимуляция

СДГ 175 ±8,9 179 ±9,7 101* ±3,07 130*±3,И

ЛДГ 68 ± 15,2 68 ± 15,4 199* ±6,5 212* ±5,9

*Р< 0,05

Таким образом, проведенное исследование выявило изменения в межуточном обмене веществ миоцитов лимфатических сосудов экспериментальных животных под действием электромагнитного воздействия и электрической стимуляции, которые свидетельствуют о развитии гипоксии сократительных клеток По данным Меерсона Ф 3 (1993) подобное возникновение перехода окислительных ферментов с аэробного дыхания в сторону анаэробного стимулирует компенсаторно-

18

приспособительные реакции в организме и увеличение частоты и силы сократимости лимфангиоиов

Известно, что стагнирующая лимфа в тканях переходит в интерстиции в желеобразное состояние, что приводит к неэффективной работе насосной функции лимфангиоиов Исследования центральной лимфы показали (рис 1), что у животных на фоне острой вторичной лимфедемы задней конечности после курса электромагнитного воздействия показатель ее динамической вязкости уменьшился до 1,43±0,037, при сопоставлении с животными группы сравнения (2,7±0,08) на 53% Соответственно это свидетельствовало и об увеличении ее текучести в 2 раза Даже по сравнению с данными интактной группы (2,15±0,052) показатель вязкости лимфы экспериментальных животных уменьшился на 45 %

Рисунок 1

График изменений динамической вязкости центральной лимфы животных в условных единицах

ингактные животные группа сравнения экспериментальные

животные

О вязкость (ед)

Проведенные экспериментальные исследования доказывают важность многофакторного воздействия на морфологические параметры лимфатической системы для улучшения их функциональных показателей в условиях патологического лимфатического стаза и транспорта лимфы

выводы

1 При острой вторичной лимфедеме задней конечности крыс наблюдается снижение пролиферативной активности эндотелиоцитов лимфокапилляров и уменьшение в них плотности кавеол на 22%

2 В паховых лимфоузлах животных с острой вторичной лимфедемой задней конечности снижаются индексы миграционной и митотической активности клеток лимфоидного ряда

3 Реакция лимфомикроциркуляторного русла при острой вторичной лимфедеме задней конечности крыс на курсовую медикаментозную терапию проявляется усилением неолимфангиогенеза и возрастанием пролиферации эндотелиоцитов лимфокапилляров в 3 раза с увеличением в них количества кавеол в 2,1 раза

4 Пик проявления морфологических признаков активности лимфоидных клеток паховых лимфоузлов животных с острой вторичной лимфедемой задней конечности приходится на 3 — 5 сутки после курсового инфракрасного лазерного облучения и сопровождается повышением индекса митоза на 76% и увеличением индекса миграции па 56%

5 Переход миоцитов лимфангионов с аэробного на анаэробный тип дыхания происходит за счет изменения баланса дыхательных ферментов в сторону значительного нарастания активности ЛДГ и снижения количества СДГ у животных с острой вторичной лимфедемой задней конечности под действием электромагнитной терапии и электростимуляции

6 Снижение вязкости центральной лимфы на 53% наблюдается у крыс с острой вторичной лимфедемой задней конечности при электромагнитном воздействии

7 Многофакторное воздействие на морфологические признаки лимфатических структур приводит к разным проявлениям компенсаторно-приспособительных реакций лимфатической системы в условиях острой вторичной лимфедемы

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Подосенкова 1 В , Кодина Т В , Колобова Т Л, Андреева С А Эндолимфатический метод введения иммуномодуляторов // Материалы VIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» М, — 2001, — С 272

2 Колобова Т Л , Катаев С И, Шишло В К , Малипин А А Стимуляция лимфодинамики у больных с постмастэктомическим отеком после лимфовенозных анастомозов // Сборник тезизов XXXV научно-практической конференции врачей 5 ЦВКГ ВВС Красногорск - 2005, - С 227 - 228

3 Колобова Т Л , Малинин А А , Шишло В К Влияние лазерного облучения на иммунокомпетентные клетки паховых лимфатических узлов // Сердечно - сосудистые заболевания М, - 2005, том 6, № 5, - С 302

4 Колобова ТЛ Пролиферативная и рециркулирующая активность клеток лимфоидного ряда при лазерной терапии // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006» Иваново - 2006, - С 62-63

5 Колобова Т Л, Шишло В К, Малинин А А, Андреева С А Лимфатический эндотелий в норме и при вторичной лимфедеме // Сердечно - сосудистые заболевания М, - 2006, том 7, № 3, - С 82

6 Колобова ТЛ Изменение иммуннокомпетентной функции лимфатических узлов под влиянием низкоэнергетического лазерного ИК-излучения // Ангиология и сосудистая хирургия М, - 2006, том 12, № 1, -С 87

7 Колобова Т Л , Катаев С И, Малинин А А Изменения баланса ферментов углеводного обмена в миоцитах лимфангионов при воздействии переменного электромагнитного поля и электрической стимуляции // Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 100 - летию со дня рождения А Н Максименкова СПб, - 2006, - С 104-105

8 Колобова Т Л, Андреева С А, Катаев С И Стимуляция лимфангиогенеза простогландиком Е1 // Морфология СПб «Эскулап» 2006, том 129, №4 -С 66-67

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

И мит - индекс митоза

И миф - индекс миграции

ЛДГ — лактатдегидрогеназа

ЛМЦР - лимфомикроцирхуляторное русло

МКА (РСЫА) - моноклональные антитела ковалентные ядерному антигену пролиферирующих клеток СДГ - сукцинилдегидрогеназа

Подписано в печать 24 04 2007 г

Формат 60x90 1/16 Уел печ л 1,5

Печать плоская Гираж 100 экз

ШхГ»

Скопировано с готовых оригинап-макетов в ООО «НЕКСТ» г Иваново уп Жиделева, 33, офис 6 Тел (4932)32-86-22 59-01-72

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вторичная лимфедема относится к группе тяжелых хронических заболеваний, имеющих тенденцию к прогрессированию, и нередко приводящие к инвалидизации больных. В последние годы, по данным многих авторов, прослеживается увеличение больных с различными формами лимфедемы (А.В.Поташов с соавт., 2000, К.Г.Абалмасов с соавт., 2001, Н.АБубнова с соавт., 2003, М.С.Бардычев с соавт., 2003).

В патогенезе лимфедемы важную роль играют два основных фактора, влияющие на общие процессы - это функциональный и механический (Foldi М.,1991, Olszewsky W.L., 1992, Dini D.et al., 1993, Jimenez Cossio J.A., 1994, Casley-Smith J.R., 1998). Оба фактора вызывают частичное или полное нарушение оттока лимфы, что одновременно влечет за собой развитие компенсаторных путей ее дренирования.

Для этого заболевания характерно вторичное поражение лимфатических сосудов и узлов, что приводит к уменьшению транспортной и функциональной емкости лимфатического русла при нормальном объеме образования ультрафильтрата. То есть это типичный высокобелковый отек, обусловленный лимфатической недостаточностью с «низким выбросом» (Foldi М. 1993). Происходит застой жидкости, богатой белком, нарушается нормальный обмен фибриногена, который в норме должен удаляться лимфатическими сосудами (И.А.Потапов, 1977). Помимо этого снижается транспорт гиалуроновой кислоты, вследствие чего возрастает ее концентрация в тканевой жидкости (Ning-Fei L. 1997).

Таким образом, основным механизмом развития лимфедемы является первичное или вторичное поражение путей лимфатического оттока, что приводит к целому каскаду патологических процессов с развитием периферической лимфогипертензии, нарушению процессов обмена и метаболизма в интерстициальном пространстве.

Лимфатические сосуды и узлы, являясь транспортными коммуникациями для лимфы, достаточно хорошо изучены и с морфологической и с клинической точек зрения. Хорошо известны и механизмы, обеспечивающие перемещение лимфы. Между тем анализу структур, участвующих в этих процессах уделено сравнительно мало внимания. Основным фактором, обеспечивающим отток лимфы, по данным современных авторов (Н.А.Бубнова с соавт., 2003, А.А.Гашев с соавт., 1990, Л.В.Поташов с соавт., 2000, P.S. Mortimer, 1998), является сохранность сократительной способности лимфангионов лимфатических сосудов. Но даже при сохранении их сократительной функции способность к «перекачиванию» лимфы может значительно уменьшаться или вообще прекращаться в связи с повышением ее вязкости.

Проблема диагностики и лечения хронических лимфатических отеков при заболеваниях и повреждениях лимфатической системы разрабатывается как в России, так и за рубежом. Однако, несмотря на внедрение в клиническую практику современных методов диагностики и различных лимфодренирующих операций, результаты лечения не являются оптимальными, что свидетельствует о необходимости дальнейшей разработки этой проблемы в направлении по изучению влияния различных лечебных мероприятий на морфологические и функциональные показатели лимфатической системы в условиях нарушения транспорта лимфы.

В рамках создания новых комплексных программ лечения вторичной лимфедемы требуется углубленное изучение морфофункциональ-ных изменений в лимфатических сосудах и узлах при воздействии физиотерапевтических методов и медикаментозных препаратов. Необходимо исследовать регенерационную способность лимфатических капиллярных структур для увеличения резорбционной способности лимфатической системы в условиях медикаментозной стимуляции вазопростаном, а также влияние инфракрасного облучения на иммунокомпетентные системы лиматического узла, электромагнитного поля на эндотелиоциты лимфатических капилляров и электрической стимуляции миоцитов лимфангио-нов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить морфофункциональные изменения паховых лимфатических узлов и сосудов задних конечностей крыс при моделировании острой вторичной лимфедемы в условиях физиотерапевтического и медикаментозного воздействия.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выявить морфофункциональные изменения паховых лимфатических узлов и эндотелия лимфатических сосудов крыс при моделировании острой вторичной лимфедемы задних конечностей.

2. Изучить морфофункциональные преобразования лимфатических сосудов задних конечностей крыс с острой вторичной лимфедемой на фоне воздействия вазопростана.

3. Оценить пролиферативную и рециркуляционную активность иммунокомпетентных клеток лимфатических узлов при лазерном облучении паховых лимфоузлов крыс с экспериментальной острой вторичной лимфедемой.

4. Выяснить характер изменения баланса дыхательных ферментов миоцитов лимфангионов крыс с экспериментальной острой вторичной лимфедемой на фоне электромагнитной и электростимулирующей терапии.

5. Проанализировать влияние электромагнитной терапии на динамическую вязкость центральной лимфы крыс при моделировании острой вторичной лимфедемы задних конечностей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые с помощью комплекса адекватных и современных методов исследования лимфатической системы выявлены структурно-функциональные преобразования элементов лимфомикроциркуляторного русла при острой вторичной лимфедеме.

Впервые научно разработано направление по медикаментозной стимуляции регенерации лимфатических капилляров и увеличению трансэн-дотелиального массопереноса в целях усиления резорбционной функции лимфатического русла. Установленный при этом положительный эффект воздействия вазопростана на лимфатические структуры открывает новые перспективы в лечении лимфедемы и позволяет улучшить результаты хирургического лечения при комбинированном использовании.

Впервые изучено воздействие инфракрасного облучения, электромагнитного поля и электростимуляции на структуры лимфатической системы в условиях острой вторичной лимфедемы, способствующие более эффективному протеканию процессов резорбции и транспорта лимфы. Это позволяет предполагать возможность их применения в клинике для стимуляции компенсаторно-приспособительных реакций лимфатической системы на ранних стадиях развития вторичной лимфедемы, когда еще морфофункциональные изменения лимфатических структур являются обратимыми.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Успешно апробированная модель острой вторичной лимфедемы задних конечностей крыс создает предпосылку для проведения дальнейших исследований в области изучения морфофункциональных особенностей лимфатических узлов и сосудов при лимфедеме различного генеза.

2. Более глубокое изучение особенностей воздействия различных методов консервативной терапии на лимфатическое русло при острой вторичной лимфедеме дают практическому врачу новые теоретические знания в лечении лимфатических отеков, возникающих при этом заболевании.

3. Данные об особенностях морфологической организации компонентов лимфатических узлов и эндотелиальной выстилки лимфатических сосудов могут быть использованы в учебном процессе при преподавании анатомии, гистологии, физиологии, иммунологии и хирургии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Созданная модель острой вторичной лимфедемы характеризуется уменьшением относительной плотности лимфатического русла подкожной клетчатки, снижением пролиферативной активности эндотелия лимфокапилляров с уменьшением плотности кавеол в них, подавлением митотической и миграционной активности клеток лимфоидного ряда лимфоузлов, увеличением вязкости лимфы.

2. Стимуляция неолимфангиогенеза, усиление пролиферации эндотелиоцитов лимфокапилляров и увеличение плотности кавеол в них на фоне острой вторичной лимфедемы происходит при медикаментозном воздействии.

3. При моделировании острой вторичной лимфедемы разнонаправленные физические воздействия вызывают усиление пролиферации и рециркуляции лимфоидных клеток лимфоузлов, изменение баланса окислительно-востановительных ферментов миоцитов лимфангионов в сторону анаэробного типа дыхания и снижение вязкости лимфы.

ВНЕДРЕНИЯ

Полученные данные о морфологии лимфатических сосудов и узлов в норме и в условиях экспериментально созданной острой вторичной лимфедемы внедрены в учебную программу кафедры анатомии человека, топ. анатомии и оперативной хирургии ГОУ ВПО ИвГМА. Оценка морфологических изменений лимфатических структур на фоне острой вторичной лимфедемы при разнонаправленном лечебном воздействии используется при подготовке хирургов в Ивановской государственной медицинской академии.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2001); XXXV научно - практической конференции врачей ЦВКГ ВВС (Красногорск 2005); XI Всероссийском съезде сердечно - сосудистых хирургов (Москва 2005); II Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва 2006); X ежегодной сессии научного центра ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН Всероссийской конференции молодых ученых (Москва 2006 г.); I сибирском съезде лимфологов (Томск, 2006 г.); VIII Конгрессе Ассоциации морфологов (Орел, 2006 г.); научно - практической конференции студентов и молодых ученых Ив-ГМА (Иваново 2006); Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. А.Н.Максименкова (С. - Петербург 2006), межкафедральной научной конференции ГОУ ВПО ИвГМА Росзд-рава (Иваново 2007).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме исследования опубликовано 8 научных работ, из них 4 публикации в журналах Перечня ВАК РФ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов исследования (3 раздела), их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список использованной литературы состоит из 167 источников, из них 65 отечественных и 102 иностранных. Работа содержит 7 таблиц, 38 рисунков, из них 31 фотография, 5 диаграмм и 2 графика.

ВЫВОДЫ

1. При острой вторичной лимфедеме задней конечности крыс наблюдается снижение пролиферативной активности эндотелиоцитов лимфокапилляров и уменьшение в них плотности кавеол на 22%.

2. В паховых лимфоузлах животных с острой вторичной лимфе-демой задней конечности снижаются индексы миграционной и митотиче-ской активности клеток лимфоидного ряда.

3. Реакция лимфомикроциркуляторного русла при острой вторичной лимфедеме задней конечности крыс на курсовую медикаментозную терапию проявляется усилением неолимфангиогенеза и возрастанием пролиферации эндотелиоцитов лимфокапилляров в 3 раза с увеличением в них количества кавеол в 2,1 раза.

4. Пик проявления морфологических признаков активности лимфоидных клеток паховых лимфоузлов животных с острой вторичной лимфедемой задней конечности приходится на 3 - 5 сутки после курсового инфракрасного лазерного облучения и сопровождается повышением индекса митоза на 76% и увеличением индекса миграции на 56%.

5. Переход миоцитов лимфангионов с аэробного на анаэробный тип дыхания происходит за счет изменения баланса дыхательных ферментов в сторону значительного нарастания активности ЛДГ и снижения количества СДГ у животных с острой вторичной лимфедемой задней конечности под действием электромагнитной терапии и электростимуляции.

6. Снижение вязкости центральной лимфы на 53% наблюдается у крыс с острой вторичной лимфедемой задней конечности при электромагнитном воздействии.

7. Многофакторное воздействие на морфологические признаки лимфатических структур приводит к разным проявлениям компенсаторно-приспособительных реакций лимфатической системы в условиях острой вторичной лимфедемы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Использование знаний о воздействии различных методов консервативной терапии при острой вторичной лимфедеме позволят практическому врачу объективизировать тактику ее лечения.

2. Можно предполагать, что применение вазопростана и электромагнитно - лазерной терапии в клинических условиях позволит стимулировать процессы лимфодинамики на всех этапах от образования лимфы до ее транспортировки и тем самым улучшит эффективность лечения лимфедемы.

3. Предполагается возможность использования изученных методов воздействия в комплексной терапии лимфатических отеков при лимфедеме, как в качестве самостоятельных способов лечения, так и после хирургических реконструктивных операций.

4. Данные о морфологической организации компонентов лимфатического русла, в частности - лимфоузлов и сосудов, могут быть использованы в учебном процессе при преподавании анатомии, гистологии, физиологии, иммунологии и хирургии.