Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Бактерицидные механизмы фагоцитоза YERSINIA PSEUDO UBERCULOSIS с разным набором плазмид

2 7

На правах рукописи

КОК ЭВАЛОВА Жанна Анатольевна

БАКТЕРИЦИДНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФАГОЦИТОЗА YERSINIA PSEUDO 'JBERCULOSIS С РАЗНЫМ НАБОР 1ПГ1АЗМИД

14.00.16 - гатологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 2002

Работа выполнена в Иркутском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока

Научные руководители:

Засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Е.П. Голубинский Кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В.И. Дубровина

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук,

профессор Л.С. Васильева

Доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Л.Я. Урбанович

Ведущая организация: Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

Защита состоится "_"_2002 г. в " " часов

на заседании диссертационного совета Д 001.054.01 в ГУ/"Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН'О) V

Адрес: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16 /

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ ""ВосточноСибирский научный центр Сибирского отделения РАМН" по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16..

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Автореферат разослан "

\чЙ.Ф. Шолохов

2002 г.

РЦЩ. Щ О

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема патогенности псевдотуберкулезного микроба представляет собой интересный, но недостаточно изученный раздел его биологии. До сих пор остаются не выясненными механизмы взаимодействия возбудителя псевдотуберкулеза и организма хозяина, особенно на ранних этапах инфекции, когда микроорганизму необходимо преодолеть защитные - гуморальные и клеточные - барьеры макроорганизма и при этом не только выжить, но и увеличить размеры своей популяции. На этой стадии развития инфекционного процесса возбудитель в качестве инструмента воздействия на системы организма хозяина использует макромолекулы, обладающие способностью ингибировать на той или иной стадии фагоцитарный процесс (Езепчук Д.В., 1977; Сомов Г.П. и др., 1990).

По мнению J1M. Куклевой с соавт. (1997), ведущими факторами патогенности возбудителя псевдотуберкулеза являются адгезины и инва-зины, а также продукты, обусловливающие внеклеточное выживание бактерий путем подавления фагоцитоза или цитопатического воздействия на фагоциты. Что касается внутриклеточного этапа развития возбудителя, то имеющиеся данные фрагментарны, нередко противоречивы (BrubakerR., 1991).

Накопленные к настоящему времени материалы однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в частности У. pseudotuberculosis, является биологически сложным, полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем, детерминирующих выражение как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса (Тимченко Н.Ф., 1989; Bolin I. et al., 1982, 1988; Cornelis G. R. et al„ 1987, 1998). Рези-стентость псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, проявляющуюся в способности к факультативному паразитированию в фагоцитах и вследствие этого играющую важную роль в патогенезе инфекции, многие авторы связывают с наличием у него плазмид и их спектром (Шуры-гина И .А. и др., 1994, 2000; Tertti R. et al., 1987).

К настоящему времени выполнено значительное количество исследований, посвященных плазмиде вирулентности иерсиний, однако многие аспекты функционирования антифагоцитарного фенотипа ее генов остаются неясными. Гораздо менее изучен другой внехро-мосомный репликон У. pseudotuberculosis - плазмида pVM82 молекулярной массой 82 мДа. Заболеваемость в виде эпидемических вспышек могут обусловливать оба доминирующих плазмидовара - 48 мДа и 48:82 мДа, содержащиеся в геноме основного этиологического агента псевдотуберкулезной инфекции у людей в Сибири и на Дальнем Востоке - У. pseudotuberculosis 1 серовара. При этом для одноплазмидного варианта характерны вспышки с более благоприятным течением,

преобладанием легких и стертых форм заболевания. Плазмида pVM82 не оказывает влияния на течение эпидемических вспышек, но обусловливает более тяжелое течение заболевания с частым вовлечением в патологический процесс печени и селезенки, поражением суставов и длительностью клинического течения.

С другой стороны, весьма обоснованно полагать, что характер инфекционного процесса, а также течение иммунных реакций при псевдотуберкулезе зависят не только от вирулентности возбудителя, но и от эффективности бактерицидных систем макроорганизма, в том числе антимикробной активности макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) (Фрейдлин И.С., 1984).

К настоящему времени накоплены довольно значительные экспериментальные материалы, затрагивающие более или менее основательно отдельные этапы фагоцитарного процесса при контакте клеток хозяина с псевдотуберкулезным микробом (Ценева Г.Я., 1988; Исачкова J1.M., Плехова И.Г., 1989; Heesmann J., Gaed К, 1989). Между тем, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитов при их взаимодействии с У. pseudotuberculosis, особенно закономерности этих реакций при фагоцитозе бактерий с разным плазмидным составом, -изучены в меньшей мере, что затрудняет понимание механизмов как патогенности псевдотуберкулезного микроба, так и ответных реакций макроорганизма.

Основная цель работы - изучение бактерицидных механизмов (ки-слородзависимые и кислороднезависимые антимикробные системы) фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба с разным набором плазмид макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Изучить фагоцитарную активность макрофагов (перитонеальных, альвеолярных) и полиморфноядерных лейкоцитов экспериментальных животных в отношении псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов;

2. Исследовать активность ферментных и других систем макрофагов и ПЯЛ, определяющих бактерицидный потенциал фагоцитов при поглощении псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов.

3. Сопоставить бактерицидную активность в отношении псевдотуберкулезного микроба у перитонеальных, альвеолярных макрофагов и ПЯЛ.

4. Исследовать влияние плазмиды вирулентности У. pseudotuberculosis на бактерицидные реакции фагоцитов.

Научная новизна

На основе комплексного сравнительного исследования впервые получены материалы, характеризующие неизвестные ранее особенности воздействия макрофагов и ПЯЛ экспериментальных животных на

псевдотуберкулезный микроб бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов на всех основных стадиях фагоцитарного процесса.

Установлено, что показатели хемотаксиса и адгезии при взаимодействии макрофагов (как перитонеальных, так и альвеолярных) и ПЯЛ с псевдотуберкулезным микробом в случае бесплазмидного варианта выше, чем в отношении бактерий, содержащих плазмиду pW48 или комбинацию плазмид pYV48 и pVM82 (pYV48:pVM82).

Показано, что плазмидсодержащие бактерии более устойчивы к разрушению макрофагами и ПЯЛ, чем клетки контрольного бесплазмидного штамма. Плазмида pYV48 и в сочетании с плазмидой pVM82 повышает устойчивость иерсиний к фагоцитозу, подавляет реактивность фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба.

Выявлено, что активность ферментов "окислительного взрыва" (глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ Н-оксидазы), а также супероксиддисмутазы и миелопероксидазы в макрофагах при фагоцитозе бес-плазмидных клеток выше, чем в случае плазмидсодержащих псевдотуберкулезных микробов. Бактерии, несущие плазмиду pYV48 или комбинацию плазмид (pYV48:pVM82), подавляют окислительный взрыв в макрофагах и ПЯЛ, снижают активность супероксиддисмутазы, миелопероксидазы и кислой фосфатазы, уменьшают содержание неферментных катионных белков и тем самым угнетают бактерицидную способность фагоцитов.

Теоретическое и практическое значение работы

Охарактеризованы бактерицидные механизмы фагоцитов при их взаимодействии с псевдотуберкулезным микробом. Разработаны и внедрены в практику научных исследований новые экспериментальные приемы с использованием монослоя культуры макрофагов для количественной оценки активности ферментов, определяющих бактерицидный потенциал макрофагов при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба.

Результаты исследования, представленные в диссертации, использованы при составлении двух методических рекомендаций: "Способ определения активности супероксиддисмутазы в полиморфноядерных лейкоцитах и макрофагах при фагоцитозе У. pseudotuberculosis" и "Способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы в макрофагах".

По результатам работы оформлено два рационализаторских предложения - № 301 и № 302 от 25.01.99. Разработанные методы внедрены в практику научной работы Иркутского противочумного института, Новороссийской и Тувинской противочумных станций.

Положения, выносимые на защиту

1. Плазмидсодержащий псевдотуберкулезный микроб более устойчив, чем бесплазмидный, к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ.

2. Хемотаксическая и адгезивная активность макрофагов и ПЯЛ в

отношении псевдотуберкулезного микроба зависит не только от наличия в нем плазмид, но и их качественного состава.

3. Факторами, повышающими устойчивость плазмидсодержащего псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, является его способность ингибировать системы макроорганизма, обеспечивающие выработку активных форм кислорода, синтез неферментных катионных белков, активность СОД и миелопероксидазы, что приводит к снижению бактерицидной способности фагоцитов.

Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, представлены на:

Международных научных конференциях "Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, 2000), "Природно-очаговые инфекции" (Улан-Батор, 2000), "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Всероссийских научных конференциях "Экологозависимая патология" (Чита, 1999) и "Проблемы медицины и биологии" (Кемерово, 1999); Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 1999,2000); научно-практической конференции "Актуальные вопросы инфекционной патологии" (Барнаул, 1999); научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 19992001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками. Список литературных источников содержит 143 наименований, в том числе 73 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При выполнении работы испольйовали штаммы У. pseudotuberculosis И-716, содержащий плазмиды pYV48 и pVM82; У. pseudotuberculosis И-727, имеющий только плазмиду pYV48; У. pseudotuberculosis 53 - селекционированный бесплазмидный штамм. Все штаммы выделены в регионах Сибири, принадлежат к I серовару, обладают характерными для псевдотуберкулезного микроба культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами. Плазмидсодержащие штаммы И-716 и И-727 вирулентны для мышей BALB/c, вызывая при внут-рибрюшинном введении в дозах соответственно 10 и 5-108 м.к. гибель животных на 5-6 сут. Бесплазмидный штамм 53 для мышей авирулен-тен.

Плазмидный состав псевдотуберкулезного микроба анализировали в соответствии с методикой Т. Kieser (1984) в модификации С.В.Бала-

хонова и др. (1998) на аппарате для вертикального гель-электрофореза с источником тока, создающим напряжение электрического поля не менее 4-5 в/см, и источником УФ-излучения с длиной волны 254-302 нм. Для скрининга плазмид использовали суточные культуры штаммов псевдотуберкулезного микроба, выращенные на питательных средах с добавлением триптозы.

Для исключения возможного интегрирования плазмиды pYV48 с хромосомой штамма У. pseudotuberculosis 53 последний перед опытом тестировали в ПЦР с праймерами Yersl и Yers2 (фирмы Кпинбиотех М).

В качестве экспериментальных животных использовали интакгных морских свинок весом 300-350 г. Количество животных в каждом опыте подбирали с расчетом получения статистически достоверных результатов. Животных из экспериментов выводили воздушной эмболией сосудов сердца.

Перитонеальные макрофаги получали по общепринятой методике (Учитель И. Я. и др., 1978) без предварительной стимуляции или после стимуляции внутрибрюшинным введением пептона, альвеолярные -путем отмывания средой 199 изолированных долей легкого. Источником полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) служил перитонеальный экссудат, который получали по методике J. G. Hirsch (1956).

Частоту слияния фагосом с лизосомами контролировали с помощью прижизненного фпуорохромирования культуры макрофагов акридиновым оранжевым с последующим определением активных клеток (Frekel С. etal., 1986).

Материал для электронной микроскопии готовили по методике R.C. Graham, М. J. Karnovsky (1966). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3-8800. Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронного микроскопа JEM-100S при увеличении от 3 до 30 тыс. При подготовке материала к электронно-микроскопическому исследованию применяли общепринятые методики фиксации, обезвоживания, заключения в эпоксидные смолы и контрастирования. Для изучения ультраструктуры клеток использовали также модифицированную нами методику R. С. Graham, М. J. Karnovsky (1966).

Хемотаксическую способность макрофагов определяли по методу М. Нельсона в изложении И. С. Фрейдлин (1986). Индекс хемотаксиса (ИХ) рассчитывали по формуле ХТ=А/В, где А - путь макрофага в сторону антигена, В - путь макрофага в сторону среды 199 и выражали в условных единицах.

Адгезивные свойства фагоцитов изучали по методу И.С. Фрейдлин (1986). Индекс адгезии определяли по соотношению (в %) количества макрофагов, прилипших к стеклянной пластинке в опытной и контрольной пробах.

Фагоцитарную активность макрофагов и ПЯЛ исследовали in vitro в переживающих однослойных культурах (Фрейдлин И. С., 1984, 1986). Интенсивность фагоцитоза оценивали по фагоцитарному числу, про-

центу активных фагоцитов, цитопатическому действию бактерий и завершенности фагоцитоза.

Интенсивность окислительных процессов в макрофагах и ПЯЛ, фагоцитирующих У. pseudotuberculosis, изучали цитохимически в монослое фагоцитов животных в реакции с нитросиним тетразолом (НСТ-тест) (Kaplow L. S., 1955; Park В. Н. et al., 1968). Об активности кисло-родзависимого метаболизма в фагоцитах судили по числу формазан-положительных клеток (в процентах) и по степени восстановления нит-росинего тетразолия в диформазан (средний цитохимический показатель активности).

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) определяли по методу Р.П. Нарциссова (1969) и М.И. Прохоровой (1982), НАДФН-оксидазы - Р.П. Нарциссова (1969) и R.L. Baehner с соавт. в модификации Е.П. Голубинского с соавт. (1995), супероксиддисмутазы (СОД) - по методу в изложении Б.Н. Матюшина (1991), миелоперо-ксидазы - по методу В.Е. Пигаревского, Ю.А. Мазинга (1981) и Т.Л. Бурой (1991). Для оценки кислороднезависимой бактерицидной системы ПЯЛ использовали метод определения активности катионных лизосомальных белков (КБ), предложенный В.Е. Пигаревским, Ю.А. Мазингом (1981). Активность лизосомальных ферментов оценивали в тесте на кислую фосфатазу в изложении Т.Л. Бурой (1991). Активность ферментов выражали в условных единицах оптической плотности.

Количественное содержание белка в исследуемом материале определяли по М. М. Бредфорду (1976).

Статистическую обработку экспериментального материала проводили в соответствии с рекомендациями И. А. Ойвина (1960) и Е.В. Мон-цевичюте-Эрингене (1964). Материалы исследования представлены в виде средней арифметической и ее средней ошибки (М±т). Различия в результатах опытов оценивали при уровне вероятности р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Резистентность псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, обусловливающая способность этого микроорганизма к факультативному паразитированию в фагоцитах, является многофакторным феноменом, многие звенья которого уже достаточно изучены. Однако, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитарноактивных клеток макроорганизма при их взаимодействии с У. pseudotuberculosis, особенно закономерности этих реакций при фагоцитозе бактерий с разным плазмидным составом, исследованы в меньшей мере, что затрудняет понимание механизмов как патогенности псевдотуберкулезного микроба, так и ответных реакций макроорганизма.

В настоящей работе мы попытались изучить особенности бактерицидных механизмов (кислородзависимых и кислороднезависимых антимикробных систем) перитонеальных и альвеолярных макрофагов, а

также лолиморфноядерных лейкоцитов восприимчивого к псевдотуберкулезу экпериментального животного - морской свинки.

С целью получения комплексной информации исследовали практически все стадии фагоцитарного процесса: хемотаксис, адгезию, фагоцитарную активность, образование фаголизосом, завершенность фагоцитоза, активность лизосомальных ферментов и ферментов "окислительного взрыва".

Объектами экспериментов служили три штамма псевдотуберкулезного микроба - V. pseudotuberculosis И-727 (вирулентный, содержащий плазмиду pYV48), И-716 (вирулентный, содержащий комбинацию плазмид pYV48:pVM82) и 53 (авирулентный, бесплазмидный).

Основные опыты по изучению сравнительной фагоцитарной и ферментативной активности, определяющих бактерицидный потенциал фагоцита в отношении псевдотуберкулезного микроба с разным плазмид-ным составом, проведены в монослое перитонеальных, альвеолярных макрофагов и лолиморфноядерных лейкоцитов.

Хемотаксические и адгезивные свойства фагоцитов. Полученные материалы показали, что функциональные возможности для хемотаксиса перитонеальных макрофагов существенно (в 1.2-2.6 раза) выше, чем альвеолярных, о чем свидетельствуют более высокие значения индексов хемотаксиса у первых во всех случаях определения. Полиморфноядерные лейкоциты по данному параметру занимают промежуточное положение между макрофагами исследованных видов.

Однако, наиболее значимым, с точки зрения задач исследования, является наблюдение, что различия в скорости миграции фагоцитарно-активных клеток в значительной мере обусловлены наличием или отсутствием плазмид у объекта фагоцитоза. Наибольшую хемотаксиче-скую активность макрофаги (как перитонеальные, так и альвеолярные) и ПЯЛ проявляли при взаимодействии с бесплазмидными клетками штамма У. pseudotuberculosis 53. Плазмидсодержащие клетки оказывали ингибирующее влияние на хемотаксис фагоцитов, причем двухплаз-мидные (У. pseudotuberculosis И-716) - в большей мере, чем одноплаз-мидные (У. pseudotuberculosis И-727).

Перитонеальные и альвеолярные макрофаги по адгезивной способности превосходят (р<0.05) ПЯЛ независимо от объекта фагоцитоза (бесплазмидный вариант и плазмидсодержащие вирулентные клетки). Между тем, и макрофаги, и ПЯЛ при фагоцитозе бесплазмидного псевдотуберкулезного микроба (штамм 53) проявляют достоверно более высокую адгезивную активность, чем в отношении клеток, содержащих плазмиды pYV48 или pYV48:pVM82 (штаммы И-727 и И-716).

Таким образом, различия в функциональной активности фагоцитов, выявленные при изучении их хемотаксической и адгезивной активности, обусловлены, не только физиологическим своеобразием отдельных макрофагов и ПЯЛ, но и наличием или отсутствием плазмид, в частности, pYV48 и pVM82, у возбудителя псевдотуберкулеза.

Фагоцитарная активность макрофагов и ПЯЛ. При изучении фагоцитарной способности установлено, что как перитонеальные и альвеолярные макрофагов, так и ПЯЛ поглощают и бесплазмидные, и плаз-мидсодержащие клетки псевдотуберкулезного микроба, однако в наибольшей мере фагоцитарная активность проявляется в отношении бес-плазмидного варианта.

Так, в случае полиморфноядерных лейкоцитов через 30 мин контакта с микробом фагоцитарное число при взаимодействии с бесплаз-мидными клетками штамма У. pseudotuberculosis 53 составило 5.6±0.8, с одноплазмидными клетками У. pseudotuberculosis И-727 - 3.3±0.3, с двухплазмидными клетками У. pseudotuberculosis И-716 - 3.8±0.5, а через 2 ч инкубации - 4.5±0.3, 2.1 ±0.3 и 2.4±0.2, соответственно (р<0.05). Сходные тенденции прослеживались и при изучении фагоцитарной активности резидентных перитонеальных и альвеолярных макрофагов морской свинки: интенсивность фагоцитоза клеток, содержащих плаз-миду pYV48 или обе плазм иды (pYV48 и pVM82), оказалась в 2.0-2.5 раза меньшей, чем в случае клеток бесплазмидного штамма.

Значительные различия в характере взаимодействия фагоциг.ми-кроб наблюдали при изучении завершенности фагоцитоза. Фагоцитированные иерсинии с плазмидами pVM82 и pYV48 или только с плаз-мидой pYV48 отличались большей устойчивостью к воздействию макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов, чем клетки контрольного бесплазмидного штамма. Полученные материалы показали, что наличие у иерсиний плазмид pVM82 и pYV48 повышает их устойчивость к фагоцитозу, подавляет реактивность фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза.

Различия в показателях частоты слияния фагосом с лизосомами при взаимодействии фагоцитов с псевдотуберкулезными микробами также, по нашим данным, обусловлены плазмидным составом объекта фагоцитоза в связи с его способностью или неспособностью ингибировать слиние фаго- и лизосом. В соответствии с полученными результатами, ведущую роль в этом процессе играет плазмида вирулентности pYV48. Присутствие дополнительной плазмиды pVM82 в клетках У. pseudotuberculosis И-716 усиливает ингибирующий эффект на процесс слияния фагосом и лизосом. Так, если при фагоцитозе клеток бесплазмидного штамма У. pseudotuberculosis 53 процент слияния фагосом с лизосомами в наших опытах был максимальным - 56.0±1.9, то при фагоцитозе моноплазмидного микроба (И-727) он снижался до 42.0±2.4, а двух-плазмидного (И-716) - до 28.0±0.13 (р£0.5).

Цитопатическое действие изученных штаммов псевдотуберкулезного микроба на ПЯЛ и макрофаги было слабо выражено.

При изучении динамики фагоцитоза на ультраструктурном уровне отмечено, что перитонеальные макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты морских свинок наиболее активно поглощают псевдотуберкулезные микробы независимо от их плазмидного состава в первые 30

мин контакта с ними. На этом этапе фагоцитоза бактерии можно наблюдать на поверхности фагоцитов, на стадии поглощения многочисленными псевдоподиями, а также внутри некоторых фаголизосом. Отмечено ингибирующее влияние плазмид на образование фагоцитами псевдоподий: их число у макрофагов и ПЯЛ, контактирующих с псевдотуберкулезным микробом, содержащим одну плазмиду pYV48 или комбинацию плазмид pYV48:pVM82, было в 1.4 и 1.8 раза, соответственно, ниже, чем в случае бесплазмидных бактерий. Установлено, что плаз-мидсодержащие бактерии препятствуют формированию фаголизосом. Количество последних в макрофагах и ПЯЛ, фагоцитирующих бесплаз-мидные клетки У. pseudotuberculosis, было в 1.2-1.5 раза выше, чем при фагоцитозе моноплазмидных и двуплазмидных бактерий. Через 2 ч контакта количество бактерий, несущих комбинацию плазмид 82:48 мДа, внутри фаголизосом увеличивается, некоторые микробные клетки находились на стадии деления. Таким образом, по морфологическим данным можно говорить о размножении плазмидсодержащих микробов в фаголизосомах фагоцитов.

В структуре макрофагов и лолиморфноядерных лейкоцитов в начальные сроки фагоцитоза иерсиний с плазмидами pVM82 и pYV48 или только с плазмидой pYV48 наблюдали незначительно выраженные изменения, такие как вакуолизация цитоплазмы, слияние нескольких фаголизосом. Вокруг фаголизосом, содержащих бактерии, наблюдали уплотнение цитоплазмы, которое имело электронноплотное гомогенное состояние. При фагоцитозе микробов бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов проявления их цитотоксичности и деструкции фагоцитов через 30 мин выражены незначительно. Увеличение количества поврежденных клеток наблюдалось через 2 ч взаимодействия фагоцитов с микробами.

Полученные материалы свидетельствуют о том, что плазмиды псевдотуберкулезного микроба pYV48 и pVM82 оказывают тормозящее влияние на функциональную активность макрофагов и полиморфноя-дерных лейкоцитов, обеспечивая замедление темпов фагоцитоза бактерий.

Окислительная активность макрофагов и ПЯЛ. В бактерицидных процессах, осуществляемых на уровне фаголизосом, как известно, ключевую роль играют активные формы кислорода, продукция которых связана с резким увеличением потребления кислорода клетками.

При изучении окислительной активности макрофагов и ПЯЛ в НСТ-тесте, результаты которого оценивали по степени восстановления нит-росинего тетразолия в диформазан (цитохимический показатель активности, выраженный в условных единицах) и количеств/ формазанполо-жительных клеток (в %), установлено, что показатели НСТ-теста у макрофагов и ПЯЛ, фагоцитирующих У. pseudotuberculosis 53 (бесплаз-мидный) выше, чем в случае поглощения ими псевдотуберкулезных микробов, содержащих плазмиду pVM82 (р<0.05). Имеются основания

предполагать, что плазмиды с молекулярной массой 48 и 82 мДа псевдотуберкулезного микроба оказывают ингибирующее влияние на "окислительный взрыв" в фагоцитах. При этом направленность количественных изменений кислородзависимого метаболизма в принципе тождественна у фагоцитов всех трех исследованных видов - перитонеальных, альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов (рис. 1).

>s

S и

S S X

о ь К

ЕГ

s н

о о я

m S

200 150 100 50 0

-1-г

30 мин 120 мин

■ Y. ptbc 53 •Y. ptbc 727 ptbc 716 -К— Контроль

Время контакта

Рисунок 1. Показатели НСТ-теста у перитонеальных макрофагов морской свинки при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m, n=8)

Однако, активация кислородзависимого метаболизма при фагоцитозе бесплазмидных клеток У. pseudotuberculosis 53 происходит значительно интенсивнее, чем в случае псевдотуберкулезных микробов, содержащих плазмиды. Это обстоятельство свидетельствует об ингиби-ровании кислородзависимого метаболизма фагоцитов клетками У. pseudotuberculosis, несущими плазмиды pYV48 и pVM82, в результате чего снижается выработка активных форм кислорода и соответственно -бактерицидная способность фагоцитов.

Ферментативная активность фагоцитов. Для выяснения вопроса, на какие реакции кислородзависимого бактерицидного механизма фагоцитоза влияют плазмиды pYV48 и pVM82 псевдотуберкулезного микроба, исследована активность ферментов этого процесса: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ-Н-оксидазы, супероксиддисмутазы, ми-елопероксидазы и кислой фосфатазы. Объектом исследования служили перитонеальные и альвеолярные макрофаги и ПЯЛ морских свинок.

Активность Г6ФДГ и НАДФ'Н-оксидазы определяли в макрофагах морской свинки, фагоцитирующих клетки бесплазмидного (53) и плаз-мидсодержащих (И-716, И-727) штаммов псевдотуберкулезного микроба спектрофотометрическим и цитофотометрическим методами и выражали в условных единицах.

Результаты цитофотометрического изучения активности Г6ФДГ при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба суммированы в таблице 1.

Таблица 1

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в макрофагах морской свинки при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m)

Фагоциты Время контакта Y. pseudotuberculosis Контроль

53 И-716 И-727

Перитоне-альные 30 мин 0.94±0.02* 0.70±0.04 0.87±0.01* 0.47±0.01

120 мин 1.17±0.02* 0.82±0.02 0.99±-.02* 0.50±0.02

Альвеолярные 30 мин 0.83±0.01* 0.64±0.03 0.81±0.04* 0.45±0.02

120 мин 1.05±0.02* 0.75±0.12 0.95±0.09* 0.49±0.09

Примечание: п (количество опытов)=6-8, * - р<0.05

Обращает внимание безусловно статистически достоверный факт (р<0.05), что в целом макрофаги, фагоцитирующие бесплазмидный штамм У. pseudotuberculosis 53, по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности превосходят макрофаги, фагоцитирующие возбудителя псевдотуберкулеза с плазмидами pYV48 (И-727) и pYV48:pVM82 (И-716).

При сравнении глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной активности пери-тонеальных и альвеолярных фагоцитарноактивных клеток не очень значительное, но закономерное преимущество следует признать за первыми.

Аналогичные закономерности отмечены нами и при спектрофото-метрическом способе определения активности Г6ФДГ(рис. 2)

ьл н

ID Э

gx

н

2

и 5 О

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

□ Y. ptbc 53

□ У. ptbc 716

□ Y. ptbc 727

□ Контроль

30 мин 120 мин

Время контакта

Рисунок 2. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы перитонеаль-ных макрофагов при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m, n=8)

Активность Г6ФДГ оказалась наиболее высокой при фагоцитозе бес-плазмидного псевдотуберкулезного микроба (53). Несколько ниже показатель активности фермента при фагоцитозе клеток, содержащих только плазмиду вирулентности pYV48 (И-727), однако и он существенно

превосходит соответствующий показатель в случае фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба, содержащего обе плазмиды рУ\/48 и р\/М82 (И-716).

Материалы проведенного исследования показали, что фагоцитоз псевдотуберкулезного микроба макрофагами сопровождается активацией Г6ФДГ, что свидетельствует об усилении окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и, как следствие, - активной наработке восстановленной формы нуклеотидадениндифосфата, усилению окислительного метаболизма. Очевидно, что активизация кислородзависи-мого метаболизма обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая, однако, носит дифференцированный характер в зависимости от исходных свойств микроорганизма, в частности, от наличия или отсутствия у него плазмид, продолжительности взаимодействия фагоцитов с микробом и особенностей фагоцитов (в перитонельных макрофагах активность Г6ФДГ выше, чем в альвеолярных). Естественно, все это может отражаться на способности псевдотуберкулезного микроба противостоять защитным факторам макроорганизма.

Результаты определения активности НАДФН-оксидазы в макрофагах морской свинки при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба дают основание считать, что характер изменения активности НАДФ Н-оксидазы в исследованных объектах в процессе фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба по всем параметрам сходен с тем, что мы отмечали при анализе материалов по активности глкжозо-6-фосфатдеги-дрогеназы (р<0.05) (табл. 2).

Таблица 2

Активность НАДФ Н-оксидазы макрофагов морской свинки при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m)

Фагоциты Время копта кта Y. pseudotuberculosis Контроль

53 И-716 И-727

Пернтонс-альпые 30 мин 1.23±0.04* 0.72±0.02 0.92±0.02 0.52±0.03

120 мим 1.36±0.01* 0.84±0.01 0.98±0.05 0.56±0.01

Альвеолярные 30 мин 1.08±0.02* 0.68±0.01 0.71 ±0.02 0.49±0.01

120 мин 1.22±0.06* 0.79±0.09 0.82±0.04 0.52±0.04

Примечание: п=8, * - р<0.05

Скорость окисления НАДФ Н возрастала по мере увеличения продолжительности контакта иммунокомпетентных клеток с псевдотуберкулезным микробом (через 2 ч показатели активности были достоверно выше, чем через 30 мин). Наиболее высокие показатели активности НАДФ Н-оксидазы отмечены у макрофагов морских свинок при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного варианта. Макро-

фаги, фагоцитирующие плазмидсодержащие иерсинии, несущие как одну, так и две плазмиды, по активности фермента уступали им в 1.31.7 раза. Активность НАДФ-Н-оксидазы в макрофагах при фагоцитозе У. pseudotuberculosis с двумя плазмидами (pYV48:pVM82) была ниже, чем в макрофагах, фагоцитирующих псевдотуберкулезные микробы, содержащие только одну плазмиду вирулентности pYV48. Перитоне-альные макрофаги несколько превосходили по ферментативной активности альвеолярные клетки.

Результаты цитофотометрического исследования подтверждаются данными определения активности НАДФ-Н-оксидазы спекгрофотомет-рическим методом (рис. 3).

TL

□ Контроль

□ Y. ptbc 53

□ Y. ptbc 727

□ Y. ptbc 716

30 мин

| мин

Время контакта

Рисунок 3. Активность НАДФ-Н-оксидазы в перитонеальных макрофагах морской свинки при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m, n=8)

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что фагоцитоз псевдотуберкулезного микроба макрофагами сопровождается активацией НАДФ-Н-оксидазы, что приводит к регенерации НАДФ, усилению окислительного метаболизма фагоцитов и, как следствие, - к повышению бактерицидного эффекта в отношении поглощенных микроорганизмов. С другой стороны, выявлен существенный инги-бирующий активность НАДФ-Н-оксидазы эффект, который оказывают плазмидсодержащие псевдотуберкулезные микробы. Основную роль в этом процессе играет, видимо, плазмида вирулентности pYV48, поскольку дополнительная плазмида pVM82 лишь незначительно изменя -ет активность фермента. Неодинаковые показатели активности НАДФ-Н-оксидазы фагоцитов в присутствии псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов свидетельствуют о разной способности их ингибировать кислородзависимый метаболизм фагоцитов, что, очевидно, может отражаться на дальнейшей судьбе микроба в макроорганизме.

Характеристику бактерицидных факторов фагоцитов морской свинки при поглощении псевдотуберкулезного микроба дополняют материалы изучения супероксиддисмутазы макрофагов и ПЯЛ в присутствии плаз-мидсодержащих и бесплазмидных бактерий (рис. 4).

0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

1

i

4 |

:t!ir

С?

о &

ж

о «

в

1Л

о

О.

¿2 0.Г7 S

в. Г-

I

>; к

□ Макрофаги

□ ПЯЛ

Время контакта 30 мин

Рисунок 4. Активность супероксиддисмутазы при фагоцитозе У. pseudotuberculosis альвеолярными макрофагами и ПЯЛ (М±т, п=8)

Установлено, что через 30 мин контакта фагоцитов с микробными клетками бесплазмидного штамма У. pseudotuberculosis 53 наблюдалось значительное увеличение активности СОД с последующим довольно быстрым снижением. У плазмидсодержащих штаммов активность этого фермента также возрастала, но в меньшей степени. Альвеолярные макрофаги проявляли большую активность СОД, чем ПЯЛ.

Штаммы У. pseudotuberculosis, содержащие плазмиду вирулентности pYV48 или комбинацию плазмид с м.м. 48:82 мДа, ингибируют в макрофагах и ПЯЛ процессы превращения супероксида в перекись водорода, и этот эффект в большей степени выражен у псевдотуберкулезного микроба с двумя плазмидами.

Для дальнейшей характеристики бактерицидных факторов фагоцитов морской свинки при их контакте с псевдотуберкулезным микробом нами изучена активность миелопероксидазы полиморфноядерных лейкоцитов в присутствии бесплазмидных (У. pseudotuberculosis 53) и плазмидсодержащих СУ. pseudotuberculosis И-716 и И-727) клеток псевдотуберкулезного микроба (рис. 5).

Как следует из полученных результатов, активность миелопероксидазы ПЯЛ в процессе фагоцитоза снижается (р<0.05). При этом лейкоциты, фагоцитирующие бесплазмидный псевдотуберкулезный микроб, по миелопероксидазной активности заметно превосходит клетки, поглощающие плазмидосодержащий микроб.

—♦—Y. ptbc 53 -П-Y. ptbc 727 —Д—Y. ptbc 716 X Контроль

Время контакта

Рисунок 5. Активность миелопероксидазы полиморфноядерных лейкоцитов морской свинки при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m, n=8)

Таким образом, плазмиды иерсиний pYV48 и pVM82 подавляют реактивность фагоцитов, снижают активность миелопероксидазы и тем самым угнетают их бактерицидную способность.

Среди независимых от кислорода механизмов микробицидности макрофагов центральное место занимают лизосомы и их ферменты. Повышенное содержание лизосом и усиленную секрецию лизосомаль-ных ферментов большинство исследователей рассматривает как признак активизации макрофагов (Фрейдлин И. С., 1984; Тимченко Н. Ф и ДР., 1986).

Указанные обстоятельства побудили нас изучить активность кислой фосфатазы перитонеальных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов, которая считается типичным маркерным ферментом лизосом, существенно определяющим киллерную способность фагоцитов.

Результаты проведенных экспериментов показали, что наибольшая активность кислой фосфатазы имеет место в случае фагоцитоза пери-тонеальными макрофагами и ПЯЛ бесплазмидного псевдотуберкулезного микроба (штамм 53). Наименьшие значения активности отмечены при контакте фагоцитов с бактериями штамма У. pseudotuberculosis, несущим две плазмиды - pYV48 и pVM82. При этом активность фермента в перитонеальных макрофагах была выше, чем в ПЯЛ.

Таким образом, псевдотуберкулезные микробы с комбинацией плаз-мид (pYV48:pVM82) или даже одной плазмидой (pYV48) существенно снижают гидролитическую активность кислой фосфатазы.

Содержание неферментных катионных белков. Одним из важных показателей степени участия ПЯЛ в развитии антиинфекционной резистентности макроорганизма является состояние интралейкоцитарных антибактериальных систем. Присутствие специфических маркеров лейкоцитов, таких как антимикробные катионные белки, определяет ПЯЛ как профессиональный фагоцит, способный дезактивировать бактерии.

С учетом этого обстоятельства в следующем опыте мы исследовали содержание в полиморфноядерных лейкоцитах неферментных катион-ных белков и влияние на них плазмидного состава псевдотуберкулезного микроба. Содержание лизосомальных катионных белков в полиморфноядерных лейкоцитах определяли по изменению оптической плотности опытной и контрольной проб (ДЕ) и выражали в условных единицах.

Установлено (рис. 6), что через 30 мин контакта фагоцитов с мик-

ДЕ 4l—-

3,5-----

3--

2,5----—♦— Y. ptbc 53

2--- Y. ptbc 727

1,5--Д^О»--—Д—Y. ptbc 716

1--—^- X Контроль

0,5--

0-1-,-,-,-

Рисунок 6. Содержание катионных белков в полиморфноядерных лейкоцитах морской свинки при фагоцитозе У. pseudotuberculosis (M±m, n=8)

робными клетками, имеющими плазмиды pYV48 и pVM82, содержание катионных белков в ПЯЛ существенно снижалось. Так, у ПЯЛ, фагоцитирующих У. pseudotuberculosis И-716 и И-727, уровень катионных белков был ниже, чем в контроле в 2.1 и 2.3 раза, соответственно. При фагоцитозе бесплазмидных клеток У. pseudotuberculosis 53 уровень катионных белков также снижался, хотя и не так резко, как в первом случае. Через 2 ч контакта фагоцитов с псевдотуберкулезным микробом разного плазмидного профиля тенденция к снижению уровня катионных белков в фагоцитирующих ПЯЛ сохранялась.

Как можно видеть из представленных материалов, процесс фагоцитоза полиморфноядерными лейкоцитами псевдотуберкулезного микроба ведет к прогрессирующему с течением времени снижению уровня неферментных катионных белков. При поглощении псевдотуберкулезного микроба, содержащего плазмиды pYV48 и pVM82, этот процесс протекает более активно, чем в случае поглощения бесплазмидных микробов. Очевидно, что снижение интралейкоцитарного содержания катионных белков, возможно в силу их секреторной дегрануляции, обусловленной присутствием патогена, облегчает способность последнего к паразитированию в макроорганизме. '

S

30 мин 120 мин

Время контакта

Различия в функциональной активности фагоцитов, выявленные при изучении их хемотаксической и адгезивной активности, обусловлены, не только физиологическим своеобразием отдельных макрофагов и ПЯЛ, но и наличием или отсутствием плазмид, в частности pYV48 и pVM82, у возбудителя псевдотуберкулеза. Фагоцитированные иерсинии с плазмидами pVM82 и pYV48 или только с плазмидой pYV48 отличались большей устойчивостью к воздействию макрофагов и полимор-фноядерных лейкоцитов, чем клетки контрольного бесплазмидного штамма. Плазмиды иерсиний повышают их устойчивость к фагоцитозу, подавляют реактивность фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза.

Полученные материалы свидетельствуют о том, что плазмиды псевдотуберкулезного микроба pYV48 и pVM82 оказывают тормозящее влияние на функциональную активность макрофагов и полиморфноя-дерных лейкоцитов, обеспечивая замедление темпов фагоцитоза бактерий.

При изучении окислительной активности макрофагов и ПЯЛ в НСТ-тесте выявлено, что активация кислородзависимого метаболизма при фагоцитозе бесплазмидных клеток У. pseudotuberculosis 53 происходит значительно интенсивнее, чем в случае псевдотуберкулезных микробов, содержащих плазмиды. Фагоцитоз псевдотуберкулезного микроба макрофагами сопровождается активацией Г6ФДГ и НАДФ-Н-оксидазы. причем активность НАДФ-Н-оксидазы оказалась наиболее высокой при фагоцитозе бесплазмидного псевдотуберкулезного микроба. Очевидно, что плазмиды псевдотуберкулезного микроба, в первую очередь плаз-мида вирулентности pYV48, оказывают ингибирующий эффект на активность этого фермента, что приводит к замедлению регенерации в фагоцитах НАДФ.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что наличие у иерсиний плазмид pVM82 и pYV48 повышает их устойчивость к фагоцитозу. Штаммы У. pseudotuberculosis, несущие эти плазмиды, подавляют реактивность фагоцитов, ингибируют "окислительный взрыв", снижают активность супероксиддисмутазы, миелопероксидазы и кислой фосфатазы, а также содержание неферментных катионных белков, и тем самым угнетают их бактерицидную способность.

Очевидно, вклад в реализацию патогенного потенциала псевдотуберкулезного микроба несут гены, локализованные на родоспецифиче-ской резидентной плазмиде вирулентности иерсиний (pCad, Lcr, pYV) молекулярной массой 45-48 мДа. Значительная часть этих генных детерминант прямо или опосредованно связана, в частности, с проявлением антифагоцитарных свойств возбудителя псевдотуберкулеза.

Имеются основания считать, что кластер генов плазмиды pVM82, расположенных на фрагменте 25 мДа, определяет ряд дополнительных факторов патогенности, так как штаммы псевдотуберкулезного микроба, содержащие обе вышеназванные плазмиды, изолируются, как пра-

вило, при эпидемических вспышках со значительным количеством тя желых и осложненных форм заболевания.

Таким образом, дисбаланс бактерицидных процессов, развиваю щихся на уровне фагоцитирующих клеток (макрофагов, ПЯЛ), с угнете нием широкого спектра функций клеток системы мононуклеарных фа гоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов играет важную роль в про явлении патогенных свойств псевдотуберкулезного микроба и в исход» вызываемого им заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Фагоцитоз бесплазмидного и содержащих плазмиды pYV48 ил1 pYV48:pVM82 псевдотуберкулезных микробов макрофагами морсш свинки является незавершенным, что более выражено при поглощена плазмидсодержащих клеток. В полиморфноядерных лейкоцитах фаго цитоз в большинстве случаев носит завершенный характер независимс от плазмидного спектра микроба.

2. Псевдотуберкулезный микроб при взаимодействии с макрофагам! и полиморфноядерными лейкоцитами подавляет активность зависимы) от кислорода бактерицидных систем. Наибольшей способностью на рушать продукцию макрофагами и ПЯЛ кислородозависимых фактороЕ бактерицидное™ обладают штаммы, несущие плазмиды pYV48 i pVM82.

3. Штаммы У. pseudotuberculosis, несущие плазмиды pYV48 pVM82, ингибируют в макрофагах и полиморфноядерных лейкоцита) дисмутацию супероксида в перекись водорода при участии СОД, сни жают активность миелопероксидазы и содержание неферментных ка тионных белков.

4. Показатели НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы и НАДФН-оксидазы при фагоцитозе псевдотуберкулезного мик роба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов у перитонеаль-ных макрофагов выше, чем у альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов.

5. Хемотаксис перитонеальных макрофагов в направлении псевдотуберкулезного микроба, независимо от его плазмидного состава, осу ществляется более активно, чем в случае альвеолярных макрофагов ь полиморфноядерных лейкоцитов. По адгезивной активности в отношении плазмидсодержащих псевдотуберкулезных микробов перитонеаль-ные и альвеолярные макрофаги превосходят полиморфноядерные лейкоциты.

Опубликованные работы по теме диссертации

1. Дубровина В.И., Голубинский Е.П., Борсук Г.И., Балахонов С.В. Щербаков А.И., Капустин Ю.М., Коновалова Ж.А. Влияние плазмид

вирулентности Yersinia pseudotuberculosis на фагоцитоз // Акту ал. вопр. инфекционной патологии. - Барнаул, 1999. - С. 78-79.

2. Дубровина В.И., Голубинский Е.П., Борсук Г.И., Балахонов С.В., Коновалова Ж.А. Особенности фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с разным набором плазмид И Мед. паразитол. -1999. - № 4. - С. 50-53.

3. Коновалова Ж.А. Кислородзависимый метаболизм при фагоцитозе Yersinia pseudotuberculosis с различным набором плазмид II Экология Байкала и Прибайкалья: Тез. докл. Всерос. науч.-пракг. молодежного симпозиума. - Иркутск, 1999. - С. 39-40.

4. Дубровина В.И., Голубинский Е.П., Борсук Г.И., Балахонов С.В., Коновалова Ж.А. Особенности фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба с различным набором плазмид // Пробл. биол. и экологической безопасности. - Оболенск, 2000. - С. 177-178.

5. Коновалова Ж.А., Дубровина В.И. Современные представления об особенностях и механизмах фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis //Scientific J. CCRNID. - 2000. - № 8. - P. 158-163.

6. Голубинский Е.П., Борсук Г.И., Дубровина В.И., Коновалова Ж.А. Бактерицидные механизмы фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis II ВИНИТИ. Закл. отчет по теме НИР. Инв. № 02200005181.

7. Коновалова Ж.А. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы макрофагов морской свинки при фагоцитозе Yersinia pseudotuberculosis II Конф. молодых ученых СО РАМН по проблемам фундаментальной и прикладной медицины. - Новосибирск, 2001. -С. 19.