Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфофункциональные основы антимикробной активности фагоцитов

На правах рукописи

МАЗИНГ Юрий Андреевич

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ

14.00.23 — гистология, цитология, эмбриология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

/> // ^

Москва 1995

Работа выполнена в Институте экспериментальной медицины Российской академии медицинских наук.

Директор Института: академик РАМН Б. И. Ткаченко.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор В. Е. Пигаревский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А. К. Дондуа, доктор медицинских наук, профессор Б. Б. Фукс, доктор медицинских наук А. Л. Черняев

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский медицинский университет.

Защита состоится 30 марта 1995 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета НИИ морфологии человека РАМН (117418, Москва, ул. Цюрупы, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН.

Автореферат разослан „_" февраля 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И. Я. Емельяненко

- о -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Новым направлением в развитии исследований о фагоцитах является изучение функциональной морфологии и биохимии антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулодитов (Пнгаревский В.Е.. 1978,1983,1987; Кокряков В.Н..1988). Антимикробные катионнне белки (АКБ) занимают одно из ведущих мест в осуществлении и регуляции неспецифических защитных реакций организма. К ним относятся белки, молекулы которых обладают суммарным положительным зарядом и выраженным антимикробным действием. Кроме того они способны играть роль медиатора воспаления, фактора проницаемссти. стимулятора метаболических процессов и служить источником неспецифических опсонинов при фагоцитозе (Ашмарин И.П. и др..1977; Пигаревский В. Е.. 1978,1983; Klebanoff S. J., Clark R.X., 1978; GabayJ.E. .et al, 1989; Lehrer R. I.. Ganz Т. .1990; Spitznagel J.K. ,1990). сформировались представления, рассматривающие ряд антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов не только как природные антибиотики широкого спектра действия, но и в качестве эффектор-ных молекул диффузной эндокринной системы, в том числе стресс-ли-митирующей (Корнева Е.А..Шхинек Э. К. ,1988; Маянский А. Н. .Маянский Д.Н., 1989; Яковлев Г.М. и др.1990; Kokrjakov V.U. et al. 1993). Возможно как прямое, так и косвенное их участие в реакциях подавления активности системы комплемента и фагоцитоза при ревматоидном воспалении (Венглинская Е.А..1994). Далеко не последнее место принадлежит катионным белкам в патогенетических механизмах повреждения тканей организма хозяина нейтрофильными гранулоцитами при ряде заболеваний (Henson P.M.. Johnston R.В.,1987;Weiss S.J., 1989; Zeok-Kapp G. et al.,1990).

Нейтрофильные гранулоциты (НГ) удивительно быстро обновляющиеся, моментально реагирующие на любые изменения в организме клетки. При различных физиологических и патологических процессах резко меняется количество нейтрофилов, их Функциональные свойства, морфологические и биохимические характеристики. Всегда пер выми появляясь в очаге повреждения, они активно стимулируют

привлечение других клеток (моноцитов, лимфоцитов, эозинофилов. базофилов). Их гранулы содержат большое количество разнообразных биологически активных веществ, которые могут в течение секунд попадать в кроЕоток. Среди них особое место принадлежит катионным белкам как новому классу эффекторных молекул, активно участвующих в защитных реакциях организма, обеспечении воспаления и клеточной цитотсксичности (Lehrer R.I. et al.1993).

Уже в начале века была обоснована необходимость оценки состава клеточных элементов крови для клинических целей, сохранившая свое значение до настоящего времени. Микробные токсины, бактере-мия и септицемия, стресс, интоксикации способны нарушить миелопо-эз и привести к выбросу из костного мозга в кровь функционально неполноценных НГ. Введение В.Шиллингом (У.Schilling) в медицинскую практику предложенного Н.В.Усковым (1890) метода лейкограмм привело в свое время к кардинальным изменениям в практической деятельности лабораторий всего мира. Сегодня без метода лейкограмм но обходится ни одно медицинское или биологическое исследование, связанное с изучением клеток крови. Однако диагностическая, и особенно прогностическая значимость клинического анализа крови за последние десятилетия существенно изменилась. Принципиальные открытия в иммунологии показали необходимость оценки не столько числа клеток крови, сколько их Функциональных характеристик (Лебедев К.А.,Понякина И.Д..1990). Такой подход оказывается оправданным и перспективным, поэтому предметом настоящего исследования стало изучение фагоцитов на основе морфологического анализа АКБ. становления этой одной из наиболее мобильных систем организма в онтогенезе. особенностей ее Функционирования при различных физиологических и патологических процессах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы стало дальнейшая разработка и практическая реализация концепции о резорбтивной клеточной резистентности. обеспечиваемой нейтрофчльными гранулоцитами и мононуклеар-ными фагоцитами, способными накапливать, изолировать, разрушать и

удалять чужеродные вещества при участии антимикробных катионных белков. Были поставлены следующие основные задачи:

1. Испытать разработанные под руководством В. Е. Лигарееского мор. Дологические методы анализа антимикробных ктгионных белков в

качестве лабораторных тестов при различных видах экстремальных воздействий и формах патологии человека.

2. Определить эффективность морфофункциональнсго анализа антимикробных кашонных белков в качестве критерия оценки состояния резистентности организма при различных видах патологии.

3. Показать роль анпиткробньи катионных белков нейтрофильных гранулоцитов в развитии первой фазы воспаления.

4. Исследовать особенности становления антимикробной функиии ■ нейтрофильных гранулоцитов в раннем постнатальном периоде.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ДИССЕРТАЦИИ.

На основании комплексного экспериментального и клинико-лабо-раторного исследования, выполненного при использовании морфологических, иммунологических и микробиологических методов, обосновано представление об антимикробных катионных белках нейтрофильных гранулоцитов как одном из универсальных механизмов осуществления защитных реакций организма. Обнаруженный у новорожденных млекопитающих транзиторный дефицит антимикробных белков нейтрофильных гранулоцитов может служить одной из ведущих причин снижения резистентности к инфекции.

Выявленные при ряде инфекционных заболеваний и стрессе закономерности изменения антимикробного потенциала НГ открывают принципиально новые перспективы для контроля за адаптивными возможностями человека. Доказательства стимулирующего действия антимикробных катионных белков нейтрофилов на макрофаги в рамках концепции о резорбтивной клеточной резистентности открывают новые пути при разработке препаратов, способных купировать инфекционные процессы. вызываемые внутриклеточными паразитами.

Обнаружено явление аномального гранулогенеза при радиоактивном поражении организма, которое может служить основой для нового

способа выявления случаев контакта с радиоактивными веществами, особенно при небольших дозах воздействия.

Клиническая апробация и внедрение в медицинскую практику цитохимических методов анализа антимикробных катионных белков представляют собой приоритетные исследования, которые позволили создать комплекс способов (защищенных 4 авторскими свидетельствами) оценки уровня сопротивляемости организма, использование которых во многих случаях даст возможность качественно менять тактику лечебно-профилактических мероприятий.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 7 и 8 Всесоюзных съездах патологоанатомов (1983,1989); 4 Всесоюзном съезде патофизиологов (1989); 1 Всесоюзном иммунологическом съезде (1989); 3 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (1992); 9th and 10th Intern. Symp. of the Problems of Listeriosis (1986,1988); 3 и 4 Всесоюзных конференциях по патологии клетки (1982,1987);3 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функция лизосом" (198G); заседаниях Лен. научного общества патологоанатомов (1979. 1985, 1986. 1987, 1989. 1990), Лен.общества иммунологов (1991).

ПУБЛИКАЦИИ.

Материалы диссертации изложены в 56 публикациях, в том числе: 20 статей в научных журналах и 4 авторских свидетельства.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования, отражены научная новизна, теоретическая и практическая значимость полученных результатов. В первых трех главах представлен обзор современных сведений о строении и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов. роли катионных белков в осуществлении

защитных реакций организма. Последующие разделы посвящены результатам собственных исследований, в процессе обсуждения которых представлен сравнительный анализ полученных результатов и литературных данных, показана роль антимикробных белков в осуществлении фагоцитами защитных реакций, обоснована возможность и необходимость использования разработанного методического подхода в оценке Функциональной активности нейтрофилов. Диссертация изложена на 242 страницах, иллюстрирована 34 таблицами и 25 рисунками, библиография содержит 565 источников.

На закипт выносятся следующие положения:

Концепция о резорбгпивной клеточной резистентности, связанная с функциональной активноетью неОтрофилыш гранулоцитов, основанная на выработке антимикробных катонных белков и их включении в клеточные реакции.

Максимальной диагностической ценностью обладают методы, позволяющие анализировать мобильные клеточные системы, особое внимание при этом необходимо уделять антимикробным белкам.

Цитохимические показатели активности антимикробных катионных белков могут быть одним из объективных критериев физиологических нарушений, происходящих в организме при экстремальных состояниях, в условиях инфекционной и неинфекционной патологии, а также одним из критериев'оценки эффективности проводимой терапии и выявления "групп риска" к развитию заболевания.

В раннем посшамыьном развитии имеется транзиторный Oe¡)5ut4um антимикробных катонных белков неьтрофильных гранулоцитов.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящей работе обследовано 515 детей и 249 взрослых, пациентов клиник г.Санкт-Петербурга с различными формами патологии и клинически здоровые люди, ' не болевшие в течение последнего месяца: 105 мужчин и 42 женщины вне беременности, 16 беременных женщин и 20 родильниц, 145 детей обоего пола различного возраста, а также 84 мужчины и женщины, имевшие контакт с радиоактивными веществами.

Забор крови производился всегда в утреннее время до еды.из пальца, у новорожденных детеП из мочки уха. используя одноразовые стерильные скарификаторы, При проведении соответствующих клинических процедур использовали забор крови из вены.

Эксперименты выполнены на самцах, исключение составили опыты. связанные с определением Функциональной активности НГ во время постнаталыюго развития, когда использовались оба пола животных. Всего изучено 76 беспородных белых крыс. 63 крысы линии "Август". 35 крыс линии "М1з1аг" весом 120-180 г. 140 морских свинок массой 200-300 г. 25 кроликов породы "Шиншилла" массой 2,5-3,0 кг. Кроме того использовано потомство 10 беспородных (47 крысят) и 15 линии "УЛэСаг" (70 крысят) беременных самок крыс. 17 самок кролика пароды "Шиншилла" (135 крольчат), родившихся в нашем виварии. Обследованы также 34 клинически здоровых теленка и 10 коров. Животные были доставлены из питомника РАМН "Рапполово" и использованы в опытах после 1-2 недельного карантина. Уход и все процедуры осуществлялись в соответствии с нормами и правилами обращения с животными.

Фагоциты получали из очага асептического воспаления, после введения внутрибрюшинно 0.3% раствора крахмала в физиологическом растворе. Брюшнум полость промывали средой 199 с добавлением гепарина до конечной концентрации 1 МЕ/мл в стерильных условиях. Полученные клетки центрифугировали в течение 15 минут при 200-250 В и использовали в экспериментах.

Для приготовления культуры макрофагов к осадку добавляли равные объемы среды RPI.il 1640 с добавлением глутамина и клетки рассовали по чашкам Петри с концентрацией 2x1О6 кл/мл. Помещенные в чашки Петри макрофаги инкубировали 1 час в среде углекислого газа (5%) при 37°С. затем три раза промывали культуральной средой для удаления не прикрепившихся клеток. Полученный монослой использовали в эксперименте. Состав среды для культивирования входили: 1 мл среды RPi.1I 1640, 15 X аутологичная кроличья сыворотка. 20 мкл глутамина. 20 мкл пирувата, 10 мкл, гентамишша. Контролем служили резидентные макрофаги брюшной полости интактннх кроликов.

- 9 -

выделенные аналогичным образом.

Экспериментальный листериоз. вызывали после в/в введения микроорганизмов в дозе 10"/кг веса тела кролика (опыты проведены в медицинском университете г.Печ [Венгрия] совместно с проф. В.Ralo-vich). • '

ЛИЗОСОНАЛЬИО-КАТИОНИЫЙ ТЕСТ. (Пигаревский В.Е.. 1979а.б)

Метод цитохимического выявления АКБ разработан В. Е.Пигаревс-ким (1975,1979а, б) и основан на способности этих белков избирательно реагировать с диахромными анионными красителями. Опубликованные В.Е.Пигаревским (1979) методические рекомендации позволили использовать тест в лабораторной и клинической практике, в дальнейшем опыт его применения потребовал внесения ряда уточнений, позволивших более широко и доступно использовать ЛКТ в научных исследованиях и у постели больного (Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А. 1981,1987).

Приготовление спиртового раствора прочного зеленого.

Раствор красителя прочного зеленого (color Index 42053) готовят на метаноловом буфере трис-соляная кислота с конечной величиной рН 8.1-8,2. Для этого 0,8 г сухого порошка трис (оксиметил) аминометана производства НПО "Биохимреактйв" растворяют в 50 нл метилового спирта и к полученному раствору добавляют 47,3 мл дис-тилированной воды и 2.75 мл 1 Н соляной кислоты, приготовленную из фиксанала. В метаноловом трис-буфере растворяют 0,1 г. сухого красителя прочного зеленого.

ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ ТЕСТ С НИТРОСИИИМ ТЕТРАЗОЛИЕМ (НСТ-ТЕСТ).

(Gilford R.H. .Malawlsta S.E. ,1970)

Показатели НСТ-теста определяли в нашей модификации. На тщательно обезжиренное предметное стекло наносят каплю крови и помещали его во влажной камере на 25 минут в термостат. Затем сгусток крови удаляют, к монослою фагоцитов добавляют среду 199, сухую плазму крови или опсонизированный комплементом зимозан. и 0,02% раствор нитросинего тетразолия, длительность пробы 30 минут при

37°С (38°С у кроликов). Высушенные препараты фиксируют ацетоном и окрашивают сафранином.

ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ШЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ.

(Шафран М. Г'. .Пигаревский В. Е.. 1975; Шафран М.Г. и соавт.. 1979)

Активность МПО в нейтрофилах оценивали, используя в качестве окисляемого субстрата орто-дианизидин. 24 мг его растворяют в 5 мл метилового спирта, добавляя 0.4 мл 3* раствора перекиси водорода. общий объем доводят дистиллированной водой до 10 мл. Фиксированные в смеси абсолютный этиловый спирт-4035 формалин (19:1) препараты инкубируют с реакционной смесью 3-5 минут при комнатной температуре. Ядра докрашивают азуром.

ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭНДОГЕННОЙ ПЕРИКИСИ ВОДОРОДА. (РОГОВИН В.В. и др..1977)

Фиксированные в смеси абсолютный спирт - формалин мазки крови инкубируют с раствором диаминобензидина 60 минут во влажной камере при 25еС. Ядра докрашивают азуром. Рассчитывают цитохимический коэффициент.

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ ТЕСТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ¡СНЕТОК (IN VITRO).

Фагоцитарную активность клеток определяли используя в качестве тест-микроба суточную культуру Staphllococcus epldermldls. штамм 9198. Микробную культуру опсонизировали ЮЯ аутологичной сывороткой, отмывали и разводили стерильным физиологическим раствором из расчета 10 микробных клеток на один фагоцит. Нейтрофилы и макрофаги получали из асептического очага воспаления, затем, добавив среду 199. инкубировали во влажной камере вместа с микробом 1 час при 37°С (у кроликов 38°С). Далее фагоциты отмывали от вкеклеточно расположенных микробных клеток, готовили мазки и окрашивали прочным зеленым - азуром. На препаратах определяли показатели фагоцитарной активности (ФЧ и ФИ) и завершенности фагоцитоза (КБА2).

ЛЕЙКОГРАХМА.

Для определения клеточного состава мазки крови и препараты отпечатки окрашивали по Май-Грюнвальду или красителем И1иек1гк1 (ИШек1пс1 0. .КтэсЬтег V. .1987). Общее число лейкоцитов определяли в камере Горяева.

ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРО-ФИЛЬШ ГРАНУЛОЦИТОВ. (Пигаревский В. Е.. Мазинг Ю. А.. 1988)

Для определения показателей секреторной активности НГ и изучения динамики воспалительной реакции использовали модифицированную нами методику "кожного окна" по Ребуку (диагностический очаг воспаления). В стерильных условиях на коже передней поверхности предплечья скальпелем наносят два микроскарификата (с целью удаления рогового слоя кожи). Микроскарификата закрывают фрагментами предметных стекол (25x35 мм) с шлифованными краями. Через 4 и 24 часа стекла снимают, подсушивают на воздухе и окрашивают вместе с мазками крови тех же больных прочным зеленым - азуром (ЛКТ). В препаратах определяют процентное соотношение НГ и макрофагов, а также ЦК содержания АКБ в нейтрофилах.

ОБЛУЧЕНИЕ. Облучение животных производилось от внешнего источника в дозах от 0.2-6.4 Гр и при ингаляции радионуклида в специальной камере в дозе 0,05-0,25Гр. • В качестве источника рентгеновского излучения использован аппарат РУМ-17 (напряжение на трубке-200 кВ, сила тока-15 мА. мощность дозы 0.5 Гр/мин).

Облучение крови УФ-лучами с длиной волны 254 им производили в аппарате "Изольда" стандартной терапевтической дозой, рекомендованной инструкцией для лечения различных заболеваний.

ЭЛЕКТР0НН0Ш11СР0СК0ПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материал фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида в течение 1,5 часов при 4°С. После промывки в 0,1М кокадилатном буфере исследуемые образцы помещали в 1% раствор четырехокиси осмия на 1-1,5 часа при комнатной температуре. Фиксаторы готовил! на 0.2М

кокадилатном буфере (pH =7.3-7,4). Срезы получали на ультрамикротоме LKB (Швеция), контрастировали цитратом свинца и просматривали с помощью микроскопа ЭМВ-1С0Л (СССР).

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Кусочки органов фиксировали в нейтральном формалине по Лилли и заливали в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематокси-лин-зозинсм, азур-эозином, по Хочкиссу, Лейшману-Романовскому и Граму. Часть материала замораживалась в жидком азоте для приготовления криостатных срезов. Гистологические срезы изготовлены на санном микротоме Reichert (Германия) или замораживающем микротоме Cryocut (США). Анализ препаратов и их фотодокументация произведены на светооптнческом микроскопе Axlomat (Германия) и люминесцентном микроскопе Л ЮНАК И2 (Россия).

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА МАТЕРИАЛА. Результаты исследований

обработаны с использованием параметрической (t-критерий Стыоден-та) и непараметрической (критерий Унлкинсона-Манна-Уитни) статистики. Использованы методы корреляционного и кластерного анализа, расчеты произведены с использованием программ электронных таблиц Cuattro и статистического анализа Statgraflcs на ПЭВМ типа IBM-PC. Во всех расчетах за минимальный принимался 95Х уровень значимости достоверности различий (Р<0.05).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. 1. ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИМЕНЕННЫХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОЗ.

Создание новых цитохимических методов анализа позволяет подойти к решению одной из назревших задач современной лабораторной диагностикч - определению показателей функциональной активности клеток. Впервые для выявлений АКБ прочный зеленый предложил J.К.Spitznagel (1961). однако метод не получил распространения из-за крайней нестабильности результатов. Его модификация, пред-

ложенная В. Е. Пигаревским (1969.1975) и получившая название "лизо--сомально-катионный тест", послужила основой, которая позволила создать удобную и надежную методику клинико-лабораторного определения АКБ (Пигаревский В.Е.. 1978.1979а, б. 1987; Пигаревский В.Е.. Мазинг Ю.А., 1981.1987), а также разработать ряд методов их выявления для лабораторных и экспериметальных исследований.

1.1. Лизосомально-катиоюлЛ тест

Возможно определение трех показателей - суммарное содержание белков в клетке, аномальные гранулы (АГ) и судьба бактерий в очаге воспаления. Все они могут быть рассчитаны на основе анализа одного и того же препарата. Для оценки результатов цитохимического выявления катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах наиболее оптимальным оказывается метод полуколичественного определения их внутриклеточного содержания путем расчета цитохимического коэффициента (ЦК). Применяемое определение процента клеток, дающих положительную реакцию на катионные белки, снижает эффективность оценки. Установлено, что при падении уровня внутриклеточного содержания катионных белков, доля клеток с отрицательной реакцией на них может не меняться, давая ложно положительный результат. Обследование людей различного возраста (таблица 1) показало, что максимальное содержание катионных белков в НГ крови обнаруживается -у детей первого года жизни й в возрасте 1-3 лет, минимальное -у новорожденных детей.

Аномальные гуаншы. (Пигаревский В.Е.. Мазинг Ю. А., Кокряков В.Н., 1983)

Использование сочетания красителей -прочного зеленого и азура обеспечивает выявление в НГ крови аномальных гранул (АГ), которые дают отрицательную реакцию на катионные белки и окрашивающихся в синий цвет азуром,- Определяют процентную долю нейтрофилов с АГ . (АЧ) при подсчете, 100 клеток в мазке, крови и. одновременно, среднее, число гранул на, клетку (АИ). В периферической крови 76 клинически здоровых людей только. 0.8 ±0,17% нейтрофилов содержали АГ. их число составило 0, 4 ±0,06.

- 14 -

ТАБЛИЦА 1. .Показатели ЛКТ здоровых людей.

Возрастная Число ЦК Доверительный

группа обследо- (X ± ш) интервал

ванных (РС0.001)

Новорожденные

(1-5 дней) 30 1.24 ±0.022 1.18 - 1.30

1-12 месяцев 22 1,89 ±0.030 1.77 - 2.01

1-3 года 32 1,96 ±0.032 1,85 - 2.07

4-12 лет 38 1.74 ±0.019 1,67 - 1.81

20-30 лет

мужчины 18 1.58 ±0,013 1,53 - 1.63

женщины 22 1.58 ±0.032 1.46 - 1.70

катионных белков. (Пигаревский В. Е.. 1979а.б)

В препаратах-отпечатках с поверхности ран и воспалительных очагов определяют жизнеспособные '(окрашиваются в синий цвет) и мертвые (окрашиваются в зеленый цвет) микробы. Определив число жизнеспособных и мертвых микробов, рассчитывают коэффициент внеклеточной антимикробной активности катионных белков (КБА1) и внутриклеточной антимикробной активности (КБА2). Последний, в сущности, является показателем завершенности фагоци-.оза бактерий НГ в очаге воспаления. Коэффициент антимикробной активности определяют по формуле: а

КБА = -------X 100 %

а + б

где а - выраженное в условных или абсолютных единицах число бактерий окрасившихся в зеленый цвет; б - выраженное в тех же единицах число бактерий, окрасившихся в синий цвет. Подсчета проводятся на 10 полей зрения при 900-1000 кратном увеличении микроскопа, обязательно использование желтого или оранжевого светофильтра.

Параллельно возможно определение показателей активности (ФЧ) и интенсивности фагоцитоза (ФИ).

Обсуждая вопрос о специфичности цитохимической реакции, лежащей в основе ЛКТ. следует отметить, что в диапазоне рН от 8.1 до 8.2 катионные белки оказываются единственными биополимерами, способными реагировать с анионными красителями, к которым относится прочный зеленый (Венглинская Е.А. и др.. 1976). В модельных системах было установлено, что лишь в строго контролируемых условиях можно добиться стехеометричности связывания этого красителя, причем интенсивность реакции возрастала при объединении нескольких белков, например гистона и лизоцима (СоПп N. Б..1973). Позднее удалось показать строгую стехеометричность окрашивания гистонов прочным зеленым при рН 8,1 (Рокоту Е. е1 а1., 1977). Весь опыт нашей работы свидетельствует об отсутствий неспецифической окраски структур, не содержащих катионные белки. Сопоставление полуколичественного и цитофотометрического способов оценки цитохимических реакций НГ крови дает почти полное совпадение результатов (Лецкий В.Б.,1979; Козинец Г.И. и др..1986). Коэффициент вариации воспроизводимости в серии при цитофотометрическом определении интенсивности окраски АКБ составил 5.4 % (Ященко Л. В. и др. ,1989).

1.2. Методика окраски антимикробта катотаа белков на гистологических срезах. (Пигарееский В.Е. .Мазинг Ю. А..

Селиверстова В.Г., 1986а,б). Наилучшие результаты сохранения АКБ получены при использовании в качестве фиксатора 2,5 % раствора глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере зеренсена (рН 7,4), продолжительность фиксации кусочка объемом 2-3 мм при 4. С 10-12 часов с максимально полным затем удалением глутаральдегида. Лучше всего использовать

1.5% раствор сахарозы в 0,1 И фосфатном буфере (рН 7.4), продол-

1

жительность промывки не менее 3 часов. Депарафинированнне срезы толщиной не более 5 мкм после промывания в дистиллированной воде погружаются на 20 минут в раствор прочного зеленого, ополаскиваются и переносятся в водный раствор азурз на 1-2 минуты. Срезы

заключаются в канадский бальзам или полистирол. Гранулы нейтрофилов и эозиноФилов, гранулы клеток Пакета, бактерии, подвергшиеся действию АКБ, окрашиваются в оттенки зеленого цвета различной интенсивности. Ядра клеток и жизнеспособные бактерии приобретают оттенки синего и фиолетового цвета.

Выявление катионных белков в полутонких срезах. Исследуемый материал Фиксируют в 2,5% растворе глутаральдегнда в 0.1 М какодилат-ном буфере (рН 7.3), дофиксируют б 1% растворе четырехокиси осмия. заливают в аралдит. На прикрепленные к предметному стеклу полутонкие срезы наносят раствор прочного зеленого, стекла нагревают до 60-70° С в течение 6-8 секунд и охлаждают 2-3 минуты, процедуру позторяют 5-6 раз. Препараты докрашивают раствором азу-ра. высушивают и рассматривают в световом микроскопе.

1.3. Ижунофлуоресцекяное выявление катионньа белков. (Пигаревский В.Е., Мазинг Ю. А.,Селиверстова В.Г.. 1986 а.б). Для выявления НПО и лактоферрина используются поликлоналыше

моноспецифические иммунные сыворотки, приготовленные совместно с В.Н.Кокряковым. Фиксированный в глутаровом альдегиде и залитый в парафин материал использовали для последующей обработки по непрямому методу Кунса. После инкубации с иммунной сывороткой во влажной камере в течение 40 минут при 37е с срезы отмывали в трех иор-циях физиологического раствора на фосфатном буфере (рН 7.2-7,4) и высушивали. На парафиновых срезах из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки человека МП0 и лактоферрин выявлялись с высокой интенсивностью свечения в НГ и глобулярных лейкоцитах. Идентичные результаты были получены в параллельно приготовленных криостатных срезах.

1.4. Совместное выявление кашоюаа белков и НПО.

(Пигаревский В. Е., 1275а: Пигаревский В. Е.. Мазинг С. А.. Кокряков В. Н.. 1982). Для определения активности миелопероксидази используется ор-то-дианизмдин. а АКБ - прочный зеленый. Мазки крови и препарат-

отпечатки фиксируют в спиртовом растворе формалина, время фиксации не более 10-15 сек. Приготовление растворов красителей не отличается от описанного е "Материалах и методах". Препараты окрашивают на МП0, промывают 1-2 минуты в проточкой зоде и помещают на 2-3 минуты в буфер Гсмори (трис-НС1) с рН 8.1-8,2 для восстановления способности АКБ реагировать с раствором прочного зеленого. Мазок помещают в раствор прочного зеленого на 20 минут. После окраски предметное стекло споласкивают водой и высушивают. Не содержащие МПО гранулы окрашиваются прочным зеленым, на фоне коричневых и зеленых гранул хорошо контурируются неокрашенные клеточные ядра. Предложенная методика позволяет выявлять два типа азу-рофильных гранул НГ человека и ряда лабораторных животных.подтверждает данные других авторов о неоднородности популяции гранул. Установленные различия могут отображать не раскрытые закономерности в дифференцировке клеток миелоидного ростка.

1.5. Совместное выявление катюнных белков и липидов.

(Пигаревский В. Е., Мазинг Ю. А..3ельцер Г. Л. .Данилова М. А. ,1984) В 40 мл 0,05М трис-НС1 буфера (рН 3,15) растворяют 0,1 г прочного зеленого, а в 60 мл изопропиловго спирта - 0,25 г жирового красного 0. растворы сливают и доводят рН до 8,15. Криостат-ные срезы, мазки крови или препараты-отпечатки окрашивают в растворе прочного зеленого - жирового красного 0 в течение 30 минут, споласкивают в двух сменах дистиллированной воды. Ядра докрашивают азуром или гематоксилином в течение 1-2 минут. Структуры, содержащие АКБ, окрашиваются в зеленый цвет, а липиды - в ярко-красный. Ядра клеток темно-синего цвета на фоне бледно-голубой цитоплазмы. Новый способ цитохимического анализа бронхиальных смывов позволил разделить макрофаги на две субпопуляции, параллельно определяя общее содержание в них АКБ. При рецидивирующем бронхите у детей много ниже уровень АКБ в альвеолярных макрофагах и НГ из бронхиального смыва, меньше число макрофагов и НГ., содержащих мелкие липидные гранулы,но неизменным остается относительное количество макрофагов с крупными липпдннми гранулами.

- 18 -

г. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦНТОВ В РАННЕЙ ПОСТНАТАЛЫЮМ РАЗВИТИИ.

Обследование 23 клинически здоровых новорожденных детей, родившихся от здоровых матерей после физиологически протекавшей беременности, показало значительный дефицит АКБ в НГ крови (таблица 2). В первый день жизни НГ новорожденных детей содержат только 64 % уровня АКБ и только половину МПО. Ситуация практически не меняется на 5 день после роадения ребенка. Но к концу первого месяца жизни показатели ЛКТ резко возрастают, столь же быстро растет активность МПО.

ТАБЛИЦА 2. Уровень антимикробных катионных белков НГ крови в раннем постнатальном развитии детей (ЦК. X ± ш).

¡Показатели 1 день 5 дней 5 «

"ЛКТ 1.15 ±0.031 1.24 ±0.029 1.79 ±0.021

МПО 0.93 ±0.027 0.99 ±0.026 1.83 ±0. 026

У новорожденных кроликов в первые 7 дней жизни МПО практически отсутствует в гранулоцитах, отмечается также дефицит АКБ. который сохраняется на 14 сутки после рождения (Р<0.05). Показатели МПО в возрасте 14 и 21 суток возрастают, но составляют только половину от уровня половозрелых животных. Окончательно потенциал МПО-системы формируется у кроликов к месячному возрасту. Мы не обнаружили различий между новорожденными и взрослыми животными в фагоцитарной активности НГ перитонеальиого экссудата по отношении к микробным клеткам'БI. ер1сЗегт1с!1з. но показатели завершенности фагоцитоза 7-дневных кроликов оказались в 2,5 раза ниже. Лишь в возрасте 21 дня они начинают увеличиваться (Р<0,05) и достигают уровня половозрелых животных на 56 день после рождения.

Аналогичный наблюдавшемуся у кроликов низкий уровень АНЬ нейтрофидов крови мы обнаружили у телят. Некоторое снижение показателей ЛКТ сохраняется в возрасте 1-2 месяцев (Р<0, 025), а дефицит МЛО выявляется даже у 3-4 месячных телят (Р<0.005).

У крыс НГ новорожденных животных содержат только половину АКБ. наблюдается следовая активность МПО и эндогенной перекиси водорода. Транзиторный дефицит АКБ сохраняется у крысят в течение первого месяца жизни. У 10-45 дневных животных содержание АКБ в нейтрофилах крови возрастает (Р<0.Ol), но не достигает уровня взрослых крыс (Р<0.0125). На 20 день активность НПО в нейтрофилах резко увеличивается и к 45 дню почти достигает уровня половозрелых животных. Для крыс Wlstar (таблица 3) обнаружены те же закономерности становления.системы НГ крови и костного мозга - содержание АКБ и МПО минимально в нейтрофилах новорожденных и максимально у взрослых животных. Сопоставлении содержания АКБ в клетках крови и костного мозга показывает, что показатели ЛКТ и МПО костномозговых нейтрофилов лишь с месячного возраста превышают таковые НГ крови. У взрослых содержание АКБ НГ костного мозга всегда существенно больше уровня клеток периферической крови.

Переходя из костного мозга в кровяное русло НГ за счет дег-рануляции специфических гранул теряют чёсть своих АКБ. Биологический смысл данного явления носит двоякий характер - с одной стороны поддерживается определенный уровень АКБ в сыворотке крови, с другой - формируется рецепторный аппарат НГ, который у клеток костного мозга находится в латентном' состоянии на мембране специфических гранул (Balnton D. F. ,1988). Различие по содержанию АКБ между клетками крови и костного мозга возникает лишь в конце первого месяца жизни (таблица 3). Отсутствие секреции АКБ может свидетельствовать о меньшем числе рецепторов на поверхности нейт-рсфилов, и, соответственно меньшей способности фагоцитов усиливать активность при повышении микробной нагрузки.

Таким образом у новорожденных млекопитающих - детей, телят, кроликов, крыс в течение первого месяца жизни ''.ущег.твует транзи-торчий дефицит АКБ и НГ периферической кропи. В этот период тилш

ТАБЛИЦА 3. Уровень антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов в раннем лостнатальном развитии крыс Wistar (ЦК. X ± m; ЛКТ - показатели лизосомально-катионного теста, МПО - показатели активности миелопероксидазы)

| Возраст Кол-во КРОВЬ КОСТНЫЙ МОЗГ

ЛКТ МПО ЛКТ МПО

12-18 16 0.76 0.32 0.78 0.28

часов ±0.062 ±0.010 ±0.061 ±0. 023

| 3 дня 5 0.84 0.34 0.85 0.32

I ±0.073 ±0.013 ±0. 034 ±0.025

| 7 дней 5 0.88 0.45 0.82 0.42

| ±0.078 ±0.016 ±0.036 ±0.027

14 дней 10 0.90 0.71 1.05 0.69

±0.073 ±0.017 ±0.041 ±0.035

20 дней 10 1.04 1.43 1.18 1.29

±0.039 ±0. 058 ±0. 031 ±0.077

30 дней 7 1.02 1.78 1.25 2.01

±0.028 ±0.047 ±0.041 ±0.039

45 дней 7 1.20 2.00 1.39 2.33

±0.031 ±0. 025 ±0.038 ±0.044

Полово- 20 1.27 2.16 1.54 2.52

зрелые ±0.019 . ±0. 020 ±0.023 ±0.031

покидающие костный мозг НГ сохраняют практически весь объем АКБ. Отсутствует снижение фагоцитарной активности НГ у новорожденных кроликов, однако фагоцитоз носит незавершенный характер. Проведенное параллельно биохимическое определение содержания катионных белков полностью подтвердили полученные нами цитохимические данные (Пигаревский В.Е. и др.. 1989).

3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ.

3.1 Влияние эмоционально-болевого стресса на цитологические показатели активности неОтрофильньа гранулоцшпов.

Сразу после прекращения воздействия стресса уровень АКБ в клетках костного мозга существенно снижен (Р<0,01) по сравнению с контрольными животными. (таблица 4). Через 6 часов отмечается его увеличение, не достигающее исходных показателей (Р<0,05). На сроке 12 часов содержание АКБ в нейтрофилах костного мозга восстанавливалось и до конца первых суток находилось в пределах значений интактных животных. Однако спустя 48 часов мы вновь обнаружили снижение их уровня (Р<0,05), которое несколько усугубилось в конце периода наблюдения на сроке 96 часов (Р<0.01).

В периферической крови содержание АКБ в НГ начинает возрастать после окончания стресса, но существенно увеличивается только через 6 часов (Р<0,001). Через 12 часов показатели ЛКТ крови снижаются практически до уровня контрольных животных. К исходу первых суток после стресса содержание АКБ достигает максимальных значений, затем падает, оставаясь тем не менее достоверно выше контроля вплоть до окончания эксперимента. Аномальные гранулы в НГ крови и костного мозга отсутствовали, за исключением 1 животного в контрольной группе и 4 - в экспериментальной. При воспроизведении той же модели стресса у кроликов наблюдались.сходные с крысами изменения показателей лейкограммы и содержание АКБ+ гранул в псевдоэозинофилах крови, АГ мы не обнаружили. Содержание МП0+ гранул в псевдоэозинофилах крови кроликов оставалось практически неизменным во все сроки наблюдения после окончания стресса.

Таким образом во время развития стресс-реакции происходит снижение содержания АКБ в нейтрофилах крови, которое затем восстанавливается, затем.оказывается выше исходного уровня. Аналогичная динамика наблюдается в клетках костномозгового резерва, однако уровень АКБ, наоборот, ниже исходного уровня. 'Описанные, выше изменения не затрагивают МПО-содержаших гранул. .

- 22 -

ТАБЛИЦА 4. Показатели лизосомалыю-катионного теста крыс при развитии эмоционально-Солевого стресса (ЦК; Х±ш).

[Срок после [воздействия

Периферическая кровь

Костный мозг

Контроль После стресса 6 часов 12 часов 24 часа 48 часов 96 часов

0.98 ±0.047 0.80 ±0.045 1.03 ±0.034 1.08 ±0.020 1.08 ±0.048 0.83 ±0. 145 0. 83 ±0.044

0.95 ±0.032 0.71 ±0.025 0.82 ±0. 024 0.92 ±0.019 1.02 ±0.022 0.85 ±0.024 0.78 ±0.015

В эксперименте с эмоционально-Солевым стрессом воспроизведена общеизвестная схема ранней постстрессорной реакции с соответствующим периодом мобилизации клеточных резервов (Горизонтов И. Д. и др..1984). Появление в периферической крови НГ с высоким содер-ианием АКБ вероятно связано с экстренным выбросом клеток костномозгового резерва, на это указывает резкое увеличение количества гранулоцитов. Снижение же уровня АКБ в оставшихся зрелых НГ костного мозга можно объяснить интенсивной их секрецией для обеспечения ускоренного выхода клеток из костного мозга, поскольку выброс катионинх белков повышает проницаемость эндотелия сосудов (Пига-ревский Б. Е.. 1933; Lehrer R. I. .Ganz Т.. 1990). Те ее причины вероятно лекат в основе повторного спада содержания АКБ черед 48 часов после окончания стрессорного воздействия, период интенсивных процессов репопуляцни ликфоидшх органов шкодящими из костного мозга клетками (Фролов Б.А., Афонина С.Н.. 1983). Снижение уровня АКБ в результате стресса зависит от силы воздействия - при шоке на фоне полнтразмы НГ практически не подержат АКБ и в дальнейшем показатели ЛКТ достигают половины от уровня нормы лишь к 3-4 дню травматической болезни (ХудайОерепоп Г.С. к др.. 1981).

- 23 -

3.2. Влияние высоких широт Европейского Заполярья на

читаохилшческие показатели активности АКБ.

Мы обследовали практически здоровых мужчин в возрасте 18-24 лет, среди них 50 человек родились и постоянно проживали в средних широтах (Прибалтика), а 60 жителей средних широт находились в условиях Заполярья 6 месяцев (20 человек), 1,5 года (22 человека) и 2,5 года (18. человек). Показатели ЛКТ у постоянно проживающих в средних широтах соответствовали данным, приведенным в таблице 1. После полугодового пребывания в условиях Крайнего Севера существенно снижались показатели ЛКТ и НСТ-теста (таблица 5). Результаты нашего определения НСТ-теста противоречат данным Д.Н. Маянского и соавт. (1980), которые не обнаружили различий через 6-12 месяцев проживания в этих условиях при постановке спонтанного варианта. однако обнаружили значительное снижение показателей стимулированного НСТ-теста. Не исключено, что выявленные различия могут быть обусловлены несколько большей чувствительностью нашей модификации НСТ-теста. Через 1,5 года жизни в высоких широтах более

ТАБЛИЦА 5. Показатели функциональной активности НГ периферической крови мужчин в высоких широтах Европейского Севера (Х±ш).

1 Климатические условия проживания ЛКТ ■ НСТ-тест % НГ с (+) Цитохимический реакцией показатель активн.

Прибалтика. постоянно Заполярье 6 мес. 1,5 года 2. 5 года 1,56 ±0,058 1,23 ±0,063 * 1,38 ±0,031 * 1,51 ±0,018 13 ±0,06 0,22 ±0,062 6 ±0.08 ** 0.08 ±0,002 # 9 ±0.10 * 0.14 ±0.009 ** 10 ±0,07 0.19 ±0,021

Достоверность различий (Р) по сравнению с показателями, полученными в Прибалтике: * <0,05; ** <0,01; # <0,001'

низкое содержание АКБ в нейтрофилах крови сохраняется, существует тенденция (Р<0,05) к увеличению показателей HCT-теста. Нормализация показателей функциональной активности НГ наступает лишь через 2.5 года пребывания жителей средних широт в условиях Заполярья.

3. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ ФИЗИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ. ОКАЗЫВАЮЩИХ ВЛИЯНИЕ НА ИММУНИТЕТ.

3.1. Влияние острой штоксикации хлорофосом на функциональное состояние неОтрофилышх гранулоцилюв.

Хлорофос является типичным представителем фосфорорганических соединений и широко применяется как инсектицид. Довольно часто при бытовых отравлениях этим ядом, несмотря на успешную антидот-ную терапию, у больных возникают инфекционные осложнения, преимущественно со стороны бронхолегочной системы (более половины из них в виде пневмоний). Можно предположить, что это связано с воздействием' на иммунную систему и снижением уровня резистентности организма. Вызванная у морских свинок легкая степень интоксикации хлорофосом уже через 60 минут приводила к появлению аномальных гранул, в то время как уровень АКБ существенно не изменялся. В палочко- и сегментоядерных нейтрофилах костного мозга через 5 и 60 минут с момента введения хлорофоса содержание АКБ также оставалось на прежнем уровне. На 5 и 10 сутки после введения яда обнаруживали снижение показателей ЛКТ до 1,73 ±0.023 (Р<0,001) и 1,68 ±0,020 соответственно (исходный уровень 1,94 ±0,036). К 10 суткам резко возрастало количество НГ с аномальными гранулами (22 ±1,755 клеток содержавших в среднем по 1,4 гранулы). Еще более интенсивно реагировала МПО-система. К 10 суткам активность МПО снизилась на ЗЗЖ, а уровень эндогенной перекиси водорода на 27% по сравнению с исходными показателями.

При средней степени интоксикации белых крыс в первые часы содержание АКБ в нейтрофилах практически не отличалось от контрольной группы,в то время как уже через 3 часа отмечали появление

множества НГ с аномальными гранулами (20 ±1.2% клеток, содержавших в среднем 1.3 гранулы). К исходу первых суток после интоксикации уровень АКБ падал на 35 % от исходного уровня (0,96 ±0,026) до 0,62 ±0,031, на 3 сутки до 0.51 ±0,034 (на 47%) и на 7 сутки до 0,36 ±0,008 (на 63%). К концу первых суток отмечалось некоторое снижение количества аномальных гранул, но все же оно оставалось достаточно высоким. На 7 сутки после введения крысам хлорофоса 9±1,1% НГ периферической крови содержали в среднем 1,6 гранулы. Показатели активности МПО нейтрофилов к 3 суткам снизились на 32%, а эндогенной перекиси водорода к 7 суткам на 34% от исходного уровня. Важно отметить, что уже через 5 минут после введения хлорофоса крысам в палочко- и сегментоядерных НГ костного мозга содержание АКБ падает с 1,20 ±0.029 до 0,83 ±0,014 (Р< 0,01). В дальнейшем показатели ЛКТ продолжали снижаться и на 7 сутки составили 0,65 ±0,017.

Таким образом при отравлениях хлорофосом наблюдается снижение показателей ЛКТ в гранулоцитах крови и костного мозга, более выраженное при средней степени интоксикации. Уже через час после отравления обнаруживаются АГ, которые затем присутствуют в клетках крови по крайней мере в течение 10 суток.

3.2. Воздействие ультрафиолетового облучения и гидродинамического удара на функциональное состояние нейтрофильта

гранулоцитов. •

Ультрафиолетовое облучение клеток крови в различных дозах не приводит к изменению содержания АКБ и НПО в нейтрофилах. Однако после аутотрансфузии показатели ЛКТ и активность МПО резко снижается. Чтобы.выяснить, опосредованы ли эти изменения уровня АКБ и активности МПО в нейтрофилах телят организменными реакциями или являются следствием.прямого воздействия на кровь, были определены показатели .катионных. белков после смешивания облученной и интакт-ной крови в соотношении 1:10. Через 1 час после инкубации смеси содержание АКБ снижалось на 1/5, активность МПО не изменялась. Но, если использовали кровь, полученную при проведении второго сеанса

через 3 суток после первого, происходило снижение активности как АКБ (на 1/3), так и МПО (на 1/5). Следующая серия опытов ставила своей задачей выяснение роли отдельных фракций крови в изменении уровня АКБ в нейтрофилах. Оказалось, что после смешивания с ин-тактной кровью (0.82 ±0.037) облученной ультрафиолетом плазмы, плазмы с тромбоцитами, эритроцитов с лейкоцитами (но без плазмы) во всех случаях происходит существенное снижение (Р<0.05) показателей ЛИТ. которые соответственно составили 0,67 ± 0,012 (8255 от уровня интактной крови); 0,69 ±0,029 (84Ж); 0,63 ±0,038 (77!?).

Другим примером непосредственного влияния на НГ служат импульсные динамические воздействия, которые являются одним из экстремальных природных и антропогенных факторов окружающей среды. Показатели ЛКТ определяли в опытах In vivo (крысы) и In vitro (клетки крови человека и крысы). Кровь заключали в эластичные резиновые оболочки и подвергали импульсивному воздействию избыточного давления в 0,78 атм. Животных фиксировали и подвергали 1- и 5-кратному воздействию с интервалом 100-200 мс. Контролем служили образцы." которые подвергали тем же манипуляциям, но без воздействия, и крысы, не подвергавшиеся баротравме. Оказалось, что воздействие in vltró приводило к заметному снижению содержания АКБ в нейтрофилах (Рис.1).несмотря на низкий исходный уровень, так как использовалась консервированная донорская кровь. Частота ударной волны не играла роли. У крыс, которые подверглись однократному избыточному давлению, было зарегистрировано максимальное снижение показателей, однако после 5-кратного воздействия мы не обнаружили существенных изменений в показателях ЛКТ.

3.3. Влияние ионизирующей радиации на функциональное состояние неатрофильта гранулоцитов.

Крысы были разбиты на 10 групп по 6 животных, каждая группа подвергнута различным дозам облучения путем введения радионуклида в легкие, внешним облучением и смешанные варианты. Животные были обследованы до и после облучения, а тагае на сроках от 3 часов до 100 суток после окончания воздействия.• В каждом случае сравнение

50

человек

а 1 6 1 в

крыс б

Рис.10. Влияние импульсных гидродинамических воздействий на уровень катаонных белков в нейтрофилах. По вертикальной оси - цитохимический коэффициент (в % от контроля). 10055 уровень: человек - 1,05 ±0.015; крыса - 1,31 ±0,030. а -контроль, б - однократное, в - пятикратное воздействие.

показателей производилось только с исходным уровнем своей группы. Во всем диапазоне использованных нами доз облучения происходило существенное увеличение показателей ЛКТ в первые 14 суток. При дозах до 0,4 Гр начиная с 36 суток наблюдения содержание АКБ в НГ крови возвращалось к исходному-уровню. При облучении большими дозами уровень АКБ нормализовался только через 50 - 100 суток. Наибольшие из использованных нами доз дали несколько иные результаты. При смешанном воздействии инкорпорированного в легкие источника радиоактивности 0,5-2,5 Гр и внешнем облучением в дозе 1.6 Гр показатели ЛКТ снижались через 3 часа (Р<0,05), далее нормализовались и оставались на исходном уровне. Внешнее облучение в дозе 6,4 Гр приводило к снижению содержания АКБ на 1-7 сутки (Р соответственно <0,005;. <0,01; <0,0125), после чего показатели ЛКТ возвращались к исходному уровню. Наиболее интенсивный процесс аномального гранулогенеза был выявлен при дозе внешнего облучения в 6,4 Гр, Через 3 часа после радиоактивного воздействия A4 вше

исходного уровня (Р<0.0025), показатель АИ в 9 раз превышает исходный. Максимум процесса приходится на срок от 3 до 50 суток, через 100 суток после облучения различия по сравнению с исходным уровнем данной группы сохраняются (АЧ.Р<0.05; АИ.Р<0.0025).

Полученные результаты проверены при внешнем облучении 60 морских свинок в дозах от 0,25 до 1,0 Гр. После облучения дозой 0.25 Гр отсутствует снижение уровня АКБ в нейтрофилах крови, но появляются первые АГ. При увеличении дозы до 0.5 Гр показатели ЛИТ снижаются (Р<0,05), возрастает число клеток содержащих АГ. После радиоактивного воздействия в дозе 0,75 Гр наблюдались проявления острой лучевой реакции, значительно снижалось содержание АКБ (Р<0,001). до 6% клеток обнаруживали в своей цитоплазме АГ. Увеличение дозы облучения до 1 Гр приводило к резкому снижению показателей ЛКТ и появлению в периферической крови большого количества НГ с АГ. К сожалению, полученные о эксперименте данные нашли подтверждение при обследовании лиц, принимавшие участие в ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. и находившихся по долгу службы в зоне загрязнения. Практически у всех обследованных обнаружены в НГ крови аномальные гранулы, наличие которых сохранялось и через 2-3 года после выполнения работ.

Результаты обследования людей показывают, что при небольших дозах лучевой нагрузки сопротивляемость организма не снижается, может даже несколько возрастать. Особенно четко это видно в эксперименте на крысах, когда во всем диапазоне доз содержание АКБ росло к исходу первых суток после облучения. Лишь очень большая для этих радиорезистентных животных доза в 6.4 Гр приводила к падению их уровня. Снижение показателей ЛКТ у морских свинок также обнаружено при большой для этих радиочувствительных животных дозе в 1 Гр (Хмельницкий О.К. и др. ,1989).

Особый интерес представляют АГ. появление которых может служить индикатором очень незначительных радиационных воздействий. Биологический эффект кратковременного воздействия радиационного или химического фактора может проявляться через десятки лет, иногда для его выявления требуется жизнь нескольких поколений.

Природа возникновения этих гранул остается абсолютно неясной, тем не менее можно предположить, что АГ являются следствием неполной пострепликативной репарации. Неполноценность внутриклеточной репарации после облучения достаточно распространенное явление (Москалев Ю.И.,1991). Это предположение подтверждается обнаружением АГ у людей через 30 лет после облучения з результате аварии.

В основе-механизма образования АГ'может лежать изменение ли-пидного компонента мембраны, развивающееся, например, при активации лерекисного окисления липидов и эндогенного фосфолипидного гидролиза (Дворецкий А.И. и др..1990). Моделью такого нарушения может служить действие натрий-водородного ионофора моненсина, приводящее к ингибированию процессинга МПО и ее аккумуляции во внутриклеточных депо, с нарушением процесса гранулогенеза и образованием гигантских гранул (Parntley R.Т. et al,,1988). Или же подобный обнаруженному при ультраструктурном анализе миелоидной линии клеток HL-60. когда образование МП0+ гранул происходит минуя аппарат Гольдам, путем интенсивного слияния везикул. В итоге гранулы оказываются набиты мембранами и больше напоминают аутсфаги-•ческие вакуоли (Balnton D.F.,1983). При окраске прочным зеленым -азуром такие гранулы будут восприниматься как аномальные.

Однако полученные нами в эксперименте данные, показавшие возможность обнаружения АГ уже через час после воздействия, о также при скарлатине, ozorosofr болезни и отравлениях не позволяют признать этот процесс только результатом ошибок ■ гранулогенеза. Присутствует второй путь аномального гранулогенеза в результате прямого действия на ИГ токсических продуктов, причем нельзя исключить потерю в части гранул АКБ. прямым следствием которой будет базофильное окрашивание гранул благодаря наличию в них сульфати-рованных мукополисахаридов. Это наблюдается в развивавшихся про-миелоцитах костного мозга (Dunn W.B. .Splcer S. S. ,1969). В известном смысле подобное .происходит с клетками больных синдромом Чеди-ак-Хигаыи. которые в процессе созревания теряют значительные количества катионных белков эластазы и катепсина G (Takeuchl К.Н. et al.,1987), а затем обнаруживают базофильнне гранулы в цитоплазме.

- 30 -

4. ЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ КЛТИОШШ БЕЛКОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ПАТОЛОГИИ.

4.1. Заболевания бронхолегочной системы.

Обследовано 34 ребенка в возрасте 4-14 лет. (14 - хроническая пневмония. 7 -муковисцидоз, 4 -синдром Картагенера, 9 -атопи-ческий обструктивный бронхит) в обострении и 74 ребенка, у которых на основании клинико-рентгено-бронхологического исследования установили диагноз рецидивирующий бронхит. Показатели ЛКТ при хронической пневмонии с обострением хронического бронхита снижены более чем в 2 раза (0.76 ±0.038) по сравнению со здоровыми детьми этого возраста, бактерицидная активность НГ в бронхиальных смывах низкая (КБА1 =29±1,2%; КБА2=7±1,1%). Показатели ЛКТ у этих и еще

4 больных в периоде клинической ремиссии составили 1,18 ±0,041. Бактерицидная активность нейтрофилов существенно (Р<0,001) возросла (КБА1 = 55 ±1,355; КБА2 - 51 ±1.2%).

На основе комплексного анализа клинико-лабораторных данных у больных рецидивирующим бронхитом были выделены три фазы течения болезни: обострение, вялотекущее обострение и клиническая ремиссия. В стадии обострения показатели ЛКТ составили только 35% от уровня здоровых детей того же возраста (0.61 ±0,029), на препаратах-отпечатках выявлен активный фагоцитоз микробных клеток, но эффективность воздействия на них АКБ оказалась крайне низкой (КБА2=

5 ±0.2%), только 1/5 часть внеклеточно расположенных микробов окрашивалась в зеленый цвет (КБА1 =16 ±0,6%). Вялотекущее обострение сопровождалось значительным, до 61% от нормы (1,06 ±0,042), снижением содержания АКБ в НГ крови, но оно выше, чем при обострении процесса (Р<0,0005). Возрастали и показатели бактерицидной активности АКБ (КБAI = 49 ±1.1%; КБА2 = 32 ±0.9%), отличаясь от полученных в острой фазе заболевания (Р<0,001).

С началом клинической ремиссии был выявлен самый высокий уровень АКБ (1,41 ±0,040), но все же значительно ниже, чем у здоровых детей этого возраста (Р<0,01). Показатели бактерицидной-активности в очаге воспаления достигали у некоторых больных

80-100% (в среднем КБА1 - 58 ±1,85?; КБА2 - 42 ±1. 955). Однако в период стойкой клинической ремиссии значения ЛКТ значительно ниже. чем в ее начале (1.09 ±0.033; Р<0.001) и мало отличаются от показателей больных при вялотекущем обострении (Р>0,05).

На всех стадиях течения рецидивирующего бронхита обнаруживались макрофаги. Если в фазу обострения основную массу воспалительного экссудата составляли НГ. то при вялотекущем обострении относительное количество макрофагов возрастало более чем в дна раза, с началом клинической ремиссии они составляли не менее 1/3 общего числа клеток бронхиального смыва. Мы постоянно обнаруживали макрофаги, фагоцитировавшие гранулы, части цитоплазмы нейтро-филов. Нередко внутри макрофага можно .наблюдать целиком поглощенные НГ. При ультраструктурном исследовании в Фагосомах макрофагов были обнаружены микробнне клетки и неоднородный по структуре и электронной плотности материал, среди которого [«¿являлись крупные осмиофильные включения, похожие на гранулы нейтрофилов. Фагоцитированные микробные клетки претерпевали изменения,которые ногою было рассматривать как следствие антимикробного действия АКБ гра-' нулоцитов. Поскольку взаимодействие НГ и макрофагов в процессе развития воспалительной реакции представляет больной интерес, этот вопрос будет специально рассмотрен в разделе 5.

При обследовании детей в возрасте до 3 лет, больных острым бронхитом (72), острой пневмонией (157) и ОРВИ (35). особо рассматривалась группа 62 детей с острой пневмонией, поступивших на отделение реанимации. Клиническая тяжесть их состояния была обусловлена симптомами дыхательной недостаточности, интоксикации, нейротокслкоза. недостаточности кровообращения. В начальный период ОРВИ с явлениями бронхита снижение уровня АКБ о НГ крови невелико. При поступлении в стационар показатели ЛКТ составляли 1,79 ±0,031, что все же существенно ниже показателей физиологической нормы (Р<0,001). Дальнейшее развитие патологического процесса приводило к снижению показателей ЛКТ уже до 1.37 ±0,033 в острый период. На фоне проводимой терапии показатели возрастали и перед выпиской достигали уровня нормы (1.81 ±0, (42; Р>0,05). П случае

осложненного течения нормализация показателей ЛКТ к моменту выписки отсутствовала. При остром бронхите в момент поступления детей в стационар содержание АКБ составляло 1.63 ±0,023 (84% от уровня здоровых детей). Затем продолжало снижаться, достигая минимальной величины на 5-6 день болезни (1,51 ±0,031). Тенденция к нормализации показателей ЛКТ отсутствовала (в момент выписки 1.51 ±0.029), хотя по общепринятым критериям их состояние оценивалось как клиническое выздоровление. У 10 детей на 2-3 день заболевания удалось определить показатели бактерицидной активности. АКБ эффективно подавляли внеклеточно расположенную микрофлору (КБА1=71 ±10.2%). Фагоцитарная активность НГ низкая, в пределах 2-655, фагоцитоз носил в основном завершенный характер (КБА2 = 58 ±11,355).

У детей с очаговой бронхопневмонией в остром периоде отмечалось выраженное снижение содержания АКБ в нейтрофилах крови до 0,81 ±0,072 (4235 от нормы). При сегментарной бронхопневмонии этот показатель снижался в меньшей степени (1,27 ±0,059), до 6635 от уровня контрольной группы. В процессе лечения происходило значительно улучшение состояния больных, но к моменту выписки показатели ЛКТ оставались низкими, у больных очаговой бронхопневмонией 1.32 ±0.051, сегментарной бронхопневмонией -1,61±0.048 (Р<0,001).

Развитие ОРЗ у детей раннего возраста сопровождается выраженным снижением показателей ЛКТ. степень которого зависит от тяжести течения процесса. В результате лечения наблюдается клиническое выздоровление больных детей, но уровень АКБ нормализуется только при ОРВИ. Из 157 обследованных детей у 45 развились осложнения (деструкция легких и плеврит), а у 17 из них, несмотря на интенсивную терапию, заболевание закончилось летальным исходом. При тяжелом течении пневмонии содержание АКБ за 2-3 суток до летального исхода было в пределах от 0 до 0,17 (в среднем 0,10 ±0,011) и перед развитием осложнений не превышало значение 0,48 (в среднем 0,33 ±0,022). У детей поступавших клинически в столь же тяжелом состоянии,но с более высоким уровнем АКБ (свыше 0,48; в ср^пнем 1,15 ±0,047), заболевание всегда протекало без осложнений.

- 33 -

4. 2. Гнойные хирургические заболевания.

Обследсвано 25 больных, находившихся на лечении по поводу эмпиемы плевры. При поступлении пациентов в стационар содержание АКБ в нейтрофилах крови составило 0,57 ± 0,052 (36 % от нормы), а в экссудате из плевральной полости только 0,33 ±0,091. При клиническом улучшении после 2-3 промываний полости растворами антибиотиков показатели ЛКТ гранулоцитов периферической крови возрастали более чем в 2 раза (1,26 ±0,053) и в 3 раза - в нейтрофилах из плеврального экссудата (до 1,01 ±0,034). Перед выпиской больных уровень АКБ нейтрофилов крови достигал нормы (1.54 ±0,070). У 3 больных,несмотря на проводимую интенсивную терапию, показатели ЛКТ оставались низкими, их состояние прогрессивно ухудшалось. Реакция на АКБ в клетках экссудата полностью отсутствовала, а в НГ крови составила 0.13; 0.16; 0,17. через несколько дней больные умерли.

Эффективным оказалось использование ЛКТ как диагностического теста в динамике лечения стойких остаточных полостей, образуюадх-ся после пневмоэктомий по поводу гангрены и гангренозных абсцессов легких. Обычно у тагах больных санация полости продолжается вплоть до ее облитерации или получения не менее трех отрицательных результатов бактериологического исследования и снижения концентрации лейкоцитов в экссудате до их уровня в крови. Но отсутствие микробов и лейкоцитов еще не гарантирует ликвидации очага воспаления, поскольку могут развиваться рецидивы. Было решено попытаться изменить тактику лечения, учитывал оценку потенциальных возможностей кикробоцидных систем НГ и в качестве критерия использовать лизосомально-катионный тест. Превышение уровня АКБ до 1.30 в нейтрофилах экссудата, что соответствует практически нормальному их содержании в тканевых НГ. позволило рассматривать ЛКТ как объективный критерий ликвидации очага воспаления. По достижению этого показателя у 3 больных была применена антибактериальная фибринная пломбировка полости, еще у 5 больных прекращена санация полости без рецидивирования и нагноения экссудата. Дальнейшее амбулаторное наблюдение в течение 1-3 месяцев этих 0 большие показало отсутствие каких-либо признаков повторного развития инфекции.

Частим осложнением течения' ряда приобретенных и врожденных пороков сердца, а также его ранений с повреждением перикарда является инфекционный эндокардит. Продолжительная безуспешная консервативная терапия часто приводит к развит™ перикардита, образованием спаек.что в конечном итоге обуславливает нарушение гемодинамики. ишемий миокарда, развитие эндокардита, нередко с летальным исходом. Мы провели обследование 36 больных инфекционным эндокардитам, которые находились на лечении в клинике госпитальной хирургии ВМедА им.С.М.Кирова. Всем им была произведена оперативная санация камер сердца с устранением внутрисердечного очага инфекции в условиях экстракорпорального кровообращения и холодо-оой кардиоплегии. У 30 пациентов наблюдали течение послеоперационного периода без осложнений, у 6 - гнойные осложнения (у 5 нагноение послеоперационной раны и одного - септическая пневмония).

Снижение показателей ЛКТ по сравнению с нормальными зарегистрировано в обеих группах больных (Р < 0.05). У пациентов без осложнений оно практически не изменялось в послеоперационном периоде. При развитии же осложнений содержание АКБ в нейтрофилах периферической крови существенно снижалось на 3 сутки после операции (Р < 0,001), за двое суток до появления первых клинических признаков развития гнойного воспаления. Например, у больного М. на 3 сутки после операции было обнаружено наиболее выраженное снижение уровня АКБ (0,82), и через 3 дня развилась септическая пневмония.

Комплексное этиотропное лечение (антибиотикотерапия, транс-фузионная терапия, местное применение антисептических средств) позволило сравнительно быстро ликвидировать патологический очаг, что нашло отражение в положительной динамике показателей ЛКТ. которые уже на 7-е послеоперационные сутки существенно возрастали (Р<0.01). К 14 суткам уровень АКБ в нейтрофилах крови был еще выше. но однако оставался ниже, чем у здоровых людей (Г<0,05).

Таким образом, у пациентов с послеоперационным периодом без осложнений, начиная с 5-7 сугок отмечается некоторое увеличение показателей ЛКТ. У больных, для которых было отмечено максимальное снижение содержания АКБ в нейтрофильных граиулоцитах крови к.

3 дно после операции, развивались гнойные осложнения, клинически проявившиеся через 2 суток, причем наиболее низкое значение показателей ЛКТ в эти сроки было зарегистрировано у больного с наиболее тяжелым осложнением - септической пневмонией.

До начала курса терапии тималином у 10 больных с хроническими пиодермитами содержание АКБ в НГ крови значительно снижено и составило 70% от нормы. Гранулоциты очага воспаления обладали невысокой фагоцитарной активностью при достаточно высокой интенсивности фагоцитоза, что усугублялось практически полным отсутствием бактерицидной активности АКБ. С началом лечения тималином возрастало содержание АКБ в нейтрофилах крови (Р<0.01) и их фагоцитарная активность в очаге воспаления. В целом интенсивность фагоцитоза снижалась.но зато его завершенность возрастала более чем в 3 раза. Эти перестройки функциональной активности НГ сопровождались существенными клиническими улучшениями - на дне язвы формировались сочные грануляции, сокращалось количество гнойного отделяемого. начиналась эпителизация. Через 5 дней после окончания лечения уровень показатели ЛКТ достигали нормы. Фагоцитарная активность НГ возрастала почти в 3 раза, а завершенность фагоцитоза -в 7 раз. Многократно увеличивалась внеклеточная бактерицидная активность АКБ. но все же оставалась на относительно низком уровне.

4.3. Ожоговая болезнь

В первые трое суток развития ожоговой болезни происходит снижение показателей ЛКТ на 30-40S, более выраженное у глубокоо-божженых (Р<0,01). При легкой ожоговой травме содержание АКБ неПтрофилов крови составило 1,07 0.069, во второй группе больных (плииадь глубокого ожога более 2055) 0,82 ±0,068 и в третьей группе (тяяпцая травма, осложнившаяся сепсисом) - О,Э6±0,089. При легком ожоге уровень АКБ возрастал только на 20-30 сутки до 1.36 о.099 (Р<0.coi). Позже 30 суток после травмы обследовать больных не удалось п связи с окончанием их стационарного лечения. При тяжелой стоговой травме наблюдалась подобная 1 группе динамика изменения показателей ЛКТ, но на более низком уровне. К 20-30 дню

содержание АКБ достигало в НГ крови значения 1.20 ±0.058,а перед выпиской на 40-50 день практически не отличалось от нормы (1.52 ±0,011; р>0.05). Если тяжелый ожог заканчивался смертью, то на 4-Ю день их уровень в нейтрофилах продолжал снижаться и составлял 40% от нормы (0.63 ±0,062). За трое суток до гибели регистрировали еще более низкие показатели (0.42±0,141). но вплоть до летального исхода содержание АКБ оставалось относительно высоким (около 30% нормы). После отторжения струпа появляется возможность оценивать показатели бактерицидной активности АКБ. В первый момент у легко и тяжело обожженых внеклеточное и внутриклеточное бактерицидное действие АКБ в пределах 8-14%. Но уже через 8-10 дней в первой группе больных оно значительно возрастало (КБА1 -55 ±3,8%; КБА2 » 45 ±3,9%), во второй группе оставалась на низком уровне (КБА1=17±2.1%; КБА2=10 ±1,3%). На 15-20 день после отторжения струпа различия между группами сохранялись (Р<0,001). Ожоговая травма вызывает снижение содержания АКБ в НГ крови на 60-70%, восстановление показателей начинается не ранее чем через 20 дней. Вне зависимости от тяжести ожога в очаге поражения фагоцитоз носит незавершенный характер, но вторичный дефект бактерицидной активности НГ быстрее восстанавливается у легко обожженых.

4.4. Инфекционные заболевания

Среди вирусных инфекций человека герпетическая инфекция за-. нимает особое место, обусловленное широким распространением возбудителей болезни - вирусов простого герпеса, разнообразием клинических проявлений, простирающихся от локальных кожно-слизистых поражений до тяжелых энцефалитов, и отличается склонностью к рецидивирующему течению с формированием вторичного иммунодефицита. Обследовано 27 больных хронической рецидивирующей герпетической инфекцией обоего пола в возрасте 15-53 лет. У 18 диагностирован геиитапьный герпес, для всех отмечено тяжелое течение инфекции с частотой обострений 5-12 раз в год, длительностью по 10-14 дней.

По морфологическим признакам воспалительной реакции выделены следующие Фазы течения инфекции: фаза 1 -наличие пузырьков,Фаза 2

- образование эрозий, фаза 3 -корочек, фаза 4 -отсутствие воспалительных изменений. Клинически Фазы 1, 2 соответствовали обострению. фаза 4 - ремиссии, а фаза 3 - переходная от обострения к ремиссии. Для характеристики защитных клеточных реакций у больны/ определяли показатели функциональной активности нейтроФилов (Фагоцитоз. НСГ-гест.ЛИТ). Кроме того было проведено иммунофермент ное определение лактоферрина и МПО в сыворотке кропи (таблица 5).

ТАБЛИЦА 5. Показатели активности антимикробных катионных белков у больных хронической рецидивирующей герпетической инфекцией.

(Показатели Фаза 1 фаза 2 фаза 3 "Г'-ЧТИЧТ И'ПЦ|| II 1 » фаза 4 Норма

ЛИТ усл. ед. 1.26 ±0.064 1.44 ±0.028 1.44 ±0.039 1.56 +0. 027 1.53 +0.01

МПО яг/мл 360 ±71.7 351 +39. 1 318 +39.0 431 ±44.0 160 ±20.0

Лактоферрш нг/мл [ 731 ±134.1 1392 ±142.6- 1542 + 186.2 2282 ±216.9 1000 ±140.0

Фагоцитоз (индекс.%) 45.2+3.95 42.3+3.04 51.3+2.16 44.7+3.70 41.2-53

Фагоцитоз (чиспо) 7.0+0.35 7.6+0.38 7.0+0.28 7. 2±0. 31 2.9-4.4

HCT спонт. <*) 26.4+0.35 20.5t4.86 23.5+4.65 18. 8+2. 34 2-20 В

HCT стим. (X) 38. 0+6. 51 21.1+3.41 32.7+4.38 26.2+3.45 23-32.4 I

Применение ЛКТ для анализа ликвора больных менингококковой инфекцией показало, что динамика показателей бактерицидной активности НГ на 1-2 и 3-4 сутки заболевания с высокой степенью достоверности говорят об исходе гнойного менингита у детей (обследовано 88 детей). Из капли ликвора, полученного с диагностическими целями, готовили мазок, который окрашивали прочным зеленым - азу-ром А и определяли КБА2. При исследовании ликвора было обнаружено высокое содержание АКБ в нейтрофилах, как правило, более высокое, чем в НГ периферической крови. Показатели ЛКТ нейтрофилов периферической крови при поступлении в стационар колебались от 1.43 до 1,86 (1.73 ±0,024) и нормализовались в зависимости от эффективности применяемой терапии на 14--21 день заболевания. В ликворе на 1-2 сутки фагоцитарная активность НГ была высокой (ФИ = 67-7335), но уже на 2-3 сутки падала в 3 раза (ФИ =до 2155). Оценка показателей завершенности фагоцитоза (КБА2) показала, что любое, даже незначительное снижение этого показателя, свидетельствует о неблагоприятном прогнозе течения заболевания. Данный способ использования ЛКТ позволил с высокой точностью прогнозировать как благоприятный, так и неблагоприятный исход. При сомнительном прогнозе предпринимался ряд дополнительных реанимационных мероприятий, направленных на максимальное выведение пюйного ликвора из суба-рахноидального пространства и стимуляцию защитных систем организма (Черных И.Д. и др., 1988). В результате интенсивной терапии больные выздоровели, ■ но в 30% случаев отмечаны остаточные расстройства неврологического характера.

Специфический процесс у больных туберкулезом отличался двусторонним поражением легочной ткани. Бактериовыделение зарегистрировано у всех пациентов. В зависимости от длительности заболевания больных разделили на следующие группы:

1-ю: 12 больных с впервые выявленным инфильтративным туберкулезом

легких, длительность заболевания до года.

2-ю: 12 больных инфильтративным и фиброзно-кавернозным туберкулезом с лпительностью заболевания от года до о лет.

3-ю: 10 больных фиброзно-кавернозным туберкулезом легких с продолжительностью заболевания более 6 лет.

4-ю: 8 впервые выявленных больных, у которых специфический процесс в легких трактовался как фиброзно-кавернозный туберкулез. развившийся на фоне отсутствия лечения.

5-ю: 5 больных фиброзно-кавернозным туберкулезом с давностью от 3 до 28 лет при прогрессирующем течении процесса.

Комплексное этиопатогенетическое лечение в 1-4 группах позволило достигнуть положительная клинико-рентгено-лабораторной динамики специфических изменений в легких, однако у больных 5 группы процесс неуклонно прогрессировал. Показатели ЛКТ оказались ниже нормы в 1 группе и в пределах Физиологической нормы у больных 2 группы. Содержанке АКБ во 3 и <1 группах было существенно выше показателей ЛКТ здоровых людей (Р<0.01). При прогрессирующем течении туберкулезного процесса мы наблюдали снижение уровня АКБ в нейтрофилах крови по сравнению с нормой (Р<0,05). Выявлено наличие высокой активности НПО у всех больных 1-4 группы, но в 5 группе она оказалась ниже показателей доноров <Р<0,05). Таким образом при длительно текущем хроническом туберкулезном процессе в легких наблюдается превышение показателей ЛКТ здоровых лиц.

Приведенные результаты, а также применение ЛКТ другими авторами при различных инфекционных {псевдотуберкулез, скарлатина, дизентерия, сальмонеллез. менингита, вирусный гепатит), инфекци-онно-аллергических (ревматизм, ревматоидный артрит, гломерулонеф-рит. рассеянный склероз, пиелонефрит), миелопролиферативных заболеваниях. бронхолегочной патологии показали его высокую эффективность как одного из показателей уровня резистентности организма (Мазинг И. А., 1988,1990,1991). Обнаружено снижение содержания АКБ при злокачественных новообразованиями легких,желудка, прямой клюки: хирургическое удаление опухолей приводило к'нормализации показателей (Бережная Н.м'.' и др'. .1984; Чердан'цева Н.В. и др.. 1989).

Вероятно существуют два варианта снижения показателей ЛКТ. Первый связан с воздействием токсических веществ непосредственно

на НГ. Это могут быть окзо - и эндотоксины микробов, экзогенные яды, интоксикации вследствие массовой гибели клеток организма. Действие токсических веществ может быть опосредовано центральной нервной системой через сложную цепь нейромедиаторных взаимодействий. Примером такой регуляции содержания АКБ в нейтрофилах крови служит снижение МП0+ гранул псевдоэозинофилов кролика после электрического раздражения структуры головного мозга Locus coeru-leus (Сьрдск Т.П.. Неведимов М.Г.. 1991). Итогом является выброс нейтрофилаии АКБ. крайним выражением такого процесса является полная пот зря клетками АКБ. наблюдавшаяся при политравме.

Второй вариант предполагает воздействие тех же веществ на .клетки костного мозга. По всей видимости в процессе гранулогенеза на стадии промиелоцита и миелоцита упаковывается меньшее количество АКБ из-за сниженного их синтеза. К выводу о дефиците синтеза лактоферрина при вирусных инфекциях пришли после его выявления в нейтрофилах иммунопероксидазным методом (Baynes R. D. et al.. 1988). Более всего данный вариант вероятен при хронически и вялотекущих заболеваниях, но в подавляющем же большинстве случаев несомненно действуют оба механизма снижения ЛКТ. Особняком стоят данные о повышении содержания АКБ нейтрофилов крови у больных туберкулезом легких, а также при алкогольной интоксикации крыс (Мартынова Н. А.. 1992). Аналогичные результаты мы наблюдали у 8 мужчин при остром метанольном отравлении, когда через 2 суток показатели ЛКТ возросли до 1,98-2,07, Можно предположить, что в этих случаях нарушается, процесс секреции АКБ при переходе НГ из костного мозга в г.ровь, как это имеет место у новорожденных. Тогда стойкое превышение показателей физиологической нормы следует относить к неблагоприятным прогностическим признакам.

Г). ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАКРОФАГОВ И НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ

В ОЧАГЕ ВОСПАЛЕНИЯ. 5.1. Стьщтщя функциональной активности макрофагов при разттт

восмпптелмюп реакнии (oru-ты in vitro).

После одною часа инкубации контрольных (резидентных) макро-

фагов с суточной культурой эпидермалмшго стафилококка четверыя часть клеток монослоя содержала микробы, десятая часть их ланзла положительную реакцию в НСТ-тесте. Макрофаги, шделеннке из очага асептического воспаления на 2 сутки после введения крахмала, содержали р цитоплазме определенное количество компонентов ПГ. Это подтверждается наличием в их цитоплазме гранулярного материала, с положительной реакцией на АКБ и МГЮ (таблица 6). Возрастал фагоцитарный индекс (Р<0, 05). почти в 2 раза увеличивался процент фагсцитируювдх клеток (Р<0.001). Однорременно в 3 раза было макрофагов. дававших положительную реакцию в НСТ-тесте (Р<0,001).

ТАБЛИЦА 6. Функциональная активность перитонезльных макрофагов в динамике асептического воспаления (X ± га).

¡Сроки излучения во «спалите-льной реакции Макрофаги (%) с положительной реакцией на Фагоцитарная активность НСТ-тест (%)

АКБ НПО ФЧ ФИ

Контроль 0 0 25 ±1 3 3 ±0. 1 10 ±0 00

2 сутки 31 ±1.0 21 ±0.9 49 ±1 1* 4 ±0 1» 31 ±1 1*

3 сутки 26 ±1.!» 19 ±1.3 34 п 1«. 4 ±0. 9«? 24 ±1 2«

4 сутки 10 ±!.4,'< 14.5±1.0# 30 ±1 2« 3 ±0. 1 19 ±1 3«,

5 сутки ! 0 ±0.8» 8 ±0.3« 28 ±1. 3 2 ±0. 15 14 ±1 1#

•Юстоверность различий (Г) по сравнению с контролем (макрофаги с положительной реакцией на АКБ и НПО по сравнению со 2 сутками): # < 0,05; 4 < 0,01; * < 0,001

У клеток, взятых из бротюй полости на 3 сутки после введения крахмала, наблюдалось некоторое снижение показателей активности. Менызее число макрофагов давало положительную реакцию на АКБ (ГчО,С5),уменьшалась фагоцитарная активность. Однако по своей

функциональной активности все они по-прежнему намного превышали контрольные. Выделенные на 4 и 5 сутки макрофаги демонстрировали дальнейшее существенное снижение показателей активности. На 5 сутки процент фагоцитирующих и HCT-позитивных клеток приблизился к контролю, интенсивность фагоцитоза микробных клеток стафилококка оказалась даже ниже, чем у резидентных макрофагов (Р<0,01).

Появление в цитоплазме перитонеальных макрофагов из асептического очага воспаления продуктов НГ сопровождается повышением их функциональной активности. Наибольшей активностью обладают 2-х суточные макрофаги, что соответствует максимальному содержанию в цитоплазме компонентов НГ. По мере развития воспалительной реакции происходит переваривание компонентов НГ и снижение показателей функциональной активности, которые к 5 суткам после индукции воспаления приближаются к значениям резидентных клеток.

5.2. Сравнительная оценка антимикробной активности лейкоцитов

на примере диагностического очага воспаления.

У всех здоровых лиц (мужчин и женщин) выявлена строгая последовательность смены клеточных реакций ДОБ. Спустя 4 часа после повреждения преобладают НГ с четко выраженными сегментированными ядрами, зернистой цитоплазмой, клеточной оболочкой, без признаков дегенерации. Встречаются единичные эозинофильные и базофильные гранулоциты, доля макрофагов не превышает 5-7%. Все клетки лежат раздельно, границы их четкие. Через 24 часа картина существенно меняется. В препарате-отпечатке содержатся преимущественно макрофаги (70 -00%) - крупные клетки с круглыми или овальными ядрами, в цитоплазме которых заметны включения и фагоцитированные НГ, клетки лежат пластами. Видны признаки клеточной деструкции: разрушенные клеточные мембраны, пикнотические ядра, клеточный детрит, . расположенные внеклеточно гранулы нейтрофилов. В условиях Физиологической нормы половые различия в динамике развития воспалительной реакции отсутствуют. Динамика асептического воспаления в ЛОВ и содержание АКБ в нейтрофилах крови стабильны на всех фазах менструального цикла. Показатели ЛКТ нейтрофилов, мигрирующих

в ДОВ не отличаются от значений клеток периферической крови, следовательно они имеют нулевую секреторную активность.

Цитологическая картина препаратов-отпечатков ДОВ при беременности не отличается от таковой у небеременных женщин: через 4 часа представлены преимущественно НГ. а через 24 часа - макрофаги. По сравнению со здоровыми мужчинаь(и и небеременными женщинами уровень АКБ в нейтрофилах крови во время беременности существенно выше (Р<0,05). В 1 и 2 триместрах показатели ЛКТ крови стабильны, несколько возрастают в 3 триместре (Р< 0,05).

В первые сутки после родов соотношение макрофагов и НГ в ДОВ остается таким же, как у беременных женщин. Содержание АКБ сохраняется на уровне, характерном для беременных женарш. но с 5 суток наблюдается тенденция к их снижению. Секреторная активность нейт-рофилов ДОВ в первые сутки после родов сохраняется на уровне беременных. но затем быстро снижается и к 5 суткам оказывается уже вдвое меньше, чем сразу после родов.

Настоящая часть исследования явилась продолжением работ, подтверждающих концепцию В.Е. Пигаревского (1978,1992) о резорб-тивной клеточной резистентности. На модели асептического перито-неального очага воспаления у кроликов било показано, что поглощение макрофагами нейтрофялов и 'продуктов их распада приводит к усилению метаболической и фагоцитарной активности клеток, причем это состояние фагоцитов сохраняется в течение двух суток. Проведенное в рамках обоснования концепции о • резорбтивной клеточной резистентности изучение процесса кооперации НГ и макрофагов ДОВ у женщин позволило разработать способ оценки секреторной активности гранулоцитов. С его помощью установлено, что НГ способны секрети-ровать АКБ у здоровых людей только на фоне беременности. Особого внимания заслуживает факт увеличения секреторной активности НГ в период, близкий рождение ребенка.

- 44 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Реакции Фагоцитов занимают одно из ведущих мест в регуляции структурного гомеостаза. являясь непременным компонентом развития занятных реакций на дестабилизирующие воздействия внешней среды обеспечивая основной уровень защиты организма от повреждений. Изучение антимикробных катионных белков позволяет показало, что наряду с опсонинами, хемоатрактантами, цитоккнами они многократно усиливают эффективность защитных функций фагоцитов. .Принципиальная новизна современных взглядов о механизме антимикробного действия нейтрофилов состоит в обосновании ведущей роли особой группы белков, обязательным физико-химическим свойством которых является суммарный положительный (катионный) заряд молекулы. Впервые на уровне целостного организма удалось показать изменения содержания АКБ нейтрофилов в зависимости от характера внешнего воздействия.

Особенностью настоящей работы являлась ее постоянная сопряженность с биохимическими исследованиями, . проводившимися группой В.Н.Кокрякова под руководством проф. .В. Е.Пигаревского.. Полученные результаты позволяют однозначно, утверждать о. наличии ..транзиторно-го дефицита АКБ у.новорожденных в качестве одной из причин их повышенной восприимчивости к инфекции. Удалось показать, насколько могут быть расширены возможности, иммунограммы.за счет методов иаучения .функциональной активности,.фагоцитов.. Разработанные методические подходы определения АКБ позволили оценивать .потенциальные возможности вышедших в кровяное русло НГ; эффективность их работы в очаге воспаления; способность к секреции АКБ при переходе из костного мозга в кровь и из крови в ткани. Явление аномального . гранулогенеза, послужило основой для нового способа выявления контактов человека с радиоактивными загрязнениями, определения биологического эквивалента дозы радиацирнного поражения.

Совокупность проведенных к настоящему времени исследований по взаимодействию НГ и моноцитов/макрофагов позволяют подтвердить положения концепции резорбтивной клеточной резистентности, суть которых состоит в способности мигрирующей части мононуклеарных фагоцитов ' приобретать принципиально новые свойства за ьчет

резорбции (зндоцитоза. сегрегации) антимикробных катионных бед-ков. В перспективе эти положения могут стать основой для разработки нового класса лекарственных препаратов. Выполненное исследование позволяет констатировать, что антимикробные катиошше белки в полной мере отражают функциональную полноценность системы нейтрофильных гранулоцитов. их определение позволяет осуществлять контроль за возрастными, физиологическими и патологическими изменениями нейтрофилов. Разработка способов и методов, позволяющих изучать Функциональную морфологию нейтрофилов. оказывается сегодня одним из стержневых направлений исследований, расширяющих возможности современного клинико-лабораторного анализа.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлена дальнейшая разработка концепции о резорбтивной клеточной резистентности. На модели асептического очага воспаления изучено взаимодействие нейтрофильных гранулоцитов и ' макрофагов. Показано, что захват перитонеальннми макрофагами структур нейтрофильных гранулоцитов. содержащих антимикробные катионные белки, в течение двух суток стимулирует их метаболическую и фагоцитарную активность.

2. В условиях экстремальных воздействий на организм, инфекционной и неинфекционной патологии проведено изучение функциональной морфологии клеток нейтрофильного гранулоцитарного ряда и показана роль антимикробных катиОнных белков в обеспечении резистентности.

3. Выявлен транэиторный дефицит антимикробных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов у новорожденных, который рассматривается как одна из причин пониженной устойчивости к инфекции в ранний псстнатальный период.

4. Установлено, что при воздействии стресса на организм происходит повышению уровня антимикробных катионнкх белков нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, однако антимикробный потенциал нейтрофилов костного мозга снижается.

5. Использование лизосомально-катионного теста в инфекционной патологии позволило осуществить дифференциальную диагностику и показать значение теста в прогнозе исхода болезни.

6. Уровень катионных белков отражает функциональную активность фагоцита, позволяет оценить полноценность его антимикробного потенциала, контролировать физиологические и патологические изменения в данных клетках. Показано, что функциональное состояние фагоцитов является одним из важнейших критериев уровня резистентности организма.

7. Показана роль антимикробных катионных белков при остром воздействие на организм ряда повреждающих агентов. Установлено, что отравление фосфорорганическими соединениями приводит к дефициту антимикробных белков, что оказывается одной из ведущих причин развития на этом фоне воспалительных процессов.

Радиоактивное воздействие вызывает появление в нейтро-фильных гранулоцитах аномальных гранул, которые могут служить индикатором лучевого поражения.

8. Показатели лизосомально-катионного теста являются объективным критерием оценки течения инфекции, эффективности проводимой терапии, выявления "групп риска" к развитию заболеваний, вызываемых патогенными- или условно-патогенными микроорганизмами.

■9. Заболевания инфекционной природы приводят к снижению показателей лизосомально-катионного теста в зависимости от тяжести течения болезни. Падение показателей ЛКТ на ' 50% от . уровня возрастной нормы свидетельствует о развитии гнойных осложнений. а снижение более чем на 90% предполагает высокую вероятность летального исхода.

-А 7 -

список работ, опубликовании* по тенв диссертации.

1. Мазинг Ю.А. Лиэосомально-клтионный тест как критерий оценки уровня неспецифической резистентности организма. // в сб.: Цитохимические и биохимические исследования в эксперименте и клинике. - Нальчик. - 1979. - С.19-20.

2. Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А., Фокина И.Я. Лизосоналыю-катионный тест и результаты его применения в экспериментальной и хлинической практике. //В сб.: Тканевая биология. -Тарту. -1980. - С.123-126.

3. Пигаревский В.Е..Мазинг D.A. К нетолике применения лизосо-мально-катионного теста в лабораторной диагностической практике. //Лаб. дело. - 1981. - НЮ. - С.579-582.

4. Назинг D.A., Старосельская И.Я. Оценке надежности лнзосо-налыю-катиониого теста для лабораторной диагностики. // Лаб.дело. -1981. - НЮ. - С.582-584.

5. Назинг Ю.А., Старосельская И.Я. Катиоиные белки нейтрофило-ци-.оп при броихолегочной патологии детей. // В сб.: Вопр. иммунологии и молекулярной биологии (тез.доил.). - Нальчик. - 1981. - т.2. - с.64-65.

6. Ширяева К.Ф..Пигаревский В.Б..Богданова А.В.,Ка?инг Ю.А., Гаврилова H.H..Данилова М.А. Некоторые показатели неспецифической резистентности у детей с рецидивирующим бронхитом. // Вопр.охраны материнства и детства. - 1982. - N 4. - С.9-13.

•7. Пигаревский В.Б., Мазинг O.A..Кокрякон В.Н. Методика совместного. выявления пероксидазы и хатионных белков в граиулоци-тах крови человека. //Лаб.дело.-1982. - N 5. -С.263-265.

8. Назинг Ю.А. Морфологическая оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в экспериментальной н клиническо.й практике. //Тр.Лен.научн.об-ва патологоанатомов. - Л. - 19Я2. вып.23. - С.16-20.

9. Кокрякор. В.Н.,Ротова Г.Н..Мазинг Ю.Д. Морфобиохимические основы функциональной активности нейтрофилов млекопитающих. //В сб.:Морфофункциональные аспекты неспецифнческой резистентности и демиелинизируюдих заболеваний. - Л. -1981.- С.31-45.

10. Пигаревский В.Е.,Назинг Ю.А..Кокряков В.Н. Методика сон-местного выявления пероксидазы и катионных белков в гранулоци-тах крови человека. //Лаб.дело. - 1982. - N5. - С.263-265.

И. Богданова А.В.,Мазинг Ю .А. .Матушкина Н.М. Некоторые особенности неспецифической резистентности у детей с рецидивирующими и другими хроническими бронхолегочными заболеваниями. // В сб: Этиология и патогенез инфек. процесса при острых и хронических восп.заболеваниях легких. - Л. - 1902. - С.39-42.

12. пигаревский В.Е., Кокряков В.11., Маэинг Ю.А. Цитохимия ферментных и нефернентных катионных белков нейтрофилоцитов в норме и патологии. // 3-я Всес.конф. по пато'л. клетки; Москва,19-21 окт.1982. Тез. докл. - М. -. 1982. - С.140-141.

13. Пигаревский В.Е., Маэинг Ю.А., Кокряков В.Н. Аномальные гранулы нейтрофилоцитов крови человека (методика выявления и диагностическое значение). //Лаб.дело. - 1983. - N6. - С.3-5.

14. Алферов В.11., Пигаревский В.Е\, Ильина И.А., Маэинг Ю.А. Неспецифические факторы защиты при острых пневмония: у детей раннего возраста. //Вопр.охраны материнства и детства. -1983. -Мб..- С.36-40. '

15. Кокряков В.Н., Мазинг Ю.А., Готова Г.М. Антимикробная активность катионных белков полиморфноядерных лейкоцитов при воспалении.. //Всес. съезд патологоанатомов УН. Тез.докл. - Ташкент. - 1983. - С.175-178.

16. Маэинг Ю.А., Желенина Л.А., "■Данилова М.А. Функциональная активность нейтрофилов при рецидивирующем бронхите. // В кн.: Рецидив.бронхит у детей и подростков. - Л. - 19В4. - С.37-40.'

17. Богданова A.B., Осидак Л.В., Маэинг Ю.А., Желенина Л:А., Онучин H.A. Некоторые особенности неспецйфической резистентности и иммунологической реактивности у детей с острым бронхитом. //В кн.¡Профилактика гриппа и других ОРЗ у детей. - Л. - 1984. - С. 101-105. .....

18. лишенко В.В.,Маэинг Ю.А. Оценка и прогнозирование 'теченйя неспецифической эмпиемы плевры с помощью лиэосомально-катион'|/б-го теста. // В кн.: Общие и частные' вопр.онкоморфологии.

Л. :Медицина. '- 1985. - С.80-82.

19. Пигаревский В.Е..Мазинг Ю.А..Селиверстова В.Г. Выявление катионных белков и пероксидазы на полутонких срезах. // Арх.па-тол. - 1986. - ВЫП.7. - С.77-80.

20. пигаревский D.E.,Мазинг Ю.А..Селиверстова В.Г. Методика окраски лиэосомальных катионных"белков в гистологических парафиновых срезах биоптатов. //Арх.патол. -1986. - вып.7. - с.82-84. '21. Пигаревский В.Е..Кудреватых И.П.,Маэинг Ю.А., Кокряков В.Н. Лиэосомально-катионный тест при гастродуоденальных заболеваниях. // Лаб.дело. - 1986. - N 7. - С.397-401.

22. Гришанин В.А., Королгак А.М., Качан М.А.,Мазинг Ю.А..Пигаревский В.Е.,Поляков И.Э. Влияние острой интоксикации хлорофосом на бактерицидные системы нейтрофила в эксперименте. //'В сб.:Частные вопр.онкоморфол. - Л.:Медицина.- 1986.-С.69-71.

23. Мартова И.В.,Мазинг Ю.А. Функциональная активность нейтрофилов при ожоговой болезни по данным • лизосомально-катионного теста. // В сб.: Частные вопр.онкоморфол. - Л.: Медицина. -1986. - С.87-89.

24. Ропича М.А., Глибин В.П., Маэинг Ю.А., Добровольская И.А. Исследование устойчивости организма к инфекции п акушерской практике. // В сб.: Частные вопр.онконорфол. - Л.: Медицина. -

1986. - С.100-103.

25. Филиппов В.К., Маэинг Ю.А., Фролов Б.А. Катионные белки нейтрофильных гранулоцитов крови и костного мозга при эмоционально-болевом стрессе у крыс. // В сб.: Частные вопр.онконорфол. - Л.: Медицина. - 1986. - С.109-112.

26. Пигаревский В.Е.,Маэинг Ю.А.,Кокряков В.НСеливерстова В.Г., Данилова М.А.,Алешина Г.М. Клиническая морфология лизосом нейтрофильных гранулоцитов. // 3 Всес.синп."Структура и функция лизосом" - Тбилиси. - 1986. - С.156.

27. Пастушенков В.Л.,Гришании В.А., Маэинг Ю.А. Информативность тестов иммунологического контроля при лечение тималмнон Больных пиелонефритами. //Военно-мед.ж. -1987. -N8. -С.28-30.

28. Ralovich B.S., Kokryakov V.N., Mazing Yu.A., Rotova G.M., Pigarevskii V.E. Data to the resistance against L.monocytogenes infection. //Proc.9th Intern. Syir.p. of the Problems of Listeriosis. - Nantes. - 1986. - P.177-182,

29. Пастушенков В.Л., Гришанин В.А., Маэинг В.А. Информативность тестов иммунологического контроля при лечение тималином больных пиелонефритами. //Военно-мед.ж. -1987.-N 8.- С.28-30.

30. Пигаревскии B.E., Маэинг Ю.А. Лизосомально-катионный тест (методическое письмо). - Л. - 1987. - 13с.

31. Пигаревский В.Е..Маэинг Ю.А.,Кокряков В.Н.,Сухонова H.A., Селиверстова В.Г.,Алешина Г.М. Эндогенные факторы риска к развитие аутоинфекционных заболеваний в раннем постнатальном развитии. // В сб.: Частные вопр.онконорфол. - Л.: Медицина. -

1987. - С.119-121.

32. Пигаревский В.Е., Маэинг В.А., Кокряков В.И. Молекулярная патология промиелоцитлрного гранулогенеэа при нейтрофильном ми-елопоээе у млекопитающих и человека. // Iii Всес.конф.по па-тол, клетки. Тез.докл. - М. - 1987. - С.164.

33. Пигаревский В.Е.,Маэинг Ю.А. Метод оценки лиэосомной секреторной активности нейтрофильных гранулоцитов с помощью диагностического очлга воспаления. //Арх.патол.-1988.-вып.7.-С.91-94.

34. Скорина H.A., Мазинг Ю.А., Самойлова К.А..Пигаревский В.Е. Влияние УФ-иэлучения и аутотрансфуэии УФ-облученной крови на содержание катионных белков в нейтрофильных граиулоцитах телят. // Цитология. - 1988. - Н 5. - С.616-622. .

35. Маэинг Ю.А., Кокряков B.rf. Экспериментальные модели реэорб-тиинсй клеточной резистентности. //В сб.: Общие и частные вопр.воспаления и иммунитета. -Л.:Медицина.- 1988.- С.66-68. S0. Пиглрепский D.E., Кокряков В.Н., Маэинг Ю.А., Селиверстова Г). Г . .Алешина Г.М. Наследственные и возрастные дефициты антимик-

робных систен нейтрофильных гранулоцитов. //В сб.:Клиническая морфология нейтрофильных гранулоцитов.-Л.:Наука.-1988.-С.76-86.

37. Маэинг С.А. Результаты применения лизосонально-катионного теста в клинической практике. //В сб.:Клиническая морфология . нейтрофильных гранулоцитов. - Л.: Наука. - 1988. - С.102-137.

38. Кучеренко А.Д., Селезнев Н.С., Маэинг Ю.А. Приненение лизосонально-катионного теста при прогнозировании послеоперационных гнойных осложнений у больных инфекционным эндокардитом. //Вестн.хирургии. -1989. - N11. - С.101-103.

39. Береэин В.М., Поэняк А.Л.,Маэинг Ю.А. Состояние антимикробных систем нейтрофильных гранулоцитов у молодых лиц в процессе их адаптации в Заполярье. //Б сб: Патоморфол. опухолей и фоновых заболеваний. - Л.: Медицина. - 1989. - С.87-89.

40. Мазинг Ю.А., Данилова М.А. Резорбтивная клеточная резистентность. //В сб. .-Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. - Горький. - 1989.- С.103-Ю9.

41. Пигаревский Ь.Е., Кокряков В.Н., Мазинг Ю.А., Селиверстова

B.Г. Возрастные иммунодефициты системы нейтрофильных гранулоцитов. //В сб.: Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. - Горький. - 1989. - С.103-109.

42. Пигаревский В.Е..Маэинг Ю.А..Кокряков B.H. Возрастные инмунодефициты системы нейтрофильных гранулоцитов. // YU1 Всес.съезд патологоанатомов. Тбйлиси, 1989. Теэ.докл. - М. - 1989.

C.232-233.

43. Алферов В.П., Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А., Ильина и.я. Лиэосомально-катионный тест в экспресс-диагностике пневмоний у детей раннего возраста. // УШ Всес.съезд патологоанатомов, Тбилиси, 1989. Теэ.докл. - М. - 1989. - С.7-8.

44. Пигаревский В.Е.,Кокряков B.H., Маэинг Ю.А., Селиверстова В.Г., Данилова М.А.,Шамова О.В. Биологическая роль катионных белков нейтрофильных гранулоцитов при воспалении. //IY Всес. съезд патофизиологов,Кишинев,1989. - М. - 1989. -т.2.- С.451.

45. Маэинг Ю.А., Пигаревский B.E., Данилова М.А., Селиверстова В.Г. Транзиторный дефицит антимикробных катионных белков у новорожденных. // 1 Всес.иммунологический съезд. Теэ.докл. - М. - 1989. - т.2. - С.237:

46. Mazing Yu.A., Danilova H.A., Kokryakov V.N, Seliverstova V.G., Pigarevskii V.E., Varos S., Kerenyi M., Ralovich B. Hae-matological reactions of rabbits infected intravenously with Listeria strains of different virulence- //Acta Microbiologica Hungarina. - 1990. - vol.37,N 1. - P.135-144.

47. Пигаревский B.E.,Мазинг Ю.А.,Кокряков B.H. Возрастные иммунодефицит системы нейтрофильных гранулоцитов. // Арх.патол. -1990. - ВЫП.6 - С.43-46.

48. Мазинг Ю.А. Функциональная морфология катиошшх белков ли-эосом нейтрофнльных гранулоцитов. //Вонр.мед.химии.-1990. - N 6.

- С.8-11.

49. Кокряков В.Н, Мазинг Ю.А., Данилова М.А., Алешина Г.Н., Новикова H.C., Шамова О.В., Кузьмин В.О. Катионние белки нейтрофнльных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении. // В сб: Проблемы медицины и биологии сегодня и завтра. Тез.докл.коиф. 100-летип Института., Л,, 1990., с.178-181.

50. Мазинг 10.А. Нейтрофильные гранулоциты и система защити хозяина. // Арх.патол. - 1991. - вып.9. - С.70-73.

51. Кузина В.А., Токаревич И.И., Мазинг Ю.А. Антимикробные ка-тионные белки при экспериментальном КУ-риккетсмозе. // Бюл.экс-перим.биол.мед. - 1992. - N10. - С.391-392.

52. Акимова С.Л., Алешина Г.И., Блинова Т.В., Доценко Е.К., Журавлев А.П.,Мазннг O.A. Новое п клинико-лабораторной оценке активности воспалительного процесса при острой пневмонии у детей. //3 национальный конгресс по болезням органов дыхания. - С.-Пб.

- 1992. - тезисы N 112.

ИЗОБРЕТЕНИЯ.

1. Краситель для выявления кагионкых белков. //Авт.свидетельство СССР. - 1184. - N1163775. (Соавт. Пигаревский В. F.. , Зельцер Г.Л., Данилова H.A.).

2. Способ прогнозирования развития осложнений при острых пневмониях у детей. //An г. свидетельство СССР. - 1936. - N1251S72. (Соавт. Пигарепский В.Е., Алферов В П., Ильина И.Я.).

3. Способ прогнозирования исхода лечения гнойных менингитов у детей. //Авг.свидетельство СССР. - 1989. - N1498454. (Соавт. Сорокина М.М., Пигарепский D.E., Черных М.Д.).

4. Способ выявления лиц, подвергшихся радиационному облучении. ;/ Авт.свидетельство.- N1769593. - 1992. (Соавт. Гришанин В.А., Черняк С.П., Пигарепский В.Е., Ксролюк A.M., Алексеев Г.И.).

РЛЦКОНМИЭЛГОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Способ оценки и прогнозирования течения неспецифической эмпиемы плевры с помокыо лизосомально-катионного теста. //ВМедА.

- 1985. - N2045/3.(Соавт. Лишенко В.В.).

2. Методика использования лизосомально-катионного теста при лечении ран. //ВМедА. - 1986. - (11314/4 .( Соавт . Лишенко В.В.).

Тш> Г->НШ:> if г 11 i у.-Г»