Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия при бесплодии

На правах рукописи

БЕССМЕРТНАЯ ВИКТОРИЯ СЕРГЕЕВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОМЕТРИЯ ПРИ БЕСПЛОДИИ

14.00.15 - Патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

и03470591

Москва-2009

003470591

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Центральной клинической больнице РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор

Самойлов Михаил Владимирович

Серебренникова Клара Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Зайратьянц Олег Вадимович

доктор медицинских наук, профессор

Коган Евгения Алтаровна

Ведущая организация:

ФГУ Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН

Защита состоится «

. 2009 года в

часов

на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_

2009 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

А.И. Щеголев

Актуальность проблемы.

Бесплодие представляет собой важную медико-социальную проблему. По данным ВОЗ бесплодными являются почти 15% супружеских пар (В.И. Кулаков, Т.В. Лопатина, 2006), Многим бездетным супружеским парам показано применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе - программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (Б.В. Леонов, В.И. Кулаков, 2004). Однако эффективность методов искусственного оплодотворения до сих пор составляет лишь 10 - 15% на одну попытку (А.ГТ. Лазарев, 2006). Таким образом, поиск причин и разработка методов повышения эффективности ВРТ является одной из актуальных задач современного российского здравоохранения, что отражено в национальном проекте «Здоровье» (Протокол №2 от 21 декабря 2005 г. Президиума Совета при Президенте РФ; Приказ Минздрава РФ № 220 от 29 марта 2006 г.). Решение этой проблемы имеет большое медицинское, социальное и демографическое значение.

Роль патологии эндометрия в патогенезе бесплодия несомненна. Ведь именно адекватное морфофункциональное состояние эндометрия является одним из основных факторов, обеспечивающих успешную имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и развитие эмбриона.

Поскольку для успешного наступления беременности решающее значение имеет состояние эндометрия в 7-10 постовуляторные дни (ПОД), соответствующие 21-24 дням «классического» 28-дневного менструального цикла, особое внимание уделяют морфологической оценке эндометрия именно в этот период, часто называемый «окном имплантации» (Mazur М.Т., Kurman R.J., 2005; Crum С.Р., Hornstein M.D., 2006 и др.). Для этого, кроме рутинного гистологического исследования соскобов и биоптатов, в последние годы с разным успехом применялись многочисленные (иммуногистохимические) ИГХ маркеры, в том числе: Ki67, PCNA, MUK1, LIF, MAG, Р27, циклин Е и другие (Pickartz Н. et al., 1990; Li S., Nakayama К. et al., 1993; Hey N.A., Li T.C. et al., 1995; Kliman HJ. et al., 1995; Cullinan E.B. et al., 1996; Lessey B.A., Castelbaum A.J. et al., 2000; Ordi J., Creus M. et al., 2002; Dubowy R.L. et al., 2003 и др.). Особое место в этом ряду занимают показатели рецепции к стероидным гормонам. Но даже в «окне имплантации» естественного цикла данные об экспрессии стероидных рецепторов отличаются у разных исследователей, что во многом связано с использованием различных систем количественной оценки (И.И. Евдоченко, 2004; С.Ю. Ншанян, 2004; Acosta A.A. et al., 2000 и др.). Это еще в большей

степени относится к сведениям о стероидной рецепции при различных типах и факторах бесплодия.

Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях гормональной терапии и применения схем стимуляции суперовуляции у женщин, участвующих в циклах ЭКО, является отражением сложных и многофакторных процессов. С одной стороны, гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов. С другой -нарушения в рецепторном аппарате могут привести к недостаточной восприимчивости эндометрия к экзогенному гормональному воздействию (Acosta A.A. et al., 2000; Crum C.P., Hornstein M.D., 2006). В то же время, сведения о соотношениях между концентрациями гормонов в крови и показателями экспрессии рецепторов к эстрогенам (ЭР) и прогестерону (ПР) при бесплодии противоречивы и фрагментарны (Tuckerman Е. et al., 2004).

Важным показателем полноценности «окна имплантации» является пролиферативная активность эндометрия, основным маркером которой является белок Ki67. Гораздо менее изучена экспрессия в эндометрии белков Р27 и циклина Е. R.L. Dubowy и соавт. (2003) и S.Lahav-Baratz и соавт. (2004) исследовали Р27 и циклин Е в течение нормального менструального цикла и при стимуляции овуляции перед ЭКО. Однако детальное изучение экспрессии этих белков при различных формах бесплодия и при различной патологии эндометрия не проводилось.

Как один из показателей полноценности «окна имплантации» отмечают поверхностную ультраструктуру эндометрия. По мнению G. Nikas и соавт. (1995; 1997) исследование поверхностной ультраструктуры эндометрия дает возможность согласовать время подсадки эмбриона с периодом максимального развития пиноподий и позволяет повысить шансы на успешную имплантацию. Но, в целом, сведения о поверхностной ультраструктуре эндометрия при бесплодии весьма фрагментарны.

Таким образом, целостной морфологической и иммуногистохимической характеристики эндометрия при бесплодии, его разных типах и факторах пока не существует. Изучения также требуют многие клинико-морфологические и лабораторно-морфологические корреляции. В то же время, эти данные имеют большое теоретическое, диагностическое и прогностическое значение. Все вышесказанное обусловливает актуальность работы в данном направлении и позволяет обозначить цель и задачи исследования.

Цель исследования: представить морфологическую характеристику эндометрия при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия; оценить диагностическое и прогностическое значение 4

комплексного гистологического, иммуногистохимического и ультраструктурного исследования эндометрия при подготовке к лечению методами вспомогательных репродуктивных технологий.

Задачи исследования

1. Изучить а- и р-эстрогеновую и прогестероновую рецепцию, экспрессию белков Р27 и циклина Е, пролиферативную активность и поверхностную ультраструктуру эндометрия периода нормального «окна имплантации».

2. Изучить патологию эндометрия в соскобах и биоптатах у пациенток с первичным и вторичным бесплодием и с различными факторами бесплодия.

3. Оценить экспрессию рецепторов к эстрогенам а и р и к прогестерону в эндометрии во время предполагаемого «окна имплантации» у пациенток с первичным и вторичным бесплодием, различными факторами бесплодия и различной патологией эндометрия, сопровождающей бесплодие.

4. Исследовать экспрессию фактора пролиферации белка К)67, белков Р27 и циклина Е, регулирующих клеточный цикл, в эндометрии во время предполагаемого «окна имплантации» у данного контингента пациенток.

5. Исследовать особенности поверхностной ультраструктуры эндометрия у пациенток с бесплодием.

6. Оценить соотношения между морфологическими и иммуногистохимическими проявлениями в эндометрии, клиническими типами и факторами бесплодия, показателями гормонального статуса.

7. Определить значение и место комплексного морфологического исследования эндометрия в алгоритме обследования пациенток в рамках программ ВРТ.

Научная новизна.

Получены новые данные о патологии эндометрия и рецепции к стероидным гормонам в период предполагаемого «окна имплантации» при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия. Патология эндометрия (хронический эндометрит, гиперпластические процессы эндометрия, недостаточность лютеиновой фазы) выявлена у всех обследованных пациенток с бесплодием, без существенных различий при первичном и вторичном его типах. Выявлены очевидные отличия нозологического спектра в подгруппах с различными факторами бесплодия. Существенные изменения в экспрессии эстрогеновых рецепторов а и прогестероновых рецепторов обнаружены у пациенток с разными факторами

бесплодия и при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие. Показана разная степень выраженности повреждения стероидной рецепции в железах и строме эндометрия.

Впервые получены количественные данные об экспрессии эстрогеновых рецепторов р. Снижение их количества при бесплодии и выраженные отличия при различной патологии эндометрия могут отражать роль эстрогеновых-Р рецепторов в патогенезе бесплодия.

Получены новые сведения о пролиферативной активности, регуляции клеточного цикла и поверхностной ультраструктуре эндометрия при бесплодии. Различия экспрессии белков Кл67, Р27 и циклина Е при различных факторах бесплодия объективно отражают неадекватность регуляции клеточного цикла и пролиферативных процессов. Степень отклонения показателей от нормы во многом связана с особенностями нозологического спектра. У всех пациенток с бесплодием и различной патологией эндометрия, сопровождающей его, отмечены существенные дефекты в развитии пиноподий.

Практическая значимость.

Полученные сведения о гистологических, иммуногистохимических и ультраструктурных особенностях эндометрия при бесплодии представляются важными для патологоанатомической диагностики и гинекологической практики. Данные об экспрессии стероидных рецепторов, белков, регулирующих клеточный цикл, и о развитии пиноподий представляют собой важные диагностические признаки, позволяющие на новом уровне формулировать патологоанатомические заключения по биопсийному материалу и соскобам эндометрия.

Результаты исследования открывают новые аспекты в традиционных клинических классификациях и, соответственно, в создании групп пациенток с учетом морфологического и иммуногистохимического исследования биоптатов и соскобов эндометрия. Это дает возможность более точно контролировать эффективность гормонального лечения, обеспечить индивидуальный подход к пациентке, а, следовательно, оптимизировать схемы гормональной терапии.

Установленные морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия подчеркивают значимость и необходимость комплексного исследования соскобов и биоптатов в алгоритме обследования пациенток в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ.

Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и

гинекологии для студентов медицинских ВУЗов и при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эндометрий женщин с бесплодием в период предполагаемого «окна имплантации» характеризуется значительными гистологическими и иммуногистохимическими особенностями, существенными изменениями поверхностной ультраструктуры.

2. Стероидная рецепция, экспрессия фактора пролиферации, белков, регулирующих клеточный цикл, и поверхностная ультраструктура эндометрия являются важными показателями полноценности «окна имплантации».

3. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование позволяет дополнить алгоритм обследования эндометрия в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ. Апробация результатов. Результаты диссертации доложены и

обсуждены на объединенном заседании кафедр патологической анатомии лечебного факультета РГМУ, кафедры семейной медицины ММА им. И.М. Сеченова и ЦКБ РАН март 2009 г. Результаты работы, отражающие основные положения диссертации, были представлены на:

• VIII и XIX Всероссийских научных форумах «Мать и дитя»; Москва; октябрь 2006 г., октябрь 2007 г.

• XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»; Москва; апрель 2007 г.

• II Региональном научном форуме «Мать и дитя»; Сочи; апрель 2008 г.

• научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии»; Москва; февраль 2008 г.

• на XXVII Конгрессе Международной академии патологии; Афины; октябрь 2008 г.

• на 3-м съезде Российского общества патологоанатомов; Самара; май 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, 4 из них в центральной российской и зарубежной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация построена по традиционному плану и состоит из введения; 4 глав, посвященных обзору литературы, материалу и методам, результатам собственных исследований и их обсуждению; выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 153 страницах, содержит 29 таблиц, иллюстрирована 41 рисунком, в том числе 33 гистологическими и электронными микрофотографиями. Список

литературы содержит 150 наименований (44 отечественных и 106 иностранных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Исследование проводилось на клинической базе кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ в патологоанатомическом отделении ЦКБ РАН.

В основе работы лежит материал 119 соскобов и биоптатов эндометрия от 102 женщин, поступивших в отделение ВРТ ЦКБ РАН и обратившихся в поликлиники №№ 1, 2, 3 ЦКБ РАН.

Клиническая характеристика материала и лабораторные исследования. Обследовано 72 пациентки с бесплодием. Возраст их варьировал от 26 до 44 лет (в среднем 34,2±0,5 лет). Первичным бесплодием (Б1) страдали 38 (52,8%) пациенток, вторичным бесплодием (Б2) - 34 (47,2%). На основании клинического обследования пациентки были разделены на три группы в соответствии с общепринятыми в гинекологической практике факторами (причинами) бесплодия. В первую группу (п=39) вошли пациентки с трубно-перитонеальным фактором бесплодия (Т-пФ), во вторую (п=17) - с эндокринным фактором бесплодия (ЭФ), в третью (п=16) - с эндометриозом. Основной жалобой у всех пациенток было отсутствие беременности в течение более 1 года до обращения при регулярной половой жизни без применения средств контрацепции. Продолжительность бесплодия колебалась от 1 до 16 лет, 5,8±0,4 лет в среднем, а 49 (68,1%) пациенток имели ранее неудачные попытки лечения методами ВРТ (в том числе - внутриматочной инсеминации спермы и ЭКО) в разных клиниках.

В ожидаемые 7-10 ПОД (в 21-24 дни 28-дневного менструального цикла (МЦ)) проводились гистероскопия с использованием аппаратуры «Karl Storz» (Германия), Pipell биопсия эндометрия или, по показаниям, раздельное выскабливание слизистой оболочки цервикального канала и полости матки. Одновременно определялось содержание эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием оборудования и реактивов на твердофазной тест-системе («Hoffman La Roch», Швейцария). Перед введением в полость матки гистероскопа брали мазки для бактериологического исследования. Посев производили на желточно-солевой агар, кровяной агар, среду Эндо и среду MRS. Видовой состав микроорганизмов определяли с помощью систем фирмы «Лахема» (Чехия).

В качестве группы сравнения исследовали эндометрий от 30 женщин без гинекологической патологии. Исследован материал, полученный при контрольной биопсии эндометрия в 7-10 ПОД после удаления внутриматочных спиралей и при гистологическом исследовании расцененный как нормальный.

Гистологическое исследование. Материал биоптатов и соскобов фиксировали в 10%-м нейтральном формалине. Дальнейшая обработка производилась по стандартной общепринятой унифицированной методике. Тканевые образцы подвергали спиртовой проводке в гистопроцессоре TP 1020, по длинной программе в течение 23 часов, которая включала: один 10% нейтральный формалин - 2,5 часа, два спирта 75° по 2,5 часа, два спирта 80° по 2 часа, три ксилола по 1,5 часа, один парафин 2 часа, два парафина по 2,5 часа. Заливка в парафиновые блоки проводилась на заливочном центре EG 1160. Срезы толщиной 5 мкм готовили на роторных микротомах RM 2135 и RM 2235 и окрашивали гематоксилином и эозином. Все вышеперечисленное оборудование - фирмы «Leica Microsystems» (Германия). Исследование гистологических препаратов проводилось в световом микроскопе при увеличениях от х50 до х400. Гистологические заключения формулировали в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах (Н.И. Кондриков 2008; Rosai J., 2004; Mazur М.Т., Kurman R.J., 2005; Crum C.P., Lee K.L., 2006), и с учетом требований Международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ 10).

Иммуногистохимическое исследование. ИГХ реакции проводили в ступенчатых парафиновых срезах пероксидазно-антипероксидазным методом с демаскировкой антигенов в . СВЧ-печи. Для визуализации реакций применяли универсальный пероксидазный набор LSAB+kit («Dako», США). Негативные контрольные реакции проводили с мышиной и кроличьей сывороткой (нормальный мышиный и кроличий иммуноглобулин). Ядра докрашивали гематоксилином Майера. Использовали мышиные моноклональные антитела к эстрогеновым рецепторам а (ЭРа) (клон 1D5 «Dako», США) и прогестероновым рецепторам (ПР) (клон 1А6 «Dako», США), к эстрогеновым рецепторам р (ЭРР) (клон PPG5/10 «Diagnostic BioSystems» США), к фактору пролиферации - белку KÍ67 (клон MIB 1 «Dako», США), а так же антитела к белкам Р27 и Cyklin Е, регулирующим клеточный цикл (клоны - DCS-72.F6 и НЕ 12, соответственно, «Diagnostic BioSystems» США).

Электронномикроскопическое исследование. Для изучения поверхностной ультраструктуры в сканирующем электронном микроскопе отдельные фрагменты эндометрия фиксировали в 2,5% растворе

глутаральдегида, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. Проводили дегидратацию в растворе ацетона, сушку с СО2 в аппарате «Quorum Technologies» (Англия). Поверхность напыляли золотом в аппарате «Eiko» (Япония) Исследование проводили в сканирующем электронном микроскопе Hitachi S 500 (Япония). Исследование проводили совместно с сотрудниками отдела электронной микроскопии НИИ Морфологии человека РАМН.

Количественная обработка материала. Количественный анализ результатов иммуногистохимических реакций проводили под увеличением объектива х400, в участках соскобов и биоптатов с преобладающими диагностическими проявлениями. ИГХ реакция в строме оценивалась только в ее резидентных клетках. Интенсивность ИГХ реакции к ЭРа, ЭР(3 и к ПР в ядрах клеток эпителия желез и стромы оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле — S=la+2b+3c, где а — % слабо окрашенных ядер клеток, b - % умеренно окрашенных ядер клеток, с - % сильно окрашенных ядер клеток (McClelland R.A. et al., 1991). Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР расценивали: 0-10 баллов - отсутствие экспрессии, 11-100 - слабая экспрессия, 101-200 - умеренная экспрессия, 201-300 - выраженная экспрессия. Применение счета H-score по отношению к экспрессии ЭР р, по имеющимся у нас сведениям, было выполнено впервые. Интенсивность ИГХ реакции к белку Ki67 оценивали в процентах (количество окрашенных ядер на 100 клеток). Интенсивность реакции к белкам Р27 и циклину Е оценивали в баллах - 1+ - слабая, 2+ - умеренная, 3+ - выраженная и в процентах (количество окрашенных ядер или цитоплазмы на 100 клеток). Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с использованием системы статистического анализа «Statistica v6.0» и программы «Excel». Описательная статистика включала подсчет среднего значения (М) и стандартной ошибки среднего (м), достоверность определяли по методу Стьюдента с использованием формулы t= M1-M2/Vm12 +м22 (р<0,05), рассчитывали коэффициент вариации по формуле CV=o/M. Проводили корреляционный анализ, при котором показатель корреляции менее 0,4 считали не значимым и не учитывали, если коэффициент был равен 0,4 - 0,5 - корреляционная связь считалась слабой, от 0,5 до 0,7 - средней, от 0,7 и выше - сильной (Г.Г. Автандилов, 1973).

Результаты исследования и их обсуждение.

Исследование эндометрия в группе сравнения показало, что в период 7-10 ПОД у обследованных женщин существовало открытое «окно

имплантации». Это, в первую очередь, подтверждают соответствующие данному периоду МЦ секреторные проявления, обнаруженные при гистологическом исследовании. Уровень экспрессии ЭРа в железах и в строме низкий (63,2+6,7 H-score), экспрессия ПР в железах эндометрия умеренная (132,5+9,5 H-score), в строме - выраженная (208,8+11,6 H-score). Пролиферативная активность клеток эпителия желез крайне низкая, в строме - слабая. Локализация Р27 и циклина Е в ядрах свидетельствует о блокировке клеточного цикла во всех клетках желез и в большей части клеток стромы. Наличие циклина Е в цитоплазме части клеток стромы свидетельствует о еще продолжающейся активности клеточного цикла. Так как, по общепринятым представлениям, именно строма играет важную роль в процессах имплантации и развития беременности, протекающие в части ее клеток процессы роста и дифференцировки вполне логичны. О том, что строма поддерживается в активном состоянии на протяжении всего «окна имплантации», свидетельствуют также высокий уровень в ней ПР и наличие слабой пролиферативной активности. Развитые пиноподии на поверхности эндометрия также отражают существование открытого «окна имплантации» у обследованных женщин группы сравнения.

По некоторым официальным статистическим данным эндометриальная патология, как первопричина бесплодия, составляет всего 3,2% (Сгит С.Р., Hornstein M.D., 2006). В тоже время, патология эндометрия была обнаружена нами у всех обследованных пациенток с бесплодием. Это выглядит парадоксальным только на первый взгляд. В работе представлен материал биоптатов и соскобов эндометрия, которые выполнялись только по строгим клиническим показаниям, основными из которых являлись - подозрение на патологию эндометрия или цервикального канала, нарушения менструального цикла. Таким образом, был изучен лишь определенный «пласт» пациенток, обратившихся в отделение ВРТ. Охватить спектр патологии у всех бесплодных женщин практически невозможно, структура и частота патологии эндометрия в нем неизбежно будет отличаться от выявленной нами. Но, в любом случае, процент ее среди бесплодных женщин высок. Патология эндометрия может и не быть первоначальной причиной бесплодия, но она всегда принимает роль значимого самостоятельного фактора, дополняет и усугубляет первопричины заболевания.

На основании данных объективного, инструментального и лабораторного обследования пациентки были разделены на подгруппы по принципу первичного и вторичного бесплодия и факторов бесплодия (рис.1). Это деление считается общепринятым в гинекологической практике (Назаренко Т.А. и др. 2004; И.В. Корнеева, Т.П. Лопатина, 2006), несмотря на

его определенную условность из-за сочетания разных факторов у многих женщин с бесплодием. Т-пФ считали основным при отсутствии маточных труб или их непроходимости, подтвержденной данными гистеросальпингографии, хромосальпингоскопии. ЭФ выделяли в связи с синдромом склерокистозных яичников, гиперпролактинемией, снижением овариального резерва, что было подтверждено данными инструментальных и лабораторных исследований при отсутствии патологии матки и маточных труб. Эндометриоз, выявленный при помощи гистероскопии и лапароскопии, считали основной причиной бесплодия при исключении (или минимальных проявлениях) другой патологии.

Рисунок 1. Диаграмма. Распределение пациенток на группы с различными факторами при первичном и вторичном бесплодии.

При Б1 по сравнению с Б2 преобладали пациентки с ЭФ и эндометриозом (в сумме 58%), в то же время при Б2 67% составили пациентки с Т-пФ.

Средняя продолжительность бесплодия была наиболее высокой у женщин с эндокринным фактором, а наиболее низкой - при трубно-перитонеальном. При изучении экстрагенитальных заболеваний в анамнезе обращает на себя внимание высокая частота перенесенных вирусных и бактериальных инфекций не только в детском, но и в старшем возрасте, причем практически без различий во всех подгруппах. Что, несомненно, могло сыграть важную роль в патогенезе бесплодия. Из соматических заболеваний у пациенток с Б1 преобладали заболевания органов дыхания и остеохондроз, а заболеваниями желудочно-кишечного тракта чаще страдали больные с Б2. Ожирение закономерно встречалось чаще у пациенток с ЭФ. При Т-пФ в анамнезе более частой была патология органов дыхания и мочевыводящей системы. Изучение спектра гинекологических заболеваний в анамнезе и при объективном обследовании выявило закономерные

особенности в подгруппах. Инфекции и воспалительные заболевания значительно преобладали у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Такие заболевания как миома и патология шейки матки чаще встречались у пациенток с бесплодием, обусловленным эндометриозом. Очевидной выглядит высокая частота оперативных вмешательств на внутренних половых органах в группе с Т-пФ. Однако частота операций на других органах не имела различий у обследованных пациенток. Так же не имел существенных отличий в подгруппах средний возраст становления менархе, продолжительность менструального кровотечения и длительность МЦ. Беременности в анамнезе имели 34 пациентки, более половины из них (55,9%) - только одну. Искусственные аборты и самопроизвольные выкидыши наиболее частыми были у больных эндометриозом. Внематочные беременности были у 10 пациенток, 9 из них страдали трубно-перитонеальным бесплодием. 68,1% обследованных нами женщин имели ранее неудачные попытки лечения методами ВРТ в разных клиниках. В основном, ВРТ использовали пациентки с Б1 и Т-пФ. В качестве метода ВРТ чаще использовалось ЭКО. Обращает на себя внимание, что исследование гормонального профиля не показало существенных отличий в подгруппах. Средние показатели сывороточных гормонов в основном находились в пределах референсных значений. Незначительные отклонения в показателях сывороточного эстрадиола обнаружены у 4 пациенток (3 из них с Т-пФ), прогестерона - у 12 (6 из них с ЭФ). Причем достоверных отличий в спектре гистологически выявляемой патологии эндометрия, экспрессии стероидных рецепторов, фактора пролиферации и белков, регулирующих клеточный цикл, у этих женщин не обнаружено.

Анализ клинических данных показал определенные различия между подгруппами. Однако клинико-лабораторные показатели были с одной стороны очень разнообразными и разнородными, а с другой - повторялись и пересекались у многих пациенток различных групп.

Спектр патологии эндометрия при Б1 и Б2 представлял, естественно, одни и те же нозологические формы, но с рядом отличий по их частоте (рис.2).

Недостаточность лютеиновой фазы (НЛФ) была преобладающим типом патологии в группе с Б1 и превосходила по частоте встречаемости НЛФ при Б2. Гистологически НЛФ проявлялась отставанием секреторных изменений в железах в среднем на 5 дней. В то же время, при Б2 по сравнению с Б1 на ведущей позиции оказываются полипы (ПЭ) и гиперплазия эндометрия (ГЭ). ГЭ имела вид простой неактивной очаговой гиперплазии, а ПЭ имели «классические» опорные диагностические признаки. Такие различия в

спектре патологии выглядят вполне логично, учитывая разные по частоте причины бесплодия при Б1 и Б2 (рис.2). Это наиболее четко видно при разделении пациенток на группы с различными факторами бесплодия.

Рисунок 2. Диаграмма. Спектр патологии эндометрия при различных видах и факторах бесплодия.

Спектр патологии эндометрия при различных факторах бесплодия существенно различался (рис.2). Так при Т-пФ преобладали ПЭ и ГЭ. При эндометриозе, по сравнению с другими группами, ведущей была НЛФ, а при ЭФ преобладал ХЭ. Эти отличия могут быть объяснены тем, что Т-пФ и эндометриоз в той или иной степени сопровождаются эндокринными нарушениями, но они не оказываются основными в патогенезе бесплодия, а ЭФ, являясь основным ведущим, в анамнезе заболевания неоднократно подвергался гормональной коррекции.

Новые аспекты открываются при исследовании спектра патологии при различных факторах бесплодия у пациенток с Б1 и Б2. У пациенток с Т-пФ НЛФ преобладала при Б1 (35%), а ГЭ - при Б2 (29,2%), ХЭ и ПЭ обнаруживались с одинаковой частотой и при Б1 и при Б2. У пациенток с ЭФ ПЭ выявлялись только при Б1, НЛФ преобладала при Б1 (37,5%), а ХЭ значительно преобладал при Б2 (50%). В группе с эндометриозом ГЭ и ХЭ выявлены только при сочетании с Б1, а НЛФ и ПЭ преобладали при сочетании с Б2 (55,5% НЛФ и 44,4% ПЭ). В группах с Т-пФ и ЭФ вполне логичным оказывается преобладание НЛФ при Б1, а при эндометриозе НЛФ преобладала при Б2, что является вполне объяснимым и, в некоторой степени, отражает эндокринные нарушения при эндометриозе, не зависящие от типа бесплодия.

Стероидная рецептивность эндометрия при бесплодии существенно изменена. Эти изменения проявлялись и при Б1, и при Б2 в достоверном снижении количества ПР в стромальных клетках и достоверно повышенной экспрессией ЭРа и в клетках желез, и в клетках стромы. Достоверных отличий в показателях Н-Бсоге ЭРа и ПР между Б1 и Б2 не обнаружено. И общая картина показателей в целом похожа. Однако уровни ПР и ЭРа в железах имели тенденцию к несколько более высоким показателям при Б 2 по сравнению с Б1, а в строме - к более низким (табл.1).

Таблица 1. Рецепторы к эстрогенам (а) и прогестерону в эндометрии женщин с бесплодием, Н-зсоге. М+м.

ПР в железах ПР в строме ЭРа в железах ЭРа в строме

Норма (п~30) 132,5+9,5 208,8+11,6 63,2+6,7 89,8+4,1

Б1 и Б2 (п=72) 139,3+8,2 183,1+5,7 149,7+8,3* 121,9+6,7*

Б1 (п=38) 131,5+11,0 187,3+6,8 141,7+11,9* 126,6+9,4*

Б2 (п=34) 148,1 + 12,3 176,9+9,0* 158,6+11,4* 116,8+9,7*

Т-пФ (п-39) 150,6+11,5 179,8+8,9* 157,6+11,2* 123,6+9,6*

ЭФ (п=17) 136,1 + 15,7 190,6+8,9 130,4+18,6* 129,2+13,9*

Эндометриоз (п=1б) 115,3+16,9 180,0+8,5* 150,9+16,0* 110,3+12,8

Т-пФ приБ1(п=16) 140,3+17,4 186,8+11,4 161,9+17,6* 135,4+12,8*

Т-пФ приБ2(п=23) 156,6+16,0 177,2+13,5 154,5+15,5* 119,4+13,5*

ЭФ при Б1 (п=14) 125,6+17,8 197,9+9,7 122,1+20,9* 129,0+16,3*

ЭФ при Б2 (п=3) 184,7+8,6* 156,7+7,2* 169,0+39,5* 130,7+20,7*

Эндометриоз при Б1 (п=8) 121,7+25,4 167,3+13,3* 129,6+23,8* 79,9+20,6

Эндометриоз при Б2 (п=8) 110,2+23,8 189,9+10,3 166,1+21,7* 117,8+14,0*

* - показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от нормы.

Нами впервые были получены количественные данные H-score, характеризующие экспрессию 3Pß в ядрах клеток эпителия желез и стромы эндометрия. В нормальном эндометрии группы сравнения уровень 3Pß и в железах, и в строме был средним и составил в железах — 110,3+3,6 баллов, в строме - 123,3+7,0 баллов. При бесплодии в целом экспрессия 3Pß была ниже, чем в норме, что говорит о недостаточном количестве рецепторов этого класса и в железах и в строме. В свете данных о том, что 3Pß в эндометрии ответственны за процессы секреции в железах и децидуальной трансформации в строме (Lecce G. et al., 2001; Taylor L.J. et al, 2005; Tessier C. et al., 2000) и, несомненно, играют не менее важную роль в формировании полноценного «окна имплантации», чем другие факторы, недостаток 3Pß в

эндометрии пациенток с бесплодием приобретает особое значение. Уровень ЭРр при Б1 был несколько выше, чем при Б2.

При бесплодии выявлены достоверные отличия в экспрессии белков Р27 и циклина Е, регулирующих клеточный цикл. Исследование эндометрия группы сравнения показало, что в норме в период «окна имплантации» происходит активная блокировка клеточного цикла в большинстве клеток эпителия желез и стромы, о чем свидетельствует наличие Р27 в ядрах. Слабая окраска циклина Е в небольшой части ядер свидетельствует о необратимой инактивации комплекса циклин Е+циклинзависимая киназа 2. Однако небольшой части клеток стромы циклин Е обнаружен и в цитоплазме, что свидетельствует о еще продолжающихся процессах митотического цикла. Митотическая активность может быть отражением важной роли стромы эндометрия в процессе имплантации и развития беременности. При бесплодии Р27 выявлялся и в ядрах, и в цитоплазме, как в железах, так и в строме. Но основным отличием от нормы явилось наличие цитоплазматического окрашивания. При Б2 процент окрашенных ядер был достоверно выше нормы. В эпителии желез циклин Е выявлялся и в ядрах, и в цитоплазме, а количество ядер лишь немного превышало нормальные показатели. Цитоплазматическое же окрашивание выявлялось в большинстве клеток. В строме также выявлялось и ядерное, и цитоплазматическое окрашивание циклина Е, причем количество клеток с окрашенной цитоплазмой значительно превышало показатели группы сравнения. Отличия в экспрессии белков, регулирующих клеточный цикл, у бесплодных женщин свидетельствуют об активности клеточного цикла (или предпосылках к ней) и в железах, и в строме эндометрия, что явно не соответствует нормальному «окну имплантации». Различий ИГХ реакции на белок Р27 при Б1 и Б2 не выявлено. В то же время, обнаружены различия в экспрессии циклина Е. И в железах, и в строме цитоплазматическое окрашивание преобладало при Б1 и по количеству клеток, и по интенсивности, а количество окрашенных ядер в строме при Б1 было достоверно ниже, чем при Б2. Это свидетельствует о том, что при Б1 митотический цикл активен в большем числе клеток, чем при Б2.

Пролиферативная активность в эндометрии при бесплодии достоверно отличалась от нормы. Показатели экспрессии Кл67 во многих группах в разы превосходили таковые у здоровых пациенток. Стоит особо подчеркнуть, что митотическая активность в эндометрии при Б1 была достоверно выше, чем при Б2, что коррелирует с соответствующими особенностями экспрессии циклина Е. Такие различия в показателях можно объяснить, исходя из

предположения об изначально измененных свойствах ткани эндометрия у первично бесплодных женщин.

Рецепция к эстрогенам и прогестерону в группах с различными факторами бесплодия не проявила существенных особенностей (табл.1). В железах количество ЭРа и ПР было несколько выше при Т-пФ, а в строме рецепция к эстрогенам и прогестерону имела тенденцию к более высоким показателям у женщин с ЭФ, чем в группах с Т-пФ и эндометриозом. Разделение на подгруппы пациенток с Б1 и Б2 по принципу факторов также не выявило существенных особенностей. Это можно объяснить только разнородностью групп пациенток, сформированных на сугубо клинической основе.

Были обнаружены особенности в экспрессии регулирующих клеточный цикл белков - Р27 и циклина Е - при различных факторах бесплодия. Экспрессия Р27 при Т-пФ отличалась от нормы большим количеством окрашенных ядер в железах и наличием цитоплазматического окрашивания и в железах, и в строме. Циклин Е выявлялся в большем количестве ядер, а в цитоплазме с большей интенсивностью и в железах и в строме. При ЭФ показатели Р27 в железах практически не отличались от нормальных показателей группы сравнения, а в строме в ядрах белок выявлялся с большей интенсивностью, а цитоплазматическое окрашивание было слабой интенсивности. Экспрессия циклина Е в ядрах практически не отличалась от нормы, но, также как при Т-пФ, выявлено цитоплазматическое окрашивание в клетках желез. При эндометриозе в эпителии желез Р27 выявлен в большинстве ядер, в стромальных клетках Р27, как и при других факторах выявлен и в ядрах и в цитоплазме, но с большей интенсивностью. Экспрессия циклина Е при эндометриозе практически не отличалась от таковой при других факторах. Эти данные показывают, что при Т-пФ адекватная блокировка митотического цикла происходит в меньшем количестве клеток, чем при других факторах бесплодия. Закономерными выглядят особенности экспрессии Кл67 при различных факторах бесплодия (рис.3). Пролиферативная активность значительно преобладала при Т-пФ и в железах и в строме, в то время как, при ЭФ была выше, чем при эндометриозе. Особенности в пролиферативной активности обнаружены и между пациентками с одним и тем же фактором, но при различных типах бесплодия (Б1 и Б2). При всех факторах у пациенток с Б1 пролиферативная активность имела тенденцию к более высоким показателям и в железах, и в строме, чем при Б2. При эндометриозе экспрессия К167 в случае Б1 была достоверно выше, чем при Б2.

Рисунок 3. Диаграмма. Фактор пролиферации при различных типах и факторах бесплодия и при различной патологии эндометрия, сопровождающей их.

Достоверные и яркие различия пролиферативной активности в железистых и стромальных клетках при разных факторах бесплодия объективно отражают неадекватность пролиферативных процессов и степень их отклонения от нормы.

Таким образом, эндометрий женщин с бесплодием в период предполагаемого «окна имплантации» характеризуется значительными гистологическими и иммуногистохимическими особенностями. Установлен ряд общих черт, характерных для групп, разделенных на основании сугубо клинических признаков (Б1, Б2, Т-пФ, ЭФ, эндометриоз). Это подчеркивает принципиальную правильность существующих стандартов группировки пациенток. Но так же очевидно, что традиционные «клинико-лабораторные» группы — весьма разнородны по состоянию эндометрия.

При анализе особенностей патологических процессов в эндометрии, сопровождающих бесплодие, выявляются новые аспекты.

Наибольшие отклонения в стероидной рецепции закономерно обнаружены при, ГЭ (табл.2), это касается в основном экспрессии ЭРа и ПР в железах эндометрия, она значительно (до 3 раз для ЭР) превышала показатели группы сравнения. При НЛФ отмечалась повышенная экспрессия ЭРа и в железах, и в строме. Экспрессия ПР в железах была несколько выше нормы, а в строме - ниже нормы. Эти изменения могут быть обусловлены недостаточным снижением уровня рецепции эстрогенов и в железах, и в строме, а также рецепции прогестерона в железах, которое должно закономерно происходить в секреторную фазу. Тем не менее ПР в строме

должны сохраняться на высоком уровне в период «окна имплантации», а у пациенток с бесплодием этого не происходит, что, вероятно, обусловлено их недостаточным синтезом в эндометрии, неадекватно подготовленном к «окну имплантации» в течение фолликулярной фазы МЦ. Наиболее низкие показатели ПР выявлены в железах и в строме ПЭ. В то же время экспрессия ЭРа в железах и в строме ПЭ, как и при другой патологии эндометрия, была выше нормальных значений. Это можно объяснить тем, что полип изначально является очагом, отличающимися неадекватной рецептивностью к стероидным гормонам. Закономерное повреждение рецепторного аппарата при хроническом воспалении с иммунным компонентом подтверждают выявленные нами изменения стероидной рецепции при ХЭ.

Таблица 2. Рецепторы к эстрогенам (а) и прогестерону при различной патологии эндометрия, Н-Бсоге. М+м.

ПР в железах ПР в строме ЭРа в железах ЭРа в строме

Норма (п=30) 132,5+9,5 208,8+11,6 63,2+6,7 89,8+4,1

НЛФ (п=29) 158,3+11,4 191,6+6,9 149,4+13,8* 118,4+10,6*

ГЭ (п=14) 193,9+8,3* 156,3+16,7* 196,9+14,6* 138,6+16,4*

ХЭ (п=11) 154,4+23,4 165,5+9,6* 173,5+17,6* 112,5+17,1

ПЭ (п=27) 85,5+11,1* 187,2+8,8 121,0+11,5* 116,1+11,0*

* - показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от нормы.

Отмечены особенности экспрессии ЭРр при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие. Они выражались в разной степени снижения экспрессии по сравнению с группой сравнения, наибольшей при ГЭ и ХЭ.

При ГЭ и ХЭ Р27 в железах выявлялся только в цитоплазме, что свидетельствует о его неактивном состоянии. Циклин Е был выявлен в цитоплазме железистых клеток с высокой интенсивностью. Учитывая биологическую сущность белков Р27 и циклина Е, эти показатели свидетельствуют о выраженной активности клеточного цикла, характерной для пролиферативных процессов. При ГЭ и ХЭ Р27 и циклин Е также обнаружены в цитоплазме большого количества стромальных клеток с умеренной и высокой интенсивностью. Показатели регуляции клеточного цикла в ПЭ и при НЛФ отличались от нормы наличием, помимо ядерного, слабого цитоплазматического окрашивания Р27 в строме и наличием цитоплазматического окрашивания циклина Е высокой и средней интенсивности и в железах, и в строме. В свете этого, значительные отклонения пролиферативной активности при различной патологии эндометрия выглядят вполне логичными. Самые высокие показатели

пролиферативной активности и в железах, и в строме закономерно выявлены при ГЭ (табл.3, рис.3). При НЛФ экспрессия Кл67 в клетках эпителия желез была в 8 раза больше нормальных значений для «окна имплантации», а в клетках стромы - в 2 раза. Высокие показатели Кл67 при ХЭ отражают активность процессов пролиферации, связанных с воспалением. В ПЭ экспрессия белка Кл67 в клетках эпителия желез несколько ниже, чем при другой патологии эндометрия, а в клетках стромы — выше нормы в 2,3 раза. Это соответствует современным представлениям о полипе как о моноклональном стромальном пролиферате с относительно ареактивным железистым компонентом.

Таблица 3. Пролиферативная активность (экспрессия белка Ю67) при различной патологии эндометрия, % окрашенных ядер. М+м.

Эпителий желез Клетки стромы

Норма (п=30) 0,7+0,3 3,5+0,6

НЛФ (п=29) 5,1+1,2* 6,9+0,8*

ГЭ (п=14) 19,3+4,8* 13,9+3,4*

ХЭ (п=11) 7,3+4,6* 9,0+1,2*

ПЭ (п=27) 2,1+1,3* 8,3+0,8*

* - показатель статистически достоверно (р<0,05) отличается от нормы.

Исследование корреляционных связей между стероидными рецепторами и фактором пролиферации при бесплодии выявило, наряду с ожидаемыми закономерностями, и некоторые особенности.

Сильная положительная корреляция обнаружена между количеством ПР и ЭРа в железах и показателем пролиферации в железах, что выглядит вполне закономерным. Логичным представляется также тот факт, что ПР в строме и Ю67 в железах имеют слабую отрицательную корреляционную связь. Особенностью же явилось отсутствие каких-либо значимых корреляционных связей между значениями Н-Бсоге стероидных рецепторов (и в железах, и в строме) и стромальной экспрессией Кл67. Это указывает на дисбаланс стероидной рецепции и пролиферативной активности при бесплодии, в первую очередь, в строме эндометрия, которая является наиболее важным компонентом полноценного «окна имплантации».

При исследовании корреляционных связей между экспрессией белков, регулирующих клеточный цикл, фактором пролиферации и стероидной рецепцией получены ожидаемые отрицательные и положительные корреляционные коэффициенты в основном для блокирующего клеточный

цикл белка Р27. Его ядерное окрашивание, как в железах, так и в строме имеет сильные отрицательные связи с ЭРа и Кл67 и в железах, и в строме, а также с ПР в железах, а с ПР в строме — обнаружена положительная корреляция. В то же время цитоплазматическое окрашивание Р27 обнаруживает диаметрально противоположные корреляционные связи. Эти данные характеризуют закономерную связь экспрессии белка, блокирующего клеточный цикл со стероидной рецепцией и пролиферативной активностью, которая сохраняется в эндометрии у бесплодных пациенток. В отличие от Р27, экспрессия циклина Е не показала четких и закономерных корреляционных коэффициентов. Обнаружена только умеренная отрицательная корреляция между ядерным окрашиванием в железах и ЭРа в железах, слабая положительная корреляция между цитоплазматическим окрашиванием в железах и ЭРа в железах, а ядерное окрашивание в строме положительно коррелирует с ПР в железах и отрицательно - с ПР в строме. Отсутствие четких корреляционных связей для циклина Е является свидетельством дисбаланса между стероидной рецепцией, пролиферативной активностью и процессами активации клеточного цикла в эндометрии у бесплодных женщин.

Важность морфологического и ИГХ исследования подчеркивается также своеобразием корреляционных связей между показателями экспрессии стероидных рецепторов в эндометрии и уровнями соответствующих им гормонов в сыворотке крови у обследованных пациенток.

В норме эстрадиол в фазе пролиферации усиливает синтез собственных рецепторов и рецепторов прогестерона. Во второй фазе менструального цикла прогестерон подавляет синтез как ПР, так и ЭР. Следовательно, закономерно должны выявляться существенные положительные и отрицательные корреляционные связи между концентрацией стероидных гормонов в крови и показателями рецепции в эндометрии (Тискегшап Е. Й а1., 2004). В тоже время, у обследованных нами пациенток с бесплодием обнаружены только единичные отрицательные корреляционные коэффициенты между прогестероном крови и ЭРа в железах, а по остальным показателям не выявлено какой-либо статистически значимой корреляционной зависимости. Это касается, как больных с Б1, Б2 и с различными факторами бесплодия, так и пациенток с разной патологией эндометрия. При исследовании гормонального профиля пациенток средние показатели эстрадиола и прогестерона в группах не имели достоверных различий и находились в пределах референсных значений репродуктивного возраста. Некоторые отклонения показателей гормонального профиля закономерно отмечены в группе с ЭФ бесплодия. В свете этого, отсутствие

четких корреляционных связей выглядит особенно значимым, поскольку может отражать дисбаланс гормональной регуляции стероидного рецепторного аппарата на уровне эндометрия и свидетельствовать о его повреждении.

Существенным представляется тот факт, что изменения в строме, касающиеся показателей стероидной рецепции, при бесплодии были более выражены, чем в железах. Это важно в свете современных представлений о том, что именно строма играет решающую роль в успешной имплантации (М.Х. Ашхаб, 2003; Ferenczy А., 2003; Mazur М.Т., Kurman R.J., 2005). Повреждение стероидной рецепции стромы, с одной стороны, может отражать главное звено в патогенезе бесплодия, с другой - служить важным диагностическим маркером в плане количественной оценки экспрессии стероидных рецепторов именно в строме эндометрия.

Дополнительным показателем полноценности «окна имплантации» является поверхностная ультраструктура эндометрия. Показано, что в этот период на поверхности клеток появляются характерные выросты цитоплазмы - пиноподии (Acosta А.А., et al. 2000). Значение пиноподий в процессе имплантации дискутабельно (Adams S.M. et al., 2002; Achache H., Revel A., 2006), но, как один из маркеров адекватного «окна имплантации», они вполне могут быть использованы. У пациенток с бесплодием отмечены дефекты в развитии пиноподий. Если в группе сравнения на поверхности эндометрия, гистологически соответствующего нормальному «окну имплантации», определяются многочисленные крупные пиноподии, практически скрывающие микроворсинки, то пиноподии при бесплодии, либо отсутствовали вовсе, либо были немногочисленными и находились на начальных этапах развития. При различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие, изменения поверхностной ультраструктуры были наиболее показательны. При НЛФ обнаружены лишь единичные пиноподии на начальных стадиях развития. При ХЭ и ГЭ поверхность клеток практически гладкая, пиноподии отсутствуют. При полипах эндометрия поверхностная ультраструктура отличается «пестротой» в разных участках.

Анализ клинико-лабораторных данных предоставляет много важной информации для диагностики бесплодия, распределения пациенток на группы в соответствии с его факторами и типами, а, значит, позволяет применять дифференцированный подход к лечению.

Но полученные нами данные о многообразии патологии эндометрия при бесплодии, о нарушениях эстрогеновон и прогестероновой рецепции, об изменениях пролиферативной активности, регуляции клеточного цикла и поверхностной

ультраструктуры делают очевидной необходимость комплексного клинико-лабораторно-морфологического обследования. Оно, несомненно, может дать основания для более точного выбора тактики лечения каждой конкретной пациентки. Не менее важной является оценка состояния эндометрия перед назначением гормональной терапии, очень «жесткой», но, в то же время, неизбежной в программах ВРТ. Восприимчивость эндометрия к воздействию эндогенных гормонов и гормональных препаратов может быть достоверно определена только с применением соответствующих ИГХ маркеров.

Рутинная гистология, иммуногистохимические реакции и изучение поверхностной ультраструктуры показывают, что у пациенток, страдающих бесплодием, «окно имплантации» неполноценно. Проведенное нами исследование дает новую, подчас неожиданную информацию, важную для подготовки пациенток к лечению ВРТ. Это по значимости вполне соответствует патологоанатомическому исследованию эндометрия в гинекологической практике вообще.

На основании этого мы предлагаем алгоритм клинико-морфологического обследования эндометрия в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ (рис.4).

Комплекс клинического, лабораторного и инструментального исследования должен включать: сбор жалоб и анамнеза, общее и специальное гинекологическое обследование, проведение функциональных проб, изучение гормонального профиля, УЗИ органов малого таза в динамике менструального цикла, допплерометрию и обследование на урогенитальные инфекции. Значимость этих данных неоценима на всех этапах обследования. Во-первых, они позволяют выявить факторы бесплодия; во-вторых, -необходимы для правильной интерпретации морфологических феноменов, наконец, - представляют неотъемлемые аргументы при выборе способов коррекции обнаруженных в эндометрии нарушений. Но исполнение этого алгоритма требует существенной детализации и модернизации морфологического исследования тканевого материала эндометрия с использованием, как минимум, шести иммуногистохимических маркеров, отражающих состояние стероидной рецепции, пролиферативной активности и особенности клеточного цикла эпителиальных и стромальных клеток, а также, по возможности, -сканирующей электронной микроскопии.

выводы

1. Эндометрий периода нормального «окна имплантации» характеризуется гистологическими проявлениями 7-10 постовуляторного дня, низкой экспрессией эстрогеновых-а рецепторов (63,2+6,7 Н-Бсоге), умеренной экспрессией эстрогеновых-р (110,3+3,6 Н-Бсоге) и прогестероновых (132,5+9,5 Н-эсоге) рецепторов, низкой пролиферативной активностью. Локализация Р27 и циклина Е в ядрах клеток свидетельствует о блокировке клеточного цикла. Поверхностная ультраструктура эндометрия характеризуется наличием многочисленных развитых пиноподий.

2. Патология эндометрия была обнаружена во всех исследованных соскобах и биоптатах у пациенток с бесплодием. Спектр патологии при первичном и вторичном бесплодии не имел существенных отличий. Наиболее частыми были недостаточность лютеиновой фазы (35,8%) и полипы эндометрия (33,3%). Недостаточность лютеиновой фазы преобладала при эндокринном факторе и эндометриозе, а при трубно-перитонеальном факторе превалировали полипы. При трубно-перитонеальном бесплодии значительную долю патологии составила также гиперплазия эндометрия, а при эндокринном факторе - хронический эндометрит.

3. При бесплодии имело место значимое повышение экспрессии а-эстрогеновых рецепторов, без достоверных различий между первичным и вторичным типами бесплодия. Стромальная экспрессия была наибольшей при эндокринном факторе, а эстрогеновая рецептивность железистого эпителия — при трубно-перитонеальном факторе. В то же время, экспрессия а-эстрогеновых рецепторов при эндометриозе достоверно от нормы не отличалась. Количество ЭРа закономерно варьировало в соответствии с патологией эндометрия - от 196,9+14,6 баллов Н-эсоге при гиперплазии эндометрия до 112,5+17,1 баллов при хроническом эндометрите.

4. Экспрессия прогестероновых рецепторов при бесплодии была существенно понижена в строме, тогда как в железах она мало отличалась от нормы. Нарушенная прогестиновая рецептивность стромы, без достоверных различий между типами и факторами бесплодия, может отражать одно их центральных звеньев патогенеза этого заболевания.

5. Впервые полученные количественные данные об экспрессии эстрогеновых-р рецепторов выявляют достоверное снижение этого показателя, особенно при вторичном бесплодии (91,4+12,8 Н-Бсоге).

Это может отражать роль ЭРр в патогенезе бесплодия. Установлены достоверные различия числа эстрогеновых-Р рецепторов при различной патологии эндометрия - от 144,7+7,9 баллов Н-всоге в полипах до 40,5+11,5 баллов при гиперплазии.

6. Во всех исследованных соскобах и биоптатах эндометрия при бесплодии пролиферативная активность была достоверно выше, чем в нормальном «окне имплантации». При первичном бесплодии показатель К167 вдвое превосходил таковой при вторичном бесплодии. При трубно-перитонеальном факторе значение Кл67 и в железах, и в строме (8,8+2,9% и 9,8+1,6% соответственно) было выше, чем при других факторах бесплодия.

7. Белки Р27 и циклин Е, регулирующие клеточный цикл, обнаружены при бесплодии не только в ядрах, но и в цитоплазме железистых и стромальных клеток. Это отражает неполноценную блокировку клеточного цикла, необходимую для адекватного «окна имплантации». Максимальное цитоплазматическое окрашивание выявлено при трубно-перитонеальном и эндокринном факторе, особенно в сочетании с гиперплазией эндометрия.

8. Поверхностная ультраструктура эндометрия при бесплодии характеризуется существенными особенностями, касающимися, в первую очередь, развития пиноподий и зависящими от соответствующей патологии эндометрия. На поверхности полипов и эндометрия с недостаточностью лютеиновой фазы имеются островки с недоразвитыми пиноподиями диаметром 2-3 мкм, а при гиперплазии и хроническом эндометрите пиноподии отсутствуют вовсе.

9. При бесплодии отсутствуют четкие корреляции между экспрессией ИГХ маркеров и концентрациями сывороточных гормонов, характерные для нормального менструального цикла. Это может свидетельствовать о дисбалансе стероидной рецепции на тканевом эндометриальном уровне.

10. Существенные гистологические, иммуногистохимические и ультраструктурные особенности эндометрия при бесплодии дают ценную информацию, дополняющую традиционные клинические классификации. Оценка морфо-функционального состояния эндометрия открывает новые возможности для обеспечения индивидуального подхода при назначении схем ВРТ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

• В алгоритм обследования пациенток с бесплодием при подготовке к ВРТ должно быть включено не только рутинное гистологическое, но и иммуногистохимическое исследование эндометрия с использованием, как минимум, шести ИГХ маркеров и, по возможности, сканирующая электронная микроскопия.

• Сведения о рецептивности эндометрия должны учитываться при назначении схем гормональной терапии.

• Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и гинекологии для студентов медицинских ВУЗов и при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТРЦИИ

1. Самойлов М.В., Серебренникова К.Г., Бессмертная B.C., Чумакова Н.В., Бабиченко И.И., Духин А.О. Экспрессия рецепторов к эстрогену и прогестерону в эндометрии пациенток с бесплодием и при использовании вспомогательных репродуктивных технологий // Материалы VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». -М:2006. -С.505.

2. Серебренникова К.Г., Чумакова Н.В., Меняшева В.Ф., Самойлов М.В., Бессмертная B.C., Хачатрян Л.Т. Эффективность лечения бесплодия при комплесной подготовке эндометрия к циклам ВРТ II Материалы VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М:2006. -С.515-516.

3. Серебренникова К.Г., Мирзоян Ж.В., Хмелевская В.Ф., Бессмертная B.C. Иммуногистохимическое и морфологическое состояние эндометрия у пациенток с бесплодием, готовящихся к экстракорпоральному оплодотворению // Материалы IX Всероссийского научного форума «Мать и дитя». - М:2007. - С.516-517.

4. Бессмертная B.C., Самойлов М.В., Бабиченко И.И., Серебренникова К.Г., Мусаева М.Г. Рецепторы к эстрогенам и прогестерону в эндометрии женщин при бесплодии // Вестник РУДН. Серия: Медицина. - 2007. - №2 - С.48-52.

5. Бессмертная B.C., Серебренникова К.Г., Самойлов М.В., Бабиченко И.И., Мусаева М.Г. Экспрессия эндометриальных рецепторов к эстрогенам и прогестерону у женщин с первичным и вторичным

бесплодием // Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М:2007 - С.534.

6. Серебренникова К.Г., Бессмертная B.C., Самойлов М.В., Бабиченко И.И. Экспрессия рецепторов к стероидным гормонам и фактора пролиферации (белка Ki-67) в эндометрии женщин с первичным и вторичным бесплодием // Материалы IV Международного конгресса. «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)». - М: 2007. - С. 10-11.

7. Бессмертная B.C., Самойлов М.В., Серебренникова К.Г., Бабиченко И.И. Морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия женщин с первичным и вторичным бесплодием // Архив патологии. - 2008. - Т.70,№4 - С.31-34.

8. Серебренникова К.Г., Бессмертная B.C., Самойлов М.В., Шульчина И.В., Хмелевская В.Ф. Современные подходы в оценке состояния эндометрия при подготовке к экстракорпоральному оплодотворению и переносу эмбрионов (ЭКО и ПЭ) // Материалы II Регионального научного форума «Мать и дитя». - Сочи 2008. - С.209.

9. Буравков C.B., Черников В.П., Бессмертная B.C., Буравкова Л.Б. Альтернативные методы подготовки препаратов для сканирующей электронной микроскопии // Материалы Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии». - М:2008. -С.20-21.

lO.Samoylov M., Serebrennikova К., Bessmertnaya V., Shulchina I., Mishnev О. Endometrial window of implantation in infertility // Histopathology. -2008 - Vol.53 - Suppl.l - P.200-201.

Н.Самойлов M.B., Серебренникова К.Г., Бессмертная B.C., Лапшихин A.A., Черников В.П., Мишнёв О.Д. Алгоритм клинико-морфологического обследования эндометрия при подготовке к лечению бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий // Российский медицинский журнал. - 2009 - №2 - С.29-32.

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная.

Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №803

Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Бесплодие представляет собой важную медико-социальную проблему. По данным ВОЗ бесплодными являются почти 15% супружеских пар (В.И. Кулаков, Т.В. Лопатина, 2006), что является критическим уровнем воспроизводства населения, причем ведущую роль в структуре бесплодия играет женский фактор (И.В. Корнеева, Т.В. Лопатина, 2006). К сожалению, эти показатели не имеют тенденции к снижению. Многим бездетным супружеским парам показано применение вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе — программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) (Б.В. Леонов, В.И. Кулаков, 2004). Однако эффективность методов искусственного оплодотворения до сих пор составляет лишь 10 — 15% на одну попытку (А.П. Лазарев, 2006). Таким образом, поиск причин и разработка методов повышения эффективности ВРТ является одной из актуальных задач современного российского здравоохранения, что отражено в национальном проекте «Здоровье» (Протокол №2 от 21 декабря 2005 г. Президиума Совета при Президенте РФ; Приказ Минздрава РФ № 220 от 29 марта 2006 г.). Решение этой проблемы имеет большое медицинское, социальное и демографическое значение.

Роль патологии эндометрия в патогенезе бесплодия несомненна. Ведь именно адекватное морфофункциональное состояние эндометрия является одним из основных факторов, обеспечивающих успешную имплантацию оплодотворенной яйцеклетки и развитие эмбриона. По данным ряда исследователей более чем у половины пациенток, включенных в программы ЭКО, наблюдаются заболевания эндометрия (Oliveira F.G. et al., 2003; Hinckley M.D., Milki A.A., 2004), а, согласно B.C. Корсак и соавт. (2005), патология эндометрия обнаруживается у 73,7% пациенток с трубно-перитонеальной формой бесплодия.

По действующему регламентирующему документу (приказ Минздрава РФ № 67 от 26 февраля 2003 г.), проведение гистероскопии и биопсии эндометрия не входит в обязательное обследование всех пациенток с бесплодием. По мнению А. В. Кузьмина и соавт. (2004) исследование биоптатов эндометрия необходимо только в случае неудачи первой попытки ЭКО. Но существуют не менее авторитетные данные о том, что проведение гистологического исследования представляется целесообразным у всех пациенток с бесплодием, так как выявление и лечение патологии эндометрия является непреложным условием для повышения эффективности ВРТ (И.Е. Корнеева, Т.В. Лопатина, 2006).

Поскольку для успешного наступления беременности решающее значение имеет состояние эндометрия в 7-10 постовуляторные дни (ПОД), соответствующие 21-24 дням «классического» 28-дневного менструального цикла, особое внимание уделяют морфологической оценке эндометрия именно в этот период, часто называемый «окном имплантации» (Mazur М.Т., Kurman R.J., 2005; Cram С.Р:, Hornstein M.D., 2006 и др.). Для! этого, кроме; рутинного гистологического исследования соскобов и биоптатов, в последние годы с разным успехом применялись многочисленные (иммуногистохимические) ИГХ маркеры, в том числе: Ki67, PCNA, MUK1, LIF, MAG, Р27, циклин Е и другие (Pickartz Н. et al., 1990; Li S., Nakayama К. et al., 1993; Hey N.A., Li T.C. et al., 1995; Kliman HJ. et al., 1995; Cullinan E.B. et al., 1996; Lessey B.A., Castelbaum A.J. et al., 2000; Ordi J., Creus M. et al., 2002; Dubowy R.L. et al., 2003 и др.). Особое место в этом ряду занимают показатели рецепции к стероидным гормонам. Но даже в «окне имплантации» естественного цикла данные о показателях стероидной рецепции отличаются у разных исследователей, что во многом связано с использованием различных систем количественной оценки (И.И. Евдоченко, 2004; С.Ю. Ншанян, 2004; Acosta А.А. et al., 2000 и др.). Это в еще большей степени относится к сведениям о стероидной рецепции при различных типах и факторах бесплодия. Стероидная рецептивность эндометрия в нормальном цикле находится в тесной связи с гормональным фоном. В течение менструального цикла эстрадиол усиливает синтез всех стероидных рецепторов, тогда как прогестерон подавляет и синтез собственных рецепторов, и синтез рецепторов к эстрогенам (ЭР) (Б.В. Розен, А.Н. Смирнов и соавт., 1981; И.И. Евдоченко, 2004; В.Н. Ковязин, 2005; Fleming Н., Gurpide Е. et al., 1980; Develioglu О.Н. et al., 1999). Состояние рецепторного аппарата эндометрия в условиях гормональной терапии и применения схем стимуляции суперовуляции у женщин, участвующих в циклах ЭКО, является отражением сложных и многофакторных процессов. С одной стороны, гормональные препараты оказывают существенное влияние на систему рецепторов. С другой — нарушения в рецепторном аппарате могут привести к недостаточной восприимчивости эндометрия к экзогенному гормональному воздействию (Acosta А.А. et al., 2000; Crum С.Р., Hornstein M.D., 2006). В то же время, сведения о соотношениях между концентрациями гормонов в крови и показателями экспрессии рецепторов к эстрогенам (ЭР) и прогестерону (ПР) при бесплодии противоречивы и фрагментарны (Tuckerman Е. et al., 2004).

Важным показателем полноценности «окна имплантации» является пролиферативная активность эндометрия, основным маркером которой является белок Ki67. Экспрессия Ki67 повышается под влиянием эстрогена и снижается под действием прогестерона и в норме тесно коррелирует с экспрессией ЭР и ПР (Mertens Н.J. et al., 2002, Taylor et al., 2005). Известны некоторые особенности экспрессии белка Ki67 в эндометрии при поликистозе яичников, при эндометриозе, при гиперпластических процессах эндометрия (Pickartz Н. et al., 1990, Li S. et al., 1993, Maia HJr. et al., 2004, Zhang E.H. et al., 2006, Lian F. et al., 2007). Но систематические сведения о пролиферативной активности в эндометрии при бесплодии, его различных формах и факторах, отсутствуют.

Гораздо менее изучена экспрессия в эндометрии белков Р27 и циклина Е, которая также находится* под влиянием стероидных гормонов. R.L. Dubowy и соавт. (2003) и S.Lahav-Baratz и соавт. (2004) изучали Р27 и циклина Е в течение нормального менструального цикла и при стимуляции овуляции перед ЭКО. Однако детальное изучение экспрессии этих белков при различных формах бесплодия и при различной патологии эндометрия не проводилось.

Как один из показателей полноценности «окна имплантации» отмечают поверхностную ультраструктуру эндометрия. В этот период на поверхности клеток появляются характерные выросты цитоплазмы — пиноподии (Develioglu О.Н. et al., 1999, Acosta А.А. et al., 2000). По данным ряда исследователей развитие пиноподий находится под контролем тех же гормональных механизмов, что и стероидная рецептивность эндометрия (Martel D. et al., 1991). По мнению G. Nikas и соавт. (1995; 1997) изучение поверхностной ультраструктуры эндометрия дает возможность согласовать время подсадки эмбриона с периодом максимального развития пиноподий и позволяет повысить шансы на успешную имплантацию. Но,, в целом, сведения- о поверхностной, ультраструктуре' эндометрия при бесплодии > весьма фрагментарны.

Таким образом, целостной морфологической и иммуногистохимической характеристики эндометрия при бесплодии, его разных типах и факторах пока не существует. Изучения также требуют многие клинико-морфологические и лабораторно-морфологические корреляции. В то же время, эти данные имеют большое теоретическое, диагностическое и прогностическое значение. Все вышесказанное обусловливает актуальность работы в данном направлении и позволяет обозначить цель и задачи исследования.

Цель исследования: представить морфологическую характеристику эндометрия при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия; оценить диагностическое и прогностическое значение г комплексного гистологического, иммуногистохимического и t ультраструктурного исследования эндометрия- при подготовке к лечению методами вспомогательных репродуктивных технологий. т t 1

Задачи исследования

1. Изучить а- и (3-эстрогеновую и прогестероновую рецепцию, экспрессию белков Р27 и циклина Е, пролиферативную активность и поверхностную ультраструктуру эндометрия периода нормального «окна имплантации».

2. Изучить патологию эндометрия в соскобах и биоптатах у пациенток с первичным и вторичным бесплодием и с различными факторами бесплодия.

3. Оценить экспрессию рецепторов к эстрогенам а и (3 и к прогестерону в эндометрии во время предполагаемого «окна имплантации» у пациенток с первичным и вторичным бесплодием, различными факторами бесплодия и различной патологией эндометрия, сопровождающей бесплодие.

4. Исследовать экспрессию фактора пролиферации белка Ki67, белков Р27 и, циклина Е, регулирующих клеточный цикл; в эндометрии во время? предполагаемого «окна имплантации» у данного контингента пациенток.

5. Исследовать особенности поверхностной ультраструктуры эндометрия, у пациенток с бесплодием.

6. Оценить соотношения между морфологическими и иммуногистохимическими проявлениями в эндометрии, клиническими типами и факторами бесплодия, показателями гормонального статуса.

7. Определить значение и место комплексного морфологического исследования эндометрия в алгоритме обследования пациенток в рамках программ ВРТ.

Научная новизна.

Получены новые данные о патологии эндометрия и рецепции к стероидным гормонам в период предполагаемого «окна имплантации» при первичном и вторичном бесплодии и при различных факторах бесплодия. Патология эндометрия (хронический' эндометрит, гиперпластические процессы эндометрия, недостаточность лютеиновой фазы) выявлена у всех обследованных пациенток с бесплодием, без существенных различий при первичном и вторичном его типах. Выявлены очевидные отличия нозологического спектра в подгруппах с различными факторами бесплодия. Существенные изменения в экспрессии эстрогеновых рецепторов а и прогестероновых рецепторов обнаружены у пациенток с разными факторами бесплодия и при различной патологии эндометрия, сопровождающей бесплодие. Показана разная степень выраженности повреждения стероидной рецепции в железах и в строме эндометрия.

Впервые получены количественные данные об экспрессии эстрогеновых рецепторов (3. Снижение их количества при бесплодии и выраженные отличия при различной патологии эндометрия могут отражать роль эстрогеновых-Р рецепторов в патогенезе бесплодия.

Получены новые сведения о пролиферативной активности, регуляции клеточного цикла и поверхностной ультраструктуре эндометрия при бесплодии. Различия экспрессии белков Ki67, Р27 и циклина Е при различных факторах бесплодия объективно отражают неадекватность регуляции клеточного цикла и пролиферативных процессов: Степень отклонения показателей от нормы во многом связана с особенностями нозологического спектра. У всех пациенток с бесплодием и различной патологией эндометрия, сопровождающей его, отмечены существенные дефекты в развитии пиноподий.

Практическая значимость.

Полученные сведения о гистологических, иммуногистохимических и ультраструктурных особенностях эндометрия при бесплодии представляются важными для патологоанатомической диагностики и гинекологической практики. Данные об экспрессии стероидных рецепторов, белков, регулирующих клеточный цикл, и о развитии пиноподий представляют собой важные диагностические признаки, позволяющие на новом уровне формулировать патологоанатомические заключения по биопсийному материалу и соскобам эндометрия.

Результаты исследования открывают новые аспекты в традиционных клинических классификациях и, соответственно, в создании групп пациенток с учетом морфологического и иммуногистохимического исследования биоптатов и соскобов эндометрия. Это дает возможность более точно контролировать эффективность гормонального лечения, обеспечить индивидуальный подход к пациентке, а, следовательно, оптимизировать схемы гормональной терапии.

Установленные морфологические и иммуногистохимические особенности эндометрия подчеркивают значимость и необходимость комплексного исследования соскобов и биоптатов в алгоритме обследования пациенток в плане подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ.

Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и гинекологии для. студентов медицинских ВУЗов и< при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эндометрий женщин с бесплодием в период предполагаемого «окна имплантации» характеризуется значительными гистологическими и иммуногистохимическими особенностями, существенными изменениями поверхностной ультраструктуры.

2. Стероидная рецепция, экспрессия фактора пролиферации, белков, регулирующих клеточный цикл, и поверхностная ультраструктура эндометрия являются важными показателями полноценности «окна имплантации».

3. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование позволяет дополнить алгоритм обследования эндометрия в плане подготовки к лечению бесплодия, методами ВРТ.

• Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и гинекологии для студентов медицинских ВУЗов и при последипломном обучении патологоанатомов и гинекологов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

• В алгоритм обследования пациенток с бесплодием при подготовке к ВРТ должно быть включено не только рутинное гистологическое, но и иммуногистохимическое исследование эндометрия с использованием, как минимум, шести ИГХ маркеров и, по возможности, сканирующая электронная микроскопия.

• Сведения о рецептивности эндометрия должны учитываться при назначении схем гормональной терапии.