Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Морфологические особенности интрамедуллярных стромальных структур гемопоэтической ниши и элементов лимфоидной стромы при хроническом лимфолейкозе

На правах рукописи

Семенова Наталья Юрьевна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНТРАМЕДУЛЛЯРНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ НИШИ И ЭЛЕМЕНТОВ ЛИМФОИДНОЙ СТРОМЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

25 ФЕВ 2015

005559493

Санкт-Петербург 2015

005559493

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федералного медико-биологического агентства» (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Бессмельцев Станислав Семенович доктор медицинских наук, профессор Ругаль Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

Кравцов Вячеслав Юрьевич - доктор биологических наук, профессор, ведущий научт " сотрудник отдела лабораторной диагностики Федерального государственного бюджетног учреждения "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М Никифорова" МЧС России.

Зарицкий Андрей Юрьевич - доктор медицинских наук, профессор, директор Институт гематологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Северо-Западнь федеральный медицинский исследовательский центр» Министерства здравоохранеа Российской Федерации.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшег профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «_»_2015 года в_часов

на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России п адресу 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотетке института и на сайте ФГБУ РосНИИГ ФМБА России.

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Татьяна Валентиновна Глазанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Механизмы, определяющие злокачественную трансформацию клеток-предшественниц лимфопоэза при лимфопролиферативных заболеваниях окончательно не расшифрованы, в связи с чем исследования с целью получения неизвестных ранее, новых данных, связанных с лейкозцой трансформацией клеток и, в частности, основанных на анализе мало изученной на сегодня кроветворной и лимфоидной стромы, особенно шипеобразующих структур являются одной из актуальных проблем современной гематологии. В обширной группе лимфопролиферативных заболеваний хронический лимфолейкоз (XJLJ1) стоит на первом месте по частоте встречаемости (Бакиров Б.А., 2013). В установлении причин появления и дальнейшей судьбы лейкозного клона при этом заболевании значимое место занимает изучение особенностей состояния ключевых нишеобразующих стромальных структур кроветворного и лимфоидного микроокружения, непосредственно регулирующих развитие гемопоэтических стволовых клеток и их коммитированных в лимфоидном направлении потомков (Montillo М., 2005; Jonathan W., 2011).

Состоянию костномозговой стромы, оценке ее роли в нормальном гемолимфопоэзе и значению ее дефектов в развитии гемобластозов, включая лимфопролиферативные заболевания, в последние годы уделяется большое внимание (Ругаль В.И., 1989; Стругов В.В., 2013; Bessmeltsev S., 2010; Scadden D.T., 2014). При этом особенности структурной организации элементов стромалыюго микроокружения, участвующие в формировании ниши клеток-предшественниц гемолимфопоэза в целом и при ХЛЛ в частности, практически не изучены. Согласно концепции остеобластно-васкулярной пиши кроветворное микроокружение содержит специализированные стромальные клеточные структуры - ниши, формируемые элементами стромы эндоста и микрососудами, которые определяют локализацию стволовых клеток и создают условия для их длительного самоподдержания, а также регулируют их дифференцировочный и пролиферативный потенциал. Вне киши стволовые кроветворные клетки не способны выполнять свои функции (Пальцев М.А., 2009; Zhang J., 2008). Также известно, что именно в костномозговых шипах гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) получают первоначальные сигналы гемопоэзиндуцирующего микроокружения, направляющие развитие гемопоэтических предшественников в лимфоидном направлении. Коммутированные лимфоидные предшественники мигрируют из костного мозга в лимфоидные органы, где при непосредственном влиянии стромального компонента лимфоидной ткани происходит их дальнейшее развитие.

В связи с этим анализ структурных особенностей кроветворной ткани и состоят« стромального мюсроокружения больных ХЛЛ является актуальным, так как на основании сведений о морфофункциональном статусе паренхимы и стромы костного мозга представляется возможным получить факты, уточняющие патогенез появления и становления неопластического клона В-лимфоцитов при ХЛЛ.

В тоже время, практически отсутствуют работы о состоянии не менее значимого регуляторного компонента, определяющего лимфопоэз - лимфоидного микроокружения при

нарушениях пролиферации и дифференцировки лимфоидных клеток при их малигнизации (Киселева М.В.. 2001; Леепман Е.Е., 2010: НепБЬапи У.. 2011). Коммитированные в лимфоидном направлении стволовые клетки мигрируют из стромальной ниши костного мозга в различные лимфоидные ткани и органы, в частности, лимфатические узлы. В них под воздействием, прежде всего фолликулярных дендритных клеток (ФДК) и эндотелия микрососудов, происходят завершающие этапы В-лимфопоэза и иммуногенеза. Учитывая этот факт, важную роль приобретает анализ состояния стромальных структур лимфатических узлов, напрямую ответственных за процессы пролиферации и дифференцировки мигрировавших из костного мозга лимфоидных предшественников.

Таким образом, изучение морфофункциональных свойств ключевых нишеобразующих элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения при малигнизированном лимфопоэзе является значимой научно-практической задачей. Сведения, полученные в ходе ее решения, важны для теоретической и практической гематологии, так как будут способствовать расшифровке патогенеза ХЛЛ, уточнению прогноза его течения и совершенствованию качества лечения заболевания.

Степень разработанности темы

Структурная организация стромы костного мозга при гемобластозах в целом изучена, однако морфофункциональный статус нишеобразующих элементов стромального микроокружения костного мозга, эндостальных образований и сосудов микроциркуляции при малигнизации лимфопоэза, в частности у больных ХЛЛ, охарактеризован мало. Недостаточно изучено состояние лимфоидного микроокружения при злокачественной трансформации лимфоидных предшественников и практически отсутствуют сведения о фолликулярных дендритных клетках, экстр ацеллюлярном матриксе и характере микроциркуляции лимфатических узлов при ХЛЛ.

До настоящего времени в условиях появления лейкозного клона у больных ХЛЛ отсутствует одновременный, сочетанный анализ ключевых стромальных структур костного мозга и лимфатических узлов, непосредственно участвующих в регуляции гемолимфопоэза и не сформулировано представление о роли дефектов нишеобразующих образований кроветворной и лимфоидной стромы в патогенезе ХЛЛ.

Цель исследования. Определить морфофункциональные особенности стромальных элементов кроветворного и лимфоидного микроокружения, участвующих в формировании ниши гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и лимфоидных клеток-предшественниц, и оценить роль стромальных изменений в патогенезе хронического лимфолейкоза.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности инфильтрации опухолевыми лимфоцитами паренхимы костного мозга больных хроническим лимфолейкозом во взаимосвязи с состоянием стромы интрамедуллярных пространств губчатой кости.

2. Представить морфологическую и иммуно гистохимическую характеристику нишеобразующих структур стромального микроокружения костного мозга - клеток эндостальных зон костных трабекул и сосудов микроциркуляторного русла кроветворной ткани при малигинизации гемолимфопоэза.

3. Охарактеризовать гистоморфологические изменения паренхимы и стромы лимфатических узлов больных ХЛЛ с поражением лимфоидной ткани.

4. Проанализировать структурную организацию ключевых стромальных регуляторных элементов лимфопоэза - фолликулярных дендритных клеток и сосудов микроциркуляторного русла при ХЛЛ.

5. Предложить концепцию роли дефектов нишеобразующих структур кроветворной и лимфоидной стромы в неопластической трансформации ГСК и клеток-предшественниц лимфопоэза.

Научная новизна работы

Впервые на клиническом материале представлены неизвестные ранее сведения о морфофункциональном состоянии нишеобразующих структур костного мозга и лимфатических узлов, непосредственно регулирующих развитие гемопоэтических стволовых клеток и клеток предшественниц в условиях малигнизации В-лимфопоэза при ХЛЛ. Данные получены на основании одновременного сочетанного структурного анализа кроветворного и лимфоидного микроокружения.

Установлено, что независимо от характера опухолевой инфильтрации костного мозга -нодулярного, интерстициального или диффузного, наблюдаются морфофункциональные перестройки клеточных и внеклеточных элементов, участвующих в формировании гемопоэтической ниши: изменяется соотношение содержания интратрабекулярных коллагенов I и III типов, увеличивается количество эндостальных стромальных клеток костного мозга, изменяется их структурная организация, нарастает плотность микрососудов костномозговой паренхимы, включая анатомические зоны локализации родоначальных кроветворных клеток в области эндоста. Выявлена взаимосвязь между плотностью микрососудов и интенсивностью опухолевого поражения костного мозга, а также показана корреляция между прогностическим фактором Zap70 (70-kd дзета-асоциированный белок) и плотностью микрососудов.

Получены новые данные, свидетельствующие о вовлечении ключевых структур лимфоидного микроокружения в генез малигнизации лимфоидных клеток при ХЛЛ -обнаружены признаки дезинтеграции ФДК в паренхиме лимфатических узлов с одновременным усилением ангиогенеза, проявляющимся разрастанием сети мелких сосудов в лимфоидной ткани.

Выдвинуто новое концептуальное положение о роли дефектов стромальных образований костного мозга, формирующих гемопоэтическую нишу, и стромальной ниши лимфатических узлов в генезе злокачественной трансформации лимфоидных предшественников.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в ходе проведенного исследования данные дополняют существующие знания о роли дефектов кроветворного и лимфоидного микроокружения в малигнизации лимфопоэза.

Установленные качественные и количественные изменения нишеобразующих структур костномозговой и лимфоидной стромы позволяют сделать заключение об их вовлечении в процесс неопластической трансформации лимфоидных предшественников при ХЛЛ и могут указывать на перестройку функции ниши, направленную на поддержание лейкозного клона.

Использованная методика одновременной оценки морфофункционального статуса структур кроветворной и лимфоидной ниш позволяет выявить у больных XJ1JI стромальные дефекты, которые могут использоваться в клинике при оценке прогноза заболевания, контроля проводимого лечения и для его совершенствования.

Методология и методы исследования

В работе были использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (лабораторные, статистические). При изучении гистологических препаратов фрагментов подвздошной кости и биоптатов лимфатических узлов применялись окраски гематоксилин-эозином, азур-Ц-эозином, импрегнация серебром, по Массону, проводившиеся по стандартным методикам. Иммуногистохимические (ИГХ) исследования выполняли с использованием панели первичных антител (Dako, Abeam, Spring Bioscience) и полимерной системы визуализации Dako по рекомендованным производителями протоколам окрашивания.

Морфологическую оценку препаратов осуществляли на световом микроскопе Nikon Eclipse Е200 со встроенной фотокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» с окуляром х10, при объективах х20, х40. Анализ гистологических препаратов выполнялся в 20 полях зрения для каждого образца.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Стромальными структурами костного мозга человека, участвующими в формировании гемопоэтической ниши, являются эндостальные клетки, сосуды микроциркуляции, интрамедуллярный и интратрабекулярный экстрацеллюлярный матрикс. В лимфатических узлах структурами непосредственно регулирующими развитие мигрировавших из костного мозга лимфоидных предшественников являются фолликулярные дендритные клетки и микро сосуды.

2. Перестройки морфофункционального статуса стромальных нишеобразующих структур при XJ1JI развиваются независимо от типа опухолевой инфильтрации костного мозга.

3. Развитие хронического лимфолейкоза сопровождается качественными и количественными изменениями эндостальных стромальных клеток и плотности микрососудов.

4. Дезинтеграция и изменение фенотипа фолликулярных дендритных клеток и усиленный ангиогенез в тканях лимфатических узлов являются характерными особенностями состояния лимфоидной ткани при ХЛЛ.

5. Одним из патогенетических факторов развития ХЛЛ является нарушение морфофункционального статуса нишеобразующих структур кроветворной и лимфоидной стромы.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом нишеобразующих стромальных структур костного мозга и лимфатических узлов 112 пациентов с первично установленным диагнозом ХЛЛ с использованием современных методов гистологических и иммуногистохимических исследований и подтверждена адекватными поставленным задачам методами статистической обработки полученных данных.

Результаты работы обсуждены и доложены на Всероссийских и Международных конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы

гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2012, 2014), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокрииологии, иейронауках и гематологии» (Санкт-Петербург, 2013), 18 Конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Стокгольм, 2013), Международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы» (Новосибирск, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Клиническая лабораторная диагностика в гематологии и службе крови» (Санкт-Петербург, 2014), II Конгрессе гематологов России (Москва, 2014), 19 Конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Милан, 2014), Юбилейной конференции, посвященной 140-летию со дня рождения А.А. Максимова «От унитарной теории кроветворения до трансплантации костного мозга» (Санкт-Петербург, 2014).

Внедрение результатов исследований в практику

Основные положения диссертации внедрены в практическую и научно-исследовательскую работу в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России». Материалы исследования используются в педагогическом процессе в ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» и при диагностике и лечении больных лимфопролиферативными заболеваниями в СПбГУЗ «Городская больница №15».

Результаты диссертационной работы включены в Методические рекомендации «Современные методы диагностики и лечения неходжкинских лимфом» (СПб, 2015).

Публикации

По теме кандидатской диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 5 в научно-практических журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований. Также опубликована глава в коллективной монографии «Актуальные вопросы медицинских морфологических дисциплин» (Новосибирск, 2014, с. 62-80).

Объем н структура диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 175 источников: 23 отечественных и 152 иностранных. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 27 рисунками.

Личный вклад автора

Автором лично проведены анализ литературных данных и планирование диссертационной работы, выполнены все гистологические, иммуногистохимические исследования, морфометрия и фотографирование полученных микропрепаратов, осуществлены статистическая обработка, анализ полученных данных, обобщение результатов исследований и подготовка материалов к публикациям.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом исследований послужили полученные до начала терапии трепанобиоптагы подвздошной кости 96 больных ХЛЛ (56 мужчин и 40 женщин) в возрасте от 49 до 73 лет (средний возраст группы 59,9±7,2 лет. медиана 60) и биопсии лимфатических узлов 61 больного (33 мужчины и 28 женщин) той же возрастной группы (средний возраст группы 60,8±6,8 лет, медиана 61). Группу сочетанного анализа составили трепанобиоптаты и биопсии лимфатических узлов 45 пациентов (28 мужчин и 17 женщин, средний возраст группы 59,9+7,7 лет, медиана 60). Контрольную группу при изучении костного мозга составили фрагменты подвздошной кости 30 здоровых лиц 50-70 лет (19 мужчин и 11 женщин, средний возраст группы 58,2+5,6 лет, медиана 58). Группой сравнения при исследовании стромы лимфатических узлов служили биоптаты лимфатических узлов 20 лиц в возрасте 48-70 лет (9 мужчин и 11 женщин, средний возраст группы 62,7±6,2 лет, медиана 63) с неопухолевой реактивпой неспецифической лнмфаденопатней.

Всего проанализировано 3658 гистологических препаратов 112 больных ХЛЛ, находившихся на обследовании в ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства» с января 2000 г. по сентябрь 2014 г. Диагноз ХЛЛ устанавливался на основании общепринятых критериев. Стадии заболевания определялись по классификации Rai.

При изучении гистологических препаратов фрагментов подвздошной кости и биоптатов лимфатических узлов применялись стандартные окраски (гематоксилин-эозин, азур-П-эозин), гистохимические окраски для выявления ретикулина и иммуногистохимические (ИГХ) исследования. Панель первичных антител для ИГХ: CD23, CD21, CD35, FDC, фасции, ламинин, коллаген I, Ш. IV типов. CD34 Class П, CD31, vWF, Zap70, ki67. CD146 (Dako. Abcam, Spring Bioscience), полимерная система визуализации Dako.

Морфологиечскую и морфометрическую оценку препаратов осуществляли на световом микроскопе Nikon Eclipse Е200 со встроенной фотокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений «ВидеоТесТ-Морфология 5.2» с окуляром хЮ, при объективах х20, х40. Анализ гистологических препаратов выполнялся в 20 полях зрения для каждого образца.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики с определением средней величины М, ее средней ошибки m, стандартного отклонения SD. Достоверность различий оценивалась с помощью критерия Стыодеита (t). критерия Манпа-Уитни. Различие между сравниваемыми показателями считалось статистически значимым при р < 0,05. Для выяснения зависимости между показателями применялся корреляционный анализ. Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием программ Statistica v.6.0, MedCalc, Microsoft Excel для Windows XP.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Нишеобразующие структуры стромального микроокруження костного мозга в

норме

При микроскопическом исследовании гистологических препаратов подвздошной кости здоровых лиц материал был представлен периостом, кортикальной пластинкой и губчатой костной тканью. Костномозговые пространства губчатого вещества были заполнены жировой и кроветворной тканью в равных соотношениях у всех лиц до 60 лет (п=22), незначительное увеличение в пределах лакун объема жировой ткани наблюдалось у лиц возрастной группы 6070 лет (п=8).

Среди адипоцитов располагались клетки трех линий миелопоэза на всех стадиях развития. Отмечался нормобластический тип эритропоэза. Клетки на стадии эритро-нормобластов располагались в центральных отделах костных лакун с наличием макрофагов среди скоплений указанных клеток. Зрелые гранулоциты были диффузно рассеяны среди адипозной ткани костномозговых лакун, незрелые формы обнаруживались эндостально. Мегакариоциты располагались разрозненно в межбалочных пространствах.

Ретикулиновый каркас костного мозга при импрегнации препаратов серебром был представлен отдельными тонкими небольшими нитями ретикулиновых волокон, ориентированных в разных направлениях и не имевших пересечений. Наряду с определением ретикулина были проведены ИГХ исследования коллагенов I, Ш и IV типа, так как они являются основными структурными белками эксграцеллюлярного матрикса, принимающими участие в морфогепезе. Во всех случаях костные трабекулы экспрессировали коллаген I типа, в 16 случаях наблюдалась выраженная экспрессия коллагена П1 типа, в основном в субэндосталышх участках и рядом с крупными сосудами, коллаген IV типа экспрессировали сосуды с хорошо выраженной базальной мембраной.

Один из элементов стромального микроокружения, образующих нишу стволовых клеток - микроциркуляторное русло (МЦР) - в костном мозге был представлен синусоидальными сосудами различного калибра и формы, а также сетью микрососудов шпрамедуллярных и эндостальных зон костномозговых пространств подвздошной кости. Была изучена плотность сосудов МЦР, так как этот существенный маркер ангиогенеза необходим для оценки состояния кроветворной ниши при малигнизации гемолимфопоэза. При ИГХ исследованиях сосудов интрамедуллярной паренхимы использовалась панель антител (CD34 class П, CD31, vWF). В контрольной группе удельная площадь микрососудов при применении указанной панели антител была следующей: CD34 class П - 9,1±1,2 %, CD31 - 10,4+1,4 %, vWF - 6,1±0,5 %.

Активный костный мозг подвздошной кости человека расположен в шпрамедуллярных пространствах губчатого вещества, сформированного костными трабекулами. При морфологическом исследовании трепанобиоптатов контрольной группы выявлялись анастомозирующие между собой костные балки правильной формы с ровными гладкими краями. ИГХ анализ костного матрикса с использованием антител к коллагену I типа выявил равномерное распределение белка по всей поверхности срезов костных трабекул подвздошной кости. Площадь трабекул губчатого вещества подвздошной кости здоровых лиц составляла 21,0±2,4%. Поверхность костных балок была покрыта сплошным слоем эндостальных

клеточных элементов, среди которых представлялось возможным выделить клетки двух типов. Первые характеризуются резко уплощенной и вытянутой формой, с удлиненными темными ядрами и тонкой полоской базофильпой цитоплазмы. Значительно реже наблюдались клетки второго типа — полигональной формы, с более заметной базофильной цитоплазмой и с круглыми, чаще всего эксцентрично расположенными ядрами. При морфометрическом исследовании количество эндосгальных клеток составило 1,4+0,2 клеток на единицу длины костных трабекул.

Как известно CD 146+ стромальные клетки участвуют в остеогенезе, их присутствие необходимо для становления гемопоэза. В исследованной контрольной группе CD 146+ клетки определялись непосредственно на эндостальной поверхности, субэндостально и периваскулярно рядом с сосудами МЦР. В процентном соотношении к площади гемопоэтической ткани количество CD 146+ не превышало 2,5+0,3%, при этом важно отметить тот факт, что в большинстве наблюдений вблизи CD 146+ клеток располагались CD34+ клетки и сосуды МЦР. Также было установлено, что состояние эндосгальных клеток в различных участках поверхности костных балок варьировало. Прежде всего, было выявлено, что состояние клеток эндосга зависело от присутствия в эндостальной зоне молодых гемопоэтических клеток гранулоцитарного ростка. В тех зонах, где отмечались признаки повышенной гемопоэтической активности, эндостальная зона отличалась увеличенным количеством стромальных клеток. Преимущественно в таких зонах выявлялись CD34+ клетки.

Таким образом, исследование подвздошной кости с применением современных гистологических методов, в том числе ИГХ, дает возможность проанализировать не только гистоархитектонику функциональной паренхимы костного мозга, но и детально оценить стромальные нишеобразующие элементы гемопоэтической ниши - систему микроциркуляцнии, а также клеточные и внеклеточные образования эндостальной зоны губчатой кости.

Паренхима и формирующие пишу стволовых клеток стромальные образования костного мозга при ХЛЛ

Анализ гистологических препаратов подвздошной кости 96 больных ХЛЛ свидетельствовал об изменении клеточного состава интрамедуллярной кроветворной паренхимы и указывал на структурные перестройки стромального микроокружения, включая образования, формирующие нишу для стволовых кроветворных клеток - сосуды МЦР и клеточные элементы, располагающиеся на поверхности костных трабекул, а также шлрамедуллярный экстрацеллюлярный матрикс эндосгальных зон.

На основании гистологических исследований губчатой кости больных ХЛЛ в паренхиме костного мозга было выделено три типа лимфоидной инфильтрации: нодулярный, интерспщиальный, диффузпый. Нодулярная инфильтрация отмечалась у 18 пациентов (18,8%), интерстициальная у 26 пациентов (27%), диффузная у 52 пациентов (54,2%).

Распределение типов инфильтрации костного мозга по стадиями Rai показано на рисунке 1. Так, 3-4 стадии характеризовались преобладанием случаев с диффузной инфильтрацией костного мозга, в то время как 0-1 стадии с преобладанием нодулярной инфильтрации. Интерстициальная инфильтрация отмечалась на всех стадиях Rai - в 3 случаях 0 стадии, в 7 случаях 1 стадии, 16 случаях 2 стадии, 10 случаях 3 стадии и 5 случаях 4 стадии.

- МДОЛЯрНаЛ S (.Чита рсТИИЖЛаМЗЯ К W'i-Yi'^'^

стадия О стадо 1 СТЗДЛЧ2 стадия 3 стадо 4

Рисунок 1. Распределение (в % соотношении) типов инфильтрации костного мозга больных ХЛЛ по стадиям Rai.

Морфологические признаки реакции сгромы костного мозга имелись при всех трех видах опухолевой инфильтрации костномозговой паренхимы. Однако были выражены неравнозначно в целом и относительно нишеобразующих элементов стромального микроокружения (таблица 1).

При выявлении в костномозговых пространствах губчатого вещества подвздошной кости нодулярных лимфоидных инфильтратов структурных перестроек элементов стромального микроокружения в кроветворной паренхиме вне зон инфильтрации обнаружено не было. Морфология МЦР русла, а также клеточных элементов эндоста и костных балок на светооптическом уровне в гистологических препаратах, окрашенных рутинными методами, не изменялась, наблюдалось незначительное увеличение числа сосудов в пределах опухолевых инфильтратов. Что касается зон поражения, при импрегнации серебром можно было отметить наличие стромальной реакции на патологический процесс в форме увеличения количества ретикулиновых нитей в месте расположения нодулярных инфильтратов. При этом в некоторых случаях отмечался очаговый ретикулиновый склероз.

При интерстициальном варианте опухолевой инфильтрации были заметны морфологические изменения организации элементов микроокружения. Стромапьная реакция заключалась в изменении ретикулинового каркаса паренхимы кроветворной ткани, в лакунах отчетливо определялось увеличение количества отдельно располагающихся фрагментов ретикулина, иногда формирующих мелкие сетчатые структуры. Одновременно увеличивалось количество волокон коллагена Ш типа в субэндостальных пространствах. Статистически достоверных количественных изменений клеток эндоста при данном поражении костного мозга, не выявлено, однако соотношение клеток с уплощенными и крупными ядрами изменяется в сторону увеличения количества последних. Достоверно увеличена плотность сосудов по сравнению с нормальным костным мозгом (таблица 1).

Отчетливо проявлялись изменения стромального микроокружения костного мозга, включая структуры, образующие васкулярную и остеобластную ниши стволовых клеток при исследовании трепанобиоптатов с диффузнььч поражением костного мозга при ХЛЛ. Наряду с изменением количества и структуры нишеобразующих элементов происходило усиление

ретикулинового рисунка вплоть до появления грубых ретикулиновых волокон, образующих пересечения с формированием ретикулинового фиброза.

Таблица 1.

Морфометрические показатели структур костного мозга подвздошной кости в зависимости от типа лимфоидной инфильтрации (М±ш)

Паренхима и строма костного мозга Здоровые лица п=30 Больные ХЛЛ

Нодуллрная инфильтрация п=18 Интерстициальная инфильтрация п=26 Диффузная инфильтрация п=52

Гемопоэтическая ткань (й том числе лимфоидиые пролнфераты) (площадь, %) 51,2±3,3 52.3±5,1 (15.7±7.5) 57,2±4,1 (25,0±6.2) 70,7±3.9» (51,15±6.92)

Жировая ткань (площадь, %) 28.Ш.0 27.5±0,7 23,8±3,8 13,0±4,2*

Костная ткань (площадь, %) 21.0±2.4 19,6±4,4 18.3±1,0 17.1±1.3

Сосуды МЦР (площадь, %) 9.Ш.2 12,3±2,5 13.Ш.2* 17,9±3,7*

Эндостальные клетки (кол-во на ед. пл.) 1,4±0,2 1.3±0.5 1.8±0,4 2.3±0,4*

Пр ол и ф ер атив ная активность 1а-67 (% в инфильтрате) Не измерялась 2.3±0.4 5,2±0,7* 9.5±1.б*

Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем;

+ - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с нодулярной инфильтрацией. Удельная площадь сосудов МЦР определялась нами с помощью ИГХ реакций с панелью антител - маркеров клеток эндотелия - СР34 с1. П, СОЭ1, фактор Фон Виллебранда 0\\Т) (таблица 2).

Таблица 2.

Результаты определения удельной площади сосудов по иммуногистохимическим исследованиям с маркерами эндотелия (М+т)

Маркер эндотелия Нодулярная инфильтрация (площадь, %) п=18 Интерстициальная инфильтрация (площадь, %) п=26 Диффузная инфильтрация (площадь, %) п=52 Контроль (площадь, %) п=30

СЭ34 с1. П 12,3+2,5 13,1±1,2* 17,9+3,7* 9,1+1,2

СБ31 11,1+2,7 12,1+3,4 20,1+4,2* 10,4+1,4

vWF 6,1±0,3 8,1+0,5 11,2+0,4* 6,1 ±0,5

Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

Данные ИГХ исследований со всеми антителами показали увеличение площади сосудов при диффузной инфильтрации по сравнению с контрольной группой, при сравнении удельной площади сосудов у пациентов с нодулярной и интерстициальной типами инфильтрации значения достоверно не отличались от контрольных, но тенденция увеличения удельной площади сосудов прослеживалась при окраске со всеми антителами. Нарастало количество микрососудов во всех отделах костномозговых пространств и. что особенно важно, в субэндостальных пространствах, также следует заметить, что в большинстве сосудов наблюдалось появление эндотелиоцитов с крупными, активными ядрами.

По результатам ИГХ исследований для дальнейших сравнений были выбраны значения удельной плотности сосудов, полученные с антителами СОЭ4 с1. П, так как этот маркер позволяет объективизировать оценку сосудов МЦР различной степени зрелости, включая популяцию незрелых эндотелиальных клеток, а также по данным статистического анализа они являются более достоверными (р < 0.03). Так было показано, что площадь сосудов при диффузной инфильтрации (17,9+3,7 %) возрастает почти в 2 раза по сравнению с контролем (9,1+1,2%), при интерстициальной инфильтрации увеличивается почти в 1,5 раза (13,1+1,2%), при нодулярной инфильтрации статистически значимых изменений не обнаружено (12,3+2,5%) (рис. 2).

Также определялась экспрессия 70-кс1 дзета-ассоциированного белка (2ар70) и оценивалась зависимость экспрессии этого белка от изменяющейся удельной площади сосудов МЦР костного мозга больных ХЛЛ. Экспрессия 7щЛ0 оценивалась в опухолевых клетках и характеризовалась как отрицательная (менее 20% экспрессирующих клеток), умеренная (2050%) и сильная (более 50%), внутренним положительным контролем служили Т-клетки. На рисунке 3 представлен график динамики показателей плотности микрососудов и уровня экспрессии 7ар70 больных ХЛЛ, была выявлена статистически значимая корреляция между этими показателями (11=0.7. р < 0,05. N=96).

Рисунок 2. Изменение удельной площади сосудов МЦР (% от площади гемопоэтической ткани) в группах пациентов по типам инфильтрации костного мозга (СГО4 cl.II) по сравнению с контролем.

Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия гар70 коррелирует с типом инфильтрации костного мозга: во всех случаях диффузной инфильтрации костного мозга (п=52) большинство лейкозных клеток были положительны (более 65%), в то время как при нодулярной инфильтрации (п=18) экспрессии в подавляющем большинстве случаев

о

ю Контроль

38 Интерсгациальнач нкфгитьтрашм я Диффузная иифгшырацня

обнаружено не было, интерстициальная инфильтрация костного мозга (п=26) отличалась переменной экспрессией гар70. Отмечались 6 случаев интерстициальной инфильтрации с отсутствием экспрессии (менее 15%), 4 случая с повышенной экспрессией (50-65%), 16

случаев с умеренной экспрессией (30-45%).

8-1-1-1-1-»-=-1-1-1-Н-»

9 18 27 36 45 54 63 72 81 х., к

Процент клеток экспрессирующих2ар70,%

Рисунок 3. Зависимость уровня экспрессии гар70 и площади сосудов МЦР у больных ХЛЛ. Примечание: наклонная линия тренда показывает зависимость исследуемых значений, 11=0,7, р < 0,05, N=96.

Нами также были проанализированы данные миелограммы и периферической крови пациентов с одновременным анализом характера поражения костного мозга на материале трепанобиоптатов. Соотношения между типами лимфоидной инфильтрации в костном мозге и параметрами периферической крови и миелограммы представлены в таблице 3. Изменений показателей выявлялись при всех типах поражения, однако в наибольшей степени бьищ выявлены при диффузном типе, при котором в периферической крови отмечалось более высокое содержание лейкоцитов (114,9+28,2* 109/л) и лимфоцитов (101,8+13,2*109/л), снижение^ уровня гемоглобина (87+5,7 г/л), а в миелограмме было увеличено количество лимфоцитог (82,1±3,3%) и миелокариоцитов (460,3±131,2*109/л).

Таблица 3.

Соотношения между типами лимфоидной инфильтрации костного мозга и лабораторными

данными (М+м)

Тип пролиферации Периферическая кровь Миелограмма

Гемоглобин, г/л Лейкоциты, 109/л Лимфоциты, % Лимфоциты, 109/л Лимфоциты, % Миелокарио циты, 109/л

Диффузный 87+5,7* 114,9+28,2* 88,6+2,6* 101,8+ 13,2* 82,1+3,3* 460,3+131,2*

Интерстици-альный 112+11,2 31,7+6,8* 85,2+2,5* 27,1±8,3* 62,9+5,4* 278,8+100,8*

Нодулярный 120+8,7 9,1+4,9 60,5+12,5 5,5+1,6 36,2+13,2 143,2+18,2

Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с нодулярной инфильтрацией.

Таким образом, учитывая, что анемия и лимфоцитоз являются неблагоприятным! прогностическими факторами заболевания, можно заключить, что нодулярная у

интерспщиальная инфильтрация свидетельствуют о более благоприятном течении ХЛЛ в сравнении с диффузным типом поражения костного мозга.

Исследование эндостальных зон показало статистически значимое увеличение количества клеток на эндосте при диффузной инфильтрации костного мозга - 2,3+0,4 ед/пл по сравнению с контролем 1,4±0,2 ед/пл (таблица 1). Одновременно с увеличением числа эндостальных клеток сгромы, изменялась структурная организация ядер. В выстилающих поверхность костных балок клетках доля клеточных элементов с вытянутыми уплощенными формами ядер уменьшалась, наблюдалось нарастание в эндостальных и субэндостальных зонах стромальных клеток с крупными просветвленными ядрами. Экспрессия молекулы СБ 146, которая маркирует стромальные клетки эндостальных и периваскулярных зон при диффузной инфильтрации, также увеличена и присутствовала практически повсеместно в субэндостальных зонах (10,2±1,3% от гемопоэтической ткани).

Иммуногистохимическое определение коллагеновых волокон не показало достоверных отличий между типами инфильтрации костного мозга. Тем не менее, тенденция к изменению распределения экспрессии коллагена разных типов присутствует и можно говорить о том, что эта проблема требует более подробного рассмотрения. Так, нарастает количество коллагеновых волокон III типа в эксграцеллюлярном матриксе у пациентов с ХЛЛ по сравнению с контролем, что отмечено в 28 случаях из 52 при диффузной инфильтрации, и в 9 случаях из 26 при интерспщиалыгой инфильтрации костного мозга.

Таким образом, у больных ХЛЛ в костном мозге наблюдаются различные варианты опухолевой инфильтрации - нодулярный, интерстициальный, диффузный. Наряду с изменениями интрамедуллярной паренхимы развитие ХЛЛ сопровождается структурными перестройками стромальных образований формирующих гемопоэтическую нишу. Нарушения МЦР проявляются ростом числа микрососудов, приводящим к увеличению их плотности в миелоидной ткани. При этом рост числа сосудов также затрагивает эндостальные зоны губчатого вещества подвздошной кости. Одновременно с перестройкой МЦР происходит увеличение количества эндостальных стромальных клеток, включая СШ46+, и наблюдается тенденция к изменению эксграцеллюлярного матрикса эндостальных и периваскулярных зон, что подтверждается ИГХ исследованиями коллагена Ш и IV типов. Очевидно, что дефекты структур формирующих гемопоэтическую нишу могут бьггь значимым патогенетическим фактором неопластической трансформации В-лимфоцитов и в таких условиях функция ниши может быть направлена на поддержание лейкозного клона.

Гистоморфологическая характеристика стромального компонента в лимфатических узлах при немалигнизированных реактивных лимфадепопатиях

При гистологическом исследовании материала контрольной группы во всех наблюдениях сохранялась структура строения лимфатических узлов. В гистологических препаратах различалась капсула, кортикальная зона, лимфоидные фолликулы в большинстве случаев с наличием светлых реактивных центров, паракортикальная зона, мозговые тяжи, лимфатические синусы, сосудистая сеть.

Капсула исследованных лимфатических узлов была представлена плотными коллагеновымн волокнами с наличием небольшого числа фиброцитов, гладкомышечных

волокон. При ИГХ исследовании в капсуле выявлялся коллаген Ш, IV типов, десмин, местами определялось позитивное окрашивание на ламинин. Инфшштративные процессы отсутствовали. Внутрь паренхимы от капсулы распространялись соединительнотканные трабекулы, содержащие сосуды. При ИГХ исследованиях в трабекулах также наблюдалась экспрессия десмина, коллагена Ш, IV типов. Кортикальная зона в изученных препаратах была расширена, содержала различной величины лимфоидные фолликулы, чаще с центрами размножения.

Фолликулы содержали центробласты, центрощпы, макрофаги, выявленные при ИГХ исследованиях ФДК. Имелись митозы, четкая зона мантии. Паракортикальная зона содержала лимфоциты малых и крупных размеров, гистиоциты. Синусы лимфатических узлов имели обычную структуру, признаков синусового гистиоцитоза обнаружено не было. ИГХ исследования с панелью антител CD21, CD23, Anti-FDC CNA.42, Anti-fascin, CD35 показали наличие ФДК в специфичных для них местах - первичных и вторичных фолликулах лимфатических узлов. При окраске с антителами Anti-fascin помимо ФДК в фолликулах, были выявлены шггердигитальные ретикулярные клетки в Т-зависимой зоне. Морфология дендритных клеток не была изменена. По данным морфометрии ФДК занимают около 23 % от площади лимфатических узлов.

При гистоморфологическом исследовании кровеносные сосуды были представлены сосудами МЦР, крупными сосудами, венулами с высоким эндотелием. Фолликулы были менее васкуляризированы, чем перифолликулярная область и мозговое вещество. ИГХ выявление сосудов и синусов лимфатических узлов проводилось с использованием моноклональных антител CD34 class II, CD31, vWF. Наибольшее количество сосудов определялось в паракортикальной зоне, единичные в фолликулах (таблица 4). ИГХ исследования с антителами к коллагену IV типа и ламинину выявляли каркас синусов лимфоузлов и крупные сосуды с базальной мембраной.

Таблица 4.

Результаты определения плотности сосудов в лимфатических узлах (М±т)

Маркер эндотелия Больные ХЛЛ (площадь, %) п=61 Контроль (площадь, %) п=20

CD34 cl. Il 12,8+0,3* 6,5±0,5

CD31 18,3±0,7* 10±0,8

vWF 15±0,3* 8±0,2

Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

Особенности структурной организации стромы лимфатических узлов при ХЛЛ При морфологическом исследовании биоптатов лимфоузлов больных ХЛЛ во всех случаях отмечались нарушение гистоархитектоники компонентов лимфоидной ткани. Диффузная инфильтрация лимфоцитами наблюдалась во всех случаях, в 18 случаях в лимфоидной ткани определялись так называемый псевдофолликулярный тип роста - участки,

которые представляли собой обычные зоны опухолевых разрастаний, окрашивающиеся в более светлые тона на более интенсивно окрашепном фоне.

Импрегнация серебром гистологических препаратов лимфатических узлов показала деструктивные изменения ретикулиновой сети лимфоидной ткани, причем в двух противоположных направлениях - дезорганизация ретикулиновых волокон с уменьшением их количества относительно площади лимфоидной ткани наблюдалась в 47 случаях (77%). второй тип - образование более грубой сети с очагами ретикулинового склероза в 14 случаях (23%).

При анализе гистологических препаратов, окрашенных рутинными методами гематоксилин-эозином и азур-И-эозином, небольшое количество ФДК определялось в единичных случаях (п=3) в псевдофолликулах. ИГХ определение ФДК с панелью антител выявило интересные факты. Стоит отметить, что маркеры CD21 и CD23 при данном варианте лимфопролиферативного заболевания присутствуют на опухолевых клетках и являются диагностически значимыми при постановке диагноза ХЛЛ. Так при ХЛЛ CD23 экспрессируется во всех случаях более чем на 50% клеток (таблица 5). CD21 во многих случаях экспрессировапся умеренно - в 32 случаях (53%) позитивны менее 25 % клеток, в оставшихся наблюдениях (п=29) экспрессия наблюдалась в 30-35% опухолевых клеток. Умеренная экспрессия CD35 обнаружена в 23 случаях (38%). Маркеры CNA.42 и фасцин показали незначительное количество разрозненно лежащих клеток, без образования сетчатой структуры, при этом следует отметить, что фасцин маркирует и шггердигитальные ДК. В 3 случаях ХЛЛ при ИГХ исследовании были выявлены ФДК, образующие сеть, в псевдофолликулах. Представленные результаты свидетельствуют о дезорганизации сети ФДК при ХЛЛ (таблица 5). Вероятно, происходит также и изменение их фенотипа под влиянием опухолевой прогрессии, так как маркеры ФДК, которые не экспрессируются одновременно опухолевыми клетками, практически отсутствуют.

Экспрессия прогностического маркера Zap70 (более 50%) определялась в 35 случаях (57%), в 10 случаях экспрессия отсутствовала (16%), в остальных наблюдениях отмечалась умеренная экспрессия (п=16,26%).

При рутинных окрасках было отмечено увеличение количества сосудов, при этом венулы с высоким эндотелием определялись значительно реже, чем в контрольной группе. ИГХ определение сосудов проводилось с использованием моноклональных антител Dako CD34 cl. II, CD 31, vWF, anti-laminin, anti-collagen IV типа. Исследования показали, что на фоне инфильтрации лимфоузлов зрелыми лимфоцитами обнаруживалось увеличение количества мелких сосудов, а также сосудов с выбухающими в просвет эндотелиоцитами с крупными ядрами, хорошо очерченными ядрышками и фибробласгоподобными клетками по периферии сосудов. Структура эндотелиоцитов указанных сосудов была характерна для клеток с высокой функциональной активностью. Морфометрические измерения с помощью программы ВидеоТест показали, что площадь сосудов МЦР составила 12,8+0,3% при ХЛЛ по сравнению с 6,5±0,5% в контрольной группе (таблица 5). ИГХ с антителами к ламинину и коллагену IV типа выявила прерывистую или отсутствующую базальную мембрану у большинства сосудов (таблица 5).

Таблица 5.

Экспрессия маркеров нишеобразующих структур лимфатических узлов (М+м)

Нкшсобразующие структуры лимфатического узла, % площадь Группа сравнения (лимфадениты) п=20 Больные ХЛЛ п=£1

Сосуды СР34 с1. II 6.5±0,5 12,8±0.3*

С023 23±3,1 79,8±4.2*

С021 19.3±1.2 24.7±2.2 (п=42)

СИА.42 17.5±1,6 7,3±1.8*

Фасцин 35,7±2,4 1Э.З±1,6-

СЭ35 28,3±2,3 11,1±3,6*

2ар70 18,2±2,1 (Г-клепси) 72,4±8,2 (35 случаев) ж 24.3±2,7 (26 случаев)

Коллаген IV 5,1±0,3 9,5±2,1*

Коллаген Ш 3.1±0,5 2,7±0,8

Лампнин 3.2±0,4 1,5±0.3*

Десыин 1,2±0.2 0.8±0,2

Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

Экстрацеллюлярный матрикс лимфатических узлов также претерпевает изменения, но не все они являются статистически достоверными. Так отмечается незначительное сокращение десмина, коллагена Ш типа в трабекулах и в паренхиме лимфатического узла. Достоверно показано сокращение количества коллагена IV типа и ламинина (таблица 5).

Представленные нами данные свидетельствуют о значительных перестройках в структурной организации лимфатических узлов при ХЛЛ, которые затрагивают как паренхиматозный, так и стромальный компонент. Во всех случаях гистоархитектоника лимфоидной ткани у больных ХЛЛ изменялась при появлении клона лейкозных клеток. При этом отчетливо регистрировались изменения ключевых нишеобразующих стромальных стр5тстур - ФДК, сосудов МЦР и экстрацеллюлярного матрикса.

В группу сочетанного анализа вошли 45 пациентов (28 мужчин и 17 женщин, средний возраст группы 59,9±7,7 лет, медиана 60), от которых были получены фрагменты подвздошной кости н биоптаты лимфатических узлов. Особенности гистоморфологических характеристик нишеобразующих структур показаны в таблице 6. Нодулярный тип инфильтрации костного мозга представлен в 8 случаях (17,8%), интерстициальный тип в 18 (40%) и диффузный в 19 (42,2%) случаях поражения костного мозга. Общая тенденция такова, что при диффузной инфильтрации костного мозга и существенных изменениях нишеобразующих структур (площадь сосудов МЦР, количество клеток на эндосте, ретикулиновые отложения, изменения экспрессии коллагенов и СО 146 в клетках субэндосгальной зоны) в лимфатических узлах определяется увеличение экспрессии гар70, усиление сосудистого компонента в лимфоидной паренхиме и сокращение сети ФДК (результаты по ИГХ реакциям с антителом к фасцину).

Таблица 6.

Особенности нишеобразующих структур костного мозга и лимфатических узлов у пациентов из группы сочетанного анализа (М±ш)

Вариант инфильтрация хоствого мозга

Нодудярныя Ннтерспщмльный Диффузный

Костный мозг Лимфатический узел Костный М02Г Лимфатический узел Костный мозг Дныфатнчеажй узел

Нишеобразующие структуры

МЦР Клетхн эндосга МЦР ФДК (Фас пин) МЦР Клетхн эндоста МЦР ФДК (Фасцнн) МЦР Клетки эндоста МЦР ФДК (Фаалга)

10,2*1,3 1.5*0,3 8,7 32,7=3.6 133*1,1 п>и 25,6*2,3 18,2±3,5* 2,8±0,5* 14.7± 1,6* 21,3*1,6*

Примечание: * - р < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем.

Полученные нами результаты подтверждают существующее положение о роли дефектов ниши в злокачественной трансформации ГСК и освещают некоторые особенности патогенеза ХЛЛ, в частности дают представление о морфофункциональных перестройках стромальных нишеобразующих элементов костного мозга и лимфатических узлов, имеющих существенное значение в процессе малигнизации лимфоидных клеток-предшественниц при этом заболевании. Нарушения состояния нишеобразующих элементов стромы могут приводить к изменению сигнальных путей регуляции пролиферации и дифференцировки нормальных лимфоидных предшественников. В связи с этим снижается противоопухолевый потенциал лимфоидной ткани и создаются условия для неопластической прогрессии.

Обобщая современные сведения и учитывая собственные данные о состоянии стромы костного мозга при малигнизированном гемопоэзе, считаем возможным дополнить существующие гипотезы лейкозогенеза собственным представлением об этом процессе, а именно, роли в его становлении дефектов стромальной ниши стволовых клеток (рис. 4).

Наши данные о состоянии эндоста при малигнизированном кроветворении свидетельствуют о резко выраженных изменениях структур, формирующих нишу стволовой клетки. Вне зависимости от характера их генеза - вторичного или первичного, они в любом случае приводят к нарушениям развития стволовой клетки. Так, в первом случае возникший и развивающийся лейкозный клон кроветворных клеток способен привести первоначально к функциональным, а затем структурным изменениям стромального микроокружения, формирующего гемопоэтическую нишу. Основным итогом этого является нарушение регуляции нормального гемопоэза, что создает благоприятные условия для прогрессии лейкоза. Наряду с этим, возможен второй путь, при котором происходит первичное поражение стромальных элементов кроветворной ниши. Это приводит к извращению генетической программы нормальной пролиферашш и дифференцировки стволовых клеток гемолимфопоэза, результатом чего является становление дисмиелопоэза с последующим появлением лейкозного клона.

Таким образом, представленные в работе данные об изменении структурной организации стромальных нишеформирующих образований костного мозга и лимфатических узлов указывает на важную роль дефектов кроветворной и лимфоидной ниш в становлении и развитии ХЛЛ. В условиях малигнизации миелоидных и лимфоидных предшественников характер перестроек нишеобразующих структур костного мозга и лимфоидной ткани имеет важное значение для установления причин развития системных заболеваний крови, определении тактики лечения, оценке его эффективности и прогнозировании возможных путей развития системных заболеваний кроветворной и лимфоидной ткани.

Рисунок 4. Концепция роли дефектов нишеобразующих элементов кроветворной и лимфоидной сгромы в малигнизированном миелолимфопоэзе.

ВЫВОДЫ

1. У больных хроническим лимфолейкозом, независимо от характера инфильтрации лимфоцитами паренхимы костного мозга - нодулярного, интерстициального или диффузного, наблюдаются морфофункциональные изменения структур стромального микроокружения, формирующих нишу гемопоэтических стволовых клеток.

2. Характерной особенностью развития ХЛЛ является достоверное увеличение количества эндостальных стромальных клеток интрамедуллярных пространств, включая С0146+ клетки, (р < 0.05) и перестройки структурной организации клеточных и внеклеточны. элементов сгромы поверхности костных трабекул, являющихся анатомическими зонам:: локализации и длительного самоподдержания стволовых клеток.

3. При опухолевой лимфоидной инфильтрации в костном мозге больных ХЛЛ выявлено достоверное усиление плотности микрососудов костных лакун подвздошной кости, включая эндостальные участки, при этом наиболее выраженные изменения отмечались при диффузное поражении кроветворной ткани (в 2 раза).

4. Установлена корреляция между прогностическим фактором - экспрессией молекулы Zap70 на опухолевых клетках и плотностью микрососудов на материале трепанобиоптатов больных ХЛЛ (R=0,7, р < 0,05), что свидетельствует о неблагоприятном типе течения заболевания при увеличении плотности сосудов в паренхиме костного мозга.

5. В лимфатических узлах больных ХЛЛ обнаруживаются нарушения структурной организации паренхиматозной и стромальной ткани, наблюдаются качественные и количественные изменения ключевых элемептов лимфоидной стромы, участвующих в поддержании лимфопоэза, а также перестройка экстрацеллюлярного матрихса.

6. Характерными особенностями опухолевой инфильтрации лимфатических узлов при ХЛЛ является дезинтеграция сети фолликулярных дендритных клеток, изменение их фенотипа и снижение количества в 3 раза (р < 0,05), увеличение плотности микрососудов в 2 раза (р < 0,05) н изменение экстрацеллюлярного матрикса лимфоидной ткани (распределение коллагенов III, IV типов, десмина, ламинина).

7. Установленные качественные и количественные изменения стромальиых нишеобразующих структур костного мозга и лимфатических узлов указывают на вовлечение кроветворной и лимфоидной ниш в генез неопластической трансформации лимфоидных предшественников у больных ХЛЛ и свидетельствуют о перестройке функций микроокружения, направленных на поддержание лейкозного клона при этом заболевании.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При установлении диагноза ХЛЛ рекомендован анализ состояния кроветворной ткани больных ХЛЛ на материале трепанобиопсий подвздошной кости. Необходимо оценивать характер лимфоидной ипфильтрации (нодулярный, интерстициальный, диффузный) и пролиферативный потенциал опухолевых клеток.

2. Наряду с выделением типов опухолевой инфильтрации необходимо изучение гисгоморфологических особенностей нишеобразующих структур костного мозга, таких как плотность сосудов микроциркуляторного русла, количество клеток на эндосте и их фенотип, распределение коллагенов I, Ш, IV типа. Помимо стандартных гистологических окрасок для более точного анализа этих структур целесообразно проводить иммуногисгохимическое исследование с антителами CD34 cl.n, CD146, collagen I, collagen Ш, collagen IV.

3. При изучении биоптатов лимфатических узлов у больных ХЛЛ для дифференциальной диагностики следует проводить 1Шмуно гистохимические исследования как для установления фенотипа опухолевых клеток (CD3, CD5, CD10, CD20, CD23, CD79a, Cyclin Dl, Вс12, Вс16, ki-67), так и для характеристики состояния фолликулярных дендритных клеток (CD35, Anti-fascin, Anti-FDC CNA.42). ангиогенеза (CD31. CD34 с1.П) и измерения уровня экспрессии белка Zap70.

4. Сочетанный гистоморфологический анализ стромальных структур кроветворной и лимфоидной ниш может быть использован в практической работе в целях уточнения прогноза течения заболевания и для оценки эффективности проводимой терапии при повторных исследованиях костного мозга и лимфатических узлов в динамике заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семенова, Н.Ю. Иммунная гистохимия при изучении ниши гемопоэтических стволовых клеток / Н.Ю. Семенова // Вестник гематологии. - 2011. - Т. VII, №1. - С. 41.

2. Ругаль, В.И. Состояние интрамедуллярной стромы больных неходжкинскими лимфомами с поражением костного мозга / В.И. Ругаль, Н.Ю. Семенова, С.С. Бессмельцев // Вестник гематологии. - 2011. - Т. VII, №2. - С. 36-37.

3. Семенова, Н.Ю. Морфофункциональные особенности стромы лимфатических узлов при ХЛЛ / Н.Ю. Семенова, В.И. Ругаль // Вестник гематологии. - 2011. - Т. VII, №4. - С. 45-46.

4. Semenova, N. Stromal microenvironment lymph nodes in CLL / N. Semenova, S. Bessmeltsev, V. Rugal //Haematologica. - 2012. - V.97(sl). - P. 521.

5. Семенова, Н.Ю. Особенности стромы лимфатических узлов при хроническом лимфолейкозе / Н.Ю. Семенова // Вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - 2012.

- С. 96-98.

6. Семенова, Н.Ю. Иммуногистохимические исследования стромы лимфатических узлов при ХЛЛ / Н.Ю. Семенова // Вестник гематологии. - 2012. - Т. VIII, №4. - С. 33.

7. Семенова, Н.Ю. Стромальное микроокружение лимфатических узлов при ХЛЛ / Н.Ю. Семенова, В.И. Ругаль // Российский биомедицннский журнал Medline.ru. - 2012. - Т. 13. - С. 524-537. [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.mcdline.ru/public/art/toml3/art42.html.

8. Ругаль, В.И. Особенности нишеобразующих структур и стромы костного мозга больных хроническим лнмфоцитарным лейкозом / В.И. Ругаль, С.С. Бессмельцев, Н.Ю. Семенова // Российский биомедицииский журнал Medline.ru. - 2013. - Т.14. - С. 347-361. [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.medline.ru/public/art/toml4/art31.html.

9. Семенова, Н.Ю. Роль стромы лимфоидной ткани при нормальном и малигнизированном лимфопоэзе / Н.Ю. Семенова, Г.С. Хорошавина// Успехи современного естествознания. - 2013.

- № 9 . - С. 86-88.

10. Семенова Н.Ю. Гистологическая и иммуногистохимическая характеристика стромы лимфатических узлов у больных с впервые выявленным хроническим лимфолейкозом и реактивной гиперплазией лимфатических узлов / Н.Ю. Семенова // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии». - СПб, 2013.

11. Бессмельцев, С.С. Лимфоидное микроокружение при хроническом лимфоцитарном лейкозе / С.С. Бессмельцев, Н.Ю. Семенова, В.И. Ругаль // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 5. [Электронный ресурс] - Режим доступа: http: www.science-education.ru/lll-10318.

12. Семенова, Н.Ю. Нишеформирующие структуры костного мозга при хроническом лимфолейкозе / Н.Ю. Семенова // Современная медицина: актуальные вопросы. - 2014. - №27. -С. 74-78.

13. Семенова, Н.Ю. Метод иммуногистохимии в оценке состояния паренхимы и стромы костного мозга и лимфатических узлов при хроническом лимфолейкозе / Н.Ю. Семенова, С.С. Бессмельцев, М.М. Багомедов и др. // Вестник гематологии. - 2014. - Т. X, №1. - С. 85-86.

14. Семенова, Н.Ю. Нишеобразующие элементы стромы костного мозга и лимфатических узлов при ХЛЛ / Н.Ю. Семенова, С.С. Бессмельцев, В.И. Ругаль И Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т. 59, №1 (1). - С. 62-63.

15. Ругаль, В.И. Актуальные вопросы медицинских морфологических дисциплин. Глава 3. Морфология синусоидальных сосудов гемопоэтической ниши костного мозга / В.И. Ругаль, Н.Ю. Семенова // Коллективная монография. Под ред. В.П. Волкова. Новосибирск: Изд. «СибАК», 2014. - С. 62-80.

16. Semenova, N. Nicheforming stromal elements of bone marrow and lymph nodes in CLL / N. Semenova, S. Bessmeltsev, V. Rugal II Haematologica. - 2014. - Vol. 99 (si). - abstr. EH Al 9ABSSUB-4212.

17. Ругаль, В.И. Нишеобразующие структуры стромы костного мозга и лимфатических узлов при хроническом лимфолейкозе / В.И. Ругаль, Н.Ю. Семенова, C.B. Волошин, С.С. Бессмельцев // Гены и клетки. - 2014. - T. К, №2. - С. 30-32.

18. Вартанян, НЛ. Мезенхимальпые стромальные клетки при апластичсской анемии, гемобластозах и негематологических опухолях / НЛ. Вартанян, С.С. Бессмельцев, Н.Ю. Семенова, В.И. Ругаль // Бюллетень СО РАМН. - 2014. - Т. 34, №6. - С. 17-26.

19. Семенова, Н.Ю. Биология ниши гемопоэтических клеток / Н.Ю. Семенова, С.С. Бессмельцев, В.И. Ругаль // Клиническая онкогематология. - 2014. - Т.7, №4. - С. 501-510.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГСК - гемопоэтическая стволовая клетки

ДК - дендритная клетка

ИГХ - иммуногистохимия

КМ - костный мозг

МЦР - микроциркуляторное русло

ФДК - фолликулярная дендритная клетка

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз

Подписано в печать 27.01.15. г. Формат А5, Усл. печ. л. 1,0 цифровая печать. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ЦОП «Сенная площадь» Россия, г. Санкт-Петерб>рг, ул. Садовая, 40 тел/факс: 438 38 07 e-mail: serrczcopy.spb.ru