Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Исследование фибробластных клеток костного мозга у больных с заболеваниями системы крови

На правах рукописи

О

° ЗАРИЦКИЙ

' АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИБРОБЛАСТНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯМИ СИСТЕМЫ КРОВИ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Санкт-Петербургском медицинском университете имени академика И.П. Павлова

Научный консультант:

академик РАМН доктор медицинских наук профессор Алмазов ВА. Официальные оппоненты:

Заслужены» деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор Мазуров В.И. доктор медицинских наук профессор Абдулкадыров К.М. доктор медЕцинских наук профессор Пожарисский К.М.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт детской гематологии Митдравмедлрома РФ

Защита состоится июня 1996 г. в часов на заседании диссертационного

совета (шифр Д 084.19.01) при Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии (г. Санкт-Петербург, улица 2-я Советская, дом 16, конференц-зал)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан "

23»

мая 1996 г.

Ученый секретарь диссертациоцпого совета

В.С. Быков

АКТУАЛЬНОСТЬ

В начале XX века великий гистолог А.А. Максимов высказал предположение о роли стромальных клеток в регуляции гемопоэза в кроветворных органах. Спустя много лет это было подтверждено экспериментальными исследованиями других авторов.

Оказалось, что стромальные клетки костного мозга отвечают за объем развивающейся кроветворной ткани, при гетеротошшй трансплантации обеспечивают построение гемопоэтического органа, морфофункционально не отличающегося от донорского (Фриденштейн А.Е., Лурия Е.А., 1980, Чертков ИЛ., Гуревич О.А., 1984.), a in vitro способны длительно поддерживать кроветворение (Dexter Т.М. et al., 1977). Популяция стромальных фибробластов также обладает остеогетшми свойствами (Gronthos etal., 1995) Основными клетками, ответственными за эти процессы, и гистогеиетически не связанными с гемопоэтическими, являются, видимо, костномозговые фибробласты (Waller Т.К. et al., 1995). Регулирующая роль клеток стромы и стромальных фибробластов, вероятно, связана с их способностью продуцировать факторы пролиферации гемопоэтических клеток (Broudy J. et al., 1986, Lee M. et al., 1987, Naparstek E. et al., 1985, Nemunaitis J. et al., 1989, Zucali J. et al., 1986), в том числе фактор стволовых клеток, обеспечивающий самоподцержание ранних клеток-предшественников (Zsebo К.М., et al., 1990, Brandt I. et al., 1992). Однако, согласно последним данным фактор стволовых клеток (stem cell factor, C-kit Iigand) может и не иметь принципиального значения для самоподдержания стволовых клеток человека (Sutherland H. et al., 1993).

Другими факторами, выделяемыми стромалышми костномозговыми фибробластами и способными регулировать рашше этапы гемопоэза, являются 1111, фактор дифференцировки лейкемических клеток ( Go! пег G. et. al., 1995), flk/flt- лиганд (Hudak S., 1995), рестрикгины (Zipori D., 1995).

Не исключается и возможность нейрогуморальной регуляции гемопоэза, опосредованной через клетки стромы костного мозга (Rameshwar A. et al., 1995). Несмотря на большие успехи в области экспериментальной гематологии, сравнительно немного исследований было посвящено количественной оценке фибробластов и стромальных клеток костного мозга, их свойств при онкогематологических заболеваниях человека. При этом не удалось выявить существенных различий в содержании фибробластных клеток-предшественников при различных заболеваниях. Открытым остается вопрос о способности

з

фибробластов и стромальных клеток костного мозга оказывать стимулирующее или иншбирующее влияние на пролиферативную активность грануломоноцитарных клеток-предшественников. Не ясна клиническая значимость исследования колониеобразующей спобности фибробластных клеток-предшественников (КОСф) и биологической активности их потомков.

Между тем, дальнейший успех терапии злокачественных новообразований возможен лишь при понимании всех механизмов опухолевого роста (Напалков Н.П. и др., 1989).

В связи с этим актуальным представляется исследование фибробластных клеток-предшественников и биологической активности их потомков у больных онкогематологическими заболеваниями.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оцепить роль клеток стромы костного мозга в регуляции пролиферативпой активности гемопоэтических клеток и их предшественников и механизмы регулирующих воздействий у здоровых лиц и больных с заболеваниями системы крови.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать колопиеобразующую способность фибробластных клеток-предшественников у больных с различными заболеваниями системы крови.

2. Выявить способность фибробластов костного мозга секретировать гуморальные факторы, стимулирующие или ингибирующие пролиферативную активность гемопоэтических клеток-предшественников.

3. Оценить вклад фибробластных клеток в создание кроветворного микроокружения у здоровых лиц и больных с заболеваниями системы крови.

4. Оценить роль тромбоцитов в рефляции пролиферации фибробластных клеток костного мозга.

5. Оценить ролль моноцитов в регуляции пролиферации фибробластных клеток костного мозга.

6. Выявить клиническую значимость теста фибробластнош колониеобразования у больных с различными заболеваниями системы крови.

7. Разработать комплексный метод для одновременной оценки

стромалыюго и гемопоэтического компонентов костного мозга.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Гематологические заболевания и лимфомы характеризуются изменением как количественных (колониеобразующая способность), так и качественных (способность влиять на пролиферативную активность гемопоэтических клеток) свойств клеток стромы костного мозга.

2. Оценка фибробластного колониеобразования имеет прогностическое значение при таких заболеваниях, как хронический миелолейкоз и острый лейкоз (прогнозирование развития властного криза, ответа на химиотерапию).

3. Цитостатическая терапия при гематологических заболеваниях оказывает влияние на количественные, качественные, в том числе генетические, свойства клеток стромы костного мозга.

4. Существует положительная корреляция между количеством ядерных клеток костного мозга и фибробластной колониеобразующей способностью, а также содержанием стромальных клеток, участвующих в создании гетеротопного очага кроветворения.

5. Фибробласты костного мозга обладают способностью регулировать пролиферацию гемопоэтических клеток, оказывая стимулирующее и ингибирующее влияние а полутвердой и жидкой среде, при этом характер влияния модулируется клетками системы мононуклеарных фагоцитов.

6. Гемопоэтические клетки (моноциты, тромбоциты) влияют на пролиферативную активность фибробластов костного мозга, а также на их способность поддерживать гемопоэз in vivo.

7. Клетки стромы и гемопоэтические клетки ассоциированы in vivo, что при культивировании в системе плазменного сгустка проявляется образованием смешанных колоний, состоящих как из стромальных, так и гемопоэтических клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Установлено, что содержание фибробластных клеток-предшественников широко варьирует в костном мозге при различных заболеваниях, сопровождающихся нарушением дифференцировки гемопоэтических клеток системы крови. При этом выявлен ряд коррелятивных связей между КОСф и гематологическими показателями, а также клиническим течением заболевания.

Показано, что заболевания, протекающие с редукцией гемопоэза, характеризуются низкой КОСф. Напротив, у больных с гиперплазией костного мозга с ненарушенной дифферендировкой гемопоэтических клеток (В 12- и фолиеводефицитная анемия, хронический миелолейкоз) наблюдается повышение КОСф.

При заболеваниях, связанных с нарушенной дифферендировкой гемопоэтических клеток (острые лейкозы, гемопоэтические дисплазии), КОСф варьирует в широких пределах. Фибробластные клетки могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее влияние на грануломоноцитопоэз. При этом конечный эффект зависит от кооперации с гемопоэтическими клетками (моноциты). В свою очередь, гемопоэтические клетки могут непосредственно влиять на функциональные и количественные свойства клеток стромы костного мозга. Так, тромбоцит-арный лизат не только стимулирует пролиферативную активность фибробластных клеток, но и способствует увеличению фибробластного колониеобразования. Ингибиция функциональной способности тромбоцитов в эксперименте уменьшает пролиферативную активность клеток стромы. Моноциты и макрофаги в определенных условиях ингибируют пролиферативную активность фибробластов и стромальных клеток. Функциональная взаимосвязь гемопоэтических клеток и клеток стромы обусловлена наличием в организме ассоциации этих клеток.

Выявлено существенное влияние цитостатической терапии на популяцию фибробластов. Оно проявляется как в изменениях их функциональных свойств (изменение фибробластного колониеобразования и способности стромальных клеток стимулировать грануломоноцитопоэз в жидкой среде), так и в появлении хромосомных поломок.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработанный метод культивирования костного мозга позволяет одновременно оценивать пролиферативную активность гемопоэтических и стромальных клеток в полутвердой среде, изучать взаимосвязи между гемопоэтическими и стромальными клетками.

Тест фибробластного колониеобразования имеет практическое значение в оценке прогноза течения ряда заболеваний системы крови. Снижение фибробластного колониеобразования происходит задолго до явных клинико-лабораторных проявлений бластного криза у больных хроническим миелолейкозом. Более того, величина фибробластного колониеобразования является прогностическим тестом развития бластного криза у больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе заболевания. У больных острым лейкозом результаты фибробластного колониеобразования связаны с клиническим течением заболевания. У больных острым лимфобластным лейкозом высокое фибробластное колониеобразование сопряжено с достижением ремиссии. Цитостатическая терапия оказывает влияние на количественные, функциональные и генетические свойства клеток стромы костного мозга. Так, химиотерапия существенно изменяет фибробластное колониеобразование, способность клеток стромы влиять на пролиферацию гемопоэтических клеток. У определенной группы больных с нелимфогранулсматозными лимфомами в периоде постцитостатической цитопепии клетки стромы существенно увеличивают продукцию факторов, стимулирующих грануло-моноцитопоэз, способствуя этим восстановлению гемопоэза.

У ряда больных острым лейкозом химиотерапия приводит к восстановлению фибробластного колониеобразования, что обеспечивает нормальные кооперативные взаимодействия между стромальными и гемопоэтическими клетками. Эти данные необходимо учитывать при планировании химиотерапии и оценке ее эффективности.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация написана на русском языке, состоит из введения, 10 глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованных литературных источников / отечественных и

иностранных /. Работа изложена на337страницах машинописи, содержит 46 таблиц I и 21 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы положены результаты исследований фибробластных и стромальных клеток костного мозга у взрослых больных с различными, преимущественно онкогематологическими, заболеваниями системы крови, находившихся под наблюдением Санкт-Петербургского медицинского университета им. академика И.П.Павлова, и межрайонного гематологического кабинета N 2 с 1978 по 1991 год. В исследование включены следующие больные: - острый лейкоз (ОЛ)- 101 больной;

- хронический миелолейкоз (ХМЛ)- 79 больных;

- хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ)- 34 больных;

- гемопоэтическая дисплазия (ГД)- 51 больной;

- нейтропенические состояния, не связанные с онкологическими заболеваниями, включая пшопластическую анемию, агранулоцитоз, В|2- и фолиеводефицитную анемию, гиперспленизм - 44 больных. Контрольную группу составили 85 пациентов с выздоровлением от неопухлевых заболеваний системы крови ( В12- и фолиеводефицитная анемия, железодефицитная анемия), больные коллагенозами, опухолями без метастазов в костный мозг. У многих больных исследования проводились в динамике.

ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основой лабораторных методов явилось культивирование гемопоэтических клеток костного мозга в различных системах, а также оценка биологической активности сред, кондиционированных стромальными клетками костного мозга. Определение колониеобразующей способности фибробластов костного мозга оценивалось по методике, разработанной проф. АЛ. Фриденштейном /1974/, колониеобразование оценивалось в инвертированном микроскопе, разработанном нами.

Культивирование гематонов (В1аггек I. е1 а1., 1990) и фибробластных клеток-предшественников проводилось также в

полутвердой среде - плазменном сгустке, что позволило в отличие от жидкой среды выявить взаимоотношения между стромальными и гемопоэтическими клетками (А.Ю.Зарицкий, 1990). Для получения фибробластных кондиционированных сред культуры фибробластов после подсчета колоний на первой и второй неделях продолжали культивировать до фазы монослоя. Как правило, производилась трипсинизация подобной культуры. Культуральная среда вторичной монослойной культуры определялась как фибробластная кондиционированная среда (ФКС).

Для получения стромалышх кондиционированных сред гемопоэтические клетки культивировали по методу получения длительных культур костного мозга (Gartner S., Kaplan H.S., 1980). Установление длительной культуры костного мозга оценивалось количеством грануломоноцитарных клеток-предшественников на поздних этапах культивирования, содержащихся в жидкой фазе. Культуральная среда длительных 5-6 недельных культур рассматривалась как стромальная кондиционированная среда (СКС).

Биологическая активность фибробластных и стромалышх кондиционированных сред оценивалась в разных тест-системах. Одной из них является тестирование кондиционированых сред в полутвердой агаровой системе, где последняя в качестве стимулятора заключается в нижний агаровый слой по аналогии с оценкой колониестимулирующей активности плазмы (А.Ю.Зарицкий и соавт., 1979). Клетками-мишенями выступали миелокариоциты лиц контрольной группы.

Другой метод оценки сводился к исследованию стимулирующей или ингибирунмцей активности при добавлении кондиционированной среды к лейкоцитарному фидеру или лейкоцитарной кондиционированной среде в двухслойной агаровой системе. Для оценки стимулирующей или ингибирующей активности кондиционированных сред в ряде случаев использовался тест захвата 3Н-тимидина клетками-мишенями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Колониеобразующая способность фибробластных клеток-

предшественников костного мозга и пролиферативной активности костномозговых фибробластов у гематологически

здоровых лиц

Для подтверждения фибробластной природы оцениваемых клеток использовали меченные ИТС антисыворотки против коллагена (в качестве положительного контроля) и против YIII:rAg (в качестве отрицательного контроля). Культивируемые костномозговые фибробласты давали интенсивное окрашивание при использовании антиколлагеновой сыворотки и не окрашивались антисывороткой против УШ:гАд, что является типичными для фибробластов костного мозга (в отличии от других клеток стромы - эндотелиальных, моноцитарно-макрофагальных). При оценке фибробластного колониеобразования отдельно учитывали количество фибробластных колоний, содержащих гемопоэтические клетки (смешанные колонии - КОСсм). Фибробластное колониеобразование исследовали на первой и второй неделях культивирования (соответственно КОС, КОСсм, КОС2, КОС2см).

Увеличение количества экспл актируемых клеток от 1*106 до 10*106 приводило к увеличению КОС и КОСсм на первой и второй неделях культивировашм. Эффективность клонирования при увеличении количества эксплантируемых клеток снижается. Величина фибробластного колониеобразования на второй неделе культивирования сопоставима с данными ряда авторов (Сая^о-Ма^рто Н. еГ а!., 1984, СеЬЫа У.е1 а1., 1989).

Описано, однако, и значительно более высокое колониеобразование. Видимо, это связано с использованием более богатых по набору аминокислот культуральных сред. Собственные исследования показали, что при замене среды 199 на среду "альфа" можно повысить фибробластное образование в 3 раза. При этом отмечается выраженная положительная корреляция между величинами фибробластного колониеобразования при культивировании на средах 199 и "альфа" (г = 0,91, Р<0.01).

Предложен еще один способ культивирования фибробластных клеток - в плазменном сгустке (с использованием или без использования метилцеллюлозы). Ранее для оценки пролиферации фибробластов в качестве полутвердой среды использовались только коллаген или агар -

для трансформированных фибробластов. Несмотря на то, что эффективность клонирования в данной системе (12,2+2,1)*105 миелокариоцитов) значительно выше, чем в жидкой (Р<0.01).

Тем не менее, результаты обоих методов оказались сопоставимыми. Система плазменного сгустка позволяет анализировать взаимоотношения стромальных и гемопоэтических клеток, поскольку препятствует их расхождению при культивировании. Представляется, что это наиболее удобный способ для исследования гематонов костного мозга (Blazzek I. et al., 1990). Совместное культивирование надосадочных миелокариоцитов и обработанных коллагеназой гематонов приводило к существенному повышению фибробластного колопиеобразования (20,1+2,3)* 105 миелокариоцитов, что свидетельствует о наличии очень значительного количества фибробластных клеток-предшественников в гематонах.

В целом система плазменного сгустка имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с жидкой средой: пролиферация клеток не зависит от качества поверхности культурального сосуда, способности клеток или их комплексов к прилипанию, позволяет изучать морфологические взаимоотношения между стромальными и гемопоэтическими клетками.

Выявленные ассоциации гемопоэтических и стромальных клеток не исключают возможности установления новых связей между этими тинами клеток, как это происходит в двухзтапной системе длительного культивирования (Чертков ИЛ., Гуревич O.A., 1984) или после аллогенной трансплантаии костного мозга.

Для оценки регуляции пролиферации фибробластных клеток исследовали способность тромбоцитов и клеток моноцитарно-макрофагального ряда оказывать влияние на этот процесс. С этой целью оценивали захват 3Н-тимидина фибробластами костного мозга в присутствии бестромбоцитарной плазмы (БТП), эмбриональной телячьей сыворотки и БТП в сочетании с тромбоцитарным лизатом. БТП обладала очень низкой способностью стимулировать пролиферативнуго активность фибробластных клеток.

Добавление тромбоцитарного лизата повышало стимулирующую активность БТП практически до уровня эмбриональной геля чьей сыворотки /Рис.1-а и 1-6/.

и

%

1! Ш

(а) (б)

Рис.1, (а)- Стимулирующая пролиферацию активность бедной тромбоцитами плазмы (БТП) и тромбоцитарнош экстракта (ТЭ). По оси абсцисс - культуралмтя среда с содержанием : I - 5% БТП, II - 10% ТЭ, III - 5% БТП и 10% ТЭ; по оси ординат -стимулирующая пролиферацию активность (М+/- т), %. За 100% принята активность 5%-ной ЭТС. Тестирование проводилось на фибробластах костного мола, (б) - Влияние тромбоцитарного экстракта ТЭ на пролиферативную активность фибробласгов костного мозга. По оси абсцисс - содержание ТЭ в культуралькой среде, %; по оси ординат - стимулирующая пролиферацию активность (М+/- т),%. Тестирование проводилось в присутствии 5% БТП.

Это подтверждает необходимость тромбоцитарных продуктов (выделяемый тромбоцитами фактор роста) для пролиферации фибробластов костнош мозга. Аналогичные данные были получены и при оценке влияния тромбоцитарных продуктов на уровень фибробластного колониеобразования. Для изучения влияния моноцитов и макрофагов на пролиферативную активность фибробластов костного мозга использовали моноциты периферической крови 15 доноров и перитонеальные макрофаги мышей. Моноциты крови и перитонеальные макрофаги подвергались воздействию липополисахарвда, родэксмана и частиц латекса. Клетками-мишенями помимо фибробластов служили клетки линии ЗТЗ и гладкомышечные клетки пупочной вены /Рис.2 и 3/.

В целом, клетки моноцитарно-макрофагального ряда были способны интибировать пролиферативную активность соединительнотканных клеток. Активация первых усиливала ингабирующий эффект. Выраженность эффектов зависела от источников

моноцитарномакрофагальных клеток и природы соединительнотканных клеток.

100_ 50 _

1

I

%

100_ so _

Ж

I

(а) (б) (в)

Рис.2. Влияние сред, кондиционированных мононуклеарными фагоцитами мышей, на пролиферацию гладкомышечных клеток (а), фибробластов костного мозга (б) и фибробластов линии ЗТЗ (в).

По оси абсцисс - пролиферация клеток под действием контрольной среды, принятая за 100 (светлые столбики), сред, кондиционированных нестимулированными макрофагами (заштрихованные столбики) и моноцитами (черные столбики); по оси ординат -показатели пролиферации клеток-мшпеней (в %). Все приведенные показатели пролиферации клеток под действием кондиционированных сред статистически достоверно (Р<0,05) отличаются друг от друга (при сравнении пролиферации различных клеток-мишеней под действием однотипных сред) и от показателя пролиферации клеток под действием контрольной среды (при сравнении действия различных сред на одни и те же клетки-мишени).

Еще одной важной характеристикой соединительнотканных клеток является их неспособность образовывать колонии в полутвердой агаровой среде. Получить фибробластное колониеобразование в полутвердом агаре возможно лишь при избытке определенных ростовых факторов или при трансформации данных клеток (Palmer Н. et al., 1988). В собственных исследованиях была оценена способность фибробластов, полученных путем трипсинизации первичных монослойных культур костного мозга лиц контрольной группы и больных со злокачественными заболеваниями системы крови, клеток линии ЗТЗ, а также трансфицированных онкогеном v-myc (клетки любезно предоставлены Т.В.Поспеловой, ЦИН). Культивирование проводили в двухслойной агаровой системе для предотвращения прилипания фибробластных клеток к поверхности чашки Петри.

Оказалось, что ни фибробласты костного мозга, ни клетки линии ЗТЗ не были способны образовывать колонии. Это является еще одним доказательством невовлеченности фибробластов костного мозга при злокачественных заболеваниях системы крови в лейкемический процесс. Напротив, клетки линии ЗТЗ, трансфицированные онкогеном v-myc, обладали высокой способностью к колониеобразованию в полутвердой агаровой среде (80,1 + 5,6).

Ни

(а)

(б)

Рис.3. Влияние стимуляции макрофагов (а) и моноцитов (б) на ингибирующую активность кондиционированных ими сред по отношению к гладкомышсчньгм клеткам (I), фибробластам костного мозга (II) и фибробластам линии ЗТЗ (III). По оси абсцисс - изменение степени иигибирующего действия кондиционированных фагоцитами сред при использовании в качестве стимуляторов латекса (белые столбики), ЛПС в концентрациях 15 мкг/мл (серые стодбик.и) и 10 мкг/мл (столбики со штриховкой), родэксмана (черные столбики); по оси ординат - показатели аффекта стимуляторов (в%). Звездочка - достоверное, (Р<0,05), отличие от нуля.

Исследование фибробластного колониеобразования у больных хроническими миелопролиферативными заболеваниями

В данную группу были включены 39 больных РЬ-положнтедьным хроническим миелолейкозом, 22 больных полицитемией, 20 больных миелофиброзом. Производилась оценка как КОС, так и КОСсм, а у некоторых больных хроническим миелолейкозом - также цитогенетический анализ культивируемых фибробластов. Ни у одного из четырех исследованных больных хроническим миелолейкозом не было выявлено РЬ-хромосомы в культивируемых фибробластах. У двух больных выявлена шперплоидия, не наблюдавшаяся при анализе костномозговых клеток ЛГабл.1/.

Результаты цитогенетического исследования клеток костного мозга и культивируемых фибробластое у больных хроническим миелолейкозом

Больной Предшествующа! Костный мозг Кулыура

терапи» фибробластов

С.С Миелосан, винкристин. 46.ХХ. «9; 22) 46,XX

рубомицин,преднизолон

КА. Миелосан, винкристин, 46.ХХ, 1(9;22) 47,XX,+4/ 47.ХХ.+5

преднизалон

МЛ. То же 46ДХ, 1(9;22) 31-55.ХХ *

К.А.И То же 47.XY.tf 1,17), 46_ХУ

((9;22),+8,

Примечание: * - в гиперплоидных клетках присутствовали неидентифицировинные маркерные хромосомы и дополнительные хромосомы, РН-хромосома отсутствовала. Окрашивание на б-диски не производилось.

Возможно, это связано с проводимой ранее цитостатической терапией (миелосан, винкристин).

У нелеченых больных в хронической фазе миелолейкоза наблюдалось более высокое фибробластное колониеобразование ЛГабл.2/ на второй неделе культивирования (КОС и КОС2см, Р < 0,01). Повышенное содержание мегакариоцитов в костном мозге было сопряжено с более высоким фибробластшлм колониеобразованисм (Р< 0,01). Терапия миелосаном и миелобромолом приводила к существенному снижению /Табл.2/ фибробластного колониеобразования (Р<0,01).

Таблица2

Фибробластное колониеобразование у больных хроническим миелолейкозом

Больные КОС1 КОС1см КОС2 КОС2см

Нслечетте М+/-я> 13.047-5.4 8.5+/-5.4 31.8+М.Н 18.7+/-2.1

Леченные М+/-т 1.1+/-0.4 1.0+/-0.3 3.5+/-1.1 2.0+/-0.3

Властный криз М+/-т 0.0+/-0.0 0.0+/-0.0 2.0+/-0.4 0.8+/-0.3

У некоторых больных исследования произведены в динамике (хроническая фаза - терапия миелосаном - бластный криз). Эти

наблюдения подтвердили общую закономерность. Оказалось, что оценка фибробластного колониеобразования имеет прогностическую значимость при данном заболевании: у нелеченных больных с нормальным или низким фибробластным колонисобразованием бластный криз развивался раньше, чем у больных с высоким фибробластным колониеобразованием (Р<0,01). Не выявлено принципиальных различий при культивировании костномозговых клеток в жидкой среде и в системе плазмсннош сгустка.

Следует отметить, что ни у одного из больных с высокой КОС не было признаков фиброза костного мозга ни в момент исследования, ни в дальнейшем. По-видимому, гиперплазия пула фибробластных предшественников направлена на поддержание пролиферации гемопоэтических клеток, дефектных по ответу на факторы, сдерживающие их пролиферацию (Eaves A. et al., 1986). В связи с тем, что отсутствуют данные о нарушении чувствительности клеток больных хроническим миелолейкозом к общеизвестным факторам роста, включая фактор стволовых клеток (Zsebo К.М. et al., 1990), представлялось небходимым оценить способность плазмы больных стимулировать пролиферативную активность гемопоэтических клеток-предшествешшков.

Оказалось, что колониестимулирующая активность (КСА) плазмы больных была ниже, чем у контрольной группы лиц (18,4+/-4,1 и 29,0+/-0,3, Р<0,01). Следовательно, гиперплазия пула грануломоноцитарных клеток-предшествеиников при этом заболевании не может быть объяснена повышением уровня 1уморальных стимуляторов и связана, вероятно, с изменением свойств стромы костного мозга и влияния перестройки Ьсг-аЫ на пролиферацию и дифференцировку (McGahon С.A. et.al.,1995).

Больные полицитемией были разделены на три группы: не получавшие химиотерапевтического лечения; исследованные непосредственно после 1-3 месячного курса терапии имифосом; больные, у которых исследование проводилось спустя 6-10 месяцев после окончания терапии имифосом. У нелеченых больных КОС и КОСсм были выше, чем у контрольной группы лиц (19,7+/-1,8, 13,2+/-1,9, Р<0,01). Лечение имифосом приводило к редукции фибробластного колониеобразования, и его величины после терапии не отличались от таковых контрольной группы лиц. Перерыв в терапии сопровождался повышением уровня как эритроцитов, так и фибробластного колониеобразования.

Наконец, у большинства больных миелофиброзом фибробластное колониеобразование (КОС и КОСсм) было резко сниженным или отсутствовало при оценке на первой и второй неделях культивирования (Р<0,01).

Колониеобразующая способность фибробластных клетокпредшественников у больных нейтропеническнми

состояниями

В исследование включено 7 больных тяжелой формой апласгаческой анемии, 10 больных агранулоцитозом (5 - острым, 5 -рецидивирующим), 22 больных В^-дефицитной анемией, 7 больных циррозом печени с гиперспленизмом. Исследования у всех больных проведены до начала терапии, а у некоторых также в процессе терапии. У многих пациентов (В 12- и фолиеводефицитная анемия, цирроз печени с гипеспленизмом) произведена оценка коловдестимулирующей активности плазмы крови. КОС у больных апластической анемией и агранулоцитозом была резко снижена /Рис. 4/.

V 40

о

ь- 36

0)

§

32

-а

Й 28

О

и.

8 24

5

а 20

а;

к

и 16

о

ЬЙ

(о 12

о

ч ч В

N с! 4

о

0

АГРАНУЛОЦИТОЗ РЕМИССИЯ

АПЛАСТИЧЕС-КАЯ АНЕМИЯ

А первичный Ш рецидивирующий в апластическая анемия

Рис.4. Колониеобразующая способность фибробластов костного мозга у больных с различными нейтропеническнми состояниями и оценка ее динамики.

Успешная терапия больных апластической анемией (преднизолон, преднизолон + циклофосфан) характеризовалась восстановлением фибробластного колониеобразования. Восстановление кроветворения у больных острым агранулоцитозом закономерно сопровождалось нормализацией фибробластного колониеобразования. В то же время у больных рецидивирующим агранулоцитозом даже в ремиссии отмечались низкие значения КОС, что, вероятно, способствует рецидивам заболевания. В целом, эти данные согласуются с выявленным уменьшением числа стромальных клеток при АА иммунологическими методами в исследованиях на трепанатах костного мозга (Окус1ау А.,1995).

У больных мегалобластной анемией и циррозом печени колониеобразование было повышено по сравнению с контрольной группой лиц (соответственно 25,6+/-2,9, Р<0,01 и 29,1+/-7,8, Р<0,01). Важно отметить, что колониестимулирующая активность плазмы при этих заболеваниях повышена не была.

Колониеобразующая способность фибробластных клеток-предшественников у больных гемопоэтическими дисплазиями

В исследование включено 20 больных рефрактерной анемией, 14 больных рефрактерной анемией с избытком бластных клеток в костном мои«, 11 больных хроническим моноцитарным лейкозом, 7 больных рефрактерной анемией в стадии трансформации. Последнюю группу составили как впервые выявленные больные, так и больные с прогрессией рефрактерной анемии.

Значения фибробластного колониеобразования, в том числе смешанного, на второй неделе культивирования у больных рефрактерной анемией были несколько ниже, чем у лиц контрольной труппы (5,0+/-2,1, Р<0,05 и 3,2+/-1,1, Р<0,05, соответственно).

Оказалось, однако, что группа больных рефрактерной анемией является неоднородной. У больных с выраженной гиперплазией эритроидного ростка (более 40%) фибробластное колониеобразование, как правило, отсутствовало.

Напротив, у больных с меньшим количеством эригроидных клеток фибробластное колониеобразование существенно не отличалось от такового контрольной группы лиц. У первой группы больных наблюдалась значительно более выраженная анемия по сравнению со второй группой

(соответственно 2,0+/-0,3 и 2,9+/-0Д*1012, Р<0,05). Это согласуется с данными о том, что эритропоэз на стромальном подслое требует меньших концентраций эритропоэтина, чем вне его ( Tsai S. et al, 1986).

У больных рефрактерной анемией с избытком бластов фибробластное колониеобразование не отличалось от контрольной фуппы лиц.

Следует, однако, отметить что на первой неделе культивирования количество смешанных колоний было выше (5,3+/-1,3, Р<0,05). Видимо, это связано с экспансией бластных клеток, зависимых от стромальных клеток костного мозга. Трансформация рефрактерной анемии характеризовалась резким снижением числа смешанных колоний (Р<0,05), что, по-видимому, отражает низкую зависимость бластной популяции от стромы. При данном заболевании выявлено изменение и других свойств стромы, в частности, повышение степени апоптоза ( Raza A. et al., 1995).

Влияние фибробластов здоровых лиц и больных с различными заболеваниями системы крови на пролиферацию грануломоноцитарных клеток-предшественников

При исследовании оценивали влияние кондиционированных сред первичных и трипсинизированных культур фибробластов костного мозга в различных вариантах полутвердой агаровой среды. Для выявления стимулирующего влияния кондиционированные среды заключали в нижний агаровый слой (Зарицкий А.Ю. с соавт., 1979), для выявления ингибирующего влияния их добавляли к лейкоцитарному фидеру или лейкоцитарной кондиционированной среде.

Клетками-мишенями для выявления стимулирующей активности служила непршгапающая фракция клеток костного мозга, для выявления ингибирующей активности использовали как несепарированный костный мозг, так и его неприлипающую фракцию.

Для оценки стимулирующей активности использовали фибробластные культуры 18 лиц контрольной группы, 21 больного Ph-позитивным хроническим миелолейкозом, 3 - миелофиброзом, 12 -острым лимфобластным лейкозом, 15 - острым миелобластным лейкозом, 11 - хроническими лимфопролиферативными заболеваниями (из них

хроническим лимфолейкозом - ,9), 11 - нейтропеническ 8 - гемопоэтическими дисплазиями. Данные представлень

80 70

30 20 10

О _

• •

о

•

•

•

•

• •

• •

• •

• •

• • • •

•

• «

• о • щ » —

•-Г- •

-. •

ми состояниями, на рис. 5.

Рис.5. Колопиестимулирующая активность сред, кондиционированных костномозговыми фибробластами.

По оси ординат - колониестимулирующая активность. 1 - контроль, 2 -хронические миелопролиферативные заболевания (черные кружки - хронический миелоленкоз, белые - миелофиброз), 3 - острый нелимфобластный лейкоз, 4 - острый лимфобластньш лейкоз, 5 - хронические лимфопролиферативные заболевания, Ь -нейтропенические состояния (черные кружки - апластическая аиемия, аграиулоцитоз, белые - В|2- и фолиеводефицитная анемия), 7 - гемопоэтическая дисшшия (белые кружки - рефрактерная анемия без увеличения количества бластов в костном мозге)

Оказалось, что среда, кондиционированная первичными и трипсинизированными монослойными культурами костномозговых

фибробластов лиц контрольной группы обладала способностью индуцировать грануломоноцитарное колониеобразование неприлипающей фракции костного мозга лиц с морфологически неизмененным костным мозгом. Фибробласты, отделенные от клеток-мишеней слоем 0,5% агара, также способствовали грануломоноцитариому колониеобразовапию.

Данные некоторых авторов противоречат нашим результатам (Савй-о-Ма^рша Н. е1 а!., 1989). Возможно, это связано с использованием разных систем оценки колониеобразующей способности фибробластов костного мозга, больных миелопролиферативными заболеваниями была достоверно более высокой, чем в контрольной группе.

Существенные различия в колониестимулирующей активности были выявлены при различных заболеваниях системы крови.

Колониеобразующая активность фибробластов костного мозга у больных миелопролиферативными заболеваниями была достоверно более выокой, чем в контрольной группе.

У больных миелобластными лейкозами данные колебались в широких пределах, наблюдаемая тенденция к увеличению стимулирующей активности статистически недостоверна.

У больных острым лимфобластным лейкозом стимулирующая активность статистически достоверно снижена. Это согласуется с данными других авторов, выявившими изменения некоторых свойств костномозговых фибробластов у больных острым лимфобластным лейкозом (МшциеН О.О, е! а1„ 1983).

У больных агранулоцитозом с замедленным восстановлением кроветворения и у больных апластической анемией стимулирующая активность была снижена.

Напротив, у больных, страдающих нейтропенией, с несниженным количеством гемопоэтических клеток-предшественников (цирроз печени, В12- и фолиеводефицитная анемия), стимулирующая активность фибробластных кондиционированных сред не отличалась от контроля.

При гемопоэтических дисплазиях наблюдалась статистически недостоверная тенденция к более высокой стимулирующей активнос ти у больных без избытка бластов в костом мозге. Хронический лимфолейкоз характеризовался низкой стимулирующей активностью фибробластов костного мозга.

Данные о низкой колониестимулирующей активности фибробластов костного мозга у больных острым лимфобластным лейкозом, гипопластической анемией, хроническим лимфолейкозом согласуются с результатами ранее проведенных собственных исследований, выявивших

низкое содержание грануломоноцитарных клеток-предшественников в костном мозге при данных заболеваниях.

Представляется, однако, что для регуляции пролифераци гемопоэтических клеток-предшественников необходим баланс между стимуляторами и ингибиторами пролиферации. В связи с этим для оценки ингибирующей активности фибробластов костного мозга исследовано 9 лиц контрольной группы, 13 больных РЬ-нозитивным хроническим миелолейкозом, 12 - хроническими лимфопролиферативными заболеваниями, 5 - рефрактерной анемией, 7 - острыми лейкозами в стадии полной клинико-гематологической ремиссии. Результаты исследования представлены в табл.3.

Таблица 3

Оценка ингибирующей активности фибробластных кондиционированных сред в двухслойной

полутвердой агаровой среде

Методы оценки

Источник ФКС •ЬШнЬиаер <И£С±Ш£С НС±ФКС

фидер ЛКС НП+ФКС

(%) (%) (%)

К 120 ±29.8 90.0 ± 20.8 61.7 ±4.2 «

п=9 п=17 п-7

ХМЛ 130.0 ±30.3 74.6 + 9.8 15.5 ±2.1 ++

п=8 п=7 п=7

ХЛПЗ 59.7 ± 6.1 93.2 ± 10.1 46.0 + 3.1 **+

п=7 п=7 п=7

ОЛПР 96.5 ± ЮЛ 89.2 ± 8.9 65.6+5.1 *

п=7 п=6 п=6

ГД 16.0 ± 4.0 62.3 ± 2.1 44.2 ±1.1 «■*+

п=4 п=3 п=4

Отсутствие ФКС 100 ± 5.1 п=42 100 ± 4.1 п=35 "

Отсутствие ФКС+ЛКС " - 107 ± 12.1 п—13

Примечания: *,** - отличия по сравнению с отсутствием ФКС (соответственно Р< 0,05; Р< 0,01); +,++ - отличие от активности ФКС контрольной группы лиц (соответственно Р<0,05; Р< 0,01). К - контрольная группа лщ, ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ФКС - фибробластная кондиционированная среда, ЛКС - лейкоцитарная кондиционированная среда, НС - несепарированные клетки, НП - неприлипающая фракция клеток.

При добавлении фибробластной кондиционированной среды к лейкоцитарному фидеру наблюдалась иигибирующая активность у больных гемопоэтической дисплазией (рефрактерной анемией) и хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Возможно, это связано с ингибированием продукции стимуляторов кроветворения мононуклеарными клетками лейкоцитарного фидера. При добавлении кондиционированных сред к лейкоцитарной кондиционированной среде выявлена ингибирующая активность фибробластов больных хроническим миелолейкозом и гемопоэтической дисплазией. Это свидетельствует о непосредственном воздействии на грануломоноцитарные клетки-предшественники.

Наконец, в третьей серии экспериментов фибробластная кондиционированная среда добавлялась параллельно к несепарированному костному мозгу и его неприлипающей фракции для оценки стимулирующей активности. Результаты сравнивали с действием кондиционированной среды костномозговых фибробластов контрольной группы лиц.

Оказалось, что соотношение величины грануломоноцитарного колопиеобразования несепарированного костного мозга по отношению к его неприлипающей фракции было значительно ниже у больных хроническим миелолейкозои, а также у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями и гемопоэтической дисплазией.

Эти результаты свидетельствуют о способности фибробпастов данного контингента больных индуцировать продукцию ингибиторов грануломоноцитарного колопиеобразования моноцитами. Для исключения связи полученных результатов с количеством фибробластных клеток в монослойной культуре произведены подобные исследования влияния кондиционированных сред культур, не достигших монослоя и содержащих разное количество фибробластных колоний.

Количественные результаты исследований несколько отличались, однако общая направленность (стимуляция или ингибиция) были такими же. Выявленные механизмы стимуляции и ингибиции I ранул омоноцитарных клеток могут иметь разную биологическую значимость при исследованных гематологических заболеваниях. Ингибрующая активность может реализоваться с помощью разных механизмов: непосредственное подавление грануломоноцитарного колониеобразования, нарушение продукции стимуляторов или индукция продукции ингибиторов в моноцитарных клетках. Фибробласты костного мозга лиц контрольной группы обладают лишь последним свойством.

Низкая стимулирующая и значительная иигибирующая активность фибробластов у больных гемопоэтической дисплазией может быть направлена на сдерживание лейкемического клона.

Возможна, однако, и другая трактовка - эти свойства фибробластных клеток способствуют практически полной элиминации пула нормальных клеток-предшественников кроветворения.

Более сложны для трактовки данные, полученные у больных хроническим миелолейкозом. Фибробласты костного мозга при этом заболевании обладают как высокой стимулирующей, так и высокой ингабирующей активностью. Если считать, что изменения свойств фибробластов имеют определенную биологическую значимость для организма, можно допустить, что повышение КСА способствует поддержанию зависимого от стромы клона лейкемических клеток хронической фазы заболевания. Действительно, появление независимого от стромы клона (бластный криз) сопровождается снижением КСА. Иншбиторная активность, хотя и высокая при этом заболевании, проявляется лишь в условиях низкой концентрации гемоэтических клеток.

Другими авторами также было выявлено изменение свойств стромы при лейкозах в плане поддержания кроветворения, однако, это было сделано с использованием в качестве мишеней клеток лейкоза мышей (Duhrsen U. et. all., 1995)

Колониеобразующая способность фибробластных клетокпредшественников у больных острыми лейкозами

Фибробластное колониеобразование у больных острым лейкозом варьировало в широких пределах. В связи с этим данные были проанализированы с использованием программы ВМЙР8Д, ВМОР7Д, ВМДР1Е

Несмотря на то, что значения фибробластнош колониеобразования зависели от цитохимического варианта лейкоза и фазы заболевания, однако, эта взаимосвязь была выражена более умеренно. Так у первичных больных OMJ1 количество смешанных колоний на второй неделе культивирования было ниже, чем у контрольной группы лиц ( Р<0,05 ), а больных с рецидивом OMJI были снижены как КОС, так и КОСсм, (Р<0,05 ). У первичных больных OJUI наблюдалось лишь более низкие значения KOCIcm ( Р<0,05 ).

Выявлены определенные различия внутри одной цитохимической группы в зависимости ог фазы заболевания. Оказалось, что КОС 1см у больных ОМЛ была самой низкой в рецидиве заболевания. Напротив, у больных ОЛЛ в рецидиве заболевания показатели фибробластного колониеобразования были самыми высокими. Отмечаются тенденции, хотя статистически и недостоверные, к более высокому фибробластному колониеобразованию у больных с полной ремиссией ОМЛ и ОЛЛ.

Обращает на себя внимание, что проведение химиотерапии существенно не сказывалось на результатах фибробластного колониеобразования. Это свидетельствует о том, что КОС у больных ОЛ во многом зависит от качественного и количественного состава костного мозга. Между тем, отрицать влияние химиотерапии не предствляется возможным. Действительно, у больных ОЛЛ проведение химиотерапии сопровождалось некоторым повышением КОС, но при этом КОСсм снижалось. Возможно, это связано с воздействием цитостатиков на популяцию гемопоэтических клеток, ассоциированных со стромальными клетками.

Важным представлялось оценить взаимосвязь между фибробластным колониеобразованием тех или иных популяций гемопоэтических клеток в костном мозге. У больных ОЛЛ выявлена отрицательная коррелятивная связь между содержанием бластных клеток в костном мозге и периферической крови и фибробластным колониеобразованием при эксплантации 10*Ю6 миелокариоцитов (соответственно г=-0,93, Р<0,05 и г=-0,21, Р<0,01). При ОМЛ выявлены как положительные, гак и отрицательные корреляционные связи между фибробластным колониеобразованием и властной популяцией клеток. Выявлена сильная положительная корреляционная зависимость между фибробластным колониеобразованием и содержанием бластных клеток в периферической крови (г=0,17, Р<0,01) и отрицательная корреляционная связь с содержанием бластных клеток при эксплантации больших количеств миелокариоцитов ( 10*106 ). Это позволяет предположить, что бластные клетки больных ОМЛ могут оказывать как ингибирующее, так и стимулирующее влияние на фибробластное колониеобразование.

Оказалось, что выявленные корреляционные связи в основном связаны с количеством смешанных колоний. Анализ результатов культивирования в плазменном сгустке показал, что у больных ОМЛ более 50% смешанных колоний включали в себя бластные клетки. Это, вероятно, связано с зависимостью пролиферации бластных клеток у первичных больных ОМЛ от стромы костного мозга. Возможно, следствием этого является выявленная положительная корреляция между

бластной популяцией клеток и смешанным фибробластным колониеобразованием.

Не менее важным является вопрос о корреляционных связях между фибробластными клетками и ростками кроветворения, не имеющими выраженных дефектов созревания, иногда в силу невовлеченности в патологический процесс. При эксплантации низкого количества гемопоэтических клеток (1*106 ) существует положительная корреляция между фибробластным колониеобразованием и процентным содержанием клеток эритроидного и мегакариоцитарного ростков. В основном положительные коррелятивные связи были выявлены при сопоставлении со смешанным фибробластным колониеобразованием (смешанное фибробластное колониеобразование - содержание эритроидных клеток в костном мозге: г=0,5, Р<0,01; смешанное фибробластное колониеобразование - содержание мегакариоцитов: г=0,7, Р<0,01). Коррелятивные связи между фибробластным колониеобразованием и эритро-мегакариоцитопоэзом у больных с рецидивом заболевания были менее выражены.

У больных в стации клинико-гематологической ремиссии были выявлены также положительные коррелятивные связи не только с содержанием эритроидных клеток в костном мозге, но и с количеством циркулирующих эритроцитов (г=0,3, Р<0,05).

Важным представлялось оценить прогностическую значимость исследованного фибробластнош колониеобразования. Оказалось, что у больных с рецидивом острого лейкоза возможность достижения второй ремиссии положительно коррелирует с высоким фибробластным колониеобразованием, оцениваемым на первой неделе культивирования (Р<0,05). У первичных больных острым лейкозом положительная связь между достижением ремиссии и высоким фибробластным колониеобразованием выявлена лишь при лимфобластном варианте острого лейкоза.

Влияние сред, кондиционированных стромальными клетками

костного мозга больных нелимфогрануломатозными лимфомами, на пролиферативную активность гемопоэтических клеток в жидкой среде

Данная группа больных была включена в настоящее исследование с целью ответить на следующие вопросы: влияет ли опухолевый процесс, не

затрагивающий костный мозг, на свойства стромальных клеток костного мозга; как влияет химиотерапия на свойства стромальных клеток морфологически интактного или измененного костного мозга. У 34 больных нелимфо1рануломатозными лимфомами проведено 54 исследования.

Первую группу составили больные без вовлечения костного мозга до терапии или после химиотерапии. В эту группу включены больные лимфомами (1-1У стадии) низкой (группа а) и высокой (группа б) степени злокачествености. Стромальные клетки получали длительным культивированием костного мозга. Влияние стромальных клеток и их пролиферетивные характеристики первой группы больных до проведения химиотерапии достоверно не отличались от таковых контрольной группы лиц. Не было выявлено также различий между больными с различными гистологическими вариантами лимфом /Табл.4/

ТаГшииа_4

Влияние сред, кондиционированных стромальними клетками больных лимфомами без вовлечения

костного мозга на пролиферативную активность гемопонпичсских клеток

Клетки-мишенн

Группы исследуемых КГ лиц олл омл/оммл

1-КГ лиц, п=38 -28+0.5 -72+1.2 -74+0.9

р<0.05 р<0.001

2- лимфомы, группа а, -30±0.8 -80±|.1 -77+1.3

п=7 р<0.05 р<0.001 р<0.01

3- лимфимы, фупиа б, -35+1.0 -78±0.7 -70+1.5

п=7 р<0.05 р<0.001 р<0.01

4- группа а после химиотерапии, +83.1+1.2 -75±0.8 -7У±1.2

п=4 р<0.001 р<0.001 р<0.(Н>|

5- группа б после химиотерапии, +96+1.4 -80+1.2 -76+0.5

п=6 р<0.001 р<().0()1 р<().0Ш

Р1-2, Р1-3, Р2-3 >0.05 >0.05 >0.05

Р1-4, Р1-5 <0.001 >0.05 >0.05

Р4-5 >0.05 >0.05 >0.05

Р2-4, Р2-5 <0.001 >0.05 , >0 05

РЗ-4, РЗ-5 <0.001 >0.05 >0.05

Примечание. КГ • контрольная группа

р - достоверность разности с контролем (клетки-мишени без кондиционироыопшт / ¡нч)^) Р - достоверность разности между исследованными группами

Клетками-мишенями для влияния стромальных клеток первой группы больных были клетки костного мозга лиц контрольной группы, а также клетки крови больных острым лимфо- и миелобластным лейкозом. После проведения химиотерапии стромальные клетки в значительной степени приобретали способность стимулировать пролиферативную активность гемопоэтических клеток контрольной группы лиц /Табл.4/, несколько снижалась длительность поддержания ими гемопоэза. Не было различий между больными с разными морфологическими вариантами лимфом.

Вторую группу составили больные лимфомами IV стадии с вовлечением костного мозга низкой (группа а) и высокой (группа б ) степени злокачественности, исследованные до и после проведения химиотерапии. Стромальные клетки первичных больных с умеренной инфильтрацией костного мозга (до 35%) в отличие от таковых первой группы обладали умеренным стимулирующим влиянием на пролиферативную активность гемопоэтических клеток лиц контрольной группы /Табл.5/.При этом пролиферативные свойства стромальных клеток существенно не отличались от таковых контрольной группы.

Таблица 5.

Влияние сред, кондиционированных стромалъными клетками больных лимфомами с инфильтрацией костного мозга менее 35% до и после химиотерапии на пролиферативную активность гемопоэтических клеток

Клетки-мишени

Группы исследуемых ОЛЛ КГ лиц

1- лкмфомы, группа а -79+1.5 +55±1.3

р<0.001 р<0.05

2- лимфомы, группа б -68±1.1 +52+1.0

р<0.01 р<0.05

3- группа а после химиотерапии -45*0.7 4-105+1.8

р<0.05 р<0.01

4- группа б после химиотерапии -52+0.6 +96±0.9

р<0.01 р<0.01

5- КГ лиц -72±].2 -28*0.5

р<0.001 р<0.05

Р1-2 >0.05 >0.05

Р1-3, Р2-4 <0.05 <0.001

р - достоверность разности с контролем (клетхи-мишени без кондиционированной среды) Р -достоверность разности между исследованными группами

После проведения химиотерапии как и у первой группы больных ингибирующее влияние на пролиферативную активность оставалось прежним, при этом повышалось стимулирующее влияние на пролиферативную активность гемопоэтических клеток лиц контрольной группы. Как в первой, так и во второй группе больных не выявлено достоверных различий в зависимости от морфологического варианта лимфом.

Стромальные клетки первичных больных лимфоцитарными лимфомами со значительной инфильтрацией костного мозга (более 40%) обладали способностью янгабировать пролиферативную активность лейкемических и, в большей степени, нормальных гемопоэтических клеток /Табл 6/.

Таблица 6

Влияние сред, кондиционированных стромальными клетками больных лимфомами с инфильтрацией костного мозга более 40% после химиотерапии на пролиферативную активность гемопоэтических клеток

Клетки-мишени

Группы исследуемых олл КГ лиц

1- лимфимы, группа а -45±0.7 +58±0.6

р<0.05 р<0.01

2- лимфомы, группа б -52±0.6 +69+0.8

р<0.01 р<0.01

3- группа а после химиотерапии -78*1.0 +26+1.5

р«Ш р<0.()1

4- группа б после химиотерапии -52+0.9 +68+0.8

р<0.05 р<0.05

5- контроль -73±1.0 -28+0.5

Р1-2, >0.05 <0.05

Р1-3 <0.05 <0.05

Р2-4 <0.05 <0.05

Примечания:

контроль - больные лимфомами без поражения костного мозга после приведении химиотерапии р - достоверность разности с контролем (клетки-мишени без кондиционироаанной среды), Р - достоверность разности между группами

Следовательно, в собственных исследованиях не удалось выявить влияния опухлевош процесса без поражения костного мозга на свойства стромальных клеток костного мозга. Характер инфильтрации опухлевыми клетками костного мозга сказывается, однако, на способности стромальных клеток стимулировать пролиферативную активность нормальных гемопоэтических клеток. Были изменены пролиферативные и функциональные свойства стромальных клеток.

После проведения химиотерапии нарастала ингибирующая активность у группы больных с лимфоцитарной инфильтрацией костного мозга более 40% по отношению к лейкемическим клеткам и уменьшалась ингибиция пролиферации нормальных гемопоэтических клеток, изменялись и некоторые другие свойства стромальных клеток. У первичных больных лимфобласгными лимфомами с выраженной инфильтрацией костного мозга лимфобластами (более 40%)свойства стромальных клеток не отличались от таковых у больных лимфоцитарными лимфомами. Однако, после химиотерапии не происходило изменение влияния стромальных клеток на пролиферативную активность гемопоэтических клеток.

ВЫВОДЫ.

1. У больных заболеваниями системы крови без нарушенной клеточной дифференцировки величина КОСф и количество ядерных клеток костного мозга взаимосвязаны: у больных с низкой клеточностью (нейтропеннческие состояния, обусловленные уменьшением продукции грануломоноцитарных клеток, миелофиброз) КОСф снижена; у больных с гиперплазией грануломоноцитарных клеток (мегалобластная анемия, гиперспленизм, хронические мнелопролиферативные заболевания) КОСф повышена.

При заболеваниях, сопровождающихся нарушением дифференцировки кроветворных клеток (острые лейкозы, гемопоэтические дисплазии) отсутствуют количественные взаимоотношения между клеточностью костного мозга и КОСф.

В процессе химиотерапии больных острым лейкозом может происходить как снижение, так и повышение КОСф, что, вероятно, связано с результирующим влиянием бластных клеток и цитостатических препаратов на фибробластные клетки-предшественники.

Фибробласты костного мозга способны секретировать гуморальные факторы, как стимулирующие, так и ингибирующие пролиферативную активность гемопоэтических клеток-предшественников, а также вещества, способствующие выживаемости гемопоэтических клеток в культуре.

Стимулирующая активность фибробластов костного мозга выше у больных с активацией грануломоноцитарного ростка, чем у больных с его депрессией.

Клетки стромы костного мозга Moiyr реагировать увеличением продукции стимуляторов грануломоноцитопоэза в ответ на проведение химиотерапии.

У гематологически здоровых лиц и у больных с различными патологическими состояниями выявлены разные ведущие механизмы ннгнбирующего влияния стромальных клеток на гемопоэз: у гематологически здоровых лиц депрессия осуществляется индукцией выделения ингибиторов кроветворения мононуклеариыми клетками, у больных хроническим миелолейкозом помимо этого наблюдается прямое подавление пролиферации гемопоэтпческпх клеток-предшественников фибробластными кондиционированными средами, у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями - индукция ингибиторов и нарушение продукции стимуляторов мононуклеариыми клетками, у больных гемопоэтическими дисплазиями выявлены все три изученные механизма ингибирующего влияния.

Моноциты и макрофаги способны ингибировать пролиферацию соединительнотканных клеток, включая фибробластные клетки костного мозга.

Для пролиферации фибробластных и стромальных клеток-предшественников необходимы тромбоцитарные продукты: использование бестромбоцитарной плазмы приводит к снижению фибробластного колониеобразования в жидкой культуре, а блокирование функциональной активности тромбоцитов in vivo сопровождается нарушением построения очага кроветворения при гетеротопной трансплантации костного мозга.

I. Исследование КОСф в жидкой среде имеет практичекое значение: низкие значения КОСф у больных хроническим миелолейкозом являются предвестником развития властного криза, нормальные или повышенные значения КОСф у больных острыми лейкозами положительно коррелируют с успешностью проводимой химиотерапии.

1. Использование системы плазменного сгустка позволяет существенно повысить эффективность клонирования фибробластных клеток-предшественников по сравнению с жидкой культуральной системой, оценивать взаимосвязь пролиферирующих гемопоэтических и соединительнотканных клеток функциональных единиц костного мозга-гематонов.

I. Сопоставление КОСф с клеточностью костного мозга и отдельных ростков кроветворения у здоровых лиц и у больных с заболеваниями системы крови позволяет считать, что тест фибробластного колониеобразовагага адекватно отражает популяцию стромальных фнбробластов, ответственных за взаимодействие с гемопоэтическими клетками in vivo.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Фибробластные клетки - предшественники могут быть оценены в разных культуральных системах. Колониеобразующая способность во многом зависит от характера используемой культуральной среды. Показано, что результаты оценки при использовании разных сред сопоставимы. Следовательно, сопоставление значений колониеобразующей способности должно основываться не на абсолютных величинах, а на сравнении результатов исследований у здоровых лиц и больных онкогематологическими заболеваниями.

2. Культивирование костномозговых клеток в системе плазменного сгустка позволяет повысить эффективность фибробластного колониеобразования. Данная система позволяет также культивировать гематоны. В отличие от жидкой культуральной системы в плазменном сгустке не происходит расхождения стромальных и гемопоэтических клеток, что позволяет изучать их взаимодействие; оценивать зависимость пролиферации лейкемических клеток от стромы.

3. Оценка фибробластных колоний, содержащих гемопоэтические клетки, более точно отражает взаимодействие стромальных и гемопоэтических клеток., что диктует необходимость раздельного подсчета фибробластных и смешанных (фибробластно-гемопоэтических) колоний.

4. Оценка фибробластного колониеобразования у больных хроническим миелолейкозом может быть использована как прогностический тест срока развития бластного криза. Данный тест и оценка грануломоноцитарного

колониеобразования являются единственными критериями прогноза сроков развития бластного криза.

5.Исследование фибробластного колониеобразования при заболеваниях, имеющих в своей основе иммунопатологические механизмы (агранулоцитоз, апластическая анемия и некоторые другие), позволяет оценить вовлеченночть стромальных клеток в данный процесс.

6.Тест фибробластного колониобразования может быть использован для прогнозирования результатов терапии больных острым лимфобластным лейкозом.

7.Исследование функциональных свойств стромальных клеток у больных нелимфограпуломатозпыми лимфомами, наряду с результатами рутинных исследований, позволяет прогнозировать результаты терапии у данной группы больных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУЕДИКОВННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колониеобразугощая способность фибробластных клеток-предшественников костного мозга у больных хроническим миелолейкозом// Тер.архив,- 1982.-N8.-C.120-123.(cobm. с Каждан И.Я., Кулик М.А., Лисовской В.А., Ярцевой Н.М., Мамаевым H.H., Щепкиной Е.А., Алексеевой Т.Г., Ивановским Ю.В., Филевым A.B., Аркадьевой Г.Е.)

2. Колониестимулирующая способность клеток-предшественников грануломонопоэза в костном мозге при истинной полицитемии и симптоматических эритроцитозах// Тер.архив,- 1982.-N8.-C.123-127. (совм. с Филев Л.В., Дыгин В.Г., Кацюбинский H.H.)

3. Использование метода иммунофлуоресценциии специфической адгезии лимфоидных клеток к эндотелию венул лимфатических узлов при исследовании больных со злокачественными нелимфогранулематозными лимфомами // Всесоюзная конференция " Современные методы морфологического исследования в теоретической и практической онкологии. Тезисы докладов.- 1983. -Том 1, С.11.(совм.с Аркадьевой Г.Е., Ивасенко И.Н.)

4. Колониеобразугощая способность фибробластных клеток-предшественников костного мозга у больных с различными нейтропеническими состояниями // Тер.архив.1983.-Ш.-С.110-114.(совм. с Кулик М.А., Каждан И.Я., Лисовской В.А., Ивасенко И.Н., Аркадьевой Г.Е.)

5. Выделяемый тромбоцитами фактор роста: механизм действия и роль в развитии заболеваний // Тер.архив.- 1984.-N7.-C.144-146.(cobm. с Алмазовым В.А., Благосклонным М.В.)

6. Влияние продуктов секреции мононуклеарных фагоцитов на пролиферативную активность соединительнотканных клеток. // Бюл.эксп.биол.мед,- 1984.-N3.-C.347-349.(cobm.c Алмазовым В.А., Козьмин-Соколовым Н.Б., Кулик М.А., Фрейдлин И.С., Аркадьевой Г.Е.)

7. Влияние стромальных клеток костного мозга на гемопоэз в культуре // Тер.архив,- 1985.-N7.-C.33-40. (совм. с Алмазовым В.А., Кулик М.А., Боргест О.В., Далдманн X, Мачулайтене Е.Р., Благосклонным М.В., Аркадьевой Г.Е.)

8. Влияние эстрона на образование очага гетеротонного кроветворения // Бюл.эксп.биол.мед,- 1986.-N6.-C.753-755.(cobm. с Алмазовым В.А., Аркадьевой Г.Е.,Ивасенко И.Н.)

9. Исследование стромальных клеток у больных гемопоэтическими дисплазиями. В кн.:"Патогенез, диагностика и лечение миелодисплазий". Рига, 1986.- С. 48. Ред. Блюгер А.Ф. и др. (совм. с Кулик М.А., Станкевич Е.Р., JIooc М.)

10. Т-гамма-лимфоцитоз: лимфопролиферативное заболевание или реактивное состояние // Вопр.онкол.1986.-т.32.-К4.-С.11-25.(совм. с Позняк Е.И., Цвейбахом A.C., Симбирцевой Н.Ю., Ивасенко И.Н.)

11. Роль стромального микроокружения в регуляции костномозгового кроветворения при стрессе // Бюл.эхсп.биол.мед.1988.-N3-C.270-271.(cobm. с Гольдбергом Е.Д., Дыгай A.M., Ивасенко И.М., Шаховым В.П.)

12. Влияние дефицита системы мононуклеарных фагоцитов и введения дрожжевого полисахарида на построение гетеротопного очага кроветворения // Бюл.эксп.биол.мед.- 1988.-N7.-C.95-97.(cobm. с Гуриной C.B., Ивасенко И.М., Кашкиной М.А., Аркадьевой Г.В.)

13. Роль тимуса и гемопоэзивдуцирующего микроокружения в рефляции кроветворения при стрессе // В кн."Механизмы патологических реакций". Томск,- 1988,- Том 5,-С.8-12.(совм. с Дыгай A.M., Шаховым В.М.,Ястребовым В.В., Ивасенко И.Н.)

14. Построение гетеротопного очага кроветворения в условиях введения донорам и реципиентам костного мозга гетерополисахарида криптококков // Бюл.эксп.биол.мед.- 1988.-N3.-C.352-353.(совм. с Ивасенко И.Н., Кашкиной М.А., Аркадьевой Г.Е.)

15. Моноклональные антитела в комплексной диагностике лимфом кожи II Сборник статей и тезисов докладов Пленума правления

ВНМОДВ. 1988.(совм. с Разнатовским И.М., Ястребовым В.В., Ивасенко И.Н.)

16. Роль тимуса в регуляции клеток стромы, ответственных за перенос гемопоэзиндуцирующего микроокружения при стрессе // Бюл.эксп.биол.мед.- 1989.-N12.-C.710-712.(cobm. с Гольдбергом Е.Д., Дыгай A.M., Ивасенко И.М., Дедовской С.М., Шаховым В.П. Хлусовым И.А.)

17. Моноклоналъные антитела в комплексной диагностике лимфом кожи И Аннотированная программа научно-практической конференции " Актуальные вопросы дерматовенерологии". Запорожье.- 1989.(совм. с Разнатовским И.М., Ястребовым В.В., Ивасенко И.Н.)

18. Взаимоотношение кроветворного микроокружения остеогенеза и гемопоэза при воздействии эстрона // Бюл.эксп.биол.мед.-1990.-N2.-C. 140-142.(совм. с Алмазовым В.А., Ивасенко И.Н .)

19. Влияние гетерополисахарида криптокоюсов на процессы регуляции кроветворения у мышей в условиях дефицита СМФ // Тезисы докладов всесоюзной конференции "Иммуномодуляторы природного происхождения". Владивосток.-1990.-С.10. (совм. с Аркадьевой Г.Е., Гуриной С.В., Ястребовым В.В., Ивасенко И.)

20. Изучение роли стромального микроокружения в регуляции костномозгового гемопоэза при введении курантила // Бюл.эксп.биол.мед. 1990. N7.-C.98-100.(cosm.c Аркадьевой Г.Е., Ивасенко И.Н.)

21. Использование плазменного сгустка для оценки фибробластных клеток-предшественников костного мозга человека // Бюл.эксп.биол.мед, -1990.-N7.-C.70-72.

22. Влияние стромалышх клеток костного мозга больных хроническим миелолейкозом и миелоидным вариантом бластного криза хронического миелолейкоза на пролиферативную активность нормальных и лейкозных гемопоэтических клеток // Экспер.онкология,- 1992.-Том 14.N3.-C.65-68. (совм. с Алмазовым В.А., Стрижак О.В)

23. Влияние стромалышх клеток костного мозга больных неходжкгошши злокачественными лимфомами и хроническим лимфолейкозом на пролиферативную активность нормальных и лейкозных гемопоэтических клеток // Экспер.онкология.- 1992.-Том 14,- N6.-C.52-55.(совм. с Алмазовым В.А., Стрижак О.В.)

24. Изменение пролиферативной активности гемопоэтических клеток под влиянием стромы костного мозга больных острым миелобластным лейкозом и больных гемопоэтической дисплазией // Экспер.онколошя,- 1992.-Том 14.- N1.-C.54-57.(cobm.c Алмазовым В.А., Стрижак О.В.)

25. Термолабильная ингибирующая пролиферацию соединительнотканных клеток активность тромбоцитов // Цитология,-1992.-Том 10.N4.(cobm. с Благосклонным М.В.)

26. Влияние тромбоцитарного экстракта и бедной тромбоцитами плазмы на пролиферативную активность соединительнотканных клеток // Физиол.человека.- 1992.-Том 10, N4.-C.676.(cobm. с Благосклонным М.В., Кулик М.А., Щепкиной Е.А., Аркадьевой Г.Е.)

27. Чувствительность к факторам роста клеток NIH ЗТЗ, трансформированных онкогеном V-myc // Цитология,- 1992,-Том 32, N4., С.358-362.(совм. с Поспеловой Т.В., Благосклонным М.В.) 28. Knochenmark - insuffizienz - alpastische Anamie // Medizine Actuell DDR. 1979, v.43, p.100-102. (Almazov V.A., Afanasiev B.V.)

29. The effect of fibroblast and stromal cell conditioned media on proliferation of hemopoietic cells // In: "Modern trends in human leukemia".

1992,-p.l01-105. (Strijak O.V.)

30. Clinical applications of stromal cell studies in acute leukemia II In:" Acute Leukemia. Prognostic Factors". Buchner et al. (ed). Springer-Verlag.

1993,-p.574-577.(Strijak O.V., Zubarovskaya L.S., Efimov K.V., Afanasiev B.V.)