Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологическая коррекция иммуно- и гепатотоксических эффектов тетрахлорметана

На правах рукописи

Муфазалова Ляйсан Фагимовна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ИММУНО-И ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ТЕТРАХЛОРМЕТАНА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 9 2012

Уфа-2012

005012843

005012843

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Алехин Евгений Константинович

Официальные оппоненты: профессор кафедры фармакологии,

клинической фармакологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Юшков Владимир Викторович; заместитель главного врача по химиотерапии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Башкирского Республиканского" клинического онкологического диспансера, доктор медицинских наук Сакаева Дина Дамировна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Мандата диссертации состоится «_» апреля 2012 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д208.006.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшею профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3).

Автореферат разослан «__»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Мнрсаева Г.Х.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В связи с возрастающей техногенной нагрузкой одной из глобальных медико-биологических проблем является изыскание путей фармакологической коррекции повреждающего действия ксслот'ж-сикантов на здоровье человека.

Тетрахлорметан (ТХМ) широко используется в лакокрасочной, кожевенной промышленности, сельском хозяйстве, быту (Бушманова А.Ю., 2006; Лим В.Г., 2006; Забродский П.И. и соавт., 2009). ТХМ может поступать в организм через неповрежденную кожу, дыхательные пути, пищеварительный тракт. В организме ТХМ депонируется в жировой ткани и оказывает плейотрошюе повреждающее действие, основным механизмом которого является активация ПОЛ (Мышкин В .А. и соавт., 2007; Бородин Ю.И. и соавт., 2008; Basu S., 2003; Botsoglou N.A. et al., 2008; Mehmeicic G. et al., 2008).

Отравления ТХМ относятся к нередким видам интоксикаций, летальность составляет от 15% до 30% (Лужников Е.А. и соавт., 2000; Забродский П.И. и соавт., 2009). В клинической токсикологии на долю ТХМ приходится до 60% всех токсических поражений печени (Венгеровский А.И. и соавт., 2004).

Хорошо известна взаимосвязь иммунной и гепатобилиарной систем, в значительной мере обеспечивающих гомеостаз организма (Ковалев И.Е., 1988; Сибиряк C.B., 2001). Несмотря на многочисленные исследования, влияние ТХМ на иммунную систему, особенно фагоцитарное звено, продолжает оставаться не полностью раскрытым, а вопросы коррекции разработаны слабо. Это особенно важно, так как высокая смертность при острых интоксикациях ТХМ тесно сЕязаиа и с его иммунотоксическим действием, формированием глубокого иммунодефицита (Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф. и соавт., 2007, 2009; Балашов C.B., 2.009; Лемза C.B. и соавт., 2010; Михеева О.М., 2011).

Известно, что активация ПОЛ, вызывая нарушение редокс-статуса кейтрофи-лов, может существенно нарушить их антимикробный потенциал (Сгепавая Е.А. и соавт., 2010; Ковальчук Л.В. и соавт., 2011; Плескова С.Н. и соавт., 201I). При токсических поражениях печени наблюдается нарушение функциональной активности макрофагов и недостаточность костномозгового кроветворения (Се-

ребров В.Ю. и соавт., 2009; Дыгай А.М. и соавт., 2010; Носкова К.К. и соавт., 2010). С другой стороны, состояние макрофагов и нейтрофилов существенно влияет на репаративную регенерацию печени (Кутана С.Н. и соавт., 1981,2000; Маянский А.Н. и соавт., 1989,2007; Цырендоржиев Д.Д. и соавт., 2000).

С учетом основного механизма повреждающего действия ТХМ, эффективную коррекцию можно было ожидать от использования препаратов с антаоксидангны-ми, иммуномодулирующими и гепатопротекгорными свойствами. Наш выбор остановился на двух препаратах - реальдироне и оксиметилурациле. Реальдирон - ре-комбинантный а-2Ь-интерферон - оказывает активирующее влияние на мононукле-арные фагоциты и нейтрофилы (Гончарова И.А. и соавт., 2004; Шкапова Е.А. и соавт., 2007; БайжановаЖ.Ж. и соавт., 2010; Абдурахманов Д.Т. и соавт., 2011).

Пиримидиновое производное оксиметилурацил - иммуномодулятор с выраженным антиоксидантным, гепатопротекторным, мембраностабилизирующим, аяпггоксическим действием (Мышкин В.А., 1995, 2001; Лазарева Д.Н. и соавт., 2004,2005; Мананова С.Ш. и соавт., 2010; Оковитый C.B. и соавт., 2010). Учитывая, что спектр фармакологической активности оксиметилурацила и реальдирона совпадают лишь частично, представляло интерес их сочетанное применение.

Цель исследования. Изучить эффективность индивидуального и сочетан-ного применения реальдирона и оксиметилурацила для коррекции фагоцитарного звена и морфсфункционального состояния гепатобилиарной системы экспериментальных животных в условиях острой интоксикации тетрахлорметаном.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние острой интоксикации тетрахлорметаном на морфофунк-циональное состояние клеток фагоцитарного звена экспериментальных животных.

2. Изучить эффективность применения реальдирона, оксиметилурацила и их комбинации для коррекции повреждающего действия тетрахлорметана на морфо-функциональное состояние фагоцитарного звена экспериментальных животных.

3. Исследовать эффективность индивидуального и сочетанного применения реальдирона и оксиметилурацила для коррекции повреждающего действия токсиканта на морфофункциональное состояние гепатобилиарной системы экспериментальных животных.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение эффективности индивидуального и сочетанного использования реальдирона и оксимети-лурацила с целью коррекции иммуно- и гепатотоксических эффектов ТХМ в условиях острой интоксикации и установлена большая эффективность имму-нокоррекции при совместноом применении препаратов по сравнению с индивидуальным использованием.

Впервые изучено влияние индивидуального и сочетанного применения реальдирона и оксимешлурацила на репаративные процессы в гепатобилиарной системе в восстановительный период после острой интоксикации ТХМ. Установлено, что ре-альдирон и оксиметилурацил при индивидуальном использовании усиливают компенсаторно - приспособительные процессы в гепатобилиарной системе после воздействия ТХМ, наибольший эффект выявляется при совместном их применении.

Личный вклад автора. Содержащиеся в работе данные получены при личном участии автора на всех этапах работы: анализ литературы, составление плана, постановка задач, выбор методов, оформление публикаций. Эксперименты и статистическая обработка их результатов полностью выполнены автором.

Научно-практическая значимость. Экспериментально обоснована целесообразность использования реальдирона и оксиметилурацила для коррекции иммуно- и гепатотоксического действия ТХМ.

Установлена эффективность совместного использования реальдирона и оксиметилурацила для восстановления микробицидной способности фагоцитов и улучшения процессов репаративной регенерации в печени при интоксикации ТХМ.

Установленные эффекты сочетанного применения реальдирона и оксиметилурацила обосновывают перспективу их использования в комплексном лечении отравлений ТХМ в практической медицине (токсикологии, интенсивной терапии, профпатологии).

Внедрение результатов в практику. Результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс кафедр общей гигиены с курсом гигиенических дисциплин, фармакологии № 1 с курсом клинической фармакологии, фармакологии № 2, биологической химии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Острая интоксикация тетрахлометаном приводит к изменениям количественного состава и функциональной активности фагоцитирующих клеток, нарушениям морфофункционального состояния гепатобилиарной системы, которые сохраняются свыше двух месяцев.

2. Реальдирон и оксиметилурацил при изолированном и особенно при совместном применении оказывают выраженное корригирующее воздействие на состояние фагоцитарного звена при острой интоксикации ТХМ.

3. Реальдирон и оксиметилурацил эффективно корригируют морфофунк-циональное состояние гепатобилиарной системы при острой интоксикации ТХМ. Наиболее эффективна комбинация препаратов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на 74-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2009); 75-й Юбилейной Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2010); 76-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2011); 10-й юбилейной Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2011»(Уфа. 2011), апробация состоялась 06.03.2012 г.

Публикации. Материалы по теме диссертации опубликованы в 13 научных работах, в том числе 4 статьи - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией.

Связь задач исследования с планами научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ (государственная регистрация № 01.2.00702370).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами, 34 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы соб-

ственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка цитируемой литературы, включающего в себя 251 источник, из которых 140 принадлежат отечественным и 111 - зарубежным авторам.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 750 белых неинбредных половозрелых крысах массой 180-220 г обоего пола, полученных из питомника лабораторных животных НПО "Иммунопрепарат" (Республика Башкортостан). Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Условия проведения экспериментов были идентичными для контрольных и опытных групп.

Животные были разделены на 5 групп (по 9-15 животных в группе): 1 группа - контроль (интактные животные), 2 группа получала токсикант (ТХМ), 3 группа - токсикант и реальдирон (Р), 4 группа - токсикант и оксиме-тилурацил (ОМУ), 5 группа - токсикант и комбинацию препаратов «Р + ОМУ».

ТХМ вводили внутрижелудочно с помощью зонда (Здольник Т.Д. и соавт., 2000). Острую интоксикацию моделировали внутрижелудочным введением ТХМ (НЕОЛАБ ООО, Ярославль) в дозе 1,25 мл/кг 50% раствора в оливковом масле на протяжении 4 суток (Саратиков A.C. и соавт., 1999).

Реальдирон (Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Israel) вводили r nose 100 000 ЕД на крысу внутримышечно 3-х кратно (в 0, 3 и 6 дни, после окончания введения ТХМ) (Гончарова И. А. и соавт., 2004).

Оксиметилурацил (Башбиомед НПО ООО, Россия) вводили внутрижелудочно в виде суспензии на 2% крахмальной слизи в дозе 50 мг/кг в течение 7 дней, посте окончания введения токсиканта (Лазарева Д.Н. и соавт., 2004). Контрольные живот-

ине получади оливковое масло внутрижелудочно или дистиллированную воду внутримышечно в том же объеме, что и при введении соответствующих препаратов.

Результаты регистрировали на 7,14,28,46 и 60 сутки наблюдения.

Функциональное состояние фагоцитов (ПМЯЛ, ПМФ) оценивали по фагоцитарной активности и интенсивности кислородзависимого метаболизма (тест восстановления нитросинего тетразолия - НСТ-тест) (Долгушин И.И. и соавт., 2009). В качестве объекта фагоцитоза использовали микросферы латекса (Фрейдлин И.С., 1984; Brock P.I. van den et al., 1988-1989). Поглотительную способность оценивали микроскопически по величине фагоцитарной активности (процент активных фагоцитов) и фагоцитарному индексу (число поглощенных частиц латекса на 1 потенциальный фагоцит). Результаты НСТ-теста оценивали морфологическим методом (Долгушин И.И. и соавт., 2009). Показатели вычисляли для интактной суспензии фагоцитов (спонтанный НСТ-тест) и в процессе фагоцитоза частиц латекса (индуцированный НСТ-тест).

Антимикробную активность фагоцитов оценивали по их способности "in vitro" инактивировать грибы Candida albicans. Количество жизнеспособных микробных клеток контролировали мерным высевом на среду Сабуро по числу колониеобразующих единиц микробов, выросших через 3 суток на среде высева (Matzner Y. et al., 1982). Инактивирующую активность фагоцитов выражали в процентах микробных клеток, инакгивированных фагоцитами (индекс инактивации - ИИ). Для блокады кислородзависимых механизмов добавляли азид натрия (Петяев И.М. с соавт., 1988).

Активность щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ), миело-пероксидазы (МП) и катионных белков (КБ) определяли цитохимическими методами в мазках периферической крови (в ПМЯЛ) и мазках смыва перитонеальных макрофагов. Активность оценивали по интенсивности окраски, пользуясь 5-балльной шкалой по методу Kaplow L.S. (1983). Вычисляли процент активных клеток в мазке (ПА), средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Активность миелопероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли по методу Sato (1928) в модификации Quaglino D. (1958). Субстрат реакции - 3% раствор перекиси водорода, краситель - бензидин.

Содержание катионных белков определяли методом Шубича М. Г. (1974). Мазки фиксировали 5% раствором сульфосалициловой кислоты, окрашивали 0,1% бромфеноловым синим на 0,05 М боратном буфере.

Активность кислой фосфатазы (К.Ф.:3.1:3.2) определяли методом азосо-четания по Нарциссову Р.П. (1968). Субстратом реакции являлся нафтол-AS-фосфат, растворенный в диметилформамиде и 0,1 н растворе уксусно-кислого натрия, красителем - 2% раствор солянокислого фуксина.

Активность щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) определяли методом азо-сочетания по Kaplow L.S. (1955), в модификации Hayhoe F.G. и Quaglino D. (1958). Субстратом реакции служила альфа-нафтилфосфат динатриевзя соль на 0,3 М ТРИС-буфере, красителем - прочный синий ВВ.

Биохимические исследования. Для исследования активности АЛТ, ACT и билирубина (общего и прямого) использовали стандартные тест-наборы.

Морфологические исследования. Материал (печень) фиксировали в забу-ференном растворе нейтрального 12% формалина. Изготавливались парафиновые срезы толщиной 6-7 мкм. В части наблюдений были изготовлены срезы толщиной 1-2 мкм, в которых хорошо визуализировались «темные» и «светлые» типы гепа-тоцитов в различных зонах ацинуса. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону. Проводились гистохимические окраски на гликоген - по Шабадашу, на жир - Суданом III. Морфометрический анализ проводили под масляной иммерсией при увеличении 90, с помощью окулярной сетей и окулярной линейки измеряли диаметры ядра и цитоплазмы гепатоцитоз.

Статистическую обработку проводили с использованием методов вариационной статистики (Гареев Е.М., 2009), пакета программ Statistica 8.0. Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Вилка. При нормальности распределения признаха оценку значимости различий проводили с использованием t-критерия Стьюдента. При отсутствии нормальности распределения признака использовали непараметрические методы статистики. Для описания групп использованы медиана и межквар-тильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью Н-критеркя Краскела-Уоллиса, для множественных сравнений использован Q-критерий Да-

на. Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05. При указании в тексте на увеличение или уменьшение того или иного показателя имеются в виду статистически достоверные различия.

Результаты исследования и их обсуждение Влияние реальдирона и оксиметилурацила на иммунотоксические эффекты тетрахлорметана. В результате исследований установлено, что острая интоксикация ТХМ приводила к развитию глубокой лейкопении вплоть до 46 суток наблюдения (рис. 1 А). На 7 сутки ее формирование было обусловлено снижением числа лимфоцитов (рис. 1 В), в то время как на 14, 28 и 46 сутки -преимущественно снижением числа нейтрофилов (рис. 1 Б).

—♦—ТХМ —*— ТХМ+Р

—'ТХМ —*—ТХМ+Р —»—ТХМ+ОМУ —»—ТХМ+Р+ОМУ

—»-тхм+ому —»-ТХМ+Р+ОМУ

В

0 7 14 28 46 60 сутт

I ТХМ —*—ТХМ+Р —«—ТХМ-ЮМУ —•— ТХМ+Р+ОМУ

Рисунок 1 - Влияние ТХМ и его комбинаций с реальдироном и оксиметилурацилом на содержание лейкоцитов (А), нейтрофилов (Б) и лимфоцитов (В)

Это сопровождалось глубоким угнетением микробицидности ПМЯЛ. Так, подавление кислородзависимого киллинга нейтрофилов наблюдалось во все сроки наблюдения и не устранялось даже к 60 суткам (рис. 2).

Контроль ТХМ ТХМ+Р ТХМ+ОМУ ТХМ+Р+ОМУ

7 сутки

□ кислородзависимый киллинг

тхм тхм+р ТХМ+ОМУ ТХМ+Р+ОМУ 60 сутки

| кислороднезависимыи киллинг

Рисунок 2 - Влияние ТХМ и его комбинаций с реальдироном и оксиметилурацилом на микробицидность ПМЯЛ (7 и 60 сутки наблюдения)

Депрессия оксидантных факторов микробицидности ПМЯЛ сопровождалась снижением интенсивности кислородзависимого метаболизма во все сроки наблюдения, что отражает уменьшение резервного потенциала нейтрофилов и подавление пероксидазонезависимых оксидантных микробицидных систем ПМЯЛ. Снижение активности МПО свидетельствует об угнетении токсикантом пероксидазозависимых факторов микробицидности ПМЯЛ (табл. 1).

Таблица 1 - Влияние тетрахлорметана и его комбинации с реальдироном и оксиметилурацилом на активность миелопероксидазы в ПМЯЛ (СЦК, в % к контролю)

Сутки ТХМ ТХМ+Р ТХМ+ОМУ ТХМ+Р+ОМУ

7 70,24 [53,57-73,81] Р,= 0,0003 75,60 [70,83-80,95] 70,24 [57,14-80,95] Р, = 0.0066 75,0 [70,24-76,19] Р, = 0,0408

14 77,14 [72,86-82,86] Р, = 0,0010 88,57 [82,86-100,0] 92,86 [85,71-102,86] Р2= 0,0457 86,43 [84,29-98,57]

28 72,12 [67,31-94,23] 117,31 [101,92-125,0] Р2= 0,0040 117,31 [100,0-125,0] Р2 = 0,0006 119,23 [101,92-144,23] Р2 = 0,0002

46 67,50 [60,0-72,50] 115,63 [103,75-121,25] Р2= 0,0001 100,0 [93,75-107,50] 118,75 [115,0-122,50] Р2<< 0,00001

60 64,89 [57,45-72,34] Р, = 0,0245 108,51 [93,62-110,64] Р2= 0,0121 94,86 [88,30-102,13] 139,36 [131,91-146,28] Р, = 0,0229 Р2<< 0,00001 Р4= 0,0029

Примечание: достоверность отличий (здесь и далее).

Р, - от контроля; Р2 - от ТХМ; Р3 - от ТХМ+Р; Р4 - от ТХМ+ОМУ.

Наибольшее подавление ТХМ оказывал на кислороднезависимые механизмы микробицидности ПМЯЛ, особенно на 7 сутки, которое не устранялось даже спустя два месяца после интоксикации (рис. 2). Это подтверждалось снижением уровня КБ в ПМЯЛ (табл. 2). Наблюдалось снижение активности кислой (7, 14 и 28 сутки) и щелочной (28 сутки) фосфатазы, что отражает нарушения метаболических процессов в ПМЯЛ. Угнетение поглотительной способности ПМЯЛ отмечено на 7 сутки (ФИ - 68,30%, р = 0,00001).

Макрофаги оказались более устойчивыми к воздействию ТХМ. Снижение кислородзависимого киллинга ПМФ было зарегистрировано на 46 и 60 сутки (рис. 3 А). Уменьшение интенсивности образования активных форм кислорода и МП в ПМФ наблюдалось с 14 суток и не восстанавливалось к 60 суткам.

Более глубокое угнетение, начиная с 7 суток, отмечалось в отношении ки-слороднезависимых микробицидных систем ПМФ (рис. 3 Б). Это подтверждалось значительным снижением уровня КБ в ПМФ. Меньшее влияние ТХМ ока-

зывал на поглотительную способность ПМФ - снижение наблюдалось только на 28 сутки наблюдения (ФИ - 71,43%, р = 0,0430).

Таблица 2 - Влияние тетрахлорметана и его комбинации с реальдироном и оксиметилурацилом на содержание катионных белков в ПМЯЛ (СЦК, в % к контролю)

Сутки ТХМ ТХМ+Р ТХМ+ОМУ ТХМ+Р+ОМУ

7 38,95 [35,79-43,16] Р,« 0,00001 78,95 [69,47-88,42] Р2= 0,0104 51,58 [50,53-64,21] Р, = 0,0008 84,21 [67,37-93,68] Р2 = 0,0016

14 69,05 [64,29-72,62] Р, = 0,0228 116,67 [114,29-125,0] Р2 = 0,0001 116,67 [100,0-122,62] Р2= 0,0006 113,10 [102,38-116,67] Р2= 0,0012

28 74,04 [69,23-76,92] Р, = 0,0001 92,31 [86,54-98,08] Р2= 0,0164 92,79 [87,50-105,29] Р2 = 0,0032 88,46 [86,54-100,0] Р2 = 0,0073

46 61,15 [48,92-70,50] 120,86 [106,47-125,18] Р2<< 0,00001 97,12 [88,49-102,16] Р3 = 0,0334 107,19 [100,0-115,11] Р2<< 0,00001

60 49,46 [46,59-50,90] Р,<< 0,00001 116,85 [108,96-122,58] Р2 = 0,0001 116,85 [108,24-123,30] Р2 = 0,0005 113,98 [102,51-127,60] Р2= 0,0005

Рисунок 3 - Влияние ТХМ и его комбинаций с реальдироном и оксиметилурацилом на микробицидность ПМФ (А - кислородзависимый киллинг, Б - кислороднезависимый киллинг)

С учетом механизмов повреждающего действия ТХМ в качестве средств корригирующей терапии нами были выбраны реальдирон (рекомбинантный альфа - 2Ь интерферон) и оксиметилурацил.

Реальдирон в условиях острой интоксикации ТХМ оказывал значимое корригирующее воздействие на нейтрофилы. Реальдирон уменьшал выраженность лей-

копении на 7 и 46 сутки, что достигалось увеличением (7 сутки) либо восстановлением (46 сутки) числа нейтрофилов (рис. 1 Б). Также реальдирон устранял депрессию ТХМ кислородзависимых механизмов микробицидности ПМЯЛ на 14, 28 и 60 сутки (ИИ составил 103,23%, 101,16% и 96,57% соответственно), а на 46 сутки даже стимулировал их (ИИ - 118,75%) (рис. 2). Это сопровождалось восстановлением интенсивности оксидантного метаболизма ПМЯЛ и увеличением (по сравнению с ТХМ) активности МПО-системы ПМЯЛ (табл. 1). Полученные данные свидетельствуют о восстановлении активности пероксидазозависимых и пе-роксидазонезависимых оксидантных микробицидных систем нейтрофилов.

Применение реальдирона устраняло депрессию ТХМ неоксидантных механизмов киллинга ПМЯЛ на 14, 28, 46, 60 сутки: ИИ составил 114,73%, 110,97%, 119,51% и 112,39% соответственно (рис. 2). Цитохимически это проявилось восстановлением уровня КБ в указанные сроки (табл. 2).

Реальдирон повышал активность кислородзависимых факторов микробицидности ПМФ (рис. 3 А). Это достигалось на 7, 14 и 60 сутки увеличением уровня МП в ПМФ, а на 28 и 46 сутки - повышением интенсивности оксидантного метаболизма ПМФ.

ОМУ также корректировал иммунотоксические эффекты ТХМ. Устранял индуцированную ТХМ лейкопению на 14 сутки, что обеспечивалось восстановлением числа нейтрофилов и лимфоцитов (рис. 1 А, Б, В). ОМУ нормализовал активность кислородзависимых микробицидных систем ПМЯЛ на 14,28,46 и 60 сутки (ИИ составил 105,0%, 90,61%, 118,75% и 105,88%) (рис. 2). Это достигалось увеличением интенсивности оксидантного метаболизма и активности МПО-системы ПМЯЛ (табл. 1). ОМУ отменял вызванное ТХМ угнетение кислороднезависимых факторов микробицидности ПМЯЛ на 28, 46, 60 сутки (ИИ составил 121,52%, 103,66% и 113,27% соответственно) (рис. 2). Цитохимически это корреспондировало с восстановлением уровня неферментных КБ в ПМЯЛ (табл. 2).

ОМУ отменял подавление токсикантом оксидантных микробицидных систем ПМФ на 46 и 60 сутки (рис. 3 А). Это обеспечивалось повышением интенсивности образования активных форм кислорода в ПМФ и активности МП

в ПМФ. В тоже время ОМУ не отменял угнетение ТХМ неоксидантных механизмов киллинга ПМФ на 7. 28, 46 и 60 сутки (рис. 3 Б).

Сочетанное применение препаратов оказывало более выраженное корригирующее воздействие на активность фагоцитов при острой интоксикации ТХМ. Комбинация «Р + ОМУ» устраняла вызванную ТХМ лейкопению на 7, 28 и 46 сутки (рис. 1 А). Это обеспечивалось либо равномерным увеличением числа нейтрофилов и лимфоцитов (7 и 46 сутки), либо - лимфоцитов (28 сутки) (рис. 1 Б. В). На 14 сутки комбинация ослабляла выраженность индуцированной ТХМ лейкопении, что достигалось восстановлением числа нейтрофилов (рис. 1 Б). Совместное использование препаратов устраняло подавление ТХМ кислородзависимой микробицидно-сти на 14, 46 и 60 сутки наблюдения (ИИ составил 105.48%, 120,31% и 110,29% соответственно) (рис. 2). Это обеспечивалось восстановлением интенсивности окси-дантного метаболизма и активности МПО-системы ПМЯЛ (табл. 1, рис. 4 А).

Комбинированное применение препаратов, в отличие от индивидуального, полностью отменяло депрессию токсикантом неоксидантных микробицидных систем ПМЯЛ на все сроки наблюдения, что подтверждалось восстановлением до нормы уровня КБ в этих клетках (рис. 4 Б). Сочетанное использование реальдиро-на и ОМУ нормализовало активность кислой и щелочной фосфатазы в ПМЯЛ.

Также комбинация «Р + ОМУ» повышала (по сравнению с ТХМ) поглотительную способность нейтрофилов на 7, 14 и 28 сутки наблюдения.

А Б

Рисунок 4 - Содержание миелопероксидазы (А) и катионных белков (Б) в ПМЯЛ при применении комбинации «ТХМ + Р + ОМУ» (60 сутки наблюдения)

Влияние реальдирона и оксиметилурацнла на гепатотоксические эффекты тетрахлорметана

Наряду с иммунотоксическим, ТХМ оказывал гепатотоксическое действие, что показано многими авторами (Венгеровский А.И. и соавт., 2004; Мышкин В.А. и соавт., 2007; Сатановская В.И. и соавт., 2009; Лемза C.B. и соавт., 2010; Y. Masuda, 2006; Botsoglou, N.A. et al., 2008). В наших исследованиях гепато-токсичность ТХМ проявилась формированием гиперферментемии, нарушением процессов эстерификации билирубина, а также морфологическими нарушениями. Наблюдались жировая и белковая дистрофия гепатоцитов, развитие фиброза, стеатоз с явлениями воспаления в III зоне ацинуса, снижались регенераторные процессы. Это сопровождалось нарушениями гемодинамики: наблюдались кровоизлияния вокруг сииусоидных капилляров.

Применение корректоров оказывало нормализующее влияние на показатели морфофункционального состояния гепатобилиарной системы. Начиная с 14 суток наблюдалось снижение гиперферментемии (АЛТ, ACT), гипербили-рубинемии, определялись морфометрические изменения.

При использовании реальдирона на 7 сутки сохранялись деструктивные изменения, вызванные ТХМ. Морфологически определялись стеатоз, лобуляр-нос воспаление, максимальные повреждения отмечались в III зоне ацинуса. Наблюдалась крупнокапельная жировая дистрофия, почти полное исчезновение гликогена из гепатоцитов, который появлялся лишь на 28 сутки. При использовании реальдирона ослаблялись явления фиброза.

На 60 сутки уменьшались признаки повреждения гепатоцитов, улучшались обменные и синтетические процессы в гепатоцитах, повышалась интенсивность процессов регенерации, активность иммунокомпетентных клеток.

Применение ОМУ, как и реальдирона, на 7 сутки не отменяло гепатотоксиче-ских эффектов ТХМ. Так, преимущественно в III зоне ацинуса наблюдались крупнокапельная жировая, баллонная дистрофия гепатоцитов, лобулярное воспаление. Отмечалось портальное воспаление с незначительным фиброзом и пролиферацией желчных протоков. На 60 сутки выявлено уменьшение деструктивных изменений,

что подтверждает гепатопротекторные свойства препарата. Наблюдалось увеличение митотической активности и признаки полиплоидии гепагоцитов, что свидетельствует о повышении синтеза ДНК. Было отмечено улучшение гемодинамики. Однако в целом признаки восстановления печени были существенно ниже, чем в группе коррекции реальдироном и/или комбинацией «Р + ОМУ».

Сочетанное применение препаратов в ранние сроки мало изменяло картину, обусловленную воздействием ТХМ. Отмечался крупнокапельный стеатоз преимущественно в III зоне ацинуса в сочетании с баллонной дистрофией гепа-тоцитов и лобулярным воспалением. В тоже время на 60 сутки наблюдалось почти полное восстановление нарушенной структуры печени: уменьшение белковой и жировой дистрофии, количества некротизированных гепатоцитов, увеличение числа двуядерных гепатоцитов (усиление регенераторных процессов) и синтетических процессов в гепатоцитах, активация и пролиферация звездчатых ретикулоцитов, улучшение микроциркуляции, отсутствие фиброза. Также отмечалось улучшение желчеотделения, что свидетельствует о повышении дезинтокш-кационной функции печени. На 60 сутки увеличивалось содержание гликогена. Можно заключить, что наибольший эффект коррекции морфологических нарушений печени наблюдался при использовании комбинации «Р+ОМУ». Тем не менее в группе «Р+ОМУ» сохранялись дистрофические изменения в гепатоцитах.

Таким образом, острая интоксикация ТХМ, наряду с выраженным гепато-токсическим действием, приводит к значительной недостаточности фагоцитарных механизмов защиты организма, которая обусловлена снижением числа нейтрофклов, их функциональной дефектностью и касается деятельности всех фагоцитов - как ПМЯЛ, так и ПМФ.

Одним из основных механизмов повреждающего действия ТХМ является активация процессов ПОЛ (Мышкин В.А. и др., 2007; Попов С .С. и соавт., 2007; Лем-за C.B. и соавт., 2010; Basu S., 2003; Botsoglou N.A. et al., 2008; Mehmeicio G. et à!., 2008). Следовательно, оксидативный стресс может существенно нарушить антимикробную активность нейтрофилов, поскольку продукция активных форм кислорода является молекулярной основой их эффекторной функции (Коваленко Е.И.

и соавт., 2007; Балашов В.Г., 2009; Долгушин И.И. и соавт., 2009; Степовая Е.А. и др., 2010; Плескова С.Н. и соавт., 2011). Этим можно объяснить выраженную депрессию ТХМ кислородзависимых механизмов киллинга нейтрофилов.

Глубокое и стабильное угнетение ТХМ неоксидантных механизмов киллинга ПМЯЛ, что цитохимически подтверждается стойким снижением КБ в этих клетках, возможно, обусловлено нарушением костномозгового кроветворения, наблюдающимся при токсических поражениях печени (Каюмова А.Ф., 1996; Зубахин А.А. и соавт., 1999; Кутана С.Н. и соавт., 2000; Шварц Я.Ш. и соавт., 2000).

Полученные данные о влиянии реальдирона на функциональную активность мононуклеарных фагоцитов и нейтрофилов согласуются с данными литературы (Гончарова И. А. и соавт., 2004; Степовая Е.А. и соавт., 2010; Плескова С.Н. и соавт., 2011). Принципиально важным является сохранение закономерностей этого 'влияния в условиях воздействия ТХМ.

Возможно, что стимулирующий эффект реальдирона на неоксидантные микробицидные системы нейтрофилов обусловлен повышением функциональной активности мононукларных фагоцитов под влиянием препарата, а, следовательно, и процессов костномозгового кроветворения. Это согласуется и с выявленным активирующим воздействием реальдирона на активность пероксидазо-зависимых оксидантных микробицидных систем ПМЯЛ.

С другой стороны, улучшение функций макрофагов при использовании реальдирона положительно влияет на морфофункциональное состояние печени, это подгверждается данными гистоморфологических исследований.

Позитивный эффект ОМУ проявился прежде всего в отношении перокси-дазонезависимых оксидантных микробицидных систем ПМЯЛ и ПМФ, что, вероятно, опосредуется защитным действием ОМУ как антиоксиданта в условиях оксидативиого стресса, вызванного ТХМ.

В силу того, что реальдирон и оксиметилурацил имеют определенные от-лкчия в иммуно- и гепатотропных эффектах и различающиеся механизмы действия, их комбинация обеспечивает более эффективную коррекцию иммуно- и гепатотоксичности ТХМ по сравнению с их индивидуальным действием.

19

ВЫВОДЫ

1. Тетрахлорметан при острой интоксикации наряду с гепатотоксическим влиянием, оказывает повреждающее воздействие на фагоцитарное звено иммунитета, что проявляется уменьшением числа нейтрофилов, подавлением окси-дантных и неоксидантных микробицидных систем нейтрофилов и макрофагов, их кислородзависимого метаболизма и поглотительной способности. В наибольшей мере ингибируются кислороднезависимые факторы микробицидносги как в ранние (полиморфноядерные нейтрофилы), так и в поздние (мононукле-арные фагоциты) сроки наблюдения.

2. При острой интоксикации тетрахлорметаном реальдирон и оксимети-лурацил при индивидуальном и совместном использовании оказывают защитное действие на фагоциты: нормализуют число нейтрофилов, микробицидную, метаболическую и поглотительную активность нейтрофилов и макрофагов.

3. Реальдирон отчетливо повышает активность кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитов и пероксидазозависимых окидантных механизмов киллинга и в ранние (мононуклеарные фагоциты), и в поздние (полиморфноядерные лейкоциты) сроки наблюдения.

4. Оксиметилурацил во все сроки наблюдения более выражено влияет на пероксидазонезависимые оксидантные механизмы киллинга фагоцитов по сравнению с пероксидазозависимыми. Наиболее эффективную коррекцию су-прессированного тетрахлорметаном фагоцитоза нейтрофилов и макрофагов обеспечивает комбинация реальдирона и оксиметилурацила.

5. Реальдирон и оксиметилурацил оказывают гепатозащитное действие при острой интоксикации тетрахлорметаном: снижают гиперферментемию, ослабляют нарушение процессов эстерификации билирубина, уменьшают выраженность белковой и жировой дистрофии гепатоцитов, некротических изменений, гемодинамических нарушений, нормализуют метаболические процессы в гепатоцитах, усиливают компенсаторно-приспособительные изменения в печени. Наибольшая эффективность достигается совместным применением реальдирона и оксиметилурацила.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комбинация «Реальдирон + Оксиметилурацил» перспективна для коррекции иммуно- и гепатотоксических эффектов ТХМ при острой интоксикации.

2 Для выявления повреждающего воздействия тетрахлорметана (острая интоксикация) на механизмы фагоцитарной защиты и оценки эффективности его фармакологической коррекции комбинацией «Реальдирон + Оксиметилурацил» рекомендуется определение содержания в фагоцитах неферментных кати-онных белков.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алёхин, Е.К. Коррекция реальдироном микробицидной активности фагоцитов при интоксикации тетрахлормеганом / Е.К. Алёхин, H.A. Муфазалова, Л.Ф. Муфазалова, Э.А. Гильманова // Астраханский медицинский журнал. -2011. - Т. 6, № 3. - С. 266-267.

2. Муфазалова, Л.Ф. Иммуномодулирующая активность оксиметилурацила при острой интоксикации тетрахлормеганом / Л.Ф. Муфазалова, НА. Муфазалова // Медицинская наука и образование Урала. - 2012. - Т. 13, № 1 (69). - С. 37-40.

3. Муфазалова, Л.Ф. Повреждающее воздействие тетрахлорметана на функциональную активность фагоцитов / Л.Ф. Муфазалова, H.A. Муфазалова // Медицинская наука и образование Урала. - 2012. - Т. 13, № 1 (69). - С. 34-36.

4. Муфазалова, Л.Ф. Влияние реальдирона на функциональное состояние нейтрофилов при интоксикации тетрахлормеганом // Вестник Башкирского университета. - 2012. - Т. 17, № 1. - С. 96-97.

5. Муфазалова, Л.Ф. Влияние интоксикации тетрахлормеганом на состояние фагоцитарного звена иммунитета экспериментальных животных / Л.Ф. Муфазалова, И.З. Набиева, Э.А. Гильманова И Материалы 74-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2009. - С. 46-47.

6. Муфазалова, Л.Ф. Коррекция реальдироном и оксиметилурацилом микробицидной активности фагоцитов при интоксикации тетрахлормеганом /

Л.Ф. Муфазалова, Э.А. Гильманова, И.З. Набиева // Материалы 74-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопро сы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2009. Т. 1. - С. 48-49.

7. Муфазалова, Л.Ф. Коррекция реальдироном микробицидной активности фагоцитов при интоксикации тетрахлорметаном / Л.Ф. Муфазалова, Э.А. Гильманова, А.Я. Мухаметзянова И Материалы 75-й Юбилейной Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 65-летию Победы в ВОВ и 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова. - Уфа, 2010.-Т. 2.-С. 27-28.

8. Муфазалова, Л.Ф. Коррекция оксиметилурацилом микробицидной активности фагоцитов при интоксикации тетрахлорметаном / Л.Ф. Муфазалова, Э.А. Гильманова, А.Я. Мухаметзянова // Материалы 75-й Юбилейной Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 65-летию Победы в ВОВ и 200-летию со дня рождения Н.И. Пирогова Уфа,

2010.-Т. 2.-С. 28-29.

9. Муфазалова, Л.Ф. Состояние фагоцитарного неспецнфичсской рйш стентности и гепатобилиарной системы при интоксикации тетрахлорметаном / Л.Ф. Муфазалова, А.Я. Мухаметзянова, А.Ф. Сайфуллина И Материалы 76-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых. - Уфа.

2011.-Т. 2.-С. 35-36.

10. Муфазалова, Л.Ф. Влияние интоксикации тетрахлорметаном на мик-робицидную активность фагоцитов / Л.Ф. Муфазалова, АЛ. Мухаметзянова, А.Ф. Сайфуллина И Материалы 10-ой юбилейной Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА -2011», посвященной году укрепления межнационального согласия, Дню Медицинского работника. - Уфа, 2011. - С. 132-133.

11. Муфазалова, Л.Ф. Коррекция реальдироном и оксиметилурацшкш функциональной активности фагоцитов при интоксикации тетрахлорметаном / Л.Ф. Муфазалова, А.Я. Мухаметзянова, А.Ф. Сайфуллина II Материалы 10-й юбилейной Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкорто-

стан «МЕДИЦИНСКАЯ НАУКА - 2011», посвященной году укрепления межнационального согласия, Дню Медицинского работника. - Уфа, 2011. - С. 134-135.

12. Алёхин, Е.К. Влияние интоксикации тетрахлорметаном на состояние фагоцитарного звена неспецифической резистентности / Е.К. Алёхин, H.A. Муфазалова, Л.Ф. Муфазалова, АЛ. Мухам етзянова // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований. Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. - Омск, 2011. - С. 188-190.

13. Алёхин, Е.К. Коррекция оксиметилурацилом функциональной активности фагоцитов при интоксикации тетрахлорметаном / Е.К. Алёхин, H.A. Муфазалова, Л.Ф. Муфазалова, АЛ. Мухаметзянова // Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований. Материалы Всероссийской научно-пракгаческой конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. - Омск, 2011. - С. 191-194.

Муфазалова Ляйсан Фапшовпа

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ИММУНО-И ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ТЕТРАХЛОРМЕТАНА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Издательская лицензия №06788 от01.11.2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450000, РБ, г. Уфа, а/я 1293; тел.: (347) 250-81-20; тел./факс (347) 250-13-82.

Подписано в печать 16.03.2012 г. Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. Тираж 100. Заказ № 691.