Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфогенез холангиоцеллюлярного рака печени при сочетанном воздействии описторхов и диметилнитрозамина

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ЧЕЛЯБИНСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

на правах рукописи

ИСТОМИНА Ольга Юрьевна

МОРФОГЕНЕЗ ХОЛАНГИОЦЕЛЛЮЛЯРНОГО РАКА ПЕЧЕНИ ПРИ СОЧЕТАННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ОПИСТОРХОВ И ДИМЕТИЛНИТРОЗАМИНА

( экспериментальное исследование )

14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск, 1995

Работа выполнена б Уральском государственном медицинском

институте.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ : доктор медицинских наук,

профессор Н.А.ЗУБОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ :

доктор медицинских наук, профессор Р.У.ГИНИАТУЛЛИН,

кандидат медицинских наук

В.Н. КОКШАРОВ.

Ведущая организация - Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова.

Защита состоится 27 июня 1995 в _ часов на заседании

диссертационного совета К - 084.04.04 при Челябинском медицинском институте по адресу : 454092, г.Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан мая 1995 т.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Л.М. Синельникова.

АКТУАЛЬНОСТЪ ПРОБЛЕМЫ

Описторхоз - паразитарное заболевание человека и отдельных видов домашних и диких животных, вызываемое в нашей стране гельминтом Opisthorchis felineus. До настоящего времени описторхоз остается одной из важных проблем современной медицины ввиду его широкой распространенности и интенсивности поражения населения эвдемичных районов (Бронштейн A.M., 1985). В крупнейшем мировом очаге описторхоза в бассейне рек Обь и Иртыш инвазированность населения достигает 83,6 %. В Свердловской области описторхоз выявлен в 15 из 22 районов, при пораженности в отдельных районах до 60% населения ( Пономарев Д.Н. и др., 1987,1988).

За время изучения описторхоза подробно исследованы природные очаги гельминтоза, дана характеристика их особенностей и напряженности, изучены вопросы клиники, диагностики, лечения. Разработан комплекс профилактических мероприятий. Достаточно полно исследованы патологоанатомические изменения гепа-тобилиарной системы при остром, хроническом, суперинвазионном и реинвазионном опксторхозе у экспериментальных животных и человека.

В очагах, эндемичных по описторхозу, существует четкая корреляция между уровнем зараженности населения и частотой первичного рака печени. Возникновение холангиоцеллюлярного рака на фоне описторхоза зависит от степени и главным образом, от длительности инвазии (Зубов H.A., 1966, Haiinasuta Т., 1984, Loivenfels A.B. ,1985). Однако проблема холангиоцеллюлярного рака как у человека, так и в эксперименте остается открытой. Считается установленной прямая этиологическая связь холан-гиокарцином с описторхозом. Но вопрос о том, как именно влияет инвазия на процесс становления и развития опухоли остается не выясненным. В отношении возможных источников развития карциномы мнения исследователей порой диаметрально расходятся. Даже в эксперименте не исследован морфогенез холангиоцеллюлярного рака на фоне описторхоза. Все работы зарубежных авторов по моделированию холангиоцеллюлярного рака при описторхозе проведены с использованием Opisthorchis viverrini, который в нашей стране не встречается.

Все изложенное явилось основанием для постановки основной цели и задач настоящего исследования.

Цель исследования: изучить морфогенез холагиоцел-люлярного рака печени при описторхозе.

Задачи исследования:

1. Создать вариант экспериментальной модели холан-гиоцеллюлярного рака на основе сочетанного действия на печень сирийских хомяков химического канцерогена диметилнитрозамина и описторхов.

2. На примере этой модели выяснить возможные морфо-генетические пути развития холангиоцеллюлярного рака.

3. Исследовать морфологию предраковых изменений в печени.

4. Уточнить возможность развития и морфологическую характеристику предраковых процессов при "чистом" описторхозе у хомяков.

5. Описать морфологические изменения в печени хомяков при хроническом введении определённой дозы диметилнитрозамина.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В работе впервые установлены два возможных морфогенети-ческих пути развития экспериментального холангиоцеллюлярного рака печени и два источника формирования холангиокарцином. Для решения этой проблемы создан вариант модели холангиоцеллюлярного рака с достаточно ранним развитием опухолей и 100% формированием холангиокарцином на основе сочетанного воздействия на печень С^зЛогсЫэ ГеКпеш и диметилнитрозамина. В эксперименте изучены предраковые изменения в печени при хроническом описторхозе. Дано описание патоморфологи-ческих изменений в печени сирийских хомяков при хроническом введешш диметилнитрозамина. На основании изучения в динамике патологической анатомии печени при сочетанном воздействии описторхов и диметилнитрозамина установлены дифференциально-диагностические критерии экспериментального холангиоцеллюлярного рака, дисплазии и гиперпластических изменений эпителия желчных протоков. Дано описание и морфологическая характеристика дисплазии билиарного эпителия. На основании изучения активности областей ядрышковых организа-

торов установлены дифференциально-диагностические критерии гиперплазии, дисплазии эпителия желчных протоков и опухолевого роста.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Одной из важных задач современной патологической анатомии является познание сущности опухолевого роста и выяснение механизмов онкогенеза. Изучение морфогенеза холангиоцеллюлярного рака печени при описторхозе позволит практическим врачам полнее осмыслить клиническую симптоматику, динамику заболевания и лечебную тактику при хроническом, длительно текущем описторхозе у людей.

Результаты работы используются при обучении студентов в курсе лекций и практических занятий по темам " Общие свойства опухолей", " Эпителиальные опухоли" на кафедре патологической анатомии Уральского государственного медицинского института. Основные принципы дифференциальной диагностики опухолевого роста используются в работе лаборатории проточной цитометрии и цитологии Областного пато-логоанатомического бюро г. Екатеринбурга.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 8 работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции и IV совещании координационного совета Всесоюзной программы "Описторхоз" (Курган, 1987),на VIII Всесоюзном съезде патологоанатомов (Тбилиси, 1989), на итоговой научной сессии СГМИ (Свердловск, 1989), на совещании проблемной комиссии АМН СССР по хронобиологии и хрономедицине (Свердловск, 1991), на Международной научной конференции "Актуальные проблемы экологической

хронобиологии и хрономедицины " (Екатеринбург, 1994), на VII научно-практической конференции врачей Областной клинической больницы №1 (Екатеринбург, 1994 ).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Существует два источника развития холангиоцеллюляр-ного рака печени: эпителий крупных желчных протоков, где паразитируют гельминты, и эпителий терминальных желчных протоков или канальцев Геринга, куда описторхи не проникают.

2. Установлены следующие этапы морфогенеза холангиоцел-люлярного рака при сочетанием воздействии на печень опис-торхов и диметилнитрозамина в эксперименте: патологическая регенерация, формирование очагов дисплазии, возникновение опухолевого зачатка, прогрессия опухоли.

3. Доказаны два пути морфогенеза холангиоцеллюлярного рака у золотистых хомяков.

4. При сочетанном воздействии на печень хомяков описторхов и диметилнитрозамина можно выделить следующие предраковые изменения: фоновый процесс - хронический продуктивный паразитарный холангит; очаги метаплазии и дисплазии эпителия септальных протоков, аденоматозных структур в стенках септальных протоков, холангиол и цистхолангиол .

5. При сочетанном воздействии на печень описторхов и диметилнитрозамина наблюдается синергичный токсический и канцерогенный эффект.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация включает введение, 4 главы, выводы, указатель литературы. Работа изложена на 156 страницах машинописного текста ( основной текст 100 стр.); иллюстративный материал представлен в виде 58 рисунков, 7 таблиц и 10 диаграмм. Указатель литературы включает 69 отечественных и 88 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом нашего исследования были сирийские хомяки собственного разведения, содержавшиеся в клетках по 5 штук соответственно полу на стандартном рационе вивария. Животные 4-5- недельного возраста разделены на 4 группы:

1 группа - 60 интактных животных.

2 группа - 70 хомяков заражены опнсторхами путем введения в глотку 50 метацеркариев каждому.

3 группа состояла из 70 зараженных аналогичным образом животных, которым на 30-е сутки инвазии начали вводить специфический гепатотропный канцероген диметилнитрозамин в виде 0,2% раствора пипеточным дозатором П-1-0,05 по 0,05 мл в глотку ежедневно. Продолжительность введения 90 суток. Суммарная доза составила 9 мг вещества на одного хомяка.

4 группа - 60 животным в сроки, соответствующие 30-м суткам инвазии у животных 2-й и 3-й групп, начато введение 0,2% раствора диметшпштрозамина пипеточным дозатором П-1-0,05 ежедневно по 0,05 мл. в глотку. Продолжительность затравки 90 суток. Суммарная доза канцерогена -9 мг.

Для заражения использовались жизнеспособные метацерка-рии, извлеченные из мышечной ткани язей методом пептического переваривания мяса рыбы. Мышечную ткань язей с кожей дважды пропускали через мясорубку. Полученный фарш тщательно перемешивали и распределяли на отдельные равные порции по 100 гр. Каждую порцию смешивали в соотношении 1: 10 с искусственным желудочным соком с концентрацией пепсина 3,5 г/л. Пептическое переваривание проводили в термостате при 4"37°С в течение 1,5 часов. Метацеркарии из пептолизата выделяли путем отстаивания и промывания осадка физиологическим раствором (Баяндина Д.Г. и др., 1985). Подсчет определенного количества личинок производили под контролем бинокулярной лупы МБС-9. Метацеркарии вводили в глотку подопытным животным с физраствором пипеточным дозатором П-1-0,2.

Для равномерного и динамического наблюдения за изменениями в печени по б хомяков из каждой группы забивали путем одномоментной декапитации в одно и то же время суток в сроки, соответствующие 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240-м суткам инвазии. В 3-й группе на 240-е сутки забиты все оставшиеся животные. Хомяки из 1, 2, 4-й групп, пережившие 240 суток, из настоящего эксперимента исключены и в дальнейшем не учитывались. Превышающее необходимое число животных было задействовано в опыте в расчете на естественную убыль, Для предотвращения каннибализма, проявляющегося с возрастом, хомяков для забоя забирали из клеток, имея в виду равномерное уменьшение количества особей в каждой клетке.

Во все сроки забоев всех подопытных животных взвешивали на весах ВНЦ-10. Забитые хомяки и извлеченная печень взвешивались на чашечных весах . Кусочки печени, вырезанные из правой и левой долей печени и соответствующим образом промаркированные, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, жидкости Карнуа с последующей проводкой и заливкой в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм приготовлены на санном микротоме МС-2.

Для получения общего представления о состоянии органа срезы окрашены гематоксилином и эозином.

Для выявления соединительной ткани проводили окраску по Ван Гизону. Коллагеновые волокна идентифицировали при окраске по Слинченко, ретикулиновые - при импрегнации серебром по Гомори, эластические - при окраске по Вейгерту.

Нейтральные мукополисахариды и гликоген определяли по ШИК-реакции с дообработкой части срезов амилазой. Для выявления кислых мукополисахаридов использовали окраску альциановым синим при pH 2,6.

Дифференцировку и избирательное выявление форменных элементов крови и клеток соединительной ткани проводили на срезах, окрашенных азурН-эозином. Окраску срезов по методу Фельгена применяли с целью определения содержания ДНК в ядрах холангиоцитов.

Для определения активности зон организаторов ядрышка депарафинизированные срезы дофиксировали в смеси метанола и уксусной кислоты в соотношении 1:3, затем инкубировали при 58-60°С в течение 30-60 сек в 50% растворе азотнокислого серебра, смешанного с 2% раствором желатины и 1 % раствором муравьиной кислоты по методу Howell W.M., Black D.A, ( 1980 ). Подсчитывали количество зерен серебра в ядрах 200 клеток при увеличении х900.

Щелочную и кислую фосфатазы выявляли по методу Гомори в криостатных срезах, изготовленных из кусочков, фиксированных при 40°С в 10% нейтральном формалине в течение 6 часов.

Часть кусочков фиксировали в 2,5% растворе глютар-альдегида на фосфатном буфере (pH 7,4) с дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере, проводили через спирты возрастающей концентрации и заливали в эпон-араддит. Полутонкие срезы изготовлены на микротоме IKB-III, окрашены толуидиновым синим.

Для микроскопического исследования и описания срезов использовали микроскопы " Биолам р-14 " и " ЕС БИМАМ Р-И" с наборами объективов, окуляров и бинокулярных насадок, обеспечивающих диапазон увеличения от х25 до х900.

Морфометрический анализ патологических изменений в печени проводили в соответствии с рекомендациями Г.Г.Автандилова 099д.

В различные сроки эксперимента на срезах, окрашенных по Ван Гизону , при помощи окулярной сетки (на 100 точек) определяли относительные площади паренхиматозного и стромального компонентов печени.

Относительную площадь эпителия селтальных протоков в сравнении с соединительнотканной стенкой подсчитывали с использованием окулярной сетки на 100 точек.

В септальных протоках подсчитывали ядерно-цитоплаз-матическое соотношение в эпителиальных клетках.

Результаты исследования обработаны с помощью обычных статистических методов на IBM 386SX.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно нашим данным, у животных 2-й группы к 60-м суткам инвазии в печени выявлена картина персистирующего гепатита, умеренный портальный и перидуктальный фиброз, склерозирующиеся гранулемы вокруг яиц и экскрементов гельминтов, холангиоэктазы. Портальный и перидуктальный фиброз по мере хронизации процесса прогрессируют, но со 180-х суток процесс стабилизируется и дальнейшей существенной динамики не наблюдается. Картина персистирующего гепатита достаточно выражена на протяжении всего эксперимента. Склерозирование паразитарных гранулем продолжается в течение 60-90 суток, в более поздние сроки гранулемы в стенках септальных протоков замещены грубоволокнистой соединительной тканью. Формирование холангиоэктазов, расширение их просвета, дислокация под капсулу заканчиваются на 90-120-й дни инвазии. Сформированные холангиоэктазы придают печени своеобразную макроскопическую картину.

Пролиферты малодифференцированных клеток вытянутой формы с удлиненным гиперхромным ядром и узким ободком

базофилыюй цитоплазмы зарегистрированы на 60-е сутки инвазии.

Пролиферация камбиальных клеток удерживается на одном уровне до 90-х суток инвазии, затем постепенно её интенсивность снижается , но тем не менее отдельные мелкие комплексы и клетки определяются на 180-240-е сутки эксперимента. Малодиф-ференцированные клетки, расположенные в перипортальных областях, складываются в трубчатые структуры со слаборазличимым просветом, в их апикальном крае появляется слизь, а в цитоплазме щелочная фосфатаза. Вокруг трубочек формируется нежная сеточка аргирофильных волокон, и камбиальные клетки постелено дифференцируются в холангиоциты, образующие псевдодуктулярные структуры. Первые признаки дифференцирован отмечены на 60-е сутки инвазии, что согласуется с данными В.Г.Бычкова (1986). К 120-м суткам просветы части холангиол кистозно расширены. Эпителий в таких ложных желчных протоках уплощен. В дальнейшем холангиолы и цист-холангиолы пребывают в неактивном состоянии.

К 90-120-м суткам инвазии в септальных протоках формируются поля метаплазии эпителия по тонкокишечному типу - появляются бокаловидные клетки, заполненные слизью. Начиная со 150-х суток, в эпителии септальных протоков отмечены участки дисплазии из клеток вытянутой формы с гиперхромными ядрами, с повышенным количеством слизи, неравномерно распределённой в цитоплазме. В таких зонах начинаются погружной рост эпителия и обособление аденоматоз-ных структур в стенках септальных протоков. Однако у данной группы животных этот процесс выражен незначительно и аденоматозные структуры не проникают за пределы стенки протоков. Также мы не наблюдали очагов дисплазии эпителия в холангиолах и цистхолангиолах.

Таким образом, при экспериментальном описторхозе в печени золотистых хомяков обнаружена пролиферация камбиальных малодифференцированных клеток с последующей их дифферен-цировкой в холангиоциты и формированием ложных желчных протоков, часть из которых кистозно расширяется. Отмечено образование в эпителии септальных протоков очагов метаплазии и дисплазии эпителия с незначительным погружным ростом в стенку септальных протоков.

-11В печени хомяков, получавших только канцероген, через месяц введения препарата выявлены дистрофические изменения со стороны гепатоцитов, уменьшение содержания гликогена. При этом репаративные процессы угнетены и проявляются минимально. Первые признаки пролиферации малодифферен-цированных клеток, которая на протяжении всего исследования незначительна и носит очаговый характер, отмечены 90 сутки эксперимента. Начиная с этого момента, появляются и признаки регенерации паренхимы, что свидетельствует об образовании клеточных элементов, устойчивых к токсическому действию канцерогена. Альтеративные и репаративные процессы максимально выражены в последние дни затравки диметилнитроз-амином. После отмены диметилнитрозамина дистрофические изменения паренхимы постепенно уменьшаются, но даже на 240-е сутки эксперимента можно обнаружить в перипортальных шлях гепатоциты с признаками повреждения. Параллельно с ослаблением повреждения восстановительные процессы приобретают законченные формы. Первые признаки дифферен-цировки камбиальных клеток отмечены к 150-м суткам опыта, когда эти клетки формируют трубчатые структуры с малоразличимым просветом. В апикальном храе клеток выявляется слизь, вокруг трубочек нежная сеточка аргирофильных волокон. К концу эксперимента просветы части дуктулярных структур расширены, камбиальные клетки вблизи портальных треугольников отсутствуют

Таким образом, при затравке диметилнитрозамином в печени золотистых хомяков преобладают альтеративные изменения с последующей регенерацией паренхиматозных клеток. В отсутствии пролиферативных стимулов пролиферация камбиальных клеток выражена слабо, течет вяло. Формирования очагов метаплазии или дисплазии в эпителии новообразованных ложных желчных протоков и в эпителии септальных или междольковых протоков не обнаружено.

При сочетанном воздействии на печень хомяков описторхов и диметилнитрозамина альтеративные изменения в органе выражены максимально и прогрессируют вплоть до отмены канцерогена с последующим плавным уменьшением. Признаки регенерации паренхимы впервые отмечены на 90-е сутки эксперимента. Соответственно большему повреждению репарация паренхимы протекает усиленно, но сроки её развития сдвинуты по

сравнешно со 2-й группой животных на более поздний период. Результатом максимально выраженных альтеративных изменений является и массивный перипортальный и перидуктальный фиброз (как проявление субституции), который по распространенности значительно превосходит аналогичый процесс у животных 2-й группы.

Начиная с 60-х суток, наблюдается бурный всплеск пролиферации малодифференцированных клеток, достигающий пика активности к 90-м суткам эксперимента, как и при описторхозе, но значительно превосходящий по выраженности аналогичный процесс у животных других групп. Признаки дифференцировки в виде формирования трубчатых структур с малоразличимым просветом появляются к 90-м суткам или несколько позже, чем у животных 2-й группы. В дальнейшем идет активная диф-ференцировка камбиальных клеток, образование широких полей дуктулярных структур, расширение просветов дуктул, формирование кистозно-аденоматозных структур. Среди пролифери-рующих клеток обнаруживаются тонкостенные новообразованные сосуды. Комплексы дуктул оплетены сетью ретикулярных, а в поздние сроки и коллагеновых волокон. Пролиферация малодифференцированных клеток после отмены канцерогена постепенно затухает, но и на 240-й день опыта комплексы таких клеток отмечены в перипортальных зонах.

С 90-го дня опыта в эпителии септальных протоков зарегистрированы признаки метаплазии эпителия по тонкокишечному типу, а к 150-м суткам инвазии - формирование очагов дисплазии эпителия из вытянутых клеток, имеющих удлиненные, гиперхромные ядра, и клеток с повышенным содержанием слизи в цитоплазме в сочетании с её неравномерным распределением. К 210-240-м суткам аналогичные участки появляются в холангиолах и цистхолангиолах. В зонах дисплазии эпителия септальных протоков вдет погружной рост эпителия в стенку протока с последующим обособлением аденоматозных структур. Этот процесс более выражен, чем у животных 2-й группы. В части аденоматозных структур сохраняется диспластичный эпителий. Такие ложные желчные протоки при пролиферации эпителия перемещаются за пределы стенок септальных протоков в перидук-туальную, а затем и в междольковую соединительную ткань. Эпителий у меньшей части аденоматозных структур утрачивает признаки дисплазии и формирует неактивные внутристеночные

ложные желчные протоки, которые не имеют тенденции к проникновению в перидуктальные ткани. В этих аденоматозных структурах, как правило, выражена метаплазия эпителия по кишечному типу. Если у животных 4-й группы очагов дисплазии эпителия не выявлено, а во 2-й группе отмечены немногочисленные фокусы метаплазии и дисплазии в эпителии сеп-тальных протоков, то в 3-й группе этот процесс имеет мульти-фокальный, распространенный характер.

Первые злокачественные опухоли обнаружены у животных 3-й группы на 150-е сутки паразитарной инвазии. К моменту окончания опыта у 100% хомяков развился холангиоцеллюлярный рак, имеющий строение дифференцированной аденокарциномы с большим содержанием слизи в клетках опухоли, в просветах опухолевых желез и свободной слизи в хорошо выраженной стро-ме опухолей. Среднее число злокачественных опухолей холангиоцеллюлярной природы у одного хомяка достигает 2,7. В печени хомяков одновременно встречаются множественные участки метаплазии, дисплазии и опухолевого роста, т.е. процесс канцерогенеза носит мультицентрический характер. После 210-и суток опыта у 36% хомяков обнаружены опухоли мезенхимального генеза - гемангиомы смешанного строения. Отдельные гемангиомы имели гигантские размеры, участки разрывов, кровотечение из которых обусловило тяжелое состояние животных.

Таким образом, при сочетанном воздействии описторхов и диметилнитрозамина наблюдается синергичный токсический и канцерогенный эффект.

Полученные данные позволяют полагать два возможных источника развития холангиоцеллюлярного рака на фоне описторхо-за. Во-первых, это эпителий септальных протоков, где паразитируют гельминты. Патологическая регенерация эпителия этих протоков при хроническом продуктивном паразитарном холангите проявляется образованием участков метаплазии по кишечному типу.

При длительной персистенции гельминтов формируются фокусы дисплазии эпителия с погружным ростом эпителиальных клеток в стенки септальных протоков. Обособление ложных протоков с диспластичным эпителием в утолщенной стенке септальных протоков - следующий этап морфогенеза. В дальнейшем наблюдается проникновение ложных желчных

протоков в перидуктальную и портальную соединительную ткань . В таких дислоцированных ложных желчных протоках и идет формирование carcinoma in situ.

Второй источник развития холангиокарцином - эпителий дуктулярных структур областей междольковых желчных протоков, куда описторхи не проникают.

В лечена человека и животных при различных заболеваниях описана так называемая дуктулярная пролиферация с формированием дуктулярных структур в перипортальных полях ( Д.С.Саркисов , 1987 ). Вопрос о происхожениии дуктул остается открытым. На основании появления недифференцированных клеток в перипортальных зонах мы предполагаем, что источником их появления являются или канальцы Геринга, или гепатоциты пограничной пластинки. Что является конкретным стимулом к такой трансформации не ясно, но количество образующихся недифференцированных клеток тем больше, чем выраженнее повреждение перипортальных гепатоцитов и соответственно канальцев Геринга. Дальнейшее образование дуктулярных структур связано с интенсивностью фибропластических процессов. Чем распространеннее и массивнее перипортальный и междольковый фиброз, тем большее количество холангиол формируется в перипортальной и междольковой соединительной ткани. Однако, полностью не известна и дальнейшая судьба этих структур. В клетках дуктул выявлен HBsAg и цитокератин эпителия желчных протоков, на основаннии чего их относят к промежуточной форме клеток с фенотипическими признаками как гепатоцитов, так и протокового эпителия (Vandersteenhoven A.M. et al., 1990). Предполагается, что дуктулярные клетки могут дифференцироваться и в сторону гепатоцитов, и в холанигоциты. Мы проследили дифференцировку камбиальных клеток, образующихся в перипортальных зонах и по ходу междольковых прослоек соединительной ткани, в сторону холангиоцитов с формированием ложных желчных протоков или холангиол, часть из которых кистозно расширяется. Мы не отрицаем возможность дифференцировки клеток холангиол и в гепатоциты, так как выраженность дуктулярной пролиферации, особенно при комбинированном воздействии на печень описторхов и диметил-нитрозамина, не согласуется с числом образовавшихся ложных желчных протоков. По-видимому, часть недифференцированных

клеток атрофируется или погибает, часть превращается в гепатоциты или эпителий ложных желчных протоков.

Известно, что результатом применения канцерогена диметил-нитрозамина является возникновение клона инициированных клеток, способных к промоции (Cameron R., Farber Е.,1981), которая представляет клональную селекцию и экспансию инцициированной клетки (Färber Е., Sarma D.S.R.,1987). Необходимым звеном фазы инициации является стимуляция пролиферации, когда при синтезе ДНК происходит фиксация повреждений (Осипова Л.А., 1984). Описторхи, механически травмирующие эпителий протоков, являются самой природой созданным фактором, стимулирующим пролиферативную активность преимущественно холангиоцитов. Различные вне- и внутриклеточные влияния способны вызвать модификацию ответа клеток, опухолевую промоцию и прогрессию. Модификация ответа клеток может возникать по механизму отбора субпопуляций, резистентных к цитотоксическому воздействию канцерогена, что и наблюдается в нашем эксперименте. Другой возможный путь - нарушение межклеточных соединений и взаимодействий, что происходит при дислокации холангиоцитов в необычных условиях (стенка протока, перипортальная и междольковая соединительная ткань).

Область ядрышкового организатора впервые описана как зона, вокруг которой возникает новое ядрышко в телофазе. При организации и созревании ядрышка в пролиферирующих клетках происходит серия изменений - ядрышковый цикл, свзанный с митотическим циклом клетки. Считается, что активное созревание ядрышка и повышение активности областей ядрышковых организаторов указывает на "решение клетки" вступить в митоз, т.е. отражает её пролиферативный потенциал. Доказана прямая корреляция между количеством ядрышковых организаторов и пролиферативной активностью клеток (Crocer J. et al. ,1988).

Связанные с зонами ядрышковых организаторов кислые негистионовые белки обладают аргирофильными свойствами, что и использовано для идентификации зон ядрышковых организаторов при окраске азотнокислым серебром (Howell W.M., Black D.A., 1980). Количество гранул серебра в ядрах является показателем активности их ядрышковых организаторов или критерием числа областей ядрышковых организаторов. В ядрышке нормальной клетки организаторы плотно упакованы и

могут идентифицироваться в виде 1-2 аргентофильных гранул. При увеличении транскрипционной активности клетки происходит увеличение степени визуализации зон ядрышковых организаторов. В опухолевых клетках с высокой пролифера-тивной активностью происходит дезагрегация и дисперсия ядрышковых организаторов, а также увеличение числа хромосом с активно работающими ядрышковыми организаторами, возможны амплификация генов и активирование онкогенов. Поэтому в малигнизированных клетках определяемое число аргентофильных гранул особенно велико, что используется для дифференциальной диагностики опухолевого роста (Аничков Н.М., Зиновьев A.C. , 1993).

Согласно результатам нашего исследования активность зон органи-заторов ядрышка , определяемая по числу гранул серебра в ядрах клеток, является четким дифференциально-диагностическим критерием малигнизации, дисплазии и гиперпластических состояний эпителия желчных протоков. При продуктивном паразитарном холангите среднее число аргентофильных гранул в ядрах холангиоцитов колеблется от 2,91 до 3,29 ( табл. 1). В случае сочетанного воздействия диметилнитрозамина проли-феративная активность клеток усиливается (среднее количество аргентофильных гранул 3,58-3.84). В очагах дисплазии эпителия септальных протоков при описторхозе пролифертивный потенциал клеток значительно (Р< 0,001) возрастает и число гранул серебра достигает 3,99 ± 1,38. Множественные фокусы дисплазии ( табл. 2) эпителия протоков, холангиол и цист-холангиол у животных 3-й группы характеризуются еще большим числом аргентофильных гранул (4,05±1,02 - 4,11±0,95), но это различие статистически не достоверно. В клетках холан-гиокарцином зарегистрирована максимальная активность зон ядрышковых организаторов (количество гранул серебра 5,36±1,22).

Другим диагностическим критерием служит процентное содержание ядер, имеющих 5 и более гранул серебра. В нормальном эпителии, в эпителии септальных и междольковых протоков у животных 4-й группы, в аденоматозных структурах холангиол с кубическим или уплощенным эпителием таких клеток не обнаружено. В гиперплазированном эпителии желчных протоков при описторхозе таких ядер содержится до 27%, в диспластичном эпителии 34-41,46%, в клетках холантиоцеллюлярного рака -

Таблица 1

Среднее число гранул серебра в ядрах эпителия септальных _протоков._

Сутки 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

60 1,65 =± 0,64 2,93 ± 0,82 3,61 ± 0,73 1,83 ± 0,73

90 1,73 ± 0,53 3,07 ± 0,93 3,58 ± 1,02 2,80 ± 1,03

120 1,71 л 0,87 3,29 ± 0,90 3,76 ± 0,94 2,72 ± 0,78

150 1,64 гк 0,60 3,20 * 0,90 3,80 ± 1,02 2,65 ± 0,76

180 1,67 ± 0,44 3,24 ± 0,96 3,79 ± 1,09 2,59 ± 0,82

210 1,68 ± 0,91 3,23 ± 0,94 3,83 ± 0,99 2,59 ± 0,77

240 1,71 ± 0,38 2,91 ± 0,94 3,84 ± 0,95 2,40 ± 0,77

4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00

- -1 — - - 2 3 ---4

груп- груп- груп- груп-

па па па па

„ — - - - — — — - —

/ - — - - - — -- _ а —-

у / /

/

90 120 150 180 210 240 Сутки

Таблица 2

Среднее число аргентофильных гранул и процентное содержание ядер с 5 и более гранулами в клетках дуктулярных структур, очагов дисплазии и холангио-целлюлярного рака.

Объект исследования Гранул серебра %

Пролиферирующие дуктулы 2,97 ± 1,02 7,79%

Цистхолангиолы с уплощенным эпителием 1,95 ± 0,79 0,00%

Цистхолангиолы с кубическим эпителием 2,69 ± 0,92 2,59%

Холангиолы и цистхолангиолы с цилиндрическим эпителием 3,58 ± 1,02 15,52%

Очаги дисплазии в холангиолах и цистхолангиолах 3,99 ± 0,90 34,46%

Аденоматозные структуры в стенках септальных желчных протоков без признаков дисплазии эпителия 2,25 ± 0,92 3,33%

Аденоматозные структуры в стенках септальных желчных протоков с диспластичным эпителием 4,05 ± 1,02 41,46%

Очаги дисплазии в эпителии септальных протоков у животных 2-й группы 3,99 ± 1,38 34,00%

Очаги дисплазии в эпителии септальных протоков у животных 3-й группы 4,11 ± 0,95 40,76%

Холангиоцеллюлярный рак 5,36 ± 1,12 77,58%

-1977,58%. Только в холангиоцеллюлярном раке и фокусах дисплазии выявлены клетки с 7 и более гранулами.

Анализ динамики веса животных показал, что острый опис-торхоз у юных хомячков определяет задержку нарастания массы животных при их росте. Хронизация заболевания, продолжающаяся в пубертатном и взрослом периодах, так же отрицательно воздействуют на физическое состояние животных. Сочетание описторхоза с введением диметилнитрозамина усугубляет дефицит веса хомяков. При адаптации к токсическому действию препарата различия в весе между животными 2-й и 3-й групп нивелируются. Развитие холангиокарцином вновь вызывает падение веса подопытных хомяков ( табл. 3 ).

Увеличение массы печени инвазированных животных, по сравнению с интактными, по нашему мнению, обусловлено разрастанием соединительной ткани в органе при хронизации описторхоза. Резкое нарастание веса и соответственно объема печени при развитии в ней злокачественных и доброкачественных опухолей может служить диагностическим признаком малигнизации.

Хронический продуктивный паразитарный холангит и пер-систитующий гепатит у животных 2-й группы приводят к развитию перидуктального и перипортального фиброза печени, поэтому у инвазированных животных стромально-парен-химатозный индекс печени превышает контрольные значения. При сочетанием воздействии спнсторхов и диметилнитрозамина также развивается паразитарный холангит, но сопутствующий гепатит приобретает черты агрессивного, что способствует более выраженному фиброзу печени ( табл. 4).

В значительном увеличении индекса стромы-паренхимы существенную роль играют и новообразованные дуктулярные структуры, холангиолы и цистхолангиолы, имеющие свой соединительнотканный каркас, интимно вплетенный в строму печени.

При сопоставлении активности областей ядрышковых организаторов (пролиферативной активности) и стромально-эпители-ального индекса холангиол с кубическим, цилиндрическим, диспластичкым эпителием и холангиоцеллюлярного рака мы выявили четкую зависимость между этими двумя показателями (коэффициент корреляции 0,98). Аналогичная зависимость (коэф-фицие21Т корреляции 0,94) установлена и между активностью зон организаторов ядрышка и ядерно-цитоплазматическим индексом в

Таблица 3

Средний вес подопытных животных в течение эксперимента в граммах.

Срок 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

0 37,7 1 7,4 37,7 ± 7,4 37,7 ± 7,4 37,7 ± 7,4

30 63,7 ± 8,7 58,2 ± 4,7 58,2 ± 4,7 63,7 ± 8,7

60 90,3 ± 6,0 79,3 ± 5,8 71,3 ± 7,0 89,2 ± 6,2

90 123,2 + 4,4 105,9 ± 7,6 100,5 ± 8,8 120,9 ± 6,0

120 129,3 + 4,9 113,8 ± 7,3 114,3 ± 8,7 127,0 ± 4,1

150 132,5 + 6,1 125,5 ± 7,7 120,8 ± 4,4 131,3 ± 4,2

180 139,6 + 5,9 128,1 ± 8,4 110,5 ± 9,0 137,1 ± 7,2

210 146,3 + 6,4 130,3 ± 8,6 126,4+ 6,9 141,5 ± 10,9

240 145,0 а. 4,1 131,5 ± 4,6 122,4 ± 3,4 134,8 ± 7,9

X ев

г г

св &

а х

£

0

1 о о

Ю

160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0

---

. - - - /

** у /

/ ''' /

---1 группа .....2 группа — • - - Ъ группа

^Г 0 / / ' ' '

1 4 груп па

--..... ■■■■

о <о

о чо

о

ач

о гч

О "О

о во

о о —

Г-1 <N1

Срок эксперимента,сутки.

Таблица 4

Стромально-паренхиматозный индекс печени сирийских _ __хомяков.

Сутки 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

60 0,033 ± 0,008 0,071 ± 0,016 0,063 ± 0,012 0,034 ± 0,007

90 0,036 ± 0,010 0,120 ± 0,015 0,110 ± 0,019 0,036 ± 0,009

120 0,037 ± 0,010 0,132 ± 0,018 0,146 ± 0,023 0,038 ± 0,011

150 0,035 ± 0,012 0,130 ± 0,022 0,151 ± 0,013 0,042 ± 0,006

180 0,038 ± 0,009 0,094 ± 0,021 0,158 ± 0,016 0,047 ± 0,013

210 0,040 ± 0,013 0,089 ± 0,019 0,155 ± 0,009 0,051 ± 0,008

240 0,041 ± 0,011 0,091 ± 0,023 0,143 ± 0,010 0,055 ± 0,009

1 группа ШЕ 2 группа В! 3 группа О 4 группа

перечисленных структурах. На основании изложенного можно заключить, что в процессе малигнизации билиарного эпителия происходит содружественная пролиферация соединительнотканных структур.

ВЫВОДЫ

1. Предложенный нами вариант модели холангиоцел-люлярного рака печени при сочетанном воздействии описторхов и диметилнитрозамина характеризуются ранним (150-е сутки) развитием холангиокарцином и 100% формированием злокачественных опухолей к 240-у дню эксперимента.

2. При воздействии описторхов в печени сирийских хомяков в сроки эксперимента развиваются следующие предраковые изменения: очаговая метаплазия и немногочисленные фокусы дисллазии в эпителии селтальных протоков.

3. Хроническое введение диметилнитрозамина (суммарная доза 9 мг) при отсутствии пролиферативных стимулов не вызывает в печени сирийских хомяков предопухолевых изменений и опухолей в течение 210-и суток.

4. Сочетанное воздействие описторхов и диметилнитрозамина на печень хомяков обусловливает синергичный токсический и канцерогенный эффекты.

5. Особенностью экспериментального гепатоканцерогенеза при сочетанном воздействии описторхов и диметилниторзамина является мультицентрический характер образования предраковых изменений и рака.

6. Возможны два источника развития холангиоцеллюлярного рака печени: эпителий крупных желчных протоков, где паразитируют гельминты, и эпителий терминальных желчных протоков или канальцев Геринга, куда описторхи не проникают.

7. Установлены следующие этапы морфогенеза холангиоцеллюлярного рака при сочетанном воздействии описторхов и диметилнитрозамина в эксперименте: патологическая регенерация, формирование очагов дисплазии, возникновение опухолевого зачатка, прогрессия опухоли.

8. Доказаны два пути морфогенеза холангиоцеллюлярного рака при экспериментальном описторхозе у сирийских хомяков:

А. Пролиферация малодиффренцированных клеток в перипортальных областях и по ходу расширенных междольковых

прослоек соединительной ткани. Группировка клеток в трубчатые и железистые структуры, диффренцировка в холангиоциты с формированием полей дуктулярной пролиферации. Постепенное расширение просветов ложных желчных протоков - формирование цистхолангиол с уплощенным или кубическим эпителием. Метаплазия эпителия холангиол и цистхолангиол в призматический или кишечный. Формирование фокусов дисплазии. Развитие carcinoma in situ. Инвазивный рост.

Б. Патологическая регенерация эпителия септальных протоков при хроническом продуктивном паразитарном холангите. Метаплазия эпителия по кишечному типу. Образование участков дисплазии. Погружной рост эпителия на этих участках. Обособление ложных протоков с диспластичным эпителием. Дислокация ложных желчных протоков в пери-дуктальную и перипортальную соединительную ткань. Опухолевый рост.

9. При сочетанном воздействии описторхов и диметилнитрозамина на печень золотистых хомяков выступают следующие предраковые изменения: фоновый процесс хронический продуктивный паразитарный холангит; очаги метаплазии и дисплазии эпителия септальных протоков, аденоматозных структур в стенках септальных протоков, холангиол и и цистхолангиол.

10. Морфологическая характеристика дисплазии билиарного эпителия включает в себя следующие положения : высокий цилиндрический многорядный эпителий; гиперхромные ядра; повышенное содержание и неравномерное распределение слизи в цитоплазме клеток; при определении активности ядрышковых организаторов среднее число аргентофильных гранул на ядро 3,99 - 4,11; ядра, имеющие 5 и более гранул серебра составляют 34 -41 %.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1, О связи холангиоцеллюлярного варианта первичного рака печени с описторхозом//Новые аспекты проблемы опистор-хоза:Тезисы докладов научно-практической конференции и IV совещания координационного совета Всесоюзной программы "Описторхоз".-Курган, 1987,- С. 51-52.

-242. О локализации описторхисов у хищных и грызунов //Научные основы оздоровительной работы при гельминтозах и некоторых арбовирусных инфекциях.- Омск, 1989.- С. 99-102. ( соавт. Зубов H.A., Беликов Е. С., Лесняк Ю.Ф. ).

3. . Изменения лёгких при описторхозе // VIII Всесоюзный съезд патологоанатомов. Тезисы докладов.- Тбилиси, 1989.- С. 4445. ( соавт. Зубов H.A., Лесняк Ю.Ф. ).

4. Роль определения активности зон организаторов ядрышка в дифференциальной диагностике опухолевого роста / / Результаты внедрения научных исследований в области онкологии и медицинской радиологии в практику .- Свердловск, 1990.- С. 11.

5. Воздействие диметилнитрозамина на печень сирийских хомяков // Временная организация чувствительности организма к биологически и экологически активным веществам: Тезисы докладов совещания проблемной комиссии АМН СССР по хронобиологии и хрономедицине.- Свердловск, 1991.- С.56.( соавт. Лесняк Ю.Ф. ).

6. Хронологические аспекты морфогенеза внутридольковых кровеносных сосудов печени при экспериментальном описторхозе// Временная организация чувствительности организма к биологически и экологически активным веществам: Тезисы докладов совещания проблемной комиссии АМН СССР по хронобиологии и хрономедицине.- Свердловск, 1991.- С.78. ( соавт. Лесняк Ю.Ф.)

7. Хронобиологические аспекты пролиферативной активности холангиоцмтов в эксперименте // Международная научная конференция. Актуальные проблемы экологической хронобиологии и хрономедицины: Тезисы докладов.- Екатеринбург, 1994.- С.89-90. ( соавт. Беликов Е.С. ).

8. К вопросу о предраковых изменениях в печени при описторхозе // Тезисы научных докладов VII научно-практической конференции врачей Областной клинической больницы №1 (15-16 декабря 1994 г.).- Екатеринбург, 1994 .- С. 162-163.

Отпечатано на ротапринте Свердловского ЦНТИ Тираж 100 экз. Заказ 197