Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль стромальной ткани в формировании гемопоэтического и иммунологического микроокружения

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ь V ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ V гА ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

^ 4:1 ' о^ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф. ГАМАЛЕЙ.

-

г4

На правах рукописи

КУРАЛЕСОВА АЛЬБИНА ИВАНОВНА

РОЛЬ СТРОМАЛЬНОЙ ТКАНИ В ФОРМИРОВАНИИ ГЕМОПОЭТНЧЕСКОГО И ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Анторефорвт

лиссергаиии на соискание ученой степени доктора биологических илук

Москна - 1994 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском ордена Трудового Красного Знамени институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный консультант:

член-корреспондент РШ. доктор биологических наук,

профессор А.Я.Фриденштейн

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик АЕН РФ,

профессор Л.А.Ярилин

доктор медицинских наук, академик АЕН РФ.

профессор Б.Б.Першин

доктор биологических наук, профессор К.А.Лебедев

Ведущая организация: Российский Государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится 1995 г.

в часов на заседании Специализированного совета Д.001:07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАИН (123098, Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. .

Автореферат разослан X/ _1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е.И.Коптелова

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение кроветворного и лимфоидного микроокружения является одной из актуальных проблем современной иммунологии. В органах гемо- и лимфопоэза поддерживается пролиферация и дифференцировка гемопоэтических и ишунокомпетентных клеток. Популяция лимфоидных и кроветворных клеток гетерогенна. Известно, сколь несхожи между собой Г-лимфоциты, различающиеся по специфичности рецепторов, а стало быть и выполняемым функциям (Тк, Ts, Тн, Taw), и неоднородная популяция В-клеток, мозаичных по классам и идиотипаы синтезируемых иммуноглобулинов. Вместе с макрофагами они осуществляют главнейшие типы иммунологического реагирования. Кроветворные клетки эритроидного, миелоидного, ме-гакариоцитарного рядов дифференцировки поддеряивают пос оянство внутренней- среды организма (содержание Og, субстратов метаболизма, эндокринная регуляция, функционирование иммунологических механизмов и др.). Жизненный цикл всех перечисленных клеток значительно короче срока жизни организма, и поэтому в кроветворной и лимфоидной тканях постоянно поддерживаются процессы обновления этих клеточных популяций за счет пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток и коммитированных предшественников из костного мозга (Фриденитейн А.Я., Лурия Е.А., 1980, Чертков И,Л,,Фриденитейн А.Я., 1977). Эти клетки, попадая в кровоток, оседают и дифференцируются только в органах кроветворения и иммунитета. Колонизация происходит постоянно и в физиологических условиях взрослого организма, а не является экспериментальным артефактом или привилегией раннего этапа онтогенеза. Миграция происходит не только меаду одноименными органами (между лимфатическими узлами, и различными участками костного мозга). Известно, что предшественники костномозгового происхождения колонизируют тимус, а затем из тимуса репопулирувт в лимфатические узлы и селезенку. ' В каждом из органов существуют свои местные специфические условия, определяющие пролиферацию и дифференцировку попавших в них клеток - предшественников. И хотя дифференцировка стволовых клеток определяется их геномом, какие именно из диффе-ренцировочных генов будут экспрессированы на поверхности этих клеток, зависит от внешних для клеток эпигеномных факторов. Совокупность этих факторов создает специфическое для клеток кроветворное и лимфоидное микроокружение. Интерес к проблеме микроокружения велик, так как это часть общей проблемы межклеточных взаимоотношений в процессе дифференцировки, роли генома и микроскру-

«ения в определении феногипических свойств индивидуальных клеток (Фриденштейн А.Я. и др. ,1983). Есть основания полагать, что влияние со стороны микроокружения связано непосредственно с развитием вторичной пострадиационной аплазии костного мозга и, . вероятно, с патогенезом некоторых иммунодефицитных состояний (Knospe W.H. ,et al.. 1966-1968. И.Н.Беляков, Ярилин A.A. и др.., 1992). Микроокру-яение - это результат активности многих категорий клеток: эндотелия сосудов, механоцитов (остеогенных, ретикулярных клеток, фиб-робластов), макрофаг алы-шх, дендритических клеток центров размножения лимфоидных фолликулов, меишальцевых клеток Т-областей лимфоидных органов, а также межклеточных компонентов: коллагеновых волокон, внеклеточного матрикса. через который стромальные клетки опосредуют свое влияние на кроветворные клетки - предпественники (2uckerman. Vdcha, 1983: Patel, Lodlsh, 1986; Gordon et al., 1987, 1988; Couloabell et al.. 1983; Robert- et al.. 1988; Ruosiathl, 1989: Toroc-Storb. 1988; Anklesaria et al.. 1992). Отсутствие сведений о роли каздого из этих компонентов в организации микро-окруиения обусловило необходимость проведения данной работы.

Цель настоящего исследования состояла в определении клеточной популяции, ответственной за перенос кроветворного и лимфоид-ного микроокруасения, выяснении ее гистогенетических отношений с линией кроветворных клеток, изучении факторов, влияющих на форми-■ рование строгальных структур, обеспечивающих гемо- и лимфопоэз.

Основные задачи исследования:

1. Выяснить, каким образом может быть перенесено кроветворное и лимфоидное микроокружение;разработать методы оценки переноса специфического микроокрукения; определить,какие клетки кроветворной и лиыфоидаой ткани ответственны за перенос микроокружения.

2. Проанализировать гистогенетические отнс-эния клеток, переносящих кроветворное и лимфоидное ыикроокружение,со стволовыми кроветворными клетками и их потомками.

3. Изучить закономерности формирования гетеротопных костномозговых и лимфоидных органов в организме нормального и облученного реципиента.

4. Исследовать степень самоподдержания клеток, переносящих кроветворное микроокружение. и возможность их репопуляции во .взрослой организме.

5. Изучить влияние ионизирущего облучения на транспланта-

бельность (перенос) специфического микроокружения, на способность стромального микроокружения поддерживать размножение и дифферен-цировку репопулирующих гемопоэтических клеток. Определить радиочувствительность процесса переноса кроветворного микроокружения. Получить индукцию кроветворного микроокружения у облученных животных и радиохимер.

6. Проанализировать закономерности образования смешанных лимфо-кроветворных органов, экспериментально создаваемых при трансплантации смеси фрагментов и суспензий клеток кроветзорных и лиыфоидных органов.

7. Выяснить возможность переноса специфического микроокружения. обеспечивающего гистогенез 1еА-продуцентов. при трансплантации вторичных лимфойдных органов, ответственных за местный иммунитет.

Новизна полученных результатов. Совокупность экспериментальных данных, полученных в представленной работе,явилась основой для создания концепции специфического кроветворного микроокру&ения.

Впервые в органах гемо- и лимфопоэза выявлена линия стро-мальных клеток, ответственных за перенос кроветворного и лимфоид-ного микроокружения.

Впервые разработан и применен метод дискриментного анализа кроветворной и лимфоидной ткани, позволяющий, используя различия между донором и реципиентом по Н-2 локусу, определить гистогене-тическую принадлежность стромальных клеток и кроветворных, лиыфоидных элементов.

Впервые доказано, что строгальная линия клеток гистогенети-чески независима от стволовых кроветворных клеток. Это означает, что в костном мозге и лимфоидных органах параллельно существуют: 1- Стволовые кроветворные клетки и их потомки и 2-стромальные клетки-предшественники,обеспечивающие дифференцировку стромальных элементов: остеогенных - в костном мозге, ретикулярных - в лимфоидных органах.

Впервые продемонстрировано, что именно приживление стромы обеспечивает создание на месте трансплантации органа аналогичного исходному. Длительно существующие гетеротопные трансплантаты кроветворной и 'лимфоидной ткани являются химерными структурами.в которых кроветворная ткань принадлежит реципиенту, а стромальная -донору. " ■

Показано, что при гетеротопнсй пересадке костного мозга не

- А -

происходит индукции кости из окружающих трансплантат тканей.

Впервые установлено, что продолжительность самоподдеркания строыальной линии клеток в трансплантатах соизмерима со сроком жизни животного. При серийных . гетеротопных . трансплантациях в условиях стимулирования строгальных клеток к образованию новой костной ткани линия стромальных элементов первичного донора успешно самоподдерживается в ходе 3-й пассажей, что аналогично продолжительности самоподдержания стволовых кроветворных клеток в условиях пассирования через организм облученных кивотн„х.

Впервые доказано при трансплантации костного мозга от облученных, толерантных, иммунизированных по секс-антигенам животных, радиохимер, что стромальные элементы не способны к репопуляции и восстановление пула этих клеток происходит за счет местных стромальных элементов, но не за счет стволовых стромальных клеток, введенных внутривенно или мигрирующих из неповрежденных участков кроветворной ткани.

Выяснено,что формирование гетеротопного костномозгового органа при трансплантации костного мозга в виде фрагментов или суспензий в желатиновых губках - не перенос готовых стромальных структур, а процесс образования их de novo, при этом воспроизводятся онтогенетические особенности развития кроветворной ткани. Величина сформированного кроветворного органа меняется пропорционально исходной клеточной плотности, поверхности трансплантата. Эта зависимость многофакторная.

Установлена радиочувствительность процесса переноса кроветворного микроокрузаения при гетеротопной трансплантации костного мозга. Do=l.7 Gy при п=2.6 (при трансплантации 1/4 содержимого бедренной кости).

Впервые показано, что восстановление способности к переносу кроветворного микроокружения костного мозга радиационных химер происходит за счет детерминированных .ютеогенных клеток стромы реципиента не ранее 26 дня после облучения.

Динамика пострадиационных изменений микроокрукения костного мозга после локального облучения бедренных костей в дозах 10,0 -50,0 Gy показывает, что клеточные элементы стромы, обеспечивающие поддержание пролиферации и диф^еренцировки репопулирующих на эту строму стволовых кроветворных клеток, имеют длительный жизненный цикл. Нарушение функций стромы по поддержанию гемопоэза происходит между 2-4 неделями после облучения, что соответствует срокам

развития феномена вторичной аплазии.

Впервые при имплантации декальцинированного костного матрик-са получена индукция кроветворного микроокружения у реципиентов, облученных в дозе 4,5 Су, и у радиационных химер.

Показано, что при трансплантации лимфоидных органов вторичного иммунитета < мезентериальных лимфоузлов) сохраняется специфичность строда. обеспечивающая дифференцировку 1вА-продуцентов, что характерно только для этой категории органов.

Установлено, что при совместной гетеротопной трансплантации костного мозга и тимуса строма каждого из компонентов сохраняет свою специфичность и обеспечивает формирование фрагментов аналогичных исходным.

Научно - практическая значимость работы. Метод дискриментно-го иммунологического анализа позволил,используя Р1 реципиентов, радиационных химер,толерантных и иммунизированных по секс-антигенам животных,впервые установить существование стромальной линии клеток,ответственных за перенос кроветворного и лимфоидного микроокружения. Выяснено, что клетки-предшественники стромальной линии, ее пролиферирущие и зрелые элементы гистогенетически независимы от стволовых кроветворных клеток.Эти данные стали основой для развития нового направления исследований-изучение стромально-го компонента кроветворного и лимфоидного микроокружения и явились фундаментом для создания концепции специфического гемопоэти-ческого и иммунологического микроокружения.Данные о гистогенети-ческой независимости стромальной линии клеток оказали большое влияние на дальнейшее исследование стволовых клеток кастнсй ткани, а также разработку метода культивирования стромапьных клеток-предшественников и их обратную трансплантацию в организм с целью изучения их дифференцировочных и пролифератавных потенций, популяционной структуры.Выявленные закономерности формирования гетеротопных костномозговых и лимфоидных органов продемонстрировали, что именно приживление стромы обеспечивает создание на месте пересадки органа аналогичного исходному. Размер гетеротопных органов зависит от исходной клеточной плотности, величины поверхности трансплантата, от факторов, действующих в организме реципиента. Возможна направленная регуляция величины гетеротопного органа: при трансплантации костного мозга облученному в дозе 4,5 Су реципиенту получено увеличение величины плацдарма для кроветворения в 2 раза." В длительно существующих (по крайней море, в

течение 14 месяцев) трансплантатах строма самоподдерживается и сохраняет донорскую природу, в то время, как кроветворные клетки замещаются на клетки реципиента. Эти результаты, а также данные о том, что восстановление пула стромальных клеток при локальном (в дозе 9,5 Су) и тотальном (8,25-11,0 Су) облучении с последующей инъекцией кроветворных клеток происходит за счет местных стромальных элементов, не за счет инъецированных клеток донора или клеток, мигрирующих из неповрежденных участков, имеют практическую значимость. Отсутствие во взрослом организме репопуляции стромальных элементов должно быть учтено при разработке путей направленного лечения вторичной пострадиационной аплазии и некоторых иммунодефицитных состояний, обусловленных повреждением стромы, при которых традиционные методы лечения не эффективны. Данные,свидетельствующие о том, что в смешанных трансплантатах костного мозга и тимуса строма каждого из компонентов ответственна за формирование фрагментов аналогичных исходным и что строма органов вторичного иммунитета при трансплантации поддерживает гистогенез 1еА-продуцентов, открывают возможность конструирования гетеротопных кроветворных и лиыфоидных органов с заданными свойствами, корректирующих возникающие в организме гемопоэтические и иммунологические нарушения.

Успешное использование в экспериментах декальцинированного костного матрикса для лечения костных дефектов у кроликов позволило применить его для стимулирования костеобразования после удаления одонтогенных кист у человека. Применение матрикса в клинике показано в тех случаях, когда не требуется сразу после операции восстанавливать опорную функцию и когда снижена естественная ос-теогенная функция. Апробация метода произведена в ММСИ №1.Н.А.Семашко (Стоматология, 1981. Мб).

Материалы диссертации включены в монографии: Е. А. Лурия "Кроветворная и лимфоидная ткань культурах"..М."Медицина", 1972г.;Фриденштейн А.Я..Лалыкина К.С. "Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предаественники". М. "Медицина", 1973г.;И.Л. Чертков.А.Я.Фриденштейн "Клеточные основы кроветворения", М."Медицина", 1977г.; Старостин В. И.. Мичурина Т. В."Строма кроветворных органов' и ее взаимоотношения го стволовой кроветворной клеткой", кн. "Морфология человека и животных, "..нтрополо-гия.М., 1977г.6т.;А.Я.Фг денштейн.Е.А.Лурия "Клеточные основы кроветворного микроокружения",М. "Медицина. )80г. ;а также в курс лек-

ций по иммуноморфологии в МГУ им. М. В. Ломоносова и ЦИУВ г.Москва.

Апробация диссертации. Диссертация апробирована на конференции отдела иммунологии НИИЭМ им.Н. Ф.Гамалеи РАМН 8 июля 1993 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международных, всесоюзных съездах, конференциях и симпозиумах, заседаниях научных обществ, перечень которых приведен в конце автореферата.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 32 научных работах.

Структура и объем диссертации. Работа написана по традиционному плану и включает следующие разделы: "Введение","Обзор литературы" (3 главы), "Материалы и метода","Собственные исследования и обсуждения их результатов"(5 глав)."Заключение","Выводы" и "Список литературы" (581 источник).Работа иллюстрирована 22 рисунками и 32 таблицами. Общий объем диссертации 349 страниц.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные.В работе были использованы мыши обоего пола линий А.СВА, С57ВЬ, РКСВА х А) ,Р1(СВА х С57ВЬ) массой 16-22 г. ( питомник "Столбовая" РАМН), мыши линии СВАТ6Т6 ( виварий Института биофизики МЗ РФ). Кролики породы "шиншилла" получены из питомника "Крюково" РАМН.

Приготовление материала для трансплантации под капсулу почки. Фрагменты костного мозга из бедренных костей. Бедренные кости мышей, умерщвленных эфиром, выделяли, не повреждая эпифизов. Кости очищали от мышц, срезали оба зпийиза и воздухом из шприца выдували костный мозг в виде единого фрагмента в среду 199. В случае необходимости этот фрагмент скальпелем делили на части. Приготовление суспензии клеток костного мозга. Костный мозг из бедренных костей мышей вымывали из медуллярной полости в пеницил-линовый флакон со средой 199, который помещали на 30 мин, на магнитную мешалку при 20°С. Взвесь клеток пропускали через пастеровскую пипетку, фильтровали через 4 слоя капрона. Суспензию центрифугировали 10 мин при 130 g и клеточный осадок ресуспензи-ровапи в среде 199 с 5% эмбриональной сыворотки коров.Подсчет количества клеток производили в камере Горяева. Жизнеспособность клеток подсчитывали по эксклюзии 0.\% раствора трипанового сине-' го. Суспензии клеток использовали для трансплантации в диффузион-

ных камерах и для в/в »ведения облученным' животным. Приготовление суспензий клеток тимуса, селезенки и эмбриональной печени. Извлеченные органы помещали в чашку Петри с культуральной средой, разрезали их ножницами на несколько частей, скальпелем выдавливали из фрагментов клетки в среду 199. Для приготовления суспензий фрагменты тканей протаскали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром иглц Суспензии фильтровали через 4-слойный капроновый фильтр, центрифугировали при 130 g в течение 10 мин., осадок ресуспензировали в среде £9® с 5£ с ^воротки; и подсчитывали число клеток в камере Горяева.

Приготовление декальцинированного костного матрикса. Швлечеиыые-у мышей бедренные кости тщательно очищали от мьшц, соединительной? ткани, костного мозга и помещали последовательно' в- растворы: хлороформ-метанол при 25°С на 1,5 ч.; холодную HfcO - Í5 мин;; 0„6ffi НС1 при 2°С на 2 ч.; 2М СаС12 при 2°С на 4 часа; 0,5М ЭДТА при на 1 ч.; 8М LÍC1 при 2°С на 4 ч.; дистиллированную H¿0 при 55°'С на 1 ч. Время пребывания в рабочих растворах костных фрагментов! кроликов увеличено на 3 часа.Декальцинированный матрикс подвергали лиофилизации. Основу предложенной схемы составлял метод Urist (1993).

Трансплантация под капсулу почки. Операция проводилась под; нембу-таловым (0,008 г./г. веса животного) наркозом. Животное фиксировали на спине . Операционное поле обрабатывали спиртом-. Над, левой почкой разрезали кожу, мьшцы. На нишей'трети поверхности-почки-острым концом зубной иглы делалась насечка на капсуле , формировался карман, в который помещайся) трансплантат. Мышечные и ковные-слои зашивались раздельно.

Трансплантация в диффузионных камерах. Диффузионные камеры готовили по Algíre et al.(1954). Использовали фильтпы НА, размер пор' 0,45^. Готовые камеры транплантировали внутрибрюшинно. . Трансплантация клеток костного мозна в- эристых губках. Использовали желатиновые губки (Cplfoamsponge, США). Губки разрезали на Фрагменты объемом 3,7.10 стерилизовали их облучением 30 кГр 60 со.В каждую губку помещали суспензию,содержащую 107клеток костного мозга. Губки трансплантировали под капсулу почки мышам. Определение числа антителообразующих к.етокЦОЮ. Число АОК в трансплантатах лимфоидных органов определяли по ме- оду Jeme, Nordin (1963).

Кариологииеский анализ. В работе использовали метод Ford et al.

(1958) для подсчета Т6Т6 хромосом в метафазных пластинках проли-ферирующих клеток костного мозга радиационных химер и костного мозга гетеротопных трансплантатов.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Пролиферативную активность клеток селезенки, мезентериальных и паховых лимфоузлов, трансплантатов этих органов исследовали в реакции бласттрансфор-мации по методу Хачикяч (1987) с некоторыми модификациями. В качестве митогенов были использованы ФГА (2,5 мкг/мл), КонА (0,5 и 1,0 мкг/мл) и ЛПС Е. coli (100 мкг/мл). Оценку пролиферативной активности лимфоцитов производили по включению Н-тимидина описанным ранее методом (Брондз и соавт., 1977).

Метод иммунофлюоресценции. Для определения происхождения стромальных клеток в гетеротопных трансплантатах и в костном мозге радиационных химер использовали метод непрямой иммунофлюорес-ценции (Coons, Kaplan 1950). Антисыворотку СВА-анти-С57В1 получали при неоднократной иммунизации мышей СБА клетками селезенки ('5х10б) мышей С57В1. Анщсыворотку использовали в разведении 1:10.Меченная ФИТЦ кроличья сыворотка против -глобулинов мьщей использовалась в разведении 1:5.

Метод прямой иммунофлюоресценции использовали для определения IgA и. IgG-продуцентов на замороженных срезах трансплантатов мезентериальных и паховых лимфоузлов (Coons, Kaplan, 1950). Облучение животных. Облучение животных, используемых в качестве доноров или реципиентов, проводили в необходимых дозах на кобальтовом облучателе ЗКУ-50 (мощность дозы 0,5 Gy/мин.) или на рентгеновской установке РУМ-3 (мощность дозы 0.5 Gy/мин.). Приготовление тотальных препаратов из диффузионных камер.Диффузи-оннные камеры извлекались из животного.Фильтры камер промывали в физрастворе, фиксировали в 960спирте 16 часов. На фильтрах, проведенных через 70°спирт, Hjß диет.. ставили реакцию на щелочную фосфатазу по Гомори (Глик, 1950). Докрасна - гематоксилином. Фильтры заключались в бальзам в виде тотальных препаратов. Определение радиорезистентности проводили на основании кривой доза-эффект, описываемой уравнением: lg s=D/Do lg е + lg п, где s-доля выживания, n - экспоненциальное число. Do- доза облучения, при которой выживает 37% клеток.

Обработка трансплантатов.Трансплантата костного мозга и совместные трансплантаты костного мозга и тимуса фиксировали спирт-фор-молом или в жидкости Максимова, декальцинировали Ы HNCLjB течение 24 часов, затем помещали в 5% iJa^-SO^na 21 часа, прошэали а про-

точной воде 24 часа. После обработки готовили гистологические срезы, на которых ставили ИЖ-реакцию или окрашвади гематоксилин-эозином. В части опытов подсчитывали количество кроветворных клеток в трансплантате и определяли массу кости. Обработка трансплантатов. образующихся на месте пересадки взвеси клеток костного мозга в желатиновых губках, проводится аналогично . Трансплантаты лимфоидных органов фиксировали в спирт-формоле. готовили гистологические препараты. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином или ставили .на них ШИК-реакцию.

Статистическая обработка результатов. Достоверность полученных результатов оценивали по критерию Сгьюдента. Разница считалась достоверной, если уровень значимости не превышал 5% (Р<0,05).

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1.Гистогенетические взаимоотношения клеток, создающих кроветворное микроокружение, с гемопоэтическими и лимфоидныыи клетками, 3.1.1. Гетеротопная. трансплантация костного мозга с использованием Fl гибридов.

Клеточные элементы органов гемо- и лимфопозза можно разделить на две группы: 1-кроветворные и лимфоидные клетки, 2-клетки, формирующие каркас этих органов (фибробласты. ретикулярные, эндоте-лиальные, жировые клетки, макрофаги) и образующие совместно с кол-лагеновыми, ретикулиновыми волокнами, основным веществом внеклеточного матрикса кроветворное микроокружение.Совокупность данных, полученных с помощью радиационных, генетических, биохимических маркеров, системы предшественников разной степени коммитиро-вания(К0Бс, КОЕбл, КОЕ-ГЭШ) позволяет утверждать, что в кроветворной системе существует единая полипотентная стволовая клетка, обеспечивающая дифференцировку в зритроидном, галоидном, мегака-риочитарном и лимфоидном направлениях, а также гистиоцитов-макро-фа14»в(фриденштейн А.Я.,Лурия Е.А., 1980, Чертков И.Л.,Фриденштейн А.Я., 1970, 1977; Чертков.И.Л. и др., 1991; Bainer Н., 1963; АЬгаш-son S. et.al.. 1977; Johnson G.R..Metcali d. 1977; McCulloch Б.А. 1978;Нага H.. OgawaM., 1978; Till J.E.. McCulloch E.A., 1980; Williaas D.E. et al., 1984; Dick J.B. et al.. 1985; Keller G. et'al., 1985; Luschka J.R. Я al., 1986; Bender M.A. et al., .1939)

Адекватные модели гпя определения гистогенетического происхождения стромальных элементов, косшо. j мозга - гетеротопная

- и -

трансплантация кроветворной ткани под капсулу почки и радиационные хшеры.При гетеротопной трансплантации костного мозга на месте пересадки формируется костномозговой орган, включающий кость с медуллярной полостью, заполненной кроветворными клетками. Кроветворные и стромальные элементы из семисингенных трансплантатов могут быть анализированы порознь.Разработанный нами метод дискри-ыентного анализа кроветворной ткани костного мозга, учитывающий иммунологические различия между донором и реципиентом по Н-2 ло-кусу, позволяет выяснить,какие именно клеточные элементы ответственны за формирование кроветворного микроокружения и в каких гистогенетических отношениях они находятся со стволовыми кроветворными клетками. Метод дискриментного анализа - иммунологический метод, который основан на том, что при трансплантации ткань приживается лишь на том реципиенте, для которого она не содержит дополнительных трансплантационных антигенов.

При сингенной трансплантации костного мозга СВАТ6Т6--СВАТ6Т6(табл. 1)под капсулой почки развивается хорошо сформированный костномозговой орган, покрытый со стороны капсулы костным чехлом, со стороны коркового слоя почки костная подложка не сплошная. Этот орган заполнен большим количеством активно про-лиферирующего и дифференцирующегося костного мозга. Через 11 месяцев на месте пересадки обнаруживается костномозговой орган, аналогичный 30 суточному.В случае аллогенной трансплантации костного мозга пересаженная ткань, начиная с .6 дня, обнаруживает признаки дегенерации и к 25 дню в 12 из 13 трансплантатов найдены небольшие Фрагменты резорбирущейся кости, лишенной остеобласти-ческого слоя, а в большинстве случаев и остеоцитов. Ни в одном из трансплантатов не было кроветворной ткани. В одном из 13 трансплантатов' на месте пересадки находилась рубцовая ткань. Добавление алпогенного костного мозга к сингенному не препятствовала развитию трансплантатов. .

Результаты двукратной сингенной трансплантации

СВАТ6Т6->СВАТвТв->СВАТ6Т6, Р1->Р1->Р1 сходны между собой. Не было отличий и в зависимости от срока пребывания трансплантатов на первом реципиенте. К концу месяца, как в сингенных трансплантатах _ того же срока, в 14 из 16 трансплантатов присутствовала костная ткань, окружающая костномозговую полость,в которой находился костный мозг.

В всех исследованных ' семисингенных трансплантатах

(СВАТ6Т6->Р1, А->Р1) была найдена кость с большим количеством

: 'Таблица I. Гетеротоппал трансплантация костного мозга

Вид трансплантации Сроки пребывания Сроки предана I реципиенте вания на 2-м реципиенте Результаты

кость с / оощее «остшм / кол-во мозгом /трансдлан-/ татсв

Сингенная 8-30 ян. С8Ар0р5 II мес. 24 24 5 5

Двухкратная сингенная — --СВАда-^ . 1-2 нес. 40-46 дн. р1-рт-рх 12 Г

Семисуигенная СВАу^^ -- Р^СВА^б х А) 19-41 зн. А—Р} ( С8%тб х А) 2,3,5,6,12,14 мес* 51 53

Ачлогениая ?! — СВАтет6 3-40 вн. — А 30 дн 0 28 " 0 9

Смесь симгениого м аллогенного к.и. 30 цн. 7 7

Семисингенная с последующей ретрансплантацией на линии исходного донора костного мозга 42-65 дн „ 6 дн. 5,12,14 .»ее? 10-60 дч. кости 14 мес* 30 вн. 0 3 Э9 42 4 5

* Вое 52 исследованные метафаэиыв плассинки содержали одну Тб хро-мосоау, т.е. принадлежали реципиенту

костного мозга.

В 3 14-месячных семисингенных трансплантатах (СВАТ6Т6~>Р1) определена по кариотипу линейная принадлежность пролиферирующнх клеток костого мозга. Все 52 пригодные для идентификации хромосомные метафазные пластинки содержали среди 40 хромосом одну хромосому Т6, т.е. являлись клетками реципиента.

Основной серией экспериментов в этой группе опытов является семисингенная трансплантация костного мозга с последующей раздельной ретрансплантацией костного мозга и кости на линию исходного донора (СВАТ6Т6->П->СВАТ6Т6. А->П->А) (Табл. 1). Результаты, полученные при использовании мышей СВА Ж и А в качестве исходных доноров, были сходными. Эффект ретрансплантации не зависел от срока пребывания на промежуточном реципиенте в пределах 42 дн.-14 мес. Структура ретрансплантатов закономерно менялась в зависимости от срока пребывания трансплантата на втором реципиенте: на 6 сутки во всех трансплантатах -ооветво^иая ткань отсутствовала, . отмечены плотные скопления ретикулярных и остеогенных шементов. на 11-15 день они содержали большое количество остеогенной ткани, очаги раннего остесгеьеза, небольшие участки кроветворения.

Трансплантаты, находившиеся на втором реципиенте линии исходного донора в течение 28-60 дней, представляли собой костный орган, заполненный активно пролиферирующим костным мозгом. Костные балки состояли из живой костной ткани с непрерывным остеобластическим слоем. Популяция кроветворных клеток представлена .клетками всех трех ростков кроветворения. Такой результат был получен и для трансплантатов, находившихся на промежуточном реципиенте 42-65дн.. 5,12-14 мес.

Во всех 5 ретрансплататах кости на реципиенте линии донора обнаружена сформированная костная ткань, содержащая остеоциты. В большинстве случаев хорошо объизвествленная зрелая ткань покрыта по поверхности слоем молодой кости. Кроветворная ткань найдена в 4 трансплантатах. Она находилась около участков новообразованной кости.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что гетеротоп-ные трансплантаты костного мозга подчиняются общим закономерностям трансплантационного иммунитета и судьба их зависит от антигенной совместимости донора и реципиента. Эти данные явились основанием для использования дискриментного анализа трансплантированной кроветворной ткани. Используя хромосомные маркеры и иммунологический дискриментный анализ, мы продемонстрировали, что ге~ мопоэтические клетки в семисингенных трансплантатах замещаются на клетки реципиента и их пересадка на линию исходного донора (Р1--СВАТ6Т6) приводит к их резорбции и не может. обеспечивать образование костномозгового органа.Поскольку на втором реципиенте (СВАТ6Т6) образуется костная ткань, полости которой заполняются кроветворными клетками, можно утверждать, что в трансплантате СВАТ6Т6--Р1 сохраняется линия детерминированных остеогенных клеток первого донора (СВАТ6Т6). Приживление стромы обеспечивает успех пересадки. Именно строма ответственна за создание на новом месте специфического .микроокружения, т. е. обеспечивает формирование структур, пригодных для репопуляции и дифференцировки ге-мопоэтических клеток реципиента. Стромальные и кроветворные клетки независимы друг от друга в гистогенетическом отношении. Гете-ротопный трансплантат - химерный орган, в котором кроветворная ткань, начиная с 3 месяцев, практически замещается на клетки реципиента, а остеогенная - принадлежит донору и способна самоподдерживаться не менее 14 месяцев без пополнения за счет клеток реципиента. Репопуляции стромальных клеток не происходит.

3.1.г. Гетеротопная трансплантация костного мозга с использованием радиационных химер Из предыдущей серии экспериментов ясно, что повторная пересадка костного мозга оказывается успешной, если второй реципиент подобран так, что у него не приживаются кроветворные клетки промежуточного реципиента, но могут приживаться клетки исходного донора. Может быть экспериментально создана обратная ситуация, когда повторная трансплантация проводится реципиенту, на котором приживаются кроветворные клетки промежуточного хозяина, но не клетки исходного донора. Две модели удовлетворяют этим условиям:! -рассадка костного мозга семисингенных и аллогенных радиохимер на линию донора ■ и реципиента.2- ретрансплантация костного мозга из гетеротопных трансплантатов от самцов (ХУ) к самкам (XX) на вторичных реципиентов - самок,иммунизированных и неиммунизиро-ванных против У антигенов самцов. В работе использовали взрослых мышей линии СВАТ6Т6, СБА, А, C57BL.F1 (СВАхА), П(СВАхС57ВЬ). Для анализа гистогенетических отношений остеогенных клеток костного мозга радиохимер со стволовыми гемопоэтическими клетками реципиента. которые у радиохимер имеют донорское происхождение, проведены с учетом контролей следующие серии экспериментов: 1- трансплантация костного мозга мышей через 4-10 дней после облучения в дозах 8,25-8,70 Су; 2- сингенная трансплантация костного мозга доноров, облученных в дозах 8,25-8.70 йу и получивших внутривенную иньекцию сингенных кроветворных клеток;3- трансплантация костного мозга доноров, облученных в дозах 8,25-8.70 ву и получивших внутривенную иньекцию аллогенных кроветворных клеток. Для лечения облученных животных использовали суспензии клеток костного мозга, селезенки, эмбриональной печени мышей. Кост» мозг аллогенных химер трансплантировали под почечную капсулу животным линии донора и линии реципиента.

Для проведения хромосомного анализа делящихся клеток костного мозга радиохилер в качестве доноров использовали мышей СВАТ6Т6, Под капсулу почки пересаживали содержимое 1 бедренной кости или равное количество костного мозга из гетеротопных трансплантатов. Опыт гетеротопной тест-транспла' -ации длился 40 дней и служил для .выявления в исследуемых популяциях клеток остеогенных предшественников, способных прибиваться на линии тест-реципиента.

Около 75Ж шшей . тотально облуче. ых в дозах 8.25-8,70 Оу и

нелеченных кроветворными клетками, погибали в течение 10 дней. В бедренной кости мышей присутствовало не более 10^ и на месте их трансплантации можно обнаружить только рубцовую ткань.

Костный мозг, извлеченный у облученных и леченных суспензией кроветворных клеток животных, на 4-22 день после, радиационного воздействия, подвергался резорбции. Восстановление остеогенных потенций происходило к 26 дню: на месте пересадки формируется костномозговой орган. Органная принадлежность кроветворной ткани, используемой для лечения, не влияла на сроки восстановления остеогенных потенций костного мозга(табл.2).Трансплантация костного мозга семисингенных химер была успешной после 30-33 дня.

Таблица 2. Остеогенная активность костного мозга облученных мыиеи, восстановленных трансплантацкеЯ сиигепных кроветворных клеток.

Доза Ввецетме клетки Срок ¡си- Реэультеты

оалуче ияяТеу) ИСТОЧНИК число (хЮ6) мешэма шм) трансплантаты / ойцев с костьо /кол-во то-ов

8,25 8.70 : 4-7 5-10 0 0 12 10

8,25 костниЯ иоэг 8,25 костиыЯ ыоэг £0 20 4-22 26-33 0 15 44 15 ;

8,70 костный мозг 8,70 костный мозг Ю-20 10-20- 5-17 26.26 0 И гб ; II 1

8,25 селезенка 8,25 селезенка 50 50 ■ 12-20 16.30 0 10 35 • 10

В части случаев рассадку костного мозга аллогенных химер (СВАТ6Т6->А) проводили после констатации факта химеризма по кроветворной ткани. Степень химеризма определяли путем подсчета метафаз, содержащих Т6Г6 хромосомы (клетки донора). У каждой химеры было идентифицировано не менее 25 делящихся клеток. Как правило, они содержали две Т6 хромосомы (за исключением 4 из 24 у 13 дневной химеры). •

Учитывая данные контрольной , серии, рассадку костного мозга семисингенных радиохимер проводили, начиная с 26-28 дня после облучения. Хотя костный мозг, выдуваемый из бедренных костей, содержал не менее 10 -3x10 клеток, все трансплантаты, как на линию донора, так и на линию реципиента, резорбировались. При использовании животных большего срока химеризма (30-33 дня) практически в половине случаев на поверхности почки мышей линии реципиента можно видеть костномозговой орган. В то же время трансплантаты на линии донора не приживаются (табл.3). При увеличении срока химеризма до 48-53 дней количество положительных результатов на линии реципиента достигает 100%. Хотя., согласно хромосомному анализу, костный мозг бедренных костей радиохимер, содержал делящиеся

клетки СВАТ6Т6 (клетки донора). трансплантаты на линии донора ре-

• Таблица 3. Гетерогонии трансплантация костного мозга сеиисииген- ~ пых и аллогеннах радиохшер на линии донора и реципиента.

" ■ 1 ■ I М I J

Реципиент Донор Доза Количество Срок Результаты облучения введенных с химерхэыа линия линия (6у) «леток (хЮ°) (дни) донора реципиента

Pj CBAjgjg 825 17 (Сел) 26 0/8 0/8

Cj CB%j6 825 8 (KM) 28 0/10 0/10

Cj C8%T6 626 8 (KM) 30-33 0/6 3/6

P¡ CBAj.6T6 825 10 (ЗШ 48** 0/6 6/6

,Ft CBA_875 5 (KM)_53 " 0/12 I0A0

Á CBA So .5 (№) fij~ 0/ñ Ti

A

СВА[.ег6 900 5 (КМ) 13** 0/6 0/6

А СВА 850 15 (Сел) 20 0/8 0/6

А СВА 900 5 КМ) 28 _ 0/6 0/6

А СВ^И6 875 5 ¡КМ) 42-44** 0/6 6/6

А СВА^бтб 875 5 (КМ)_53м1 0/8 8/8

к в часлителе-количеств» трансплантатов с «остыо и костным мозгом,

в эиакенагеле-общев «оличество трансплантатов. кк- степень химериэаа определяли по хромосомной метке.

зорбировались.

У аллсгениых радиохимер остеогенные потенции костного мозга восстанавливаются через 40 дней после облучения. В трансплантатах на линии реципиента присутствует полноценный костномозговой орган. Несмотря на то, что костный мозг 53-дневных радиохимер состоял из клеток донора (т.к. содержал Т6Г6 хромосомы), трансплантация его на линию донора была безуспешной.

Проведенные исследования показали, что: 1- остеогенные потенции летально облученных восстановленных трансплантацией кроветворных клеток швей, длительное время подавлены. V мышей, леченных сингенным костным мозгом, они восстанавливаются после 22дня, у аллогенных химер - с середины 2 месяца, 2 - судя по тому, что костеобразование удается получить лишь при трансплантации костного мозга радиохимер на линию реципиента, восстановление остеоген-ных потенций строш происходит за счет клеток самого облученного организма, но не донора. Это справедливо и для тех случаев, когда 100%-ый костномозговой химеризм был до. .азан хромосомной меткой делящихся клеток. Результаты не зависили от того, инъецировали ли облученным мышам клетки костного мозга, содержащие детерминированные остеогенные клетки-предшественники (ДОКП), или клетки селезенки. эмбриональной печени, не содержащие ДОКП. 3 -остеогенные клетки стромы костного мозга вс тганавливаются не из кроветворных клеток, а независимо от них, т.е. в костном мозге параллельно линии стволовых кроветпрных клеток существует линия детерминированных остеогенньк клеток строш, спос бных к самоподдержанию и

дифференцировке. Стромальные элементы костного мозга не способны к репопуляции при внутривенном введении облученным мышам.

3.1.3 Анализ взаимоотношений стромальной и кроветворной ткани на модели иммуннзированшх яивотных, различающихся по секс-антигенам.

Экспериментальные данные, полученные в этой серии опытов, призваны ответить на вопросы: 1-не образуются ли в трансплантатах костного мозга остеогенные клетки из окружающих тканей реципиента, 2-не происходит ли пополнения пула остеогенных клеток за- счет стволовых кроветворных клеток.

Самок П иммунизировали путем 5-кратного введения (с интервалом в 1 неделю) внутрибрюшинно по 5x10 ^клеток селезенки от самцов одного из родителей.

При семисингенной трансплантации костного мозга от самцов СВА или С57ВЬ на ненмнунизированную самку Р1 под капсулой почки через 30 дней формируется типичный костномозговой орган. Более крупные трансплантаты получены в варианте СВА->Г1, и поэтому в дальнейшем использовали в качестве доноров мышей СВА. При трансплантации костного мозга самцов одной из родительских линий на иммунизированную сашу П (соответственно) происходит резорбция пересаженной ткани.

Эти данные позволили перейти к эксперименту с пассированием костного мозга самцов СВА. Исходно содержимое 1 бедренной кости мышей СВА помещали под капсулу почки неиммунизированной самки П. Через 2,5-3 месяца на месте трансплантации присутствует костномозговой орган, включающий костную капсулу и костный мозг. По нашим данным,' к этому времени такой костномозговой орган представляет химерную структуру, состоящую"из костной ткани, принадлежащей донору (т.е. самцу СВА), и кроветворной ткани, замещенной клетками реципиента (П). Извлеченный из таких трансплантатов костный мозг делии на 2 части и 1 фрагмент подсаживали нормальным самкам Р1, другой - самкам П.иммунизированным против секс-антигенов самца. К 30 дню трансплантаты у неиммунизированннх самок П содержали кость с костным мозгом, как при сингенной трансплантации, а у иммунизированных самок Р1 трансплантаты подверглись резорбции.

Суммируя данные, можно сделать заключение, что степень антигенных различий самца и салки недостаточна для отторжения гетеротопных трансплантатов костного мозга в случае нонммунизнрованмой

самки-реципиента, но достаточна, если самка-реципиент, предварительно иммунизированна клетками самца.

Тот факт, что костный мозг из 3-месячных гетеротопных семисингенных трансплантатов'от самца к самке при его ретраенлдан-тации на неимиунизированную самку Fl проявляет свои остеогеннае свойства, а при его ретрансплантации на иммунизированную самку Fl. резорбируется, указывает на то, что в нем присутствует линия остеогенных клеток только исходного донора. Таким образом,за 3 месяца строма гетеротопного костного мозга не пополняется клетками хозяина ни за счет репопуляции скелетных стромальных клеток реципиента, ни за счет индукции остеогенных свойств у клеток окрував-щих трансплантат. Полученные данные подтверадаот ранее сделанный нами вывод о гистогенетической независимости популяций кроветворных и остеогенных клеток.

3.1.4.Гетеротопная трансплантация костного мозга с использованием толерантных аивотных Для выяснения возможных связей мевду линиями стромальных и кроветворных клеток, необходимо уточнить не происходит ли при ге-теротопной трансплантации образование костной ткани не только в результате дифференцировки костных клеток - предшественников, присутствующих в трансплантате,• но и в результате индукции из местных соединительнотканных клеток реципиента, окруващих трансплантат. Этот вопрос возникает в связи с данными о костной индукции различными способами, в том числе, костной тканью ( Фридени-тейн А.Я., 1963; Urist M.R..MC Lean F.C., 1952; De Bruyn P. P. Н. Kablsch W.T., 1955; ReddyA.H., Anderson W. A., 1976).

В экспериментах использовали ыыаей линии СВА и А, Для получения толерантных кивотных новое жденным ыыиам линии А в вену шеи вводит* 5x10 клеток селезенки взрослой самки СВАТ6Т6. Для констатации феномена толерантности мышам трансплантировали кову самок СВл по методу Bill Ingham R.. Medavar F. (1951) , усовершенствованному в лаб. вирусологии ИЭКО.

Поставленный в этой серии вопрос рассмотрен в опытах, где в качестве промежуточного хозяина использовались аллогенные реципиенты, толерантные к линии донора, а в качестве вторичного реципиента - мыши', сингенные первые реципиентам, но не толерантные к линии исходного донора.

Толерантным мышам в возрасте 30 - 12 дней трансплантировали под капсулу почни костный мозг мышей личин СВА. Через 52 - 83 дня

под капсулой почки находился костномозговой орган. Костный мозг, извлеченный из трансплантата, делили на''равные части и ретранс-плантировапи под капсулу почки мытам СБА и А. Ретрансплантаты фиксировали на 30 день после подсадки вторичному реципиенту. Из селезенки одной из толерантных мышей-реципиентов, имеющих на поверхности почки 5 - месячный трансплантат костного мозга, были сделаны препараты для анализа наличия Т6Т6 хромосом в делящихся клетках. В настоящее время нет однозначных данных о том. с какого Срока начинается процесс замещения кроветворных элементов транс-, плантатов. Однако, известно, что даже в условиях парабиоза мышей в течение месяца около 18 % клеток костного мозга бедра замещаются на клетки второго партнера (Harris I. et al., 1964). И в условиях гетеротопной трансплантации замещение клеток происходит гораздо интенсивнее, чем в этих же органах в условиях парабиоза. Полное замещение лимфоидной ткани, пересаженных лимфоузлов, селезенки, тимуса на реципиентские лимфоциты происходит к 30 - 40 дню (Дидух М. С., 1967; Green I.. 1964; Ducor Р. et al. , 1965). Известно также, что кроветворная ткань толерантных животных на 4 месяце1 после гюстнатальной индукции толерантности состоит почти целиком йэ клеток реципиента - процент химеризма в их костном мозге уже через 1 месяц падает-до 18 % (Trentin 1.1.,Session I., 1962), что соответствует и наиим данным по хромосомным маркерам селезенки толерантных животных. Из налего опыта выяснилось, что не' менее 90* делящихся клеток селезенки принадлежат реципиенту А. Исходя из этих данных, можно быть увереНньм. что трансплантаты костного мозга, находящиеся у толерантных животных А. репопулироваш главным образом (если не исключительно) кроветворными- клетками А.

Линия СВАТ6Т6 (линия донора). Ретрансплантаты костного мозга имели такую же морфологическую картину, что и сингенные трансплантаты костного мозга, т.е. во всех трансплантатах присутствуют костная и кроветворная ткани(табл.4). Ретрансплантаты костного мозга , взятого после 83-дневного пребывания на толерантном реци~. пиенте, неимеют • отличий от предыдущих трансплантатов.

Таблица 4. Результаты ретранстантаци* костного иоэга из гетеротстых трансплантатов толерантных «квотных Лиши Лини* Вреия пребв- Лиши Время пре- Результаты ретрвис-перекч- nepaw»- »а«** в орга- вторкч- быванкя t адаптации

ного но го ниаме толе- иого организме t

«опора рецп- рактноге о- реця- вторичиого Iri"!

пи»ота еотного/яни/ гмеита Reqi^wma loar

СВА А 52 А 30 7/7

___СБА_30_=_б/6_

СВ» А 83 Л X V» _CSA 30_- .

Линия-А(линия реципиента).Ретрансплантаты костного мозга, извлеченные после 52- н 83-дневного пребывания на толерантном реципиенте, сходны по гистологическому строению с аллогенньыи трансплантатами. Иногда находятся фрагменты мертвой костной ткани, лишенные остеобластического слоя, остеоцитов. Располоиение костных балок, их структура свидетельствуют, что это кость новообразованная и подвергшаяся резорбции. Костный мозг во всех трансплантатах отсутствует. Это свидетельствует о том, что кроветворное элементы А не вступают на путь дифференцировки в направлении остеогенеза, хотя в данном случае производилась сингенная для них трансплантация. В то же время пересадка этой кроветворной ткани на линию реципиента приводит к образованию полноценного костномозгового органа.

Эти результаты совпадают с наиими данными, полученными в предыдущих сериях экспериментов, о том, что линия остеогенних клеток-предшественников сохраняется в трансплантатах длительное время и не пополняется за счет стволовых кроветворных клеток реципиента. Индукция остеогенеза в окружающих трансплантат тканях реципиента не выявлена. В целом, эксперименты на толерантных реципиентах не выявили остеогенные потенции самих кроветворных клеток костного мозга, хотя опыт был поставлен таким образом, что, если бы такие потенции существовали, то они могли быть выявлены,

3.1.5.Происхождение стромапьных механоцитов костного мозга из гетеротопных трансплантатов и от радиационных химер по данным их типирования по изоантигенам.

Разработанный в лаборатории ншуноморфологии НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи метод культивирования стромальных клеток-предшественников (Чайлахян Р. К., 1969; Фриденитейн А.Я., Чайлахян Р.К., 1971) дал возможность прямо протипировать гистогенетическую принадлежность клоногенных предшественников стромальнс.. линии клеток.ответственной за перенос, формирование ыикроокрувения. Наличие такой линии клеток и генетическая независимость ее зрелых,пролиферирующих и по функциональному проявлению стволовых клеток была продемонстрирована в предыдущих сериях экспериментов.

В работе использовались 2 месячные радиохимеры, полученные при внутривенном введении 107клеток костного мозга СБА мышам П (СВАхС57ВЬ) облученным в дозе 11,0 Су, и 2-месячные семисингенные гетеротопные трансплантаты костного мог а СВА->П(СВА х С57В1Л,

Костный мозг из бедренных костей радиохииер и иэ гетеротопных трансплантатов эксплантировали In vitro в Лейтеновсюю пробирки с покровными стеклами. Покровные стекла с культурой клеток мшкй исследовали непрямым методом флюоресцирующих антител. Культуры на 10-ый день промывали фосфатным буфером и фиксировали охлажденным ацетоном. Изоантисыеоротку СВА--анти-С57В1, получали, иммунизируя мышей СБА клетками селезенки мышей C57BL; антисыворотку использовали в разведении 1:10. Меченная иэотиоцианатом флуорссцин-на(ФИТЦ) кроличья сыворотка против гамма-глобулиноп мышей использовалась в разведении 1:Б; применяли так же помеченную кроличью сыворотку против гамма-глобулинов мышей. Специфичность иммунофлу-оресцентной реакции проверяли в сравнении со следующими контролями: клетки* нормальная сыворотка крови имей*- моченная ФИТЦ сыворотка к гамма-глобулинам нншей;клетки+ изолинейнал СВА-анти-С57ВЬ сыворотка + мышиная антисыворотка к гамма-глобулинам идай; клетки»меченная ФИТЦ антисыворотка к гамма-глобулинам мышей. Клетки из костного мозга из гетеротопннх трансплантатов у мышей использовали для постановки цитотоксической реакции с той же иэо-линейной антисывороткой.

Семисингенные гетеротопные трансплантаты костного мозга (CBA-F1) через 2 месяца представляли хорошо развитые костномозговые органы, включающие кость и кроветворные клетки. Из одного трансплантата вымывалось в среднем около 3x1 (гклеток. Гемопоэти-ческие клетки составляли примерно 95%, а ретикулярные клетки и макрофаги -5%.

Использованная антилинейная сыворотка имела цитотокснческий индекс 1,0 для клеток C57BL и гибридов F1 и 0,03 для клеток СОЛ.В суспензии клеток костного мозга гетеротопных трансплантатов цито-токсическому действию подвергалось около половины клеток.

На 10-ый день после эксплантации клеток костного мозга. в культурах обнаружены колонии фибробластов, состоящие иэ десятков или сотен клеток, и небольиие группы фибробластоз, расположение между колониями. Между колониями и на самих фибробластах выявилось большое количество макрофагов. Фиброблясты в культурах четко отличаются от макрофагов. Фибробласты, растущие в культурах клеток иэ гетеротопных трансплантатов,имели донорское происхождение, тогда как гистиоциты в'этих же культурах оказались на ВОТ. рсципн-ентского и на 20% донорского происхождения .

Семисингеннно радиохнмеры (СПА ->Г1). Клеточный состав кост-

• гг ■

мого мозга 2-х месячных радиохимер не отличался от клеточного состава нормальных мышей. В среднем из одной бедренной кости вымывалось 2х 1 (Ркостномозговых клеток. Во взвеси клеток, вымытых из бедренной кости радиохимер, цитотоксическому действию подвергалось столько же клеток, сколько и во взвеси клеток костного мозга интактшх мышей GBA. При эксплантации In vitro взвеси клеток, вымытых из полости бедренных костей у нормальных мышей и радиохимер, были получены культуры, морфологически сходные с таковыми гетеротопных трансплантатов. Фибробласты радиохимер четко различаются от гистиоцитов по реакции с антилинейной сывороткой. Фибробласты связывают антитела к Н-2 антигенам реципиента, а гистиоциты не связывают эти антитела. Следовательно, фибробласты радиохимер имеют реципиентское (F1) , а гистиоциты - донорское (СВА) происхождение. Результаты, полученные в реакции иммунофлюоресцен-ции, свидетельствуют о том, что фибробласты костного мозга гисто-генетически независимы от макрофагов - гистиоцитов и от кроветворных клеток, пул клеток-предшественников стромы не пополняется и за счет клеток костного мозга, содержащихся в суспензии, используемой для в/в введения реципиентам с целью получения химер. Эти результаты полностью совпадают с данными по хромосомному анализу фибробластов, растущих in vitro из костномозгового органа, образующегося при трансплантации костного мозга самки морских свинок сингенному самцу линии Huston (1976),

Успешное формирование и поддержание гемопоэтических территорий. как показано нами, осуществляется специальной категорией клеток кроветворной ткани - стромапьндаи элементами. Строма ответственна за создание на новом месте специфического микроокружения, привлекающего репопулирующие кроветворные элементы реципиента и обеспечивающего условия для их размножения и дифференцировки в определенных направлениях. Именно поэтому на месте трансплантируемых фрагментов костного мозга, селезенки, тимуса, лимфатических узлов развиваются органы, аналогичные исходным (Фриденштейн А.Я.. Куралесова А.И.. 1968 - 1986, ДидухМ.С., 1967). Определяющая 'роль строш подтверждается многочисленными данными по трансплантации. Когда тиыэктомированному реципиенту со слабым типом отпет? на определенный антиген трансплантируется тимус от сильно отвечающего донора, в таком тимусе дифференцируются Т-клетки ре-

ципиента, отвечающего по сильного типу (Zinkemagol R.M. Gl al,1978). При пересадке селезенки нормального донора реципиенту S1/S1 (анемия которого обусловлена нарушением способности стро-мальных клеток к синтезу ростового фактора для СКК) клетки последнего, заселяющие трансплантат, дифференцируются.в направлении эритропоэза (Bernstein S.Е., i970).При в/в введении костномозговых клеток летально облученным мышам в их селезенках развиваются го-мопоэтические очаги трех ростков кроветворения. Каждый тип очага располагается в строго определенных участках, имеющих характерные морфологические и цитохимические особенности (Till I.E..McCulloch Е. А.,1961). Если в селезенку облученной мьши поместить фрагменты ткани облученного бедра, то гемопоэтические колонии, образующиеся после в/в инъекции кроветворных клеток, на ткани бедра преимущественно миелсидные (что характерно для костного мозга) , а на ткани селезенки - преимущественно эритроидные (Wolf N.S.. Trentin I.I., 1968). Трансплантаты костного мозга, находящегося на разных стадиях функциональной активности, повторяют особенности исходных Фрагментов (Maniatis А. et al.,1971 Tavassoli М..Crosby W.,1970).

Попытки моделирования in vitro длительного поддержания кроветворения и лимфопоэза били успешны в тех случаях, когда либо сохранялись морфологические структуры костного мозга, тимуса, либо, когда гемопоэтические клетки культивировались на предварительно выращенных стромальных подложках (Лурия Е.А., 1969, 1972; Dexter Т.Н., 1979; WMtlock С. eta]., 1994). Во всех случаях костномозговой подслой функционирует как кроветворное микроокру-вение, и сгромальные клетки связаны между собой и гемопоэтически-ми клетками тесными контактами, включая образование общих мембранных комплексов ( Alien Т.D., Dexter Т.М., 1976) . Регуляция гемопоэза путем прямых медалеточных контактов не исключает других регуляторных механизмов (ростовые и дифференцировочные факторы) , Неоднородность состава стромального компонента в костном мозге определяет градиент в распределении клеток по степени коммитиро-ваяия (Shackney et al., 1975). Существует приуроченность стромальных территорий к с* делышм категориям Т клеток-предисствсшш-ков (Dappen G. et al., 1982). Это справедливо и для В (■слеток с их разнообразными иммуноглобулиновьши рецепторами.

Положение о том, что именно строма определяет дифференцировку кроветворных и Лимфоидных клеток подтверждено в опытах по трансплантации клонированных диплоидных вташов стромальных клеток. В

случае трансплантации шташдв фнбрабластов костного мозга на месте пересадки развивается* кость с костный мозгом, а в случае трансплантации шташов фнбробластов селезенки-лимфоидный ор-ган(Фридеиштейн А. Я., Чайлахян Р. К., Герасимов Ю. В. , 1978,1968), Аналогичные данные получены Owen М(1986), Patt J.M(19ß2). Длительно существующие гетеротопные трансплантаты представляют собой химерные структуры, где стропа принадлежит донору, а кроветворные и лимфоидные клетки - реципиенту. Гемопоэтические клетки замещают-' ся в результате репопуляции. Имеются данные о том, что в кроветворной ткани трансплантатов костного мозга в течение длительного оремени наряду с клетками реципиента сохраняются кроветворные клетки донора (Amsel Sh., Dell E.S.. 1971 ¡Старостин В.И.,1081). Следует отметить, что работа Amsel Sh.,Dell Е, S.фактически проведена на другой модели: подкожная трансплантация костного мозга в костных чехлах. В этих условиях кроветворная строма переносится в сохраненном виде, а не строится de novo, как в наших опытах, и, естественно, темп миграции гемопоэтических клеток может быть иной. На моделях гетеротопной трансплантации костного мозга радиационных химер выяснено, что стромальные элементы не способны к репопуляции, их восстановление происходит за счет элементов самой стромы, а не за счет СКК. Не происходит и индукции стромы из окружающей ткани.

Стромальные и кроветворные элемента независимы друг от друга в гистогенетическоы отношении, а это значит, что в костном мозге и лимфоидных органах параллельно поддерживается линия стволовых кроветворных клеток, и их потомков и линия, которая обеспечивает поддержание, размножение и дифференцировку стромальных клеток(ос-теогеншх-в случае костного мозга, ретикулярных-в случае селезенки, тимуса, лимфоузлов). Метод культивирования стромальных клеток-предшественников позволил прямо определить гистогенетическую принадлежность стромальных клеток-предшественников стромальной линии. С помощью непрямого метода иммунофлюоресцирующих антител показано, что стромальные-и кроветворные элементы гистогенетичес-ки независимы как на уровне зрелых и пролиферирующих клеток, так и клеток-предшественников. Аналогичный вывод был сделан на тех же моделях с использованием цитолитического действия Т-киллеров, а так же цитотокспческой реакции с антилинейной сывороткой и комп-ле-ентоц(Лацинш Н.В. и др. .1984). Ploemaclier et.al, (1983), получивший противоположный результат на снигеиных радиохиыерах.в пос-

ледствии отказался от своих данных(устное сообщение). Ошибка была связана с трудностями идентификации типов делящихся клеток. С аналогичными трудностями столкнулись и те, кто определял гистоге-нетическую принадлежность стромы в длительных культурах кроветворной ткани, поддерживающих костных мозг людей, подвергнутых химиотерапии и трансплантации гемопоэтической ткани доноров, различающихся по половым хромосомам или по глюкозо-6-фосфодегидрогена-3e(Fialkow et.al..1982; Keating et.al.,1982). Получены данные, позволяющие говорить об иерархии стромальных клеток-предшественников по аналогии с таковой стволовых кроветворных клеток. Популяция стромальных клеток-предшественников гетерогенна и включает в себя; 1 - клетки, которые по своим пролиферативным и диффереи-цировочным потенциям являются претендентами на роль стволовых клеток стромальной ткани, способных при обратной трансплантации в организм обеспечивать образование кости, хряща, ретикулярной ткани: 2 - коммутированные предшественники для остеогенной и хрящевой ткани; 3 - коммитированные предшественники для ретикулярной ткани (Фриденитейн А.Я., Чайлахян Р. К., Герасимов Ю.В..1987-1993). Owen М. (1990-1993), используя соответствующие дифференцировочные белки-маркеры, продолжает работу по изучению популяциенной структуры щгеток-предшественников.

3.2. Образование эктопического костного мозга - результат ■ формирования структур de novo.

3.2.1'. Динамика формирования гетеротопных трансплантатов.

Для ответа на вопрос, существуют ли специальные клетки, ответственные за перенос микроокрукекия, следует обратиться к динамике развития гетеротопных трансплантатов костного мозга. Модель гетеротопной трансплантации в принципе может быть использована для получения количественных характеристик процесса переноса микроокружения. т.е. определения параметров, от которых зависит размер создаваемого строгального плацдарма. Оценить величину стро-мапьного плацдарма комто. в частности, по количеству кроветворных клеток в гетеротепком оргаяе. Гетеротопная трансплантация фрагментов костного мозга известна давно. Однако, только в работах, проведенных за 2 последних десятилетия , в том числе и о наших работах, содержатся более подробные данные гистологического анализа (Фриденитейн и др.,1968;Tavassoii М. ,1972). В данной, работе использовались мыши СВА,Fl(СБА х С57В1). весом 18 - 20 гр. Трансплантации подвергалось содержимое одной бедренной кости. Последо-

вательность стадий развития гетеротолных трансплантатов костного мйзга следующая: в первые 48 часов из трансплантата начинают исчезать гемопоэтические клетки, и начинается васкуляризация трансплантата. К 3 суткам исчезает четкость границ трансплантата, продолжаются некротические изменения, разрушение структур костного мозга, фагоцитоз гемопоэтических клеток. В это же время начинается пролиферация ретикулярных клеток, преостеобластов, вырабатывающих коллаген . С .3 - 5 дня отмечается интенсивное развитие остео-генной ткани костных балок, т.е. формируется специфическая стро-ма, отличающая костный мозг от других кроветворных и лимфоидных органов. 7-8 день знаменуется перестройкой кости с участием остеокластов. Начинается новая фаза васкуляризации - появляются первые синусоиды. Начавшаяся резорбция кости ассоциируется с гемопо-этической активностью. Первые гемопоэтические клетки, как правило, обнаруживаются на 7 - 10 день. В последующие сроки костная ткань ремоделируется и в результате формируется костномозговая полость, заполняющаяся гемопоэтической тканью, включающей кроветворные клетки всех типов дифференцировки. После двух недель можно считать. что костномозговой трансплантат не отличается от костного мозга in situ по клеточному составу, но вес составляет лишь 25% от начального веса. К 4 - 5 неделе трансплантат стабилен и время его дальнейшего существования соизмеримо с продолжительностью жизни животного. Трансплантат представляет собой костномозговой орган.-

Количество кроветворных клеток в трансплантатах этого срока приблизительно равно количеству гемопоэтических клеток в трансплантированном фрагменте костного мозга. Эта ситуация сохраняется до 1 мес. Далее при подкожной трансплантации соотношение остается 1:1. а при трансплантации в оптимальные условия под капсулу почки отмечено превышение исходного количества клеток к 8 мес. практически это соотношение остается на протяжении всего срока наблюдения - 14 месяцев . Масса костного каркаса, формирующегося заново в трансплантате, достигает к 1 месяцу величины 0,9+0,1 мг. если трансплантировано под капсулу почки содержимое одной бедренной кости, включающей 0,8+0,1 х 10^ кроветворных клеток. Вес костного ' плацдарма постепенно увеличивается, достигая максимальной величины к 8 месяцу .

Чанные, полученные (Горская Ю.Ф. и др.) при эксплантации кроветворных клеток 4 и 14- месячных трансплантатов в монослойные

культуры, позволяющие определять количество стромапьных клеток-предшественников, свидетельствуют, что в костном мозге бедра и в трансплантате количество предшественников отличается: на 4 месяце количество КОКф на орган в бедренной кости примерно в 4,9 раза меньше, чем в трансплантате (соответственно 84+2,4 и 403+9,3), а к 14 месяцам это соотношение снижается до 2,5 раз (соответственно 270+16,2 и 687+18,6), хотя абсолютное количество клеток-предшественников увеличивается в бедренной кости примерно в 3,2 раза, а в трансплантате - в 1,5 раза. Увеличенное количество КОКф в "трансплантатах, по сравнению с костным мозгом бедренной кости, возможно, связано с преобладанием пролиферативных процессов в период формирования и функционирования трансплантата.

Гистологический анализ свидетельствует, что: 1 - морфогенез трансплантатов костного мозга, ведущий к формированию во взрослом организме нового кроветворного органа в нетипичном месте, повторяет процессы нормального онтогенетического развития костного мозга (подрастание капилляров, пролиферация остеобластов, возникновение губчатой кости, развитие синусоидов, резорбция кости.за счет действия остеокластов и образование медуллярной полости, которая заполняется кроветворными клетками), 2 - при гетеротопной трансплантации костного мозга происходит формирование костномозгового органа,' включающего 2 компонента: строму, создающую кроветворное микроокружение, и гемопоэтические клетки. Развитию кроветворной ткани предшествует образование кости и Формирование костномоговой полости. Данные свидетельствуют о сопряженности этих процессов. Строма костного мозга обладает остеогенными потенциями.

Было выяснено, что при однократной трансплантации полный потенциал переноса костного мозга вообще не реализуется. Об этом свидетельствует "озмсяность повторных пассажей ткани из гс-теротопных костнсмосгс;шх органов с образованием каждый раз кости с костным мозгом. Дг;л определения способности остеогенных клеток костного мозга к длительному самсподдсржанию проведена 1 - серийная ретрансплантация костного мозга из гетеротопных трансплантатов и 2 - трансплант.ацип костного мозга от мышей, подвергнутых фракционированному облучению в дозе 4, 5 Су ( интервал между облучениями 24 дня).

Костный мозг, извлеченный из бедренной кости и содержащий о среднем 1,0 х ^кроветворных клеток, трансплантировали под кап-

аулу почки первому реципиенту. Через 45 дней костномозговой орган. образующейся на месте пересадки, извлекали, освобождали от костной капсулы фрагменты кроветворной ткани и последние рет-рансплантировали под капсулу почки второму реципиенту. Аналогично происходила ретрансплантация костного мозга в организм третьего и четвертого реципиентов.

В организме первичного реципиента н 45 дню во вновь образованном костномозговом органе содержится кость и костный мозг. Количество кроветворных клеток (1.0 х 1Q7) равно количеству гемопо-этических клеток, содержащихся исходно в одной бедренной кости. После второго пассажа на месте пересадки обнаруживается костномозговой орган с количеством кроветворных клеток несколько меньшим, чем в трансплантатах предыдущего срока (0,9 х ю'). Резкое истощение популяции гемопоэтических клеток происходит после 3-го пассажа, количество костной ткани также резко уменьшается. После 4-го пассажа трансплантаты либо полностью резорбировались, либо были существенно меньше, чем в 3-м пассаже (4,0 х 10^). Данные свидетельствуют о том, что линия стромальных клеток костного мозга исходного донора успешно самоподдерживается в ходе 3-4 пассажей. При этом каждый раз она образует новую костную ткань и сохраняет стромальные предшественники, способные, к самоподдержанию. Ситуация, аналогичная тому, что имеет место при серийных пассажах кроветворных клеток через организм облученных мышей (Till G., McCulloch Е.. 1972.1980) . Показано, что костный мозг теряет свою релопулирующую активность после 3-го пассажа. Кроветворные клетки селезеночных колоний практически исчезают к 4-му переносу, если интервал между пассажами составлял 14 дней, и к 4 - 6 переносу при увеличении интервала до 14.дней. Следует уточнить, что истощение популяции стволовых стромальных клеток происходит только в том случае, когда популяция клеток, была вынуждена строить микроокружение заново, если пассирование костного мозга происходит совместно с кйстной капсулой, то и 8- 10 пассажей не уменьшают количества клеток в костномозговом органе (Чертков И.Л.. Гуревич O.A.. 1984).

На модели фракционированного облучения животных в дозе 4.5 Gy с ' интервалом в 24 дня мы изучали способность стромальных клеток к самоподдержанию. Основными показателями полноценности переноса микроокружения служили: количество кроветворных клеток в трансплантате и количество КОКф на орган в опытах in vitro по

культивированию стромальных клеток-предшественников (совместили работа с к.б.н. Горской Ю. Ф.). Непосредственно после тотального облучения мышей в дозе 4,5 Gy в костном мозге остается 10% клеток, способных образовывать колонии фибробластов In vitro (КОКф): 40 КОКф по сравнению с 405 -И 8,5 КОКф в норме. Содержание КОКф в бедренной кости постепенно восстанавливается до 240+11,5 , так и не достигая нормы к 24 дню. Это совпадает с данными in vivo. Дальнейшее пассирование приводит к истощению пула стромальных предшественников и после 4-кратного облучения строма теряет трансплантабельность и способность поддерживать пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток. Пострадиационные изменения стромы и кроветворных клеток взаимосвязаны.

В популяции кроветворных клеток костного мозга, как следует из наших опытов, не все элемены способные к построению микроокружения, реализуют свои возможности. Следовательно, размер гетеро-топного костномозгового органа определяется не только количеством трансплантированных клеток.

Для определения зависимости размера трансплантатов от количества пересаженной ткани проведена трансплантация костного мозга в виде суспензии в трехмерных каркасах (желатиновые губки) и в виде фрагментов под капсулу почки. На месте трансплантации губки, наполненной костным мозгом, формировались костномозговые органы. Большая часть губки в них резорбировалась; а развивающаяся костная ткань образовывала капсулу, окружающую медуллярную полость, заполненную костным мозгом. К 15 дню губка еще сохраняется в существенном количестве. В ее порах разрастается ретикулярная ткань, обнаруживаются большие костные трабекулы. Кроветворные клетки располагаются в виде изолированных очагов. К концу месяца губка в значительной степени рассасывается и большая часть трансплантата занята костной тканью. Среди костных балок располагались костные очаги и сосуды типа с..нусоидов. Костный мозг, находящийся в медуллярной полости, включал все ростки кроветворения: зритро-идный. миелоидный, мегакариоцитарный. Количество клеток костного мозга варьировало в зависимости от количества трансплантированных клеток и размеров, губки (табл. 5) , т.е. начальной плотности костномозговых клеток в губках. Основные этапы развития трансплантатов в губках аналогичны таковым в гетеротопных трансплантатах. На I стадии развития большинство кроветворных клеток погибает и происходит разрастание стромальной ткани, затек и губка*

развивается костная ткань. И, наконец, кость ремоделируется. образуется медуллярная полость, которая заполняется костным мозгом. По сравнению с трансплантацией Фрагментов костного мозга все эти процессы в губках происходят медленнее.

Первое, что мы выяснили, это влияние размеров ложа на результат трансплантации..

; Таблица 5. ГЕГЕРОТОПНАЯ ТРАНСЦИАИГАЦИН КОСТНОГО МОЗГА В ГУБКАХ

Количество трансп-лаятировашгах клеток костного мозга 05ъем губки (ми3) Количество трансплантатов . Количество костномозговых клеток, содержащихся в трансплантате (х

ю7 3 8 1,03* 0,20

ю7 7 5 2,24+ 0.22

то7 10 7 3,30^ 0,34

Равное количество клеток - 10 - помещалось в губки разного объема - 3, 7, 10 мм3. Таким образом в опыте менялась клеточная плотность при трансплантации. Можно видеть, что/неа.ктря на то, что трансплантировали равное количество клеток, -"костномозговью органы сильно различались по количеству заселивших их кроветворных клеток: Количество клеток, извлеченных из губок, имеющих объем 7 мм3 вдвое больше, чэм в губках объемом 3 ымэ, а губки объемом 10 отличаются от последних более чем в три раза. Эффективность переноса микроокружсиия была далеко неодинаковой.

Далее в губки одного и --зго же размера помещали разное количество живых костношзгобых ¡шеток. Число 8ивых клеток, которое мы трансплантировал;:, отличалось в 10 раз, а именно 1041 10~кпе-ток. К тем трансплачгатам, которые содержали Ю^еавых клеток, было добавлено 9x10костномозговых клеток, убитых облучением (доза облучения 60 Су) (табл.6).

Телица 6 ГЕГЕКШШАЯ 1РА1КПЛАШ'/ШИЯ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА " ------ а ______

Количество Количество ь-л- Количество Количество кроветьэр трансплантированных ток костного моэ- Шх платок костного плеток костного га, облученных в мозга .зодерзаг^тхея ь иозга_дозе 60 Су_'_трансплантате

10° 107

9 х 10°

10 10

3,1(£ 0,30 6,40* 0.93

Были получены результаты, которые следовало ожидать,если предположить, что существует многофакторная зависимость между количеством трансплантированных костномозговых клеток и размером образующегося костномозгового органа. В данном случае количество костного мозга о гетсротогжых органах, возникши при пересадке 1С!?к./ю~

ток, не в 10 раз, а лишь незначительно (в 1,7 раз) превышало количество клеток в органах, возникших от пересадки 1$клеток. Эти и подобные эксперименты убедили нас в том, что при трансплантации кроветворных клеток в губках эффективность переноса костномозгового микроокружения - это не постоянная величина и она тесно связана с 1 - исходной клеточной плотностью и 2 - величиной поверхности трансплантата. Получив данные с губками, мы пришли к необходимости выяснить зависимость между количеством трансплантированных костномозговых клеток и величиной образующегося костномозгового органа при пересадке фрагментов костного мозга под капсулу почки..

Костный мозг каждого из 13 доноров распределяли между тремя реципиентами таким образом: одному из них пересаживали все содержимое одного бедра (трансплантат I), а двум другим - по половине содержимого второго бедра (трансплантат II и III). В шести опытах брались по три донора, от которых костный мозг одного бедра пересаживался отдельно каждому из трех реципиентов, а костный мозг вторых бедер пересаживали вместе одному реципиенту. В девяти опытах брали по одному донору, от которого костный мозг из одного бедра трансплантировали целиком одному реципиенту, а костный мозг второго бедра делили на части, а именно, на половину, четверть и два раза по одной восьмой. Каждый из этих фрагментов пересаживали отдельно четырем реципиентам. В каждом образующемся костномозговом органе определяли количество кроветворных клеток и вес костной капсулы. Такая постановка опыта давала нам возможность просуммировать количества кроветворных клеток, образующихся в каждом . опыте из трансплантатйв разной величины и сравнить эти результаты с количеством клеток в трансплантате одного бедра, который мы использовали в качестве контроля. Показано , что строгой пропорциональности между количеством пересаженной костномозговой ткани и размером образующихся костномозговых органов не обнаруживается.

Число кроветворных клеток в трансплантате I и в сумме трансплантатов II и III представляло собой выборки из нормального распределения со средними, которые составляли соответственно 1,09 х 10?и 21,7 х 10б. В И из 13 случаев число кроветворных клеток в трансплантатах II + III было вдвое больше чем в трансплантате I. В среднем отношение числа клеток в трансплантатах II + III к числу- клеток в трансплантате I (подсчитанное для каждого донора) превышало 2. Это с высокой достоверностью отличается от I - воли-

чины, которую следовало ожидать, если бы количество пересаженной ткани определяло число клеток в образующемся кроветворном органе. По весу костной капсулы трансплантаты II + III также превынали трансплантат I в среднем в 1,7 раз. Трансплантаты трех бедер не в

Таблица Величина гетеротопных костномозговых органов

Размер иахощгар Число транс- Число клеток 8 гетерэтотмх? •> трансплантата гслактатов костномозговых органах /хЮ /

Э 6 3.0 + 0,5

I 27 1,4б * 0,27

Ш 7 1,78*0,44

1/4 в I,ZI * о!гг

1/8 , 16 0,72 ? 0^1

г/г * 1/4 + г/а 5 з.аг * о,78

очного донора__4

*t) частях по стчояеияо к соггримому костномозговой полости одного Ледра

три раза, а в 1,9 раза превышают результаты, полученные при трансплантации I бедра (табл.7). А трансплантат четверти бедра дает костномозговые органы, которые уступают по величине костно-мозгошм органам, полученным при трансплантации I бедра, и не в 4, а в 2 раза. То ке относится и к костномозговым органам, полученным при трансплантации 1/8 бедра. Они уступают по величина костномозговым органам, полученным при трансплантации I бедра ке i< В раз, а в 3,7 раза.

Данные подвернуты статистическому анализу (обработка данных проведена совместно с канд. ¡.-.vr. наук А. М. Леснтоэичэн. УГУ), Во-первых, бьш зычислзн ко-?$^яциег*!' корреляции мевду количеством полученных «(лоток и размере ••• .^^сплантироваяноГг ткани костного коз-га. Этот коэффициент сказался равным 0,50 . что свидетельствует о том, что чйсую кроветворных клеток в образовавшемся костномозговом органе находится в зависимости от числа пересаженных клеток, в чем, конечно, не было сомнения. Однако, о характере этой многофзкгорной зависимости коэффициент корреляции сам по се-бз не свидетельствует. Возникает вопрос о параметрах исходных трансплантатов, которые влияют на взаимодействия переносящих мик-роокруконие клеток.Фрагменты костного мозга, пересеяенные под капсулу почки, приобретают форму, близкую к иару" или полусфере.Такую *е форму имеет и гетеротопное костномозговое ыикроокругение (ГКМО).которое формируется на месте пересадки.При трансплантации Фрагментов костного мозга разной величины изменяется не только об-ьеи исходных трачеплататоз.но такае их поверхность и радиус. Костняя ткань,которая составляет важный компонент гемопеэти-чсского микроокружения.располагается по поверхности ГКМО, Отсюда

следует, что величина поверхности мозет влиять па количеств кии ти, а радиус - на интенсивность,с которой слияние, исходящее о г по верхности ГКМО,воздействует на клетки, заполняющие его полость. Сделана попытка выяснить,как зависит величина ГКМО от радиуса (М и площади (Б) поверхности шаров,имеющих объем (V) исходных трансплантатов ( имея в виду, что йк'^ТТ а Были вы числены уравнения линейной регрессии.характеризующие зависимость числа клеток в ГШ.с одной стороны,и параметров Н н V исходных трансплантатов - с другой (рис. 1):.

'/» >л

Крпиис аиисйлий |)сгрсссии дла зависимости ислнчшш N гкмо ог объема (v) и /1Л,1н(1?) нсхолноп'

гра^

'платата,. .. ............ .......

л; по оси .с — оАт-^ыи тч>.,>1 ы« тр^й^илькт.шти» пи оги<.-

'¿вемни к оСъену траьснлвтат* костного мозга одного ,3елр.1. ш> ос» о1Ш««ат ~ величине ГКМО (чнгло клотик а медуллярной п, <и-. стп|; 6. ьо оси «боинсс—радиусы походные т|>аи£пл1ш.лон но; БТКошению к радиусу тралеилаитат, ючи^ло ыоэга олного белр*.' по йен ординат величия, ГКМО (число кл.ток I М«ДулЛИр1,оД гги-Л 'достщ.

Как видно,лучшее приближение точек к прямой имеет место, если в качестве независимого переменного "берется Я,и худшее -при параметре У.С помощью дисперсионного анализа были подвергнуты гцдшор ке гипотезы о линейной зависимости числа клеток в ГКМО от параметров В и СОказалось, что обе гипотезы не отвергаются, если пользоваться £36 уровнем значимости. При этом согласие с гипотезой и линейной зависимости от параметра В оказалось очень хороший (около 60%). По разбираемому критерию более правдоподобной предо является, гипотеза о линейной зависимости от В.В дальнейшей предо гонг выяснить биологический смысл обнаруженной зависимости". Соотношение численности клеток в пересаженной кроветворной ткани и в образовавшемся гетеротопном костномозговом органе характеризует эффективность переноса шшреюкружения (ЭПМ).На основании разничнй ь ЭПМ при трансплантации 2-х разных проб костисто мозга нельзя сравнивать содержание в этих пробах клеток, переносящих ныфоок ружение, но ЭПМ служит важным относительным количеством «;н прите-

рием, который мотет быть с успехом применен для анализа факторов, регулирующих размер кроветворного микроокружения при гетеротопной трансплантации.

3.3. Влияние радиационного облучения на кроветворное микроокружение.

3.3.1. Определение радиочувствительности процесса 'переноса кроветворной ткани.

Данные о гистогенетическсй независимости стромальной линии нлеток костного мозга от СКК били получены на модели облученных EüBOTHUX, где строгальные и кроветворные клетки могли изучаться порознь, благодаря их различной радиочувствительности. Экспериментальная модель для изучения СКК. созданная Till J. и McCtilloch Е. (1861), позволила получить данные, характеризующие радиочувствительность КОЕс. Для KOEc Do=0,95 Gy, п=1,5. Определение радиочувствительности элементов стромы могло быть проведено на моделях in vitro и in vivo. Поскольку КОКф дают рост колоний в монослой-ных культурах стромальннх клеток-лредаественников, возможно построение полной дозовой кривой клеточкой выживаемости. Для КОКф костного мозга морских свинок Do=l,87 Gy при п=1,5 (для суспен-зин) и Do=l,93 Gy при п=1,5 (для фрагментов) ( Фрнденштейн А.Я. и др., 1981). Рудакова С.Ф. и др.(1984) получили более низкие показатели - Do=l,?8 Gy. Для Do=l,7 Gy при п=1,5 ( rio данным Горской Ю. Ф. и др. ,13"'?) Do»2,15 Gy (по дачным Wertsei. al.,3980). Вариации, рс.;ояно. обусловлеш различит: в схеьш эксперимента, дозиметрии и т.д. Для определения радиочувствительности стромальпых клеток in vivo могла быть использована модель гатерогопной трансплантации костного мозга.

В качестве доноров'и реципиентов использовали ышей Fl (СБА х С57В1), весом 20 - 22 г. За 10 мин. до извлечения костного шага доноров облучали в долах 0,0 - 8,4 Gy на кобальтовом облучателе при мощности дозы 0,5 Gy/шш. Под капсулу почки трансплантировали содержимое 1, 3 бедреншх костей или фрагменты 1/4 и 1/8 костного мозга, содержащегося в одной бедренной костк. В 1сачестве контроля использовали такие se по величине фрагменты иесблученно-го костного мозга. Через 1,5; 2,5; 4,5 месяца подсчитывали количество костномозговых клеток в трансплантате (данная серия пнспепнментоа проведена совместно с д.м. н. Конопляшиковкм А. Г. Hü-? медицинской радиологии. г.Обнинск).

Кривая доза - эффект для величины гегеротошюго косгнсмиаг» вого окружения при трансплантации 1/4 бедренного костного мозг-д (фиксация через 1.5 мес.) характеризуется До - 1,7 Gy при п -2,6, а при трансплантации 1/8 бедренного костного мозга - До 1.34 Gy при п <■ 1.7 (график 2).

Полученные результаты близки к данным, полученным Фрнденш-тейном А.Я. и др.(1981) на модели in vitro. Данные свидетельствует о том, что стромальные клетки-предшественники более радиоре •

Ри:. Z Л'Яог.(в «II Гам.в-3 ^уЧЕНИР НИ I.ч> Гh'l. '

Ao« jt^U.iTTMÍGy) '' J .« rw« - cp*a>i*.C И) no 3 - 10 Tf »i'-v..

"ШикттагтаНтУЩвм^ж^

аистентны. чем СКК. В тех случаях, когда для этих ае транспланта тов (1/4 содержимого бедра) определяли радиочувствительность строыальных кпетон через 2.5 месяца и 4.5 месяца после пересадки, получили соответственно следующие показатели Do=2.4 Gy при п=1.0 и Do*1.64 Gy при n*6,á.При трансплантации одного объема бедра показатели Do и п в зависимости от срока фиксации имеют разные величины (колебания Do от 1.44 Gy до 2,53 Gy).

Основная задача следующей серии экспериментов, заключающихся в трансплантации 1/8. 1/4. 1 и 3 необлученных и облученных объемов костного мозга, призвана ответить на вопрос - является ли формирование новой кости и костномозгового мнкроокружения независимой суммой эффектов выживания и роста клеток - предшественнп ков. могущих претендовать на характеристику единиц нсстноыозгоио -

го мшфсдакруяешш (подобно тому, как рассматривается формирование колоний стволовнми кроветворными -клетками разной степени коммити-рованности или как восстановление паренхимы различных облученных органов "единицами клеточной пролиферации" по Хендри и Поттену) или наблюдаемые эффекты, наряду с независимой пролиферацией клеток от части исходных, выживших элементов обязаны еще И'кооперативному взаимодействию клеточных элементов, формирующих гемопоз-тическое микроокруженио.

Результаты изучения радиочувствительности клеток, формирующих костномозговой орган, в зависимости от объема высакенного костного мозга и срока забоя реципиентов свидетельствуют, что показатели радиочувствительности (особенно относящиеся к величина экстрагюляционнаго числа! значительно варьируют. Поэтому ыокно сделать вывод о том, что формирование нового костномозгового органа в данной экспериментальной системе не является только независимой суммой эффектов выживания и последующего роста клеток -предшественников гешпоэтической строш, а еце^отражает слоеныз процессы клеточной кооперации, природа которых не &шет быть охарактеризована только на основе радиобиологических опытов. Радиобиологические опыты только указывают, что при варьировании по любому из доступных в этих опытах факторов (например, по клеточнос-ти трансплантата, сроку его роста или по дозе облучения) существуют сбои оптиыалькыэ условиг, роста м клэточной продукции, возможно, с одним максимума; каждого из факторов. Учитывая денные результаты, корректно считать, что показатели Оо.п для стро-малммх клеток костного мозга, определяемые прй гетерогенной трансплантации, характеризуют не радиочувствительнсоть КОКф, как в опытах in vitro, а радиочувстзнтельность процесса переноса (радиочувствительность траисплантабельности) костного мозга.

3.3,2. Роль стромальноге кроветворного имфоокрукения облученных реципиентов в обеспечении пролиферации и диффэренцировки репопулирующих гешпоэтических клеток. Сущестаеачы-э изменения в ткани, ответственной за перенос, формирование и функционирование кроветворного мшероокруяения, вызываются облучением. Для оценки состоянии стромалмгай ткани могут быть истользев&ш несколько по-|;и:'атслой и каждый из них характеризует разные отделы сложной fлеточной популяции элементов стромм (Чертков И.Л., Фриденатсйн А3977). Тест на способность стромы служить плацдармом для кроютьоренкя основан на оценке того, как кроветворный клетки ро-

популируют на стромальную ткань и ведут себя на ней. Этот- тест характеризует состояние зрелых стромапьных клеток. Тест на чраж: плантабельность сводится к оценке способности кроветворной ткани переносить свое микроокрухение при гетеротопной трансплантации. Он характеризует состояние тех пролиферирующих стромальных клеток, за счет которых обновляются зрелые стромапьные элементы.

а. Изменения строш, влияющие на возмояносгь ее репопуляции кроветворными клетками. В этой серии экспериментов у нишей П (СБА х С57В1) локально облучали одну заднюю конечность в дозах 10,0; 20,0; 30.0; 50,0 С!у. Через разные интервалы времени (1 сут., .14 - 20 дн., 1-6,5 нес.) вивотных тотально облучали в до зе 12,0 Су и внутривенно вводили им 106 клеток костного мозга. На 11 день у мышей извлекали облученные и необлученные бедренные кости, фиксировали их. на гистологических срезах подсчитива ли количество гемопоэтических ;агов на каядую бедренную кость. Сравнение количества кроветворных колоний, обнаруаенных в кости, получившей локальное и тотальное облучение, и в кости, облученной только тотально, показывает способность строш обеспечивать диф ференцировку и пролиферацию попавших на нее гемопоэтических нле ток. Если определять число кроветворных колоний, которые образу ются в костном мозге бедренной кости, которая была подвергнута

Таблица 3- Регенерация кроветгорной ткани -костного мозга о^лучетмх мьшвИ на предварительно локально о''чууепной строые.

Доза лок&яыюго О^ЛУЧР1'1-*«

/Су/

Яггервач Результаты

ме«пу ю- /колкчестю кроретрорных очагов в кости/

качьныч и ~----—-—■■

тотадьиым о*лучрнп&я прокученная

о^яучрнирм кость ность

10,0

I сут. 14 сут. I мес. 3 иес. 6,: урс.

6,6 | 0,1 8 1 I О,* т 0.1 5,а I О.Е 8 Л I 0 3

7,6 £ 0,1

а,21 о,| т а * о,1

б,2 Г 0,2

ад I о,з

£0,0

I сут. 14 сут. Ы оут. I мес. 3 мес, мес.

6,а 5 о,г э,7 ; о,1

8:?

4.5 } 0,2

6.6 i 0,3

§,5 <\8 7 5

е!1

б,7

в,г

Ш И:!

Э0,0

14 оут. 1 мес.

. 3,£ ? 0,г

4]а I о!г

7,4 х О.1 7^9 I 0,2

50,0

} сут.

1 МРС.

3 мес.

0я*

6,5 6.4

' 0,2

6,8 I 0,2

в кслтрвяьнай группе «чвотных, не гюлучиршнх ии'екцию кро-яеюрних клеток,не 1олее I очага на предварительна пЧлучри-¡ую каст о.

присутствуют ецнннчные гемиюэтуческне клетки.

предварительному локальному облучению в дозах 10,0; 20,0; 30,0 и 50,0 Gy за сутки до .повторного тотального облучения и трансплантации клеток, то выясняется, что даже доза 50,0 Gy не лквает строму способности служить подходящим плацдармом для развития кроветворных колоний (табл.8). Это не значит, что такая строма будет длительно поддерживать геыопоэз. В том случае, когда Местное облучение проводилось за х мес. до тотального облучения и лечения, в костях, облученных в дозе 10,0 Gy, количество кроветворных колоний не отличалось от такового в контроле, у облученных в дозе 30,0 Gy составляло примерно половину, а при дозе 50,0 Gy колонии вообще не образовывались. Наконец, если меаду двумя воздействиями проходило три месяца, число колоний в костях, облученных локально в дозах 10,0 Gy было нормальным, в дозах 20,0 - 30,0 Gy не достигало нормы - 70,358. • При дозе 50,0 Gy колонии не образовывались. ■

Сходные результаты получены в отноиении .стромы селезенки (Jenkins V. Kv et al.. 1970). Patt H.. Maloney И. (1§75) описывает длительно сохраняющуюся гипоплазия в костном мозгр бедра у кроликов при местном облучении в дозе 10.0 Gy. У крыс при облучена э дозе 20,0 Gy через 2-3 недели в голени происходит регенерация кроветворной ткани на облученном участке, но через 2 мес. кроветворение затухает (вторичная аплазия). При этом восстановить гемо-лозз можно, но не за счет внутривенной инъекции костного мозга, а путем механического разрувения облученного костного мозга и введения Фрагментов аутологичного костного мозга в депопулировэшую костную полость (Knospe W. et al.,1968, Crosby H. et al.,106В). Через 6 мес.. однако, на фоне аплазии кроветворные очаги могут появиться и без кюретажа. Через в мес. после облучения в дозах 50,0 - 100,0 Gy в костном мозге бедра мшаей число кроветворных клеток составляет только 2556 от контрольного числа (Dexter et al.,1977), в костном мозге кроликов через 2 мес. после локального облучения в дозе 20.0 Gy - Ш (Patt Н. et al., J972),в костном мозге морских свинок - 10% (Лациник Н.В. и др., 1979).

Динамика пострадиационных изменений микроокружения свидетельствует о том, что эффекторные клетки, вырабатывающие факторы микроокружеинл, имеют длительный жизненный цикл.Пострадиационные дефекты обнаруживаются лишь тогда, когда эти клетки переходят из G n G фазу. Эти пораженные клетки неспособны к пролиферации.

Вероятно, это и обуславливает сохранность микроокружения в перьиь недели после облучения в высоких дозах и развитие вторичной аплазии костного мозга через несколько недель после облучения (Фри денатейн А. Я.. 1990).

Стропа, обеспечивающая микроокружение, Ьказывается более ра диорезистентной. чем кроветворные клетки, включая СКК, которые после облучения в дозе 10.0 Gy практически все гибнут ( Раушенбах НО... Чертков И.Л., 1965. Bond V. et al.. 1965, McCulloch Е..ТП1 I.-, 1962). Этот вывод относится к зрелым стромапьшм клетка.! и их функциям, не связанным с пролиферацией, впоследствии они должны замениться на клетки, имеющие более высокую радиорезистентность. По мнения некоторых авторов (Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я., 1977), время меаду высоким локальным облучением и моментом потери своих функций, определяющих их как носителей микроокруие-ния -время обновления большей части стромальных клеток. Гемопозтнчес-кие и. стромалыше клетки после облучения ведут себя по-разному: восстановление пула кроветворных клеток возмоано за счет penoriy лируюцих СКК, стрональные клетки, создающие микроокруаение, регенерируют только за счет местных элементов, что обуславливай! сходство регенерации строки при местном и общем облучении.

б. Изменения строка, обуславливающие ее трансплантабелыюсть.

• Трансплантабельность■стромы характеризует способность стро мальных элементов переносить кроветворное микроокружение при ге теротопной трансплантации костного мозга.•Костный мозг, локально облученный In vivo в дозе 9,5 Gy, при пересадке под капсулу почки через 2, 10.21 день после воздействия лишен остеогенных потенций Будучи трансплантированным через 27 дней, такой костный мозг фор мирует На месте пересадки костномозговой орган, содержащий кость с костным мозгом(табл. 9). Если проводить тотальное облучение до

Таблица Я... Гетеротопная трансплантация костного моага oí оанакраг-

НО и дву>"1атно оолученны* доноров при экранировке оцной конечности

Доза облу- Вреия от облучения Результата трансплантации *

>ения по трансплантации облученкая~эк£>анировшшая

Яу / i дни / конечность конечность

_ __

г о/9 .

10 0/9 9/9

/ ¿1 О/в 8/8

£7 7/9 9/9

. . зг голо lo/lo

8,6 * г 7 0/7 1/1

интервал не*- {| '

% fW«»«*»» || Щ

JO__9/9

я - 0' ошвние количеств» трансплантатов,соцврпцн* кость с костнш иоагои.к ойчеиу количеству пересаженных тры.лглантатов.

нора п такой «о дозе с экранировкой одной конечности, то поено убедиться, что сроки.восстановления остеогенных потенций костного мозга одинаковы при тотальном и локальном облучении . Аналогичные результаты получены нами и при пересадке костного мозга от облученных в дозе 8,25 - 8,7 Gy мышей, восстановленных трансплантацией сингенных кроветворных клеток. Однако, восстановление неполное, если трансплантабельность оценивать и по числу репопулирую-щих на эту строму клеток. Облученная строма длительное время оказывается дефектной, что подтверждают и данные других авторов (Chamberlen W. et al.,1974). Fried W. et al. (1973) отмечал, что при облучении в дозе 5,0 Gy не выявляется изменение объема переносимого микроокрукения. Однако, при двукратном облучении с интервалом 2-28 дней происходит уменьиение величины переносимого микроокружения. Клетки адгезивного слоя в длительных культурах по Dexter (1979), подвергнутые трехкратному облучению в дозе 4,5 Gy (интервал 21 день), утрачивают способность поддергивать пролиферацию стволовых кроветворных клеток в культурах (Zuckerman К. et с.1.. 1986).

После местного облучения в дозе 20,0 Gy трансплантабелькость не .восстанавливается, несмотря на то, что на такую строму репопу-лируют кроветворные клетки . Таким образом, In situ повреждение стромы не сразу становится очевидным, а проявляется при замещении через несколько недель. Судьбу трансплантата определяют клетки г предшественники. Отсутствие восстановления стромальных потенций костного мозга, несмотря на то, что в ранние сроки после облучения в эти участки мигрируют кроветворные клетки, свидетельствует о том, что стромальные'клетки, в отличие от кроветворных, предс-тавляпт собой нерепопулиругщую популяцию клеток (Фриденштейн А.Я. и др.. 1968 - 1993). В наших опытах показано, что если в течение первых часов после облучения в дозе 8,25 - 10,0 Gy трансплантировать под капсулу почки содержимое целого бедра, то формируется костномозговой орган. Через 2-4 дня трансплантабельность теряется. Сохраняющаяся сразу после облучения способность к трансплантации угасает, и это можно объяснить, например, тем. что в первые дни клетки "тратятся" на образование более зрелых элементов и их число ниже уровня, необходимого для результативной трансплантации. Полученные данные согласуются с динамикой восстановления КОКф in vitro (Горская Ю.Ф. 1993. Лациник Н.В. и др..

1994). Возможные сроки наступления регенерации определяются именно числом выживших стволовых стромальных клеток и скоростью их пролиферации.

3.3.3. Индукция кроветворного микроокружения у облученных мышей.

При внутримышечной и подкожной имплантации декальцинирован-ного кос. ого матрикса и дентина у крыс, кроликов, морских свинок и мышей происходит образование хряща и кости путем индукции. В последнем случае возникает и микроокруяение для кроветворных клеток (Фриденштейн А.Я.. Лалыкина К. С., 1973, игШ М. ,1973, 1/г1з1 М. еЬ а!.. 1967. Ио1о(Загзку еЬ а\., 1970).

Данная серия экспериментов посвящена выяснению возможностей индуцирования микроокруяения» пригодного для пролиферации и диффе-ренцировки гемопоэтических клеток у мышей .облученных в дозе 4,5 ву, и у радиохимер. В опытах использовали взрослых мышей СВА в качестве доноров и И (СВА х С-7В1) в качестве реципиентов. Де-кальцинированный костный матрикс имплантировали нормальным реципиентам и реципиентам: 1 - облученным в дозе 4.5 йу за 2 часа до имплантации; 2 - облученным в дозе 12.0 Су; 3 - облученным в дозе 12,0 ву и получившим внутривенную инъекцию 1Оплеток костного мозга. Сроки фиксации 12-81 день. Исследовано 104 трансплантата.

Имплантация необлученным мьшаы Р1. У необлученных реципиентов через 12 дней после подсадки в декальцинированном матриксе обнаруживаются зоны резорбции. Часть из них ассоциируется с зонами новообразования хряща. Небольшие участки образованной кости отмечены во всех имплантатах. К 20 - 25 дню количество костной ткани заметно увеличивалось. Внутри сплошных костных пластинок

Таблица 1Р. Результаты трансплантация декальцинироаанного костного ¡¡атрккса нормальным и облученным «ивотнии

Доза облучения /6у/ Кол-во клеток Срок фик- Кол-во Результат«

костного мозга для а/в веедвия сации /дни/ трансплантатов рвзорб- кость цкя хряч кость с хост>»м МОЗГОМ

- 12 20-25 36-52 81 4 г! 8 4 5 ь * I 17

450 — *& ■ 42-58 Ы 5 6 И 7 5 2 ? I 6 8

1200 60 4/24 - 4

1200 10° 19-29 33-51 ш 11 7 3 3 I I 4 2 4 3 г 7 5 :

начинают формироваться полости, на строку которых происходит ре-

популяция кроветворных элементов. Зл менты костного мозга репопу-лируют лишь на строму, заключенную внутри новообразованной кости.

Имплантация индуктора мьшам, облученным в дозе 12,0 Су(табл.10). Из 24 облученных и нелеченкых костным мозгом мьшей 20 погибли в течение 16 дней. Имплантаты у непогибших мышей зафиксированы на 60 день. Новообразованная кость обрамляет полости, заполненные костномозговыми клетками. Для имплангата характерно преобладание эритроидного кроветворения.

Имплантация индуктора мьшам. облученным в дозе 12.0 ву и леченным костным мозгом. В имплантагах. где не обнаружена к 13 - 29 дно индукция, индуктор плотно обрастал соединительной тканью и процессы резорбции в нем слабо выражены. В имплантатах, в которых отмечена новообразованная остеогенная ткань или хрящ, идет интенсивная резорбция матрикса. Одни зоны резорбции заполняются разрастающейся соединительной тканью, другие - ассоциируются с осте-огенной и хондрогенной тканью. К концу месяца в трансплантатах происходит образование костномозговых полостей и. заполнение их кроветворной тканью. Плотность упаковки костномозговых клеток в дальнейшем увеличивается. В 78Х случаев в имплантатах, зафиксированных на 33 - 51 день,присутствует сформированный костномозговой орган. Г1о мере увеличения срока пребывания матрикса в организме реципиента растет доля резорбирующихся имплантатов: на СО день -36.4% имплантатов подверглись резорбции, на 81 день - 57,1% . Ни в одном из имплантатов на 81 день не отмечено присутствия костного мозга. Получение индукции.эктопического остеогенеза у облученных мышей и радиохимер открывает возмокность определения источника кндуцибельных остеогенных клеток-предшественников.

,3.3.4. Использование декальцинированного костного матрикса для стимуляции костеобразования после удаления одонтогенных кист у человека.

Данный раздел работы выполнен совместно с Винниковой Н. И. и Мельниковой Г.Б. (ММСИ им.Н.А. Семашко). Феномен стимуляции костеобразования под влиянием декальцинированного костного матрикса может быть использова в практической медицине,например, в стоматологии. Известно, что при заяивлении костной раны под кровяным сгустком после удаления кист средних и больших размеров часто остается не выполненный костью дефект, уменьшающий

прочность кости, а также наблюдается утолщение альвеолярного отростка, затрудняющее протезирование. Нередко после цистэктомии распадается кровяной сгусток, присоединяется воспалительный процесс, происходит расхождение швов. В связи с этим стимулирование процесса регенерации кости тлеет большое практическое значение. С целью стк.../ляции костеобразования в ране после цистэктомии мы предложили использовать декальцинированный костный матрикс, который предварительно был успешно использован в экспериментальной работе по изучению эктопического остеогенеза.

В отличие от других материалов, приготовленных из костной ткани,, используемых при лечении костных дефектов (лиофилизирован-ная. замороженная или фиксированная формалином кость), декальцинированный матрикс имеет 2 принципиальные особенности. Во-первых, в момент имплантации он не выполняет опорную функции и,во-вторых, индуцирует образование кости из клеток окружающей соединительной ткани. Поэтому его применение в клинике показано в тех случаях, когда не требуется сразу после операции восстанавливать опорную функцию и когда снижены естественные остеогённые потенции. Работа проводилась в два этапа: экспериментальная работа на кроликах и проведение клинических испытаний. При трансплантации матрикса в дефект челюсти кролика к концу второго месяца на рентгенограммах наблюдается практически полное заполнение дефекта. В группе контрольных кроликов дефект остался неизменным. Для приготовления де-кальцинированного костного матрикса для клиники использовали фрагменты бедренных костей и ребер людей, • погибших от травм и сердечно-сосудистых заболеваний. Проведено оперативнее лечение 13 больных по поводу одонтогеннык кист. После удаления оболочки кисты уплотненную поверхность кости трепанировали в нескольких местах бором, после чего полость заполняли щебенкой де-кальцинированного костного матрикса. Возраст больных был 21-80 лет. Через месяц после операции на рентгенограммах отмечалось рассасывание склерозированной костной пластинки, ограничивающей костную полость, и появление вновь образованной костной ткани, идущей по краям раны. В небольших кистах (1,5 - 3 см) полное восстановление костной ткани наблюдалось через 6 кес. В больших кистах (4 - 6 см) восстановление костной ткани на 2/3 наступало через 4-6 мес.. ,а полное восстановление - через 8-14 мес. Результаты свидетельствуют о целесообразности использования индуктора репаративьиго костеобразования в клинических условиях.

3.4. Взаимодействие стрсмальных элементов различного органного происхождения. .

Имеются многочисленные доказательства тесной связи между тимусом - важным органом иммунитета и костным мозгом - основным органом кроветворения. В организме костный мозг и тимус анатомически изолированы, и-один из путей изучения механизмов их взаимодействия заключается в устан злении прямого контакта тканей этих органов в эксперименте, в частности, при гетеротопной-трансплантации или культивировании в диффузионных камерах.

Донорами тимуса и костного мозга служили 1 мес. мыши Р1 (СБА х С57В1), реципиентами - взрослые мыши Р1 (СВА х С57В1) весом 18 - 22 г. В контрольной группе под капсулу почки трансплантировали половину одной доли тимуса, разделенную на 10 фрагментов, в опытной группе - смесь Фрагментов тимуса и костного мозга. Для приготовления смеси костный мозг бедренной кости был поделен на 10 частей. Фрагменты тимуса и костного мозга перед трансплантацией тщательно перемешивали. Сроки фиксации 10, 20 дней, 1, 3, 6, 8 !:ес. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин - эозином или ставили на них ШИК - реакцию. Исследовано 93 трансплантата.

Изолированные трансплантаты тимуса практически воспроизводят его нормальную структуру и достигают полного развития на 2 - 3 месяц . К 6 мес. имеется тенденция к резкому увеличению доли жировой ткани. В смешанных трансплантатах фрагменты костного мозга и тимуса легат изолированно, граница между ними, как правило, четкая. Строма тимуса обеспечивает лимфоидную дифференцировку, а ос-теогенная - гемопоэтическую. Отмечено 3 характерных вида контакта кроветворной и лимфоидной ткани в смешанных трансплантатах: разделение этих двух видов тканей костью, тогда к последней со стороны тимуса обязательно примыкают 2-3 слоя соединительнотканных клеток: разделение компонентов только соединительнотканной прослойкой; непосредственный контакт участков кроветворной и лимфоид-ной ткани. Костномозговая ткань в смешанных трансплантатах имеет некоторые особенности. Костномозговой орган на ранних сроках имеет не совсем типичную морфологическую картину: лишь в од,-ном из трансплантатов кость образовала сплошной костный панцырь, в остальных - она как бы "не успевала" за развитием костного мозга. В этих трансплантатах развитый костный мозг не пол-

костью покрыт сверху костным чехлом. До 6 мес. количество костного мозга прогрессивно увеличивается. В поздних трансплантатах костный мозг имеет костный чехол сверху, как ;в изолированных костномозговых трансплантатах. В некоторых 20-дневных трансплантатах было отмечено проникновение тяжей остеогенной ткани в глубину тге^ зского фрагмента. Вокруг них лимфоидная ткань имеет более рыхлую упаковку. После 3 мес. тимический компонент в смешанных трансплантатах содеряит и жировую ткань, доля которой далее существенно увеличивается. К 3 - 8 мес. около 1556 трансплантатов не содержат тимус ,а в остальных еще содержатся небольшие участки тимуса.

При трансплантации смеси суспензий клеток тимуса (107 ) и клеток костного мозга (5 х 10 6) в диффузионных камерах не происходит изменения сроков поддержания остеогенной и кроветворной ткани по сравнению с изолирова'—ым костномозговым трансплантатом. Достоверного роста тимического зпителия в камерах не отмечено. Лимфоидные элементы виде небольших скоплений располагались диф-фузно по поверхности фильтра. В тех случаях, когда между костномозговыми и облученными в дозе 40,0 Су химическими компонентами помещали фильтр НА (величина пор 0,45/«). не наблюдали изменения динамики развития кроветворного компонента, но происходило замедление процесса созревания костной ткани.

Несмотря на кажущуюся независимость существования двух пространственно разобщенных органов - костного мозга и тимуса, они тесно взаимосвязаны. Именно из костного мозга предшественники Т-лимфоцитов мигрируют в тимус. Будучи в костном мозге, эти пред-пественники через гуморальный продукт gp22 оказывают хелперное действие на колониеобразующую активность СКК (Мирошниченко И.В. и др., 1989. Ярилин A.A. и др., 1987, Yarilin A.A. et al., 1990). Тимэктомия мьшей сникает скорость миграции стволовых клеток из костного мозга и угнетает их гранулоцитарную дкфференциропку (Петров Р.В. и др.. 1976). Трансплантация костного мозга от ти-мэктомированных доноров интенсифицирует дифференцировку СКК в эритроидном направлении (Петров Р.В.. Манько В.Й. и др., 1979). Возрастная инволюция тимуса у старых мышей сопровождается угнетением гранулоцитарного ростка (Хаитов P.M. , Рябова Л.В., 1978). Показано, что у мышей иммунодефицитных линий HRS и С58 возрастает число колоний гранулоцитарного типа. Интересно отметить, что у

мышей nude отношение эритроидных колоний к гранулоцитарным соответствует показателям у эутимусных мышей (Ватырбеков А., 1990). При использовании хромосомной метки выяснено, что при в/в введении клеток костного мозга облученным мышам метка обнаруживается в тимусе раньае. чем в селезенке и лимфоузлах (Harris H., Ford C.B.. 1974, Ford С.Е., Micklem H..1960 - 1963). Во взрослом организме тимус подвергается возрастной инволюции, и возраст животного оказывает большое влияние гг развитие трансплантата. Учитывая это, использовали в качестве доноров одномесячных мышей. По данным Metcalf D. (1963), при трансплантации тимуса под капсулу почки в 100% наблюдается регенерация ткани, тогда как 10 % трансплантатов под кожу гибнет. Вес трансплантатов под капсулу почки в 3-6 раз больше, чем при подкожной пересадке. Это послужило нам основанием для выбора места трансплантации. Трансплантация тимуса тимэктомированным при рождении швам нормализует картину крови, состояние периферических тканей, реакцию на гомотрансплантат, продолжительность жизни. Поскольку с помощью хромосомных маркеров показано, что через 12-14 дней после пересадки в трансплантате содержатся исключительно клетки донора, через 10 - 13 недель 7S -100% клеток принадлежат реципиенту (Miller I.. 1962:1963, Harris P.et al., 1963). можно говорить о том, что строма донора.играет существенную роль в развитии Т-лимфоцитов (Беляков И.М.. Ярилин А. А.. 1992). Этот вывод подтверждают и опыты по трансплантации тимуса в диффузионной камере тимэктомированным животным. У таких животных происходит восстановление трансплантационного иммунитета и способности продуцировать гуморальные антитела, но уровень лимфоцитов в крови, лимфоузлах остается низким (Miller I., Osoba D., 1963; 1964), что можно объяснить,например, отсутствием короткодис-тантных факторов строш тимуса. Регулирующая роль стромы отмечена в процессе онтогенетического развития тимуса (Dapper G..Crouse D., 1982; Kieran M. et al., 1989). Возрастная инволюция тимуса сопряжена с изменением строш, в частности, со снижением экспрессии маркеров la АГ и ТЕЗ (McForland Е. et al., 1984). Клетки стромы разного происхождения (экто- и эндодермального) создают зоны ыикроокружения. различающиеся по способности обеспечивать дифференцировку Тн и Ts (Defresne M.'. Boni ver M., 1985). Следует отметить, что авторы уделяют основное внимание эпителиальному компоненту, отвечающему за формирование генетической рестрикции ответа Т-клеток на антигены, а не ретикулярным клеткам.

Последние в тимусе не достаточно хорошо изучены, хотя ухе известны маркеры этих клеток: у мышей ER TR4, у человека - кератин. IP 1.2; LE 61; ТЕЗ. MR 3.6; ИНС1, реже МКС1И la). Полученные нами данные свидетельствуют о том. что в смешанных трансплантатах строма определяет направление дифференцировки репопулирующих на нее клетог. - предшественников. Каждый из компонентов в смешанных трансплантатах обеспечивает развитие фрагмента аналогичного исходному органу. Особенность этих трансплантатов заключается в интенсивном росте кроветворной ткани. Нарушена некоторая синхронность роста кроветворной и костной ткани в ранних трансплантатах. Возможно, факторы, выделяемые Т-лимфоцитами, стимулируют рост ге-мопозтической ткани, с одной стороны. G другой стороны, показано, что например ТНФ-бета фактор, выделяемый Т-лимфоцитами, обладает способностью не только резорбировать уже имеющуюся кость, но и инпибирует образование кости (Inompson В. et al., 1982; Bertollni D. et al.. 1986). Горская Ю.Ф. <1983) показала, что клетки, имеющие Thy-1 маркер, т.е., по-видимому. Т-лимфоцита, in vitro могут вырабатывать активность, ингибирующу» рост остеогенных клеток. В совместных трансплантатах па мере жирового перерождения тимичес-кого компонента уменьшается- его влияние на судьбу остеогенной ткани трансплантата. Может быть, именно за счет фактора, выделяемого облученными Т-лимфоцитами^ происходит замедленное созревание костной ткани: на фильтрах диффузионных камер на 20 день присутствует -лишь фосфатазоположительная остеогенная ткань. В диффузионных камерах не отмечено достоверного роста эпителия, что может быть объяснено тем, что необходимы иные оптимальные количественные сочетания клеток тюедса и костного мозга, или их конкурентными взаимоотношениями. Ода»из путей к изучению роли микроокружения в иммунитете, в частности, в инфекционном, заключается в экспериментальном создании сметанных лимфо-нроветворных органов. Для анализа этого вопроса весьма плодотворным окажется метод трансплантации смесей кроветворных и лимфоидных клеток в губках. Преи-ыущество такого метода трансплантации в следующее контакт между разными типами клеток теснее, в суспензии, чем в гетеротопных трансплантатах; формирование, кроветворных и лимфоидных структур будет происходить в трехмерном1каркасе.

3.5, Формирование лимфоидного микроокружения при гетеротоп-ной трансплантации лимфоидных органов местного иммунитета.

При гетерси'опной трансплантации лимфоидной ткани селезен-

ки,тимуса.лимфоузлов происходит формирование de novo лимфоидных органов аналогичных исходны» (Metcali D.,1965;Leuchars E.et al., 1978.Дидух M.С.1969.).При этом воспроизводятся специфические особенности стромы:у тимуса.например, сильно или слабо реагировать на разные АГ и вступать в реакцию с клетками, участвующими в иммунологических реакциях(Zinkernagel R.,-1961).Показано,что стромапь-ные фибробласты селезенки переносят специфическое микроокруае-ние.на котором репопулирующие В-клетки проходят весь путь гистогенеза вплоть до АТ-образующих кпеток(Чайлахян Р.К., 1993).Известно, что в лимфатических лимфоузлах,ответственных за формирование вторичного иммунитета доминируют IgA-продуценты, в остальных-IgG-синтезирующие клетки.В данной серии опытов предстояло выяснить, способна ли строма лимфоидных органов вторичного иммунитета при гетеротопной трансплантации избирательно поддерживать диф-ференцирорку Т-клеток различных субпопуляций, В-клеток, продуцирующих антитела разных классов,в частности, IgA.

Паховые лимфоузлы,фрагменты мезентериальных лимфоузлов, равные по величине паховым,фрагменты 1/6 селезенки-нативные и облучение в дозах 1,5;3,0;4,5 Gy-трансплантировали под капсулу почки, Преимущество модели:регенерация трансплантата сопровождается элиминацией со стромы пересаженных кроветворных и лимфоидных клеток и последующей репопуляцией трансплантата вновь пришедшими предшественниками гемо-и лимфопозза реципиентского происхождения. Определяли степень регенерации трансплантатов по восстановлению общей клеточности, популяции антителообразующих клеток(АОК) и различных субпопуляций Г и В-лимфоцитов, реагирующих на митогены ФГА,Кон А, ЛПС E.coli(РТБЛ). С помощью прямого метода иммунофлюо-ресцирующих антител определяли наличие IgG и IgA-продуцентов в трансплантатах мезентериальных и паховых лимфоузлов.

К 30 дню после трансплантации количество клеток в пересаженных паховых лимфоузлах достигает исходного уровня.а в трансплантатах селезенки и мезентериальных лимфоузлов -50-7IX от исходного уровня.Облучение в дозе 4,5Gy подавляет процессы регене- ' рации пересаженных Фрагментов лимфоидной ткани. Количество . клеток в трансплантатах селезенки достигает лишь 1/2-1/3 исходного количества клеток,1/5 - 1/7 - в трансплантатах мезентериальных и паховых лимфоузлов.Количество АОК на 10 клеток в нормальных трансплантатах мезентериальных и паховых лимфоузлов составляет около 55Е от исходного уровня,селезенки - существенно выше. АОК в облученных

трансплантата«. (4,5> СуУсоставляет от соответствующих величин нормальных трвйСшеотаяев для селезенки 0.656, мезентериальных лимфо-узлов-0,3%,да» гахошх-О, ГЖ. В РБТЛ при добавлении ФГА в культуры клеток лиыфоида&м органов показано, что популяция предшественников Т^лиифощигов1 наименее выражена в селезенке и наиболее развита в глхсвш лимфоузла« (рис.3). При пересадке лимфоидных

ЯмйАммы'&Ат^десф!*»«» жмфошгм т>» тшт** «V 4 инщ лмфс««*«

I

|

1 щ

1

Г 1 1 Г^ Л,

¡Г1"

I Р»*С(М а * К-Т?»* фор» »4*» дчифоцло» ВО!

' »дмжю« Ко» Л а жгя1тг?*ж ы«» кмфаоАмш

Гргамо» с м »р**ги»кг*»в», амамо егму»«««* >

х

1 4

ГУ

«•ОриМкМИ

Гра>СвЛАИ(«Т« ТркМАДкХТПМ

органов популяция Т^-предшественников в трансплантатах селезенки близка к исходному уровню, слегка увеличена в трансплантатах мезентериальных лимфоузлов и втрое снижена в трансплантатах паховых лимфоузлов. В облученных трансплантатах динамика восстановления предшественников Т2-лимфоцитов- отличается от таковой в нормальных трансплантатах. В трансплантатах селезенки регенерация популяции этих клеток задержана. Наиболее резкое подавление популяции этих клеток выявлено в трансплантатах мезентериальных лимфоузлов. Данные, полученные в- РТБЛ при добавлении в культуры клеток трансплантатов лшфоузлов Кон А, свидетельствует о том, что количество предшес зенников в популяции Т -клеток в 1,5 раза увеличивается в трансплантатах селезенки и резко (в 9 раз) возрастает в трансплантатах мезентериальных лимфоузлов. В трансплантатах паховых лимфоузлов популяция Тх-предшественников, »наоборот, снижается вдвое. В облученных в дозе 4,5 йу трансплантатах паховых лимфоузлов количество Т^-предшественников остается таким же, как в нормальном трансплантате, в то время как в селезенке популяция этих предшественников резко подавляется.Данные по ингибирование Т^-популяции в трансплантатах мезентериальных лимфоузлов статис-

тически недостоверны (рис.4)-. Анализ данных, полученных при постановке РВТЛ с ЛПС E.coll, показал, что количество В-предшествен-ников в трансплантатах селезенки и паховых лимфоузлов остается на уровне исходных органов, в трансплантатах мезентериальных лимфоузлов увеличивается в 2.5 раза (рис.5). С учетом данных по коли-

честву АОК, ' определенных методом Ерне, можно утверждать, что в трансплантатах селезенки и паховых лимфоузлов количество В-пред-шественников остается на уровне исходных органов, но блокирован процесс их дальнейшей дифференцирован. В трансплантатах мезенте-риалыих лимфоузлов количество В-предоественников возрастает в 2,5 раза, в то время как количество АОК резко снижено. В облученных трансплантатах доля популяции В-предшественников снижена в несколько раз во всех видах трансплантатов лимфоидной ткани.

С помощью прямого метода Кунса при нанесении анти-IgA-CbiBO-ротки (Sigma) и aHTH-IgG-сыворотки (Sigma) в разведении 1:16 на замороженные гистологические срезы показано.что именно сохранившаяся строма трансплантированных органов обеспечивает поддержание и дифференцировку репопулировавших В-лимфоцитов в том же направлении, что и строма нативных органов: в 3-х месячных гетеро-топных трансплантатах мезентериальных лимфоузлов около 80% анти-телообразующих клеток принадлежат к IgA-продуцентам, тогда как в трансплантатах паховых лимфоузлов практически все клетки, образующие антитела, относятся к IgG-продуцентам. В данных опытах не определяли степень химеризма лиыфоидной ткани трансплантата. Учитывая данные Дидух N.C., Фриденштейна А. Я. (1969. 1970) о степени химеризма в трансплантатах лимфоузлов, можно утверждать, что уже

в 3-мес. трансплантатах 75-10055 лимфоидных клеток принадлежат реципиенту, и, следовательно, ^-продуценты в исследованных трансплантатах мезентериальных лимфоузлов в основном принадлежат не донору, а реципиенту. В гетеротопных трансплантатах мезентериальных лимфоуз лов строма донорского типа в течение, по крайней мере, 3-х месяцев поддерживает гистогенез В-клеток в направлении ^А-продуцен-тов.

Полученные данные свидетельствуют, что облучение в дозах 1.5-3,0 Су не препятствует восстановлению стромы кроветворной ' ткани,но приводит к выраженному повреждению стромы лимфоидных органов. Доза облучения 4,5 йу усугубляет эту ситуацию.Строма не восстанавливается по рассмотренным тестам (АОК, РБТЛ)в течение 2 месяцев после облучения. Показано,что в мезентериальных лимфоузлах. относящихся к органам вторичного иммунитета, в условиях гете-ротопной трансплантации перене иная строма донора способна поддерживать дифференциггавку репопулирующих предшественников АТ-син-тезирующих клеток реципиента до ígA-cинтeзиpyющиx клеток.

ВЫВОДЫ.

1. Выявлена линия стромальных клеток, ответственных за перенос и Формирование кроветворного и лимфоидного микроокружения.

2. На моделях универсальных Р1 реципиентов, радиационных химер, толерантных и иммунизированных по секс-антигенам животных, с помощью хромосомных маркеров и дискриментного иммунологического анализа впервые показано, что в кроветворной и лимфоидной ткани зрелые и пролиферирующие стромальные клетки, • а по функциональным тестам и клетки - предшественники составляют стромальную линию, гистогенетически независимую от стволовых кроветворных клеток.

Стромальные кпетки-предшественники этой линии, выявляемые в монослойных культурах костного мозга из семисингенных трансплантатов и от радиационных химер, по данным типирования по изоанти-генам гистогенетически независимы от стволовых кроветворных клеток.

3.Установлено,что длительно существующие ге^еротопные трансплантаты костного мозга и лимфоидной ткани представляют собой химерные структуры. . в которых гемопозтическая и лимфоидная ткань принадлежит реципиенту, а стромальная - донору.

Выяснено, что при трансплантации костного мозга под капсулу почки не происходит индукции кости из окружающих трансплантат тканей.

4. При ретрансплактации костного мозга из семисингенных ге-теротопных трансплантатов (CBA->F1) и костного мозга радиохимер на линию донора и реципиента показано, что стромальные элементы не способны к репоиуляции и саыоподдержание, восстановление пула этих клеток происходит за счет местных стромальных элементов, но не за счет стволовых стромальных клеток, введенных внутривенно или мигрирующих из неповрежденных участков кроветворной ткани.

. 5. Продолжительность самоподдержания стромальной линии клеток соизмерима со сроком жизни животного. При серийных- гетеротоп-ных трансплантациях в условиях стимулирования стромальных клеток к образованию новой костной ткани линия стромальных элементов первичного донора успешно самоподдерживается в течение 3-4 пассажей. Пул стромальных костномозговых клеток, обеспечивающих пере-ьос микроокружения, способен к самоподдержанию в условиях 4-кратного облучения в дозе 4,5 Gy (интервал 24 дня).

6. Формирование гетеротопного костномозгового органа при трансплантации костного мозга в виде фрагментов или взвеси клеток в желатиновых губках - это не перенос готовых стромальных структур, а процесс формирования микроокружения dc novo, при этом воспроизводятся онтогенетические особенности развития кроветворной ткани. Размер образованного костномозгового органа зависит от исходной клеточной плотности и величины поверхности пересаженной ткани. Эта зависимость многофакторная.

В качестве важного относительного количественного критерия, который может быть использован для сравнительного анализа факторов, воздействующих на размеры специфического микроокрукения при трансплантации, рекомендовано ввести понятие "эффективность переноса микроокружения" (ЭПМ - соответствует отношению количества гei.tonoзтинеских клеток во вновь образованном костномозговом органе к количеству кроветворных клеток в трансплантате в исходный момент).

7. Проанализировано влияние ионизирующего облучения на перенос и поддержание кроветворного и лимфоидного микроокружения.

Определена радиочувствительность процесса переноса специфического кроветворного микроокружения. Do равно 1,7 Gy при п =.2,6 (при трансплантации 1/4 фр.агмента костного мозга одной бедренной кости взрослой ши).

Факторы облученного организма способны влиять на величину гетеротопного костномозгового органа. При трансплантации костного

- ьз -

мозга мышам, облученным в дозе 4,5 Су, величина гетеротопного стромального плацдарма для кроветворения увеличивается в 2 раза.

Восстановление остеогенных потенций и способности к переносу кроветворного ыикроокружения костного мозга радиационных химер происходит за счет детерминированных остеогенных клеток стромы реципиент не ранее 26 дня после облучения.

Динамика пострадиационных изменений микроокружения после локального облучения бедренных костей животных в дозах 10^0 - 50,0 йу показывает, что клеточные элементы стромы, обеспечивающие поддержание пролиферации и дифференцировки репопулирующих на эту строму стволовых кроветворных клеток, имеют длительный жизненный цикл. Нарушение функции регуляции кроветворения происходит между 2-4 неделями после облучения, что соответствует срокам развития феномена вторичной аплазии.

8. Впервые при транспла ации декальцинированного костного матрикса мьшам, облученным в дозе 4.5 Су. и радиационным химерам, получена индукция кроветворного микроокрунения.

9. Изучена возможность применения в клинике декальцинированного костного матрикса в качестве индуктора репаративного косте-образования для лечения одонтогенных кист в тех случаях, когда не требуется сразу после операции восстанавливать опорную функцию и когда снижены естественные остеогенные потенции организма.

10. Установлено, что при совместной гетеротопной трансплантации костного мозга и тимуса, стропа каждого из компонентов сохраняет свою специфичность и обеспечивает формирование фрагментов, аналогичных исходным органам.

11. Показано, что при трансплантации лимфоидных органов вторичного иммунитета (ыезентериапьных лимфоузлов) сохраняется специфичность стромы. обеспечивающая дифференцировку ^-продуцентов, что характерно только для этой категории органов.

12. Опреде,.она ведущая роль стромы в процессе формирования костномозговых и лимфоидных органов при гетеротопной трансплантации костного мозга и лимфоидной ткани. Выявлены закономерности развития этих гетеротопных органов. Доказано наличие гистогенети-чески независимой линии стромальных клеток, переносящих специфическое микроокруаение,обеспечивающее пролиферацию и дифференцн-ровку кроветворных клеток.Совокупность полученных данных послужила фундаментом для создания концепции специфического кроветворного и лимфоидно! э мжроокружения.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ДОЛОЖЕНЫ НА:

1. IX Международном конгрессе анатомов. Ленинград. 1970.

2.Всесоюзных конференциях го радиационной иммунологии и микробиологии. Москва. 1972, 1977.

3. На Ylli Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов. Ташкент, 1974.

4. Всесоюзной конференции по общей и прикладной иммунологии.Москва. 1974.

5. Координационном совещании по проблеме "Клетки-предшественники для кроветворной ткани . Москва, 1977.

6. VI Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов.Москва. 1979.

7. IX Международном симпозиуме по сравнительному изучению лейкозов

8. Всесоюзной конференции 'Актуальные вопросы иммунологии". Москва. 1Э81.

9. Международном симпозиуме "Стромальная и Т-клеточная регуляция кроветворных стволовых клеток". Москва, 1984.

10. Всесоюзном симпозиуме "Кроветворные клетки-предшественники в механизмах повреждения и консолидации системы крови при действии на организм экстремальных факторов". Челябинск, 1986.

11. Всесоюзном обществе иммунологов. Москва, 1986, 1989.

12. Всесоюзном обществе анатомов, гистологов, эмбриологов. 1987, 1990.

13. XXV Международном конгрессе гематологов. Канкун, Мексика, 1994. *

14. XII Европейском съезде иммунологов. Барселона, 1994.

15. Всероссийском обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Московское отделение). Секция общей и прикладной иммунологии. 1994.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга. -Цитология. -1968.-т. 10.-N 5./соавторы: Фриденштейн А.Я.,Петракова К.В., Фролова Г. П. /.

2. Precursor cells for osteogenic and hemopoletlc tlssue.Analysis of heterotopic transplants of bone marrow.-Transplantation. -1968. -N 2. /соавторы: Фриденштейн A.Я.. Петракова К. В., Фролова Г. П. /.

3.Гетеротопные трансплантаты костного мозга толерантных животных. -Бюлл. экспер. биол.мед.-1970.- N 7.

4. Клетки кроветворной и лимфоидной ткани как источник пополнения остеогенной ткани у взрослых млекопитающих.- Материалы IX Международного конгресса анатомов. Ленинград.-1970./соавторы: Фриденж-теин А. Я., Лалыкина К. С. /.

5.Остеогенные потенции костного мозга облученных мышей, выявленные гетеротопной трансплантацией.-Бюлл. экспер.биол. мед.-1971.- N 6.

6. usteogenic precursor cells of bone marrow in radiation chime-ras.-Transplantation.-1971.-N 2./соавтрр: Фриденштейн A.Я./.

7. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга радиохимер. Анализ методом гетеротопной трансплантации.-Онтогенез.-1971.-N 5.

/соавтор: Фриденштейн А.Я./.

8. Взаимоотношения стволовых кроветворных клеток и стромальных элементов костного мозга и селезенки у радиационных химер.-Вопросы радиационной иммунологии и микробиологии. Москва. -1972.

9.Гистогенетические отношения между стромальными и кроветворными клетками в гетеротопных трансплантатах селезенки.- Онтогенез. -1973.- N 6. ■

10. Определяющая роль строш тимуса в дифференцировке иммунокомпе-тентных 1слсток. -Материалы Всесоюзной конференции по общей и прик-лляи.'Ч иммунологии. Москва. -1974. /соавтор: Афанасова Л. А. /.

11.0 восстановлении остеогенных свойств костного мозга после облучения по данным гетеротопной трансплантации.-Бюлл. экспер. биол.мед.

12. Влияние некоторых факторов на дифференцировку стволовых гемо-поэтических клеток.-Онтогенез.-1976. - N 2. /соавторы:Каулен Д. Р., Голованова Т. А.. Хоробрых В. В. /.

13. Происхождение стромальных механоцитов в культурах костного мозга по данным исследования с изолинейной сывороткой. -Бюлл. экспер.биол.мед.-1976. -N 10. / соавторы: Иванов-Смоленский A.A., Горская L. Ф., Лациник Н. В./.

14. Анализ методом гетеротопной трансплантации стромальных элементов костного мозга, ответственных за создание специфического микроокружения. -Сборник научных трудов "Радиационная микробиология и иммунология". Москва.-1977./соавтор: Филякина Н. С./.

15. Факторы, влияющие на объем микроокружения костного мозга при гетеротопной тоансплантации. -Тезисы координационного совещания по проблеме "Клетки-предшественники для кроветворных тканей".- 1977. /соавтор: Филякина Н. С./.

16. О происхождении стромальных механоцитов костного мозга радиохимер и гетеротопных трансплантатов по данным исследования с антилинейными сыворотками. - Тезисы координационного совещания по проблеме "Клетки-предшественники для кроветворных тканей".- 1977. /соавторы: Иванов-Смоленский А. А. и др./.

17. Происхождение стромальных механоцитов костного мозга по данным их типирования по и?оантигенам и хромосомным маркерам.-Онтогенез. -1978. -т. 9. -N 3. /с вторы: Иванов-Смоленский А. А., Чайлахян Р. К., Герасимов Ю. В.. Горская Ю. Ф., Лациник Н. В. /.

18. Origin of bone narrow stromal In radlochimeras & heterotopic transplants melanocytes.-J. of Exper. Hematol.-1978. - N 6./соавторы: Фриденштейн А.Я.. Иванов-Смоленский A.A.. Чайлахян P.К.. Герасимов Ю. В.. Горская D. Ф. /.

19. Развитие кроветворной и лимфоигной тканей в совместных трансплантатах костного мозга и тимуса. - Онтогенез. -1978. /соавтор: Афанасова Л. И. /.

20. Перенос кроветворного микроокружения при гетеротопной трансплантации костного мозга.-Актуальные вопросы пересадки органов и тканей.Груды института.-1978.-Выпуск 3./соавторы:Григулевич Н.С., Филякина Н.С. /.

21. Перенос кроветворного микроокружения с помощью гетеротопной трансплантации костного мозга.- 1 Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов, тезисы докладов.Москва. -1979. / соавторы: Филякина Н. С.. Григулевич Н. С. /.

22. Стромальные механоциты костного мозга: клонирование в культу-ах и создание кроветворного микроокружения.-Тезисы материалов iX еидународного симпозиума по сравнительному изучению лейкозов.

-1979./соавторы: Фриденштейн А. Я., Лациник Н. В., Лурия Е. А.. Кузнецов В. А. /.

23. Образование кроветворных территорий при гетеротопной трансплантации костного мозга. -Онтогенез. -1980. -т. 11. -No. /соавторы: Лациник Н. В.. Сидорович С. Ю., Григулевич Н.И., Лазоренко-Маневич Е., Филякина Н. С.. Фриденштейн А. Я./.

24. Использование декальцинированного костного ма-Грикса для стимуляций костеобразования после операции цистэктомии по поводу одон-тогенных кист. -Стоматология.-1981.-Мб./соавторы: Винникова Н.И., Мельникова Г.Б.. Филякина Н.С./.

25. Клетки, создающие кроветворное и лимфоидное микроокружение: свойства, влияние внешних факторов и регуляция антителоооразова-ния в культурах. -Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы иммунологии".Москва. -1981./соавторы: Генкина E.H.. Герасимов Ю. В., Го^акая Ю. Ф. , Григулевич Н. И., : узнецов С. А., Кулаги-

на H. H.. Лурия E. A.. Сидоренко A. В., Чайлахян P. К. /.

26.Действие бактериальных антигенов к микоплазм на дифференциров-ку кроветворных клеток-предшественников и иммуногенез. - тезисы докладов 1 Всесоюзной конференции "Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология". Москва.-1982./соавторы: КауленД. Р., Санин А. В., Хоробрых В. В., Бертенева Н. С., Маликов В. Е., Горская Ю. Ф. /.

27.Клетки-переносчики кроветворного микроокруяения.-Итоги науки и техники. Серия "Иммунология". Москва. -1983. -т. 12. /соавторы: Фри-денштейн А. Я., Лациник Н. В., Чайлахян Р. К.. Горская Ю. Ф., Сидоро-вичС.Ю., Герасимов D.В./.

28. Количественные характеристики переноса гемопоэтического мик-роокрукения. -Бюлл. экспер. бипл. мед. -1984.- N 12. /соавторы: Ле-онтович A.M., Круковец И. Л., Фриденштейн А. Я./.

29. Образование' костной ткани при гетеротопной трансплантации на трехмерных каркасах клеток костного мозга и выращенных из них фибробластов. -Материалы съезда анатомов, гистологов, эмбриологов. Винница. -1986. /соавторы: Чайлахян Р. К., Трошева А. Г., Шишкова В. В./.

30. Количественные характеристики переноса гемопоэтического микроокруяения при гетеротопной трансплантации костного мозга. -Материалы симпозиума "Кроветворные клетки-предшественники при действии экстремальных факторов". Челябинск. -1989. /соавтор: Леонто-вич А. М. /. ■

31. Индукция костной ткани под влиянием декальуинированного мат-икса у облученных мьшей.-Онтогенез.-1994. - в печати./соавторы: аевская М. В., Герасимов Ю.В., Лациник Н. В., Генкина Е. Н. /.

32.Immune response 1п lymphoid organs formed In the place of transplantation of spleen stromal fibroblasts.-ABstract of 12tti European lnuaunology meeting.-Barselona.-1994.-p. S./Chailakliyan I;., Gerasimov Ju.. Latzinic N., Genkina E., S"snovskaia 0./. 33. Transfer of lymphoid nicroenvironaient by the spleen stromal fibroblasts strains and inuaune responce in the ne^ly-foracd organs.-Abstract of XXV Congress of the International society of Hematology.-Cancun, Mexico.-1994.-p.2d7/Ciiallakhyan R., Gerasimov Ju.. Latzinic H., GenkinaE./.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AT - антиген _ AT - антитела

AOK - антителообразующие клетки КОЕс- колониеобразуощая единица селезенки КОКф- клетки, образующие колонии фибробластов СКК - стволовая кроветворная ¡слетка ТИФ - фактор некроза опухоли

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ 0ОНЦ АМН СССР"

ПОДП..К ПЕЧАТИ .94 Я*' - ЗАКАЗ |74Г ТИРА>л|0() ЗКЗ,