Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Морфофункциональная характеристика стромы костного мозга больных гипопластической анемией

РОССИИСКИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

0 '1

и'' На правах рукописи

р " -* Г".

■ I <•- '

ПОНОМАРЕНКО

Владимир Михайлович

УДК: 616.155.194.7-07:612.419.014.2.

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРОМЫ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ГИПОПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ

14.00.29—ГЕМАТОЛОГИЯ И ПЕРЕЛИВАНИЕ КРОВИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — 1993

/

Работа выполнена в лаборатории по изучению лейкозов Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.

Научные руководители: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник В. И. РУГАЛЬ; доктор медицинских наук, профессор К. М. АБДУЛКАДЫРОВ.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В. И. МАЗУРОВ доктор медицинских наук, ст. н. е., Б. В. АФАНАСЬЕВ

Ведущее учреждение — 1 Санкт-Петербургский медицинский институт имени академика И. П. Павлова.

¿^ ОЗ- О

Защита состоится « » 199 ' г. в ( > часов

на заседании специализированного совета 084.19.01 Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ч 1 1'д

Автореферат разослан « » 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских паук В. С. БЫКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. До настоящего времени гипопластическая анемия (ГА) остается малоизученной патологией с высокой летальностью. В значительной степени это связано с тем, что сведения о патофизиологических изменениях при развитии ГА являются разрозненными, и отсутствует достаточно стройная и приемлемая концепция патогенеза. Естественно, недостаток данных о патогенетических процессах, происходящих при этом заболевании, не позволяет всеобъемлюще и эффективно подойти к проблеме лечения больных ГА. В последнее десятилетие с помощью иммунологических, культуральных и биомолекулярных исследований были выявлены определенные функционально-регуляторные сдвиги при данной патологии, что позволило сделать вывод о нарушении межклеточной регуляции вследствии снижения количества гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и их чувствительности к митогенным факторам (Marsh J. С. W. et. al. ,1991; Najed Y. et. al. , 1990; Nissen C. ,1990.). До сих пор дискутируется вопрос о патогенетических нарушениях, приводящих к развитию недостаточности ГСК (Nissen С. ,1991; Islam А. ,198Ь; Young N. S., 1991;Torok-Storb В. ,1990.). К сожалению имеются весьма скудные данные об изменениях в клетках стромы костного мозга при ГА, хотя хорошо известно, что в постнатальном периоде именно эти клетки несут основную нагрузку в самоподдержании и коммитировании ГСК (Фриденштейн А. Я. ,1980; Islam А. ,1985; Tavassoli М. ,1990; Jacobsen К. et. al., 1990.). Таким образом, выявление возможных морфофункциональных отклонений в клетках стромального микроокружения костного мозга является актуальным аспектом при изучении патогенетических механизмов развития ГА.

Общеизвестно, что специфичность костного мозга, в отличии от других кроветворных органов, заключается в наличие костной ткани, органические и неорганические компоненты которой (особенно, изобилие депонированных в ней высокоактивных микроэлементов) оказывают существенное регуляторное

воздействие на гемопоэтические и стромальные клетки костного мозга, потенциирующее процессы кроветворения (Peck W. А. ,1988;

Нетееаг<1 й ,1989;РагПи А. М,, 1989.). Несмотря на это, практически отсутствуют данные о роли и состоянии костной ткани при нарушениях гемопоэза, поэтому актуальность ее изучения во взаимосвязи с гемопоэтической и стромальной тканями костного мозга при такой депрессии кроветворения, как ГА, не вызывает сомнения.

Для изучения клеток стромальной ткани во взаимоотношении с гемопоэтической и костной тканями при ГА на настоящем этапе исследования наиболее целесообразным и информативным представляется использование методов гистоморфометрии и электронной микроскопии цельных фрагментов трепанобиоптатов костного мозга с постановкой морфофункциональных ультрацитохимических реакций. Совокупность этих методов в изучении костного мозга при ГА крайне затруднена из-за определенных сложностей в обработке и приготовлении биопсийного материала. В настоящее время это стало более доступным благодаря новым модификациям общепринятых методик разработанных в лаборатории по изучению лейкозов НИИ гематологии и трансфузиологии г. Санкт-Петербурга. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выявление морфофункциональных изменений клеток стромального микроокружения и изучение

взаимозависимости между костной, стромальной и гемопоэтической тканями костного мозга при развитии ГА. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить ультраструктурные изменения стромальных клеток костного мозга при ГА по сравнению с клетками здоровых лиц.

2. Дать сравнительную морфофункциональную оценку активности стромальных клеток костного мозга больных ГА и здоровых лиц.

3. Провести гистоморфометрический анализ состояния костной, стромальной и гемопоэтической тканей костного мозга при ГА в сравнении с нормой.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые, представлена сравнительная характеристика ультраструктуры клеток стромального

микроокружения костного мозга здоровых лиц и больных ГА. Получены новые данные о морфофункциональноц состоянии сосудистых, яндостальных, периваекулярных и промежуточных ретикулярных клеток костного мозга при ГА, указывающие на нарушения интрамедуллярной сгрчмальной регуляции

кроветворения. Впервые, на субмикроскопическим уровне проведена

оценка функциональной активности стромальных клеток костного мозга с использованием морфофункциональной классификации ядрышек и метода серебрения области ядрышкового организатора в норме и при ГА. В результате ультраструктурных исследований стромальных клеток костного мозга больных ГА, впервые, при данной патологии, описаны патологические включения, охарактеризованные как провирусные и вирусо-подобные структуры. На основании гистоморфометрических исследований нормального костного мозга и при ГА, впервые получены данные о пропорциональной зависимости. между объемами костной, стромальной и гемопоэтической тканями, как единой взаиморегулируемой системы. Показано участие костной ткани трабекул костного мозга в патогенезе угнетения кроветворения при ГА. Впервые, концептуально доказывается гипотеза о поражении стромального микроокружения костного мозга, как одного из первичных звеньев развития ГА. Проведенные исследования продемонстрировали значимость комплексного использования гистоморфометрических и электронно-микроскопических методов с постановкой • ультрацитохимических реакций при изучении цельных фрагментов трепанобиоптатов костного мозга, как диагностического метода определения морфофункционального статуса стромальных клеток в межтканевых взаимоотношениях с гемопоэтической и костной тканями в костном мозге при ГА.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты могут быть использованы для научных разработок при изучении роли стромы костного мозга в регуляции гемопоэза и ее участии в патогенезе депрессий кроветворения. Применение ультрацитохимического метода серебрения области ядрышкового организатора стромальных клеток костного мозга трепанобиптатов подвздошной кости подтвердило принципиальную возможность электронно-микроскопического изучения функциональной активности этих клеток, как критерия их морфофункционального статуса при гематологических заболеваниях. Субмикроскопическое обнаружение патологических вирусо-подобных структур в стромальных клетках костного мозга при ГА, как возможного признака их поражения, может иметь значение для изучения этиологических, патогенетических и прогностических факторов, а также учитываться при разработке новых методов ведения и тактики

лечения больных ГА. Данные об участии костной ткани в патогенезе ГА и о существовании пропорциональной взаимозависимости между •костно-мозговыми тканями расширяют возможность дифференциальной диагностики этого заболевания, что необходимо для наиболее обоснованного выбора терапевтической тактики. Критерии гистоморфометрической и ультраструктурной оценки состояния стромального микроокружения костного мозга человека могут быть использованы при анализе данных трепанобиопсий больных с различными заболеваниями системы крови и для выявления качественных и количественных изменений клеточных элементов микроокружения в условиях нарушенной гемопоэтической функции.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Комплекс гистоморфометрических и электронно-микроскопических методов исследования

трепанобиоптатов костного мозга подвздошной кости внедрены в повседневную работу цитологической лаборатории по изучению лейкозов НИИ гематологии и трансфузиологии г. Санкт-Петербурга. Материалы диссертации используются при проведении занятий с курсантами циклов усовершенствования врачей ГИДУВ'а г. Санкт-Петербурга.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации

докладывались и обсуждались на 2-м Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Челябинск,1986г.); на 2-м Украинском съезде гематологов и трансфузиологов (Киев,1986г.); на 2-м съезде гематологов и трансфузиологов Польской Народной Республики (Люблин,1987г.); на конференциях молодых ученых ЛНИИГПК (Ленинград, 1988г.) и КНИИГПК (Киров, 1988г.); на 2-м съезде терапевтов Киргизии (Фрунзе,1988г.); на 2-й научно-практической конференции врачей цитологов

(Рига,1989г.); на 3-м съезде гематологов и трансфузиологов Узбекистана (Ташкент,1990г.); на 2-м съезде гематологов и трансфузиологов Азербайджана (Баку,1990г.); на заседании городского общества гематологов и трасфузиологов (Ленинград, 1990г.); на международном симпозиуме "Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка" (Москва, 1990г.); на международном симпозиуме "Современные направления лечения лейкозов человека" (Санкт-Петербург,1992г.); на 24-м Всемирном конгрессе международного общества гематологов (Лондон,1992г.); на 12-м Европейском конгрессе международного общества

гематологов (Бена,1993г.); на 22-м Всемирном конгрессе международного общества экспериментальных гематологов (Роттердам, 1993г.).

По изучаемой проблеме опубликовано и принято в печать 30 работ, из них: 8 в зарубежной печати и 10 в отечественных центральных журналах, в которых отражено основное содержание диссертации.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Основной материал изложен на 134 страницах и иллюстрирован 3 таблицами и 40 рисунками. Библиография включает 474 источников ( 42 отечественных и 432 иностранных).

- 6 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В основу работы положены результаты ультраструктурного и ультрацитохимического исследования костно-мозговых стромальных клеток, а также данные гистоморфометрического исследования костной (костная ткань трабекул), стромально-адипозной (с учетом жирового перерождения всех стромальных клеток) и гемопоэтической ткани костного мозга здоровых лиц и больных ГА. Изучен материал 60 трепанобиопсий костного мозга подвздошной кости, из них: 20 здоровых лиц( "Н" - нормальный костный мозг),. 20 больных ГА с содержанием гемопоэтической ткани в костном мозге менее 20%, но более 5% ("Г" - гипопластический костный мозг) и 20 больных ГА с содержанием гемопоэтической ткани менее 5% ("А" -апластический костный мозг). В результате исследования проведен сравнительный ультраструктурный анализ клеток, составляющих строму костного мозга, и обобщены гистоморфометрические данные о взаимоотношениях между тканями, формирующими костный мозг. Диагноз ГА устанавливался на основании клинических данных, исследований периферической крови, пунктатов грудины и трепанобиопсий подвздошной кости. Под наблюдением находилось 40 больных ГА 18-50 лет. У всех больных в анамнезе имелись указания на частые респираторные заболевания, у 18 из них - на контакт с вредными веществами (бензин, урсол, пары азотной кислоты и др.), у 2-х - на перенесенную инфекцию вирусом гепатита. Получение материала для гистологического и электронно-микроскопического исследования больных осуществлялось до начала

иммуносупрессивной терапии. Трепанобиопсию производили в области задней ости подвздошной кости с помощью иглы-трепана Jannshidi. Получали столбик костного мозга длинной не менее 20 мм. Для гистологического исследования трепанобиоптаты фиксировали в ценкер-формоле, декальцинировали и заливали в парафин. Готовили срезы толщиной 5 мкм и окрашивали их азуром-2-эозином. При морфометрическом исследовании гистологи-. ческих препаратов костного мозга высчитывалось процентное содержание костной, стромально-адипозной и гемопоэтической тканей в единице площади с помощью тест-гточек окулярной сетки по

Автандилову (1973), что сопоставимо с объемами этих тканей. Количество остеоидных клеток в единице площади подсчитывали с помощью мелкого квадрата окулярной сетки.

Для электронной микроскопии биопсийный материал костного мозга фиксировали в 0,5% растворе глутаральдегида на 1М како-дилатном буфере (рН-7,4) в течении суток с последующей до-фиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере в течении 1,5 часа. После дегидратации в батарее спиртов восходящей концентрации материал заключали в ЭПОН-812 с полимеризаций в течении суток. Серийные срезы готовили на ультрамикротоме L.KB-5 и окрашивали спиртовым раствором уранилацетата и цитрата свинца. Просмотр и фотографирование серийных срезов стромальных клеток осуществлялся на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-7A при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Для ультрацитохимического маркирования клеточных мембран стромальных клеток костного мозга использовали 0,3% раствор рутениевого красного и 1,5% раствор альцианового синего, которые являются специфическими красителями гликозаминогликанов, а последний связывается и с гликопротеинами плазматических мембран. Эти красители добавлялись в фиксирующие растворы в пропорции 1:3. Обезвоживание в спиртах и заключение в ЭПОН-812 проводилось аналогично вышеописанной стандартной методике. Контролем служили стромальные клетки костного мозга без обработки вышеуказанными красителями.

Ультрацитохимическое окрашивание нитратом серебра области ядрышкового организатора (ОЯО) коитно-мозговых клеток производили по методу Howell & Black (1980) в модификации Ploton et. al (1982) с увеличением сроков инкубации в окрашивающем растворе (Блинова Т. С. 1990). Метод серебрения ОЯО основан на нргерофильности ядрышковых кислых протеинов, главным образом фосфопротеинов, которые также называются аргентум-белками (Hub?] Н. R. 1985, Goodpasture С. et al. 1975, 3chwart?acher Н. G. et al. 1978). Аргентум-белки локализуются в ядрышках на фибриллярных центрах и плотном фибриллярном компонент", что соответствует ^ЯО, но отсутствуют на гранулярном компоненте, н чем и заключается специфичность реакции ''Plot.on P. et at. 198?, Hernandez-Verdum D. et al. 1980). Для выявления <''•?/.> образцы трепанобиоптатоь костного мозга фиксировали я раствора глутаральдегида на 1М какодилатном

буфере (рН-7,4) в течение 20 мин. и дополнительно фиксировали в растворе Карнуа (уксусная кислота: этиловый спирт - 1:3) в течении 10 мин. Следующим этапом проводилась регидратация в батарее спиртов низходящей концентрации, отмывание в 1М какодилатном буфере в течении 20 мин. и окрашивание. Окраска производилась раствором состоящим из одного объема 2% желатины в 10% растворе муравьинной кислоты и 2-х объемов 50% раствора нитрата серебра в течении 1 часа. После окрашивания материал промывали в нескольких порциях Ш какодилатного буфера и помещали в 5% раствор тиосульфата натрия на 10 мин. Затем отмывали в 1М какодилатном буфере, дегидратировали и заключали в ЭПОН-812 по вышеописанной методике. Ультрацитохимическое исследование функциональной активности ядрышек методом серебрения ОЯО проводилось совместно с к. м. н. Т. С. Блиновой.

Результаты научных исследований обрабатывались

математико-статистическими методами, подробно изложенными в соответствующей литературе(Иванов Ю. И. 1990). Достоверность результатов оценивали по критерию Фишера-Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. На материале трепанобиоптатов костного мозга 20 здоровых лиц и 40 больных ГА было проведено сравнительное изучение клеток, составляющих костно-мозговую строму в норме и при патологии, а именно: интрамедуллярных сосудистых клеток, формирующих вазальную стенку; эндостальных ретикулярных клеток, непосредственно прилегающих к костной ткани; периваскулярных ретикулярных клеток, контактирующих с сосудистыми клетками; промежуточных ретикулярных клеток, находящихся в промежутке между эндостальными и периваскулярными клетками.

Интрамедуллярныз сосудистые клетки. При просмотре ультрагонких срезов трепанобиоптатов костного мозга подвздошной.кости больных ГА и здоровых людей была исследована ультраструктурная организация эндотелиальных клеток венозных синусоидов, эндотелиоцитов и гладко-мышечных клеток капилляров, формирующих сосудистую сеть интрамедуллярной паренхимы костного мозга. В нормальном костном мозге выявлялись зндотелиоциты двух типов. В одних имелись крупнк1 ядра с несколько извитыми контурами, .чаще овальные, реже лопастные с умеренной конденсацией хроматина по периферии ядра, с четким преобладанием эухроматина и центрально расположенным ядрышком. Цитоплазма этих клеток была богата оргаяеллами, с хорошо выраженым комплексом Гольджи, развитой гранулярной эндоплазматической сетью, где также выявлялись электронно-плотные гранулы, митохондрии, множественные пйно- и экзоцитозные микропузырьки. Клетки синусоидов другого типа имели уплощенную форму с длинными резко истонченными цитоплазматическими отростками. Ядра в этих клетках были плоские, овальные с грубым конденсированным хроматином по всему сечению, лишь с небольшими участками эухроматина. Ядрышки не выявлялись. Как в перикарионе, так и в маргинальных участках цитоплазмы наблюдалось м&ное количество органоидов: единичные митохондрии с небольшим числом крист и матриксом умеренной электронной плотности, незначительное количество везикул, электронно-плотные гранулы. При изучении срезов костного мозга больных ГА, также как и в норме; выявлялись эндотелиальные клетки синусоидов двух типов. Одни имели цитоплазму богатую органеллами, с расширенными канальцами

зндоплазматического ретикулума, с большим содержанием рибосом, полисом и неспецифических гранул. Ядра этих клеток были со множественными инвагинациями, равномерным распределением плотного хроматина, с небольшим ядрышком и содержали до 4-х патологических внутриядерных включений, с однотипной структурной организацией. Другой тип зндотелиоцктов синусоидов характеризовался цитоплазмой Еытякутой формы и уплощенным ядром с конденсацией хроматина по периферии. Цитоплаэматическая мембрана люминэльной поверхности этих клеток при ГА . окрашивалась альциановым синим и рутениевым красным более интенсивно, чем в норме.

Эндотелиальные клетки капилляров костного мозга, как здоровых людей, так и больных ГА, полиморфизмом ядер, в зависимости от активности и калибра того или иного кровеносного сосуда. Наиболее часто встречались эндотелиоциты капилляров нормального костного мозга имевшие ядра с равномерным распределением эухроматина и небольшим ядрышком. В цитоплазме выявлялись множественные везикулы, единичные мелкие митохондрии и лизосомальные гранулы, микрофиламентозные структуры и другие органеллы, необходимые для жизнедеятельности клетки. При ГА превалировали капилляры с эндотелиоцитами содержащими ядра неправильной изогнутой конфигурации с широким уплотнением хроматина по периферии при наличии одиночного компактного ядрышка и 2-4 патологических включения. В цитоплазме определялись небольшие фагосомы, единичные везикулы, обилие рибосом и полисом, за счет которых была значительно усилена электронная плотность этих клеток по сравнению с нормой. Гладко-мышечные клетки капилляров костного мозга, как в норме, так и при ГА имели в цитоплазме характерные миофибриллы с небольшим количеством митохондрий, вакуолей, рибосом и полисом. Оиоидные ядра этих клеток с равномерным распределением эухроматина по всей площади ядра обладали крупными центрально расположенными ядрышками. Отличительной особенностью этих клеток при ГА было наличие до 7 внутриядерных патологических включений.

Таким образом существенными отличительными особенностями ультраструкгуры интрамедуллярных сосудистых клеток при ГА было наличие в их ядрах множественных, _ различных но структуре

- и -

патологических включений и более интенсивное окрашивание мембранного гликокаликса специфическими красителями, как косвенного признака усиленной функциональной способности этих клеток.

Эндостальные ретикулярные клетки. При. изучении стромальных клеток в эндостальной гоне костного мозга выявлялись три морфофункциональных типа клеток: остеобластные, костные уплощенные и фибробластоидные клетки.

Электронно-микроскопический анализ эндостальной поверхности нормального костного мозга показал присутствие довольно гетерогенной группы стромальных клеток, отличающихся по своей ультраетруктурной организации. Непосредственно на поверхности костных балок встречались крупные остеобластные клетки со сравнительно гладкими контурами. Их цитоплазма

характеризовалась большим количеством структур гранулярной эндоплазматической сети, образующих сложную систему канальцев. В одних местах они располагались параллельно, а в других -формировали цистерны. Митохондрии имели овальную или округлую форму. Кроме того, в цитоплазме встречались вакуоли, мелкие гранулы. Ядра этих клеток, в одних случаях были округлой формы с центрально расположенным электронно-плотным ядрышком, в других, неправильной формы с инвагинациями и неравномерным распределением гетерохроматина. При ГЛ аналогичные клетки эндостальной зоны костного мозга отличались от нормальных лишь структурой ядер, характеризующихся более вытянутыми овоидными контурами, наличием большого нуклеолонемного ядрышка, одиночных патологических включений и равномерным распределением эухроматина. Еще одной отличительной особенностью этих клеток явилось интенсивное окрашивание альциановым синим и рутениевым красным мембранного гликокаликса и межклеточных контактов.

На поверхности костных трабекул имелись реэкс уплощенные клетки, так называемые "костные уплощенные клетки", с электронно-плотной цитоплазмой и небольшим количеством органелл. Определялись »больших раемеров митохондрии, единичные гранулы, пузырьки и вакуоли с мелкими гранулярными образованиями внутри. Уплощенные ядра этих клеток имели высокую конденсацию гетерохроматина вдоль ядерной оболочки и глыбками по воей площади ядерного среза Их ультрструктурная

организация, как в норме, так и при ГА, не имела отличий. Эндостальный слой фибробластоидных клеток костного мозга ("клетки костно-мозгового мешка") в норме был представлен уплощенными клетками с рыхлой электронно-светлой цитоплазмой, содержащей множественные микрофиламентозные структуры, цистерны с мелкогранулярным содержимым, единичные митохондрии. Ядра этих клеток были вытянутой формы с конденсацией гетерохроматина по периферии и единичными глыбками в центре. При ГА отмечалась трансформация этих клеток в адипозные со множественными и различными по размерам жировыми вакуолями, большим количеством митохондрий, рибосом и полисом. Ядра имели неправильную форму, с конденсацией хроматина по периферии. В некоторых из них выявлялись центрально расположенные плотные ядрышки и патологические включения.

Периваскулярные ретикулярные клетки. На серийных срезах трепанобиоптатов 20 здоровых лиц и 40 больных ГА были изучены клетки экстрацеллюлярно прилегающие к сосудистым клеткам костного мозга, ультраструктурная организация которых отражала их функциональную специфику. Это были адипозные, макрофагальные и фибробластоидные клетки. Периваскулярные адипозные клетки в норме характеризовались наличием в цитоплазме одной крупной и несколько мелких вакуолей, небольшого количества митохондрий, микрофиламентозных структур, зерен гликогена и рибосом. Ядра этих клеток были поджаты жировыми вакуолями и имели равномерное распределение эухроматина по всей площади ядерного среза и активным ядрышком в центре. При ГА эти клетки имели значительные отклонения и морфологически, в большей степени,' носили черты фибробластоидных клеток. В их цитоплазме отмечалось множество мелких и средних размеров жировых вакуолей, большое количество митохондрий, везикул, рибосом и полисом. Ядра со множественными инвагинациями и неравномерным распределением гетерохроматина имели активные нуклеолонемные ядрышки и четко выраженные патологические включения. Периваскулярные клетки нормального костного мозга в основном имели определенную" структуру с небольшой, но богатой органеллами цитоплазмой при наличии единичных лизосомальных гранул, множества везикул и микрофиламентов. Ядра этих клеток были правильной овальной

формы, резке с инвагинациями, и конденсацией хроматина по периферии в виде тонкой полоски и глыбками в центре. При ГА ультраструктурная организация этих клеток характеризовалась цитоплазмой с большим количеством митохондрий, рибосом и полисом. Их крупные ядра имели неправильную форму с плотным распределением хроматина, небольшим активным ядрышком в центре и наличием множественных (до 7 в одном ядерном срезе) патологических включений. Макрофагальные клетки в периваскулярных участках, как в норме, так и при ГА, имели идентичную структуру цитоплазмы с обилием фагоцитируемого, клеточного детрита и ядра с равномерным распределением эухроматина. Исключением являлось лишь присутствие в патологических клетках единичных внутриядерных включений, а в цитоплазматических фагосомах вирусоподобных образований.

Ультраструктура периваскулярных ретикулярных клеток при ГА отличалась от нормы: увеличением содержания в цитоплазме митохондрий, рибосом и полисом, наличием в ядрах высокоактивных ядрышек нуклеолонемной структуры с несколькими фибриллярными центрами, как показателей высокой функциональной активности клетки; выраженной жировой трансформацией, как свидетельства энергетической невостребованности со стороны гемопоэтических клеток; содержанием в ядрах всех стромальных клеток множественных однотипных по структуре патологических включений.

Промежуточные ретикулярные клетки. Электронно-

микроскопическое изучение трепанобиоптатов костного мозга больных ГА и здоровых людей позволил выявить группу ретикулярных клеток топографически расположенных между периваскулярными и эндостальными зонами экстрацеллюдярных участков костного мозга, которые, как в норме, так и при патологии, имели характерные особенности фибробластоидных, адипозных и макрофагальных клеток. Фибробластоидные ретикулярные клетки нормального костного мозга обладали упорядоченной структурой цитоплазмы с наличием мелких митохондрий, микрофиламентов вокруг ядра, единичных лизосомальных гранул и других жизненноважных органелл. Ядра этих клеток на поперечных срезах были овальной формы о единичными инвагинациями'и плотным распределением хроматина по периферии. Однако при ГА эти клетки имели отросчатую цитоплазму с хаотичным распределением органелл, крупные митохондрии с измененной структурой крист, обилие

сналичием плотного хроматина по периферии и в центре, с несколькими ядрышками активной структуры и множественными патологическими включениями. Промежуточные адипозные клетки нормального костного мозга содержали, в основном, по одной крупной жировой вакуоли, поджатое овоидной формы ядро с малоактивным ядрышком и нежной структурой хроматина. Структура цитоплазмы этих клеток была менее богата органеллами по сравнению с клетками периваскулярной локализации и содержала обилие верен гликогена, везикулы, единичные мелкие митохондрии. Однако, при ГА, в этом типе клеток обнаруживалось по несколько крупных и множество мелких и средних размеров жировых вакуолей, большое количество митохондрий, рибосом и полисом. При этом ядерная структура не отличалась от нормы, за исключением внутриядерных патологических включений, имеющихся в большинстве этих клеток при патологии. Ультраструктура макрофагальных клеток этой зоны, формирующих в норме эритроидные и гранулоцитарные островки, а при ГА окруженных единичными лимфоцитоподобными клетками, была практически идентична. Цитоплазма этих клеток содержала множественные гранулы, пузырьки, остатки клеточного детрита и другие присущие этим клеткам органеллы. Овоидные ядра с единичными инвагинациями имели равномерное распределение эухроматина и единичное центральнорасположенное ядрышко. При ГА в ядрах этих клеток также выявлялись патологические образования с различной ультраструктурной организацией.

Таким образом, отличительной особенностью ультраструктры промежуточных ретикулярных клеток при ГА от нормальных, по-мимо тотальной жировой трансформации, было: увеличение в цитоплазме количества митохондрий, рибосом и полисом; наличие в ядрах множественных патологических включений; вакуолизация фибробластоидных клеток с изменением структуры

митохондриального аппарата..

Ядрьшковьи аппарат стромальных клеток. В последнее время стало широко известно, что структурная организация ядрышек изменяется в зависимости от функционального состояния клетки, так как ультраструктура ядрышка тесно' связана со скоростью продукции пре-рибосом&льной РНК (рРНК), процессинга и выхода пре-рибосом в нуклеоплазму_ (СЗоеззепз Б. 1984). При этом существует строгая корреляция между субмикроскопической архитектоникой ядрышка и степенью дифференцировки клетки

(Baserga R. 1976). Также доказано, что, чем выше функциональная активность клетки, тем активнее синтез рРНК (Baserga R. 1976, 1982) и выше активность рибосомных генов на хромосоме, локализация которых соответствует области ядрышкового организатора (0Я0) (Goessens 6.1979). . Белки, находящиеся в СЯО, являются аргерофильными и хорошо выявляются с помощью ультрацитохимической реакции серебрения (Ploton D. et al. 1983). В результате этого было показано, что интенсивность окраски ядрышек находится в строгой корреляции с темпом синтеза рРНК (Зацепина О. В. 1985, Челидзе П. В. 1987, Derenzini M.et al. 1982, Rebusque M. J. 1981, Ploton D. et al.1983). Для сравнительной оценки активности ядрышкового аппарата стромальных клеток костного мозга в норме и при ГА была использована морфофункциональная классификация активности ядрышек по их ультраструктурной организации (Блинова Т.О.1990, Baserga R. 1976, Goessens G. 1984) и сопоставлена с классификацией по аргерофильности ядрышек при окраске нитратом серебра (Блинова Т.О. 1990, Морозова Е. О. с соавт. 1990, Ploton D. 1983).

В соответствии с морфофункциональ'ной классификацией активности ядрышек нами проведена количественная оценка наиболее активных нуклеолонемных ядрышек с маленькими фибриллярными центрами и выраженным гранулярным компонентом в стромальных клетках костного мозга 20 здоровых людей и 40 больных ГА. Было показано, что 29,0±0,б% стромальных клеток нормального костного мозга содержат умеренно- и высокоактивные ядрышки, тогда как при ГА этих клеток насчитывалось 68,4+0,7% (Табл.1). При ультрацитохимической окраске нитратом серебра трепанобиоптатов костного мозга 4-х больных ГА и 4 здоровых людей оценивалась аргерофильность ядрышек по распределению в них гранул серебра, а именно: - диффузное распределение, соответствующее низкой функциональной активности клетки (малоактивные); - распределение в виде нескольких мелких аргентум-вон, что ассоциируется со средней функциональной активностью клетки (умеренноактивные); - распределение в виде крупной звездчатой аргентум-зоны, присущее клеткам с высокой степенью Функциональной активности (высокоактивные). Результаты исследования показали, что в нормальном

костном мозге содержится 29,5+0,9£ аргентум-поэитивных стромальных клеток с умеренно- и высокоактивными ядрышками, а при ГА клетки с аналогичным распределением гранул серебра составляли 69,5±1,2% (Табл.1).

Таким образом, изучение структурной организации и аргерофильности ядрышкового аппарата стромальных клеток костного мозга, как показателей их функционального статуса, определило, более чем двукратное увеличение количества клеток с активными ядрышками при ГА по сравнению с нормой. Эти данные свидетельствуют об усилении функциональной способности стромальных клеток при имеющейся патологии. ТАБЛИЦА 1.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ПО УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И АРГЕРОФИЛЬНОСТИ ИХ ЯДРЫШЕК В НОРМЕ (Н) И ПРИ ГИПОПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ (Г).

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СТЕПЕНЬ Н Г

АКТИВНОСТИ ЯДРЫШЕК в % В %

1.По морфофункциональной классификации: п=20 п=40

умеренно- и высокоактивные ядрышки 29,0±0,6 68,4+0,7

2. По аргерофильности при окраске нитратом серебра: п-20 п-20

умеренно- и высокоактивные ядрышки 29,5+0,9 69,5+1,2

Патологические включения. При электронномикроскоппческом изучении ультраструктурной организации стромал1_ных клеток костного мозга больных ГА было обнаружено, что практически все клетки стромы содержат в своих ядрах множественные патологические включения, отсутствующие в гемопоэтических клетках. Это не позволяет расценивать их как артефакты обработки исследуемого материала, а лишь подчеркивает специ-' фичность их локализации в стромальных клетках костного мозга.

Кроме того была выявлена динамическая упорядоченность ультраструктурной организации патологических внутриядерных включений в клетках стромы при ГА. Наряду с общими морфологическими признаками: округлая форма и

электронно-светлый ореол, отделяющий включение от ядерного хроматина, - они имели определенные структурные особенности. Первый тип внутриядерных включений обладал рыхлой фибриллярно-гранулярной структурой, значительно отличающейся от структуры ядерного хроматина своей меньшей электронной плотностью. Во втором типе прослеживалась упорядоченность фибриллярных структур в виде колец и образование в их середине единичных плотных гранул. Третий тип внутриядерных включений имел центрально расположенное тельце из плотных гранул окруженное единичными фибриллярными кольцами. Дополнительно к этому, в цитоплазматических фагссомах стромальных клеток при ГА были выявлены вирусо-подобные структуры (Филдс Б. 1989, Соловьев В. Д. 1979, Yamazaki К. 1989, Gallo R. С. 1990). Схематическое изображение структурных особенностей 3-х типов внутриядерных включений и цитоплазматииеских вирусоподобных структур в стромальных клетках костного мозга больных ГА наглядно показывает морфологическую родственность этих образований и в определенной мере отражет динамику их развития или созревания (Рис.1).

Сравнительная гистошрфомэтрия постно- мозговых тканей на полутонких срезах трепанобиоптатов подвздошной кости 20 здоровых лиц (Н), 20 больных ГА с гипопластическим (Г) и 20 больных ГА с ашзастическим (А) костным мозгом показала, что помимо увеличения объема стромально-адипозной ткани (при "Г" в 1,6 раза; при "А" в 1,9 раза) и снижения объема гемопоэтическей ткани (при "Г" в 2,6 раза; при "А" в 12,7 раза), имелся значительный рост объема костной ткани трабекул костного мозга (при "Г" ь 1,4 раза; при "А" в 1,7 раза) (Таб.2). Эти данные наглядно демонстрируют, что замещение гемопоэгичеокой ткани при ГА происходит не только за счет разрастания стромальных клеток и их адипозного перерождения, но и за счет роста объема костной ткани, как результата увеличения количества оетеоидных клеток, а не костного матрикса (Рис. 2). Полученные гиетоморфометричеокие данные свидетельствуют о коррелляции между суммарным увеличением

'У

ФГС

2 ТИП

зтип

в н

У

т р

и я Д

Е Р

Н Ы Е

В К Л Ю Ч Е Н И

я

ЦИТОПЛАЗМАТИ ЧЕСКИЙ ТИП ВКЛЮЧЕНИЙ

Рис, 1. Типы патологических включений в ядрах и цитоплазме стромальных клеток костного мозга больных ГА. ЯХ - ядерный хроматин; Ор - ореол; С - сердечник; ФГС - фибриллярно-грануллярные структуры; К - капсид; ФК - фибриллярные кольца; ПГ' - плотные гранулы.

объема костной и сгромально-адипозной тканей при ГА и снижением объема гемопоэтической ткани костного мозга (Рис.3). Таким образом, между костной, стромально-адипозной и гемопоэтической тканями костного мозга прослеживаются строгие балансные взаимоотношения, изменение которых в гипопластическом и апластическом костном мозге отражают степень угнетения гемопоэза (Рис.4), а следовательно и тяжесть клинического течения заболевания. ТАБЛИЦА 2.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДАННЫХ ГИСТОМОРФЭМЕТРИИ НОРМАЛЬНОГО (Н), ГИПОПЛАСТИЧЕСКОГО (Г) И АПЛАСТИЧЕСКОГО (А)

КОСТНОГО МОЗГА.

ОБЪЕМ в % Н Г А

Костная ткань трабекул 23,8+0,5 32,7+1,8 39,7+1,2

Стромально-адипоэная ткань 30,6+1,3 49,8+1,1 5б,7±1,2

Гемопоэтическая ткань 45,6+1,4 17,5+1,6 3,6+0,5

КОЛИЧЕСТВО ОСТЕОИДНЫХ КЛЕТОК

В ЕДИНИЦЕ ПЛОЩАДИ 3,5±0,1 5,5+0,2 7.0±0,2

* Коэффициент достоверности "Р" во всех случаях меньше 0,001

а» 10

23.&

т

Ь2,7

39,7

Ко^Ьо

ОСТЬОИД. КАбТОК'

Ъ Е&.пг-Ои,

±±+ [5/5)

П"

ти

4-4

кости.

Н -Г ^ КГ*

Рис.2. График зависимости изменения объема костной тканы трабекул (1) и количество остеоидпых клеток (2) иормдльного(Н) гипопластического (Г) м апластичеекого (А) костного мезга.

*/.Ь I I

СО- 1 | 2

49.8

30' £0 (0

ъ ел

52 Л

25.8

ЗО.Ь

17.5

З.С \о о!

и

н

и

Кос* и.

^ >Ао>ГЬ,

РисЗ. График зависимости изменения объемов костной (1), стромально-адипозной (2) V гемогюэтической (3) тканей нормального (Н), гипоаластическога (Г) и апластического (А)

костного мозга

100

90

80.

40

60

5о

4ЕН

зо 20 10

О О О о о

ор ° О о

орИ

О О о о о о о о ©

Х11Ш

Г®

23.6' Н111

ПI' I

Еца

пни

32. Ч

5.С

ООО

56/?

<11III

н

тип

кости. ЬАО»ГЛ .

Рис.4. График изменения соотношении объемов костной (1), стромально-адипозной (2) и гемопоэтической (3) тканей нормального СЮ, гипопластицеского (Г) и апластического (А)

Костного мозг/».

з

а

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Первоначальный термин ГА был использован более 100 лет тому назад Эрлихом при определении панцитопении с характерным жировым замещением красного костного мозга. В последствии, детализируя некоторые патофизиологические особенности ГА с более глубоким угнетением кроветворения и тотальной аплазией костного мозга, стал использываться термин АА, которым постепенно подменялся изначальный. Это послужило существенным препятствием для формулирования патогенетической концепции данного заболевания, как динамического процесса, через сопоставление известных на сегодняшний день патофизиологических сдвигов. Таким образом, для обсуждения полученных данных, как звеньев патогенетической цепи развития заболевания, целесообразнее употребить более широкое понимание ГА, которое включает в себя не только АА, но и другие состояния сопровождающиеся однотипными патофизиологическими изменениями, основу которых помимо панцитопении составляют сдвиги в костном мозге (Табл.3).

При обсуждении необходимо упомянуть о роли стромальных клеток костного мозга в регуляции гемопоэза. Все сигналы, поступающие из циркуляции в костный мозг о потребностях в клетках крови, принимаются барьерными эндотелиальными и периваскулярными макрофагальными клетками. От них переработанная информация через продукцию цитокинов поступает к промежуточным стромальным клеткам, ответственным за дифференцировку и созревание гемопоэтических клеток. Это, в свою очередь, опосредует стимуляцию зндостальных стромальных клеток, непосредственно участвующих в самоподдержании ГСК, запуская процесс ремоделирования костного матрикса, что необходимо для потенциирования пролиферирующих ГСК. Такая регуляторная иерархия в костном мозге обеспечивает постоянство пула ГСК и достаточную защиту от внешних воздействий. Последующее коммитирование ГСК происходит по мере их продвижения от эндоста к периферии, а точнее перехода от одной стромальной клетки к другой за счет перераспределения адгезивных и антиадгезивных молекул на поверхности этих клеток, экстрацеллюлярный матрикс которых содержит определенный набор (код) индукторов дифференцировки, соответствующий потребностям в клетках крови. В .результате

Таблица 3. ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КОСТНОМ МОЗГЕ БОЛЬНЫХ ГИГОШАСГИЧЕСКШ АНЕШ1ЕП.

Уровни исследований Патофизиологические отклонения от нормы

1. На тканевом уровне а) снижение объема гемопоэтической ткани (менее 20X от общего объема)

б) увеличение объема стромально-адипозной ткани

*в) увеличение объема костной ткани трабекул

2. На клеточном уровне а) угнетение пролиферативной способности ГСК и снижение их количества

б) усиление пролиферативной способности стромальных клеток in vitro

*в) усиление функциональной активности стромальных клеток in vivo

г) усиление жировой трансформации стромальных клеток

*Д) увеличение количества остеоидных клеток в трабекулах костного мозга

е) усиление цитотоксического эффекта Т-лф на миелопоэз

3. На органоидном уровне а) увеличение количества жировых вакуолей в стромальных клетках

*б) увеличение количества активных ядрышек в стромальных клетках

*в) увеличение содержания митохондрий, рибосом и полисом в клетках стромы

*Г) наличие патологических включений в ядерном аппарате клеток стромы

4. На молекулярном уровне а) усиление выработки ОНФ- альфа

б) усиление выработки КСФ

в) усиление выработки ИНФ-гамма

г) усиление выработки ИЛ2

Д) усиление экспрессии антигенов' гистосовместимости DR2 и DRw3

е) угнетение выработки Ш11 (при тяжелых формах)

* - отмечены изменения впервые выявленные при настоящей исследовании

межклеточных контактов осуществляется обмен генетической информацией с дальнейшей дифференцировкой и созреванием гемопоэтических клеток вплоть до появления в циркуляции высокоспециализированных клеток крови. Таким образом, основополагающая роль стромальных клеток в регуляции гемопозза обеспечивается локальной продукцией цитокинов, протеинами экстрацеллюлярного матрикса и прямыми межклеточными контактами, которые осуществляются через адгезивные молекулы поверхностных рецепторов. Из этого следует, что нормальный гемоиоэз целиком зависит от адекватного приема, переработки и передачи информации стромальными клетками, нарушения которых неминуемо ведет к какой-либо неполноценности и соответственно к компенсаторным реакциям, необходимым для зосполнения этого недостатка, но требующего уже бол* ших энергетических затрат.

Патофизиологические сдвиги, имеющиеся при ГА (Табл.3), наглядно показывают выраженное преобладание изменений со стороны стромальных клеток костного мозга. При морфологическом описании ультраструктуры клеток стромы больных ГА, по сравнению с клетками здоровых людей, нами было выявлено, что наряду с тотальным жировым перерождением отмечались изменения, общие для всех стромальных клеток, не зависимо от их локализации в паренхиме костного мозга. Это было значительное увеличение содержания митохондрий, рибосом и полисом в цитоплазме и более интенсивное окрашивание специфическими красителями надмембранного гликокаликса, как субъективных признаков усиления клеточной функции. Использование двух взаимоконтролируемых методов подсчета стромальных клеток с умеренно- и высокоактивными ядрышками (критерий функциональной активности клетки), продемонстировало более чем двукратное увеличение функционально-активных клеток стромы при ГА, чем в норме (Табл.1). В довершение ко-всему, при ультраструктурном изучении ядерного аппарата клеток костного мозга больных ГА впервые при данном заболевании были выявлены многочисленные патологические включения, которые не обнаруживались в гемопоэтических клетках, а локализовались специфично в клетках стромы.

- 24 -

Факт обнаружения в ядрах стромальных клеток костного мозга патологических образований с упорядоченной структурой (Рис.1) требует особого внимания, так как зная компактность и ценность ядерных структур не только для всей жизнедеятельности клетки и ее потомства, но и для близлежащих клеток, не трудно предположить, что эти образования могут быть причиной или следствием определенных функциональных сдвигов, имеющих место в костном мозге больных ГА. При этом необходимо учесть, что именно на стромальных клетках костного мозга лежит основной груз регуляции гемопоэза ("обучения" гемопоэтических клеток) и в особенности процесса самоподдержания ГСК, как основы будущего благополучия гомеостаза клеток крови. В результате анализа полученных данных было отмечено, что ультраструктурная организация патологических внутриядерных и цитоплазматических включений имеет поразительное сходство по своей морфологии с провирусными и вирусными внутриклеточными образованиями, которые выявляются при экспериментальных вирус-индуцированных лейкозах, опухолевых процессах и при различных вирусологических исследованиях. Структура

внутриклеточных зрелых вирусов очень простая и характеризуется сердцевиной, состоящей из плотно упакованных белковых молекул, и гликопротеинового капсида, покрывающего сердцевину (Еутенко 3. А. 1984, Эренпрейса Е. А. 1990, Milla F. 1992, Negoescu А. 1989, Pujol-Moix N. 1990, Weldon R. А. 1990). Также стадия жизненного цикла многих вирусов проходит в ядре клеток-носителей в виде - провирусных частиц способных длительное время персиетировагь в ядрах и интегрировать собственные молекулы в геном клетки, при этом не оказывая литического воздействия на саму клетку. Такие провирусные частицы морфологически определяются в ядрах, как рыхлые белковые молекулы резко отличающиеся от ультраструктурной организации ядерного хроматина клетки (Зильбер JLA. 1968, Соловьев В.Д. 1979, Abdon N.I. 1981, Bagnara 6.P. 1990, Deppert W. 1990, Holland С. A 1989, Smith R. D. 1990).

Вирусная персистенция и вмешательство в геном стромальных клеток костного мозга, особенно присущее группе ретровирусов и их эволюционных дериватов, может приводить либо к извращению генетической информации, передаваемой посредством межклеточных контактов гемопоэтическим клеткам, либо к нарушению адгезивных

свойств пораженных клеток, что не позволяет произвести полноценный обмен генетической информацией (Allen Т. D. 1991, Gallo R. С. 1990, Yamazaki К. 1989). В любом случае будет происходить изменение функционально-регуляторных межклеточных взаимодействий, в результате которых клетки могут неадекватно реагировать на действия различных инициирующих сигналов, что может находить свое крайнее проявление при стрессовых ситуациях (дополнительные инфекции, аллергические реакции, интоксикации и т. д.) (Bagnara а Р. 1990, Ciavarra R. Р. 1990, Yanagihara R. 1990).

Весьма важным является и тот факт, что персистирующие провирусные частицы способны активироваться и служить субстратом для образования многочисленных новых вирусов под воздействием форболовых эфиров и ИЛ2, продукция которых усиливается при цитотоксических реакциях Т-лф, что также имеет место при различных стрессовых состояниях. Образование новых вирусов после длительной персистенции может происходить с изменением вирусного штамма и сопровождаться цитопатическим эффектом как на клетки-носители, так и на близлежащие клетки, что обусловливает дополнительный цитотоксический эффект Т-лф на ткани содержащие эти клетки (Щданов В. М. 1990, Зильбер Л. А. 1968, AbrahanG.N. 1990).

Аналогичная картина прослеживается и при ГА, о чем свидетельствуют как патофизиологические сдвиги цйтокинной регуляции(Табл. 3), сочетание которых наблюдается именно при вирусных инфекциях, так и наличие в ядрах и цитоплазме стромальных клеток патологических провирусо- и вирусоподобных структур, выявленных при настоящем исследовании. Если учесть и тот факт, что клетки етромы костного мозга (в которых при ГА, по нашим данным, имеется выраженная патология: изменение структуры митохондриальных крист, резкое расширение канальцев эндоплаз магического ретикулума, появление многочисленных неспецифических гранул и включений) несут основную нагрузку в регуляции процессов самоподдержания и коммитирования ГСК (количество которых при ГА резко снижено даже в ремиссии, при отсутствии в них каких-бы то ни было морфологически определяемых отклонений), мокно сделать вывод о неполноценности регуляторных механизмов со стороны клеток стромы, как ведущего патогенетического звена развития ГА. В основе этого может лежать провирусная персистенция или

вирусное поражение стромальных клеток. Ограничение потенции ГСК и их чувствительности к индукторам дифференцировки, как следствие увеличения компенсаторных энергетических затрат, реально ведет к нарушению взаимоингибирующего баланса между клетками лимфо- и миелопоэза. При ГА это выражается в прогрессирующем усилении цитотоксического эффекта Т-лф, регуляция которого зависит от достаточного количества миелоидных клеток (Aranda-Anzaldo А. 1990, Balleari Е. 1991). В зависимости от уровня их недостаточности происходит все нарастающее угнетение миелопоэза, развитие •панцитопении и усугубление депрессии кроветворения вплоть до полной аплазии костного мозга, что зависит, как отмечается в литературе последних лет, уже от состояния иммунной системы (ChanV. С. 1989, Nissen С. 1991).

По имеющимся данным при ГА имеется повышение функциональной активности стромальных клеток костного мозга, что выражается в усилении их пролиферативной способности in vitro, обогащении экстрацеллюлярного матрикса белковыми структурами и накоплении нерасходуемых нейтральных жиров, что обусловливает их жировую трансформацию. Это в полной мере подтвердили результаты настоящего исследования, где было выявлено увеличение количества функционально-активных стромальных клеток при повышенном содержанием в их цитоплазме митохондрий, рибосом и полисом, а также множественных различных по размерам жировых вакуолей, как компенсаторного признака их гиперфункции. Дополнительно к этому, усиление интенсивности окрашивания специфическими красителями надмемранного гликокаликса стромальных клеток при ГА свидетельствует о белковой насыщенности внеклеточного матрикса, как результата невостребованности активно продуцируемых регуляторных протеинов, необходимых для дифференцировки и созревания гемопоэтических клеток.

Выраженные патофизиологические изменения на молекулярном, органоидном и клеточном уровнях при ГА находят свое отражение и в межтканевых нарушениях в виде жирового замещения гемопоэтической ткани костного мозга, крайняя форма которого

наблюдается при аплазии (Табл.3). Однако при сравнительной гистоморфом'етрии нормального, гшюплаотичеокого и

апластического костного мозга, в дополнение к разнополюсному изменению объемов стромально-адипозной и гемопоэтической

тканей, в результате настоящего исследования был впервые выявлен весьма существенный патофизиологический аспект ГА - это увеличение объема костной ткани трабекул, за счет увеличения количества остеоидных клеток. Хорошо известно, что основное направление остеогенеза осуществляется от периоста к эндосту, где происходит, главным образом ремоделирование костного матрикса посредством взаиморегуляторных связей между костными, стромальными и гемопоэтическими клетками костного мозга. Этот процесс характеризуется резорбцией костной ткани остеокластами - потомками гемопоэтических клеток - под контролем стромальных и остеоидных клеток с целью обеспечения метаболизма депонированных в кости микроэлементов, которые необходимы для поддержания высокой потенции пула ГСК. При этом остеокластная резорбция строго корреллирует с гемопоэтической активностью (Lee М. У. 1991). При ГА отмечается резко выраженное снижение или отсутствие резорбции остеокластами, как логическое завершение недостаточности ГСК. Это наводит на мысль о нарушении ремоделирования костной ткани, приводящее к компенсаторной стимуляции остеоидных и стромальных клеток, что прямо соотносимо с угнетением гемопоээа и снижением количества клеток крови. Это подтверждают наши данные, в которых прослеживается чуткая динамическая зависимость увеличения суммарного объема костной и етромальной тканей от степени угнетения гемопоээа, следствием которого является соответствующее снижение объема гемопоэтической ткани костного мозга (Fhc.4). Таким образом, соотношение трех основных тканей костного мозга - гемопоэтической, етромальной и костной - представляет собой единую взаимозависимую балансную систему, компенсаторные изменения которой в полной мере могут отображать патогенетические сдвиги и состояние

костно-мозгового кроветворения, что наглядно показано на примере настоящего изучения костного мозга больных ГА.

На основании полученных данных и сведений, имеющихся в литературе о патофизиологических сдвигах при ГА вполне правомерно выдвинуть гипотезу о патогенетическом механизме развития ГА, схематическое изображение которой представлено на Рис. 5. где прослежены две стадии патогенеза ГА. Стадия первичных, скрытых нарушений, характеризующаяся регуляторными

сдвигами со стороны стромального отдела костного мозга, т. е. сдвигами подготавливающими условия и предопределяющими развитие вторичных нарушений в результате различных дополнительных воздействий, сопровождающихся цитотоксическими реакциями; и стадия вторичных, явных нарушений, которая несет в себе патофизиологические особенности, составляющие клиническую специфику ГА.

В заключении необходимо отметить, что представленный патогенетический механизм развития ГА с характерными для него патофизиологическими сдвигами в полной мере, может отображать первичную ступень доклональных изменений кроветворения в лейкозогенезе и служить моделью первичных нарушений, способствующих развитию онкогематологических заболеваний, что требует дальнейшего более глубокого и всестороннего изучения.

Г

I

ВТОРИЧНЫЕ НАРУШЕНИЯ

ГЕМОПОЭЗ

¡УСИЛЕНИЕ ОСТЕР- И АДИПОГЕНЕЗА

ДИСБАЛАНС МЕЖДУ КОСТНО-СТРОМАЛЬНОЙ И ГЕМОПОЭТИ-ЧЕСКОЙ ТКАНЯМИ В КОСТНОМ МОЗГЕ

УГНЕТЕНИЕ ГЕМОПОЭЗА И недостаточность ГСК

ПАНЦИТОПЕНИЯ

1-

ПРОГРЕССИРУЮЩЕЕ УСИЛЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ лаVIг Г- ЛИМФОЦИТОВ_

""•йщ" ОТ шят лмм шш^^штш^^тша мД

ПЕРВИЧНЫЕ НАРУШЕНИЯ

Г--------I

I_

нарушение регуляции самоподдержания и коммитирования ГСК (внутриядерная персис-тенция провируса?)

ограничение потенции и чувствительности к ростовым факторам

НАР УШЕНИЕГ7ЯЕХАНИЗМ А

ИНГИБИЦЙИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ РЕАКЦИИ

ВОЗДЕЙСТВИЯ ЭТИОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ

-- активация ---- дифференциация ' > :чгиеиция

Рис. 5. Принцизшальная схема патогенетического механизма развития гипопластической анемии.

- 30 -

выводи

1. Клетки стромального микроокружения костного мозга больных ГА имеют значительные патологические отклонения ультраструктурной организации ядра и цитоплазмы по сравнению с клетками здоровых лиц, что указывает на патогенетическую значимость этих клеток в развитии заболевания.

2. У больных ГЛ выявлено резкое увеличение количества стро-мальных клеток с активными ядрышками при наличии в цитоплазме повышенного содержания митохондрий, рибосом и полисом, а также усиление интенсивности окрашивания специфическими красителями надмембранного гликокаликеа, что в совокупности является морфологическим критерием активации функциональной способности клеток стромы костного мозга по сравнению с клетками здоровых людей.

3. В стромальных клетках :;остного мозга при ГЛ выявлены патологические внутриядерные и цитоплаэматические включения, локализация и ультраструктурная организация которых предопределяет их вирусное происхождение.

4. При ГА показано значительное увеличение объема костной ткани трабекул соотнссимое с прогр- сирующим жировым перерождением клеток стромы костного мозга и угнетением гемопоэза.

5. Пропорциональное изменение объемоЕ костной, стромальной и гемоиоэтичес-кой тканей при ГА носят компенсаторный характер и зависят от степени угнетения кроветворения, что доказывает существование единой системы балансных м^лтканеьых взаимоотношений ь костном мозге.

6. Первичное поражение клеток стромального микроокружения костного мозга является одной из наиболее вероятных причин развития ГЛ.

- 31 -СПИСОК РАБОТ опубликованных по теме диссертации.

1. Блинова Т.е., Пономаренко ЕЕ, Шляпочникова Г.П. , Кравец В. Е Ультраструктура стромы костного мозга человека в норме// Сб. докл. 2-го съезда гематол. трансфузиол. Украины. -Киев, 1986. -С. 53.

2. Блинова Т. С., Пономаренко R М. , Шляпочникова Г. П., Ругаль В. К Электронно-микроскопические особенности стромы костного мозга здоровых людей// Сб. докл. 2-го Всероссийского съезда гематол. трансфузиол. -Челябинск, 1986. -С. 192.

3. Ругаль В. И. , Блинова Т. С. , Пономаренко В. М. , Шляпочникова Г. П. Абдулкадыров К. М. Синусоиды стромы костного мозга подвздошной кости человека// Архив анат. -1987. -N10. -С. 72-77.

4. Ругаль В. И., Блинова Т. С., Пономаренко В. М. , Шляпочникова Г. П. Абдулкадыров К М. Морфология стромы костного мозга подвздошной кости человека. Адипоциты и ретикулярные клетки// Архив анат. -1987.-N12.-С. 55-60.

5. Абдулкадыров К. М., Ругаль В. К , Блинова Т. С., Пономаренко В. М. Морфология стромы костного мозга человека в норме и при остром лейкозе// Лейкозы: Сб. науч. трудов. -Л., 1988. -С. 3-9.

6. Ругаль В. И. .Абдулкадыров K.M. .Блинова Т. С. .Пономаренко В.М. Кроветворное микроокружение костного мозга в норме и при остром лейкозе// Сб. докл. 2-го съезда терапевтов Киргизии, -Фрунзе, 1988. -С. 11.

7. Ругаль В. И., Абдулкадыров К М. , Блинова Т. С. , Пономаренко Е М. Эндостальные клетки стромы костного мозга подвздошной кости человека// Архив анат.-1988.-N11.-С. 64-69.

8. Абдулкадыров К М. ,Ругаль В. И. .Блинова Т. С. .Пономаренко В. М. Механизм миелодепрессии при остром лейкозе и роль стромы в становлении гемопоэза после цитостатической аплазии// Сб. докл. 2-ой научно-практической - конференции гемат. трансфузиол. Литовской ССР,-Вильнюс., 1989.-С. 218-219.

9. Пономаренко В. М. , Блинова Т. С., Шляпочникова Г. П. Ультраструктура клеток мегакариоцитарного ряда по данным трепанобиоптатов практически здоровых людей// Наследственные и приобретенные тромбоцитопатии: Сб. науч. трудов, -JL , 1989. -С. 96-103.

10. Ругаль В. И., Блинова Т. С., Пономаренко В. М. Кроветворное микроокружение при остром лейкозе// Сб. докл. всесоюзной научно-практической конференции врачей-цитологов,-Рига, 1989. -С. 60-61.

11. Раков А. А., ПЬцеваТ. А., Блинова Т.О., Рогалева Е. 1й , Пономаренко Д Ы., Ругаль Е И. Некоторые морфофункциональные особенности гемопоэтической ткани при предлейкозных состояниях// Гематол. трансфузиол. -1990. -HI. -С. 27-31.

12. Морозова Е. О., Блинова Т. С. , Шномаренко Е М. , Мамаев' Е Е Уартинес У. , Павлова Е А., Саыускевич И. Г., Литвинская Е. Е , Щербакова Е. Г., Блинов М. Е Характеристика биогенеза рибосом мононуклеарных клеток у больных гемобластозами при использовании метода серебрения интерфазных ядрышек// Сб. докл. 3-го съезда гематол. трансфузиол. Узбекистана, -Ташкент, -1990. -ч. 2,-С. 49.

13. Rugal V. I. .Ponomarenko V. М. .Blinova Т. S., Abdulkadyrov К. № Hemopoietic precursors and their microenvironment: Genesis and morphofunctional interrelations// Intern. Symp. "Molecular Factors of Hemopoiesis and Stem Cell"-itoscow,1990.-P. 66.

14. Блинова Т. С., Морозова Е. О. , Пономаренко Е М. , Блинов М. Е Ультраструктурная организация и аргентофильные зоны ядрышек лимфобластов больных острым лимфобластным лейкозом// Гематол. трансфузиол. -1990. -N11. -С. 14-17.

15. Пономаренко. Е М., "Блинова Т. С., Шилова Е. Р., Ругаль В. И. Ультраструктурные особенности стромальных Клеток костного мозга больных гипопластическрй анемией// Сб. докл. 2-го съезда гематол. трансфузиол. Азербайджана,-Баку, 1990. -С. 111-112.

16. Ругаль Е И. , Блинова Т. С., Пономаренко Е М. , Раков А. А. Стромальнозависимые нарушения гемопоэза// Сб. докл. 2-го съезда гематол. трансфузиол. Азербайджана, -Баку, 1990. -С. 130.

17. Ругаль В. И. , Блинова Т. С., Пономаренко Е М., АбдулкадыровК М. Ультраструктурная организация кроветворного микроокружения ко.стного мозга человека// Гематол. трансфузиол. -1991. -N3. -С. 11-15.

18. Ругаль В. И., Блинова Т. С., Пономаренко Е М., Раков А. А. Метод оценки роли дефектов кроветворного микроокружения в развитии нарушений функции костного мозга// Сб. докл. всесоюзного съезда врачей-лаборантов, -Ивано-Франковск, -1991. -С. 33.

19. Ругаль В. И. .Блинова Т. С. .Шномаренко В. М. .АбдулкадыровК. М. Кроветворное микроокружение и его роль в нарушениях гемопоэза// Вопросы клинической и экспериментальной патологии: Сб. науч. трудов. -М. , 1992. -С. 3-9.

20. Пономаренко В. М. , Блинова Т. С. , Шилова Е. Р. , Оводов К Г., Ругаль В. И. Новые ультраструктурные особенности стромальных клеток костного мозга больных с апластической анемией// Гематол. трансфузиол. -1993. tNI. -С. 11-15.

21. Пономаренко В. М. , Абдулкадыров К. М., Ругаль R И. Усиление остеообразования при тяжелой апластической анемии// Гематол. трансфузиол. -1993. -N6. -С. 44-45.

22. Пономаренко В. М. , Ругаль В. И. Нарушение межклеточной регуляции при апластической анемии// Гематол. трансфузиол. -1994. -N1. -С.

23. Ругаль В. И., Пономаренко В. М. , Абдулкадыров К М. Изменения структуры элементов гемопоэтического микроокружения костного мозга при миелодиспластическом синдроме// Эксперимент, онкол. -1994. (в пбчати).

24. Rugal V. I.'.Blinova Т. S. ,Ponomarenko V. М., Abdulkadyrov К. М. Shabalin V.N. Ultrastructural organization of the hemopoietic microenvironment of he human bone marrow// Tiss. React.-1994. (Submitted).

25. Ponomarenko V. M. , Shilova E. , Rakov A. , Rugal V. Increased Trabecular Bone Tissue in severe aplastic anemia as evidence of its involving rt pathogenesis// Br. J. Haematol. -1992. -Vol. 82. -P. 254.

26. Ponomarenko V. M. , Ovodov N. , Rugal V. Ultrastructural peculiarities of bone marrow stromal cells in severe aplastic anemia// Br. J. Haematol. -1992. - Vol. 82. -P. 254.

27. Rugal V., Rakov An. , poriomarenko V. M. , Abdulkadyrov К. M. Role of the stromal microenvironment in the regulation of hemopoiesis and regeneration of bone marrow// Exp. Hematol. -1993. -Vol. 21.-P. 1051.

28. Rugal V. , Rakov An., Ponomarenko V. M., Abdulkadyrov К. M. Haemopoietic microenvironment in.myelodysplasia//Ann. Haematol. -1993.-Vol.4.-P. 95.

29. Ponomarenko V. M. , Abdulkadyrov' К. M., Rugal У. I. The intranuclear provirus-like inclusions in aplastic anemia bone marrow stromal cells// Ann. Haematol.-1993.-Vol. 4.-P. 145.

30. Poriomarenko V. M., Rugal V.I. Enhanced functional activity, of aplastic anemia bone marrow stromal cells: using the argentum nucleolar organizer region (AgNOR) method// ton. Haematol. -1993&-Vol. 4. -P. 63.

- 34 -

Список рационализаторских предложений по теме диссертации.

1. Метод приготовления объектов для электронно-микроскопического исследования из трепанобиоптатов костного мозга. Удост. на рацпредложение N301 от 06.01.86г.

2. Модификация метода заключения биопсийного материала в гистологической практике. Удост. на рацпредложение N321 от 03.09. 86г.

3. Модификация ультрацитохимического метода окраски серебром области ядрышкового организатора Удост. на рацпредложение N360 от 12. 04. 88г.

4. Метод окраски альциановым синим цельных фоагментов трепанобиоптатов костного мозга для ультраструктурного исследования. Удост. на рацпредложение N391 от 02.11. 89г.

5. Ультрацитохимический метод окраски серебром области ядрышкового организатора клеточных элементов трепанобиоптатов костного мозга. Удост. на рацпредложение N402 от 05.07. 90г.

6. Метод окраски рутениевым красным цельных фрагментов трепанобиоптатов костного мозга для ультраструктурного исследования. Удост. на рацпредложение N403 от 05.11.90г.

Подписано к печати 29. Формат бумаги № печ. л. Тираж 4вв экз. Заказ -//1Т ГППП-3. 191104, Санкт-Петербург, Литейный пр., 55