Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные антитела в изучении антигенного состава BRANHAMELLA CATARRHALIS

На правах рукописи

,3 од

2 1, ,по7 Гончаренко

Анна Владимировна

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ИЗУЧЕНИИ АНТИГЕННОГО СОСТАВА ВЙАЫНАМЕи-А САТАРМНАШ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Научные руководители:

Официальные опоненты:

Ведущая организация -

доктор медицинских наук Л. Н. Падюков, кандидат медицинских наук В. В. Свиридов, доктор биологических наук В. А. Алешкин, кандидат биологических наук А. Н. Мац.

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова.

Защита состоится 20 ноября 1997 г. на заседани! специализированного совета (Д 001.38.01) при НИИ вакцин и сыворото им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 103064, г.Москва, Малы Казенный переулок, д.5а.

Автореферат разослан 20 октября 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин сывороток им И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Branhamella catarrhalis является возбудителем тяжелых инфекций: среднего отита у детей, острой пневмонии, бронхитов, синуситов и коньюкгивитов (Doern G.,1986).

Этот микроорганизм долгое время описывался как нормальный представитель флоры верхнего дыхательного тракта (Feder Н, 1984), что не способствовало его изучению. В настоящее время твердо установлена роль этого микроорганизма как инфекционного агента, вызывающего заболевания не только при иммунодефицитных состояниях, но и у лиц с нормальным иммунным статусом (Bluestone С., 1992).

К настоящему времени в мировой литературе имеется достаточно много публикаций, посвященных исследованию антигенной структуры В. catarrhalis, идентифицированы некоторые ее антигены, в том числе основные белки внешней мембраны, среди которых обнаружены железорегулируемые белки. Вместе с тем, роль большинства антигенов этой бактерии в развитии заболевания, факторы, определяющие её вирулентность и патогенность, остаются малоизученными. Для решения этих вопросов наиболее целесообразно использование методов современной иммунохимии. В частности, для изучения антигенного состава большую ценность имеют препараты антител, способные специфически реагировать со строго определенными антигенными структурами микроорганизма. Наряду с препаратами поликлональных антител применяются и обладают рядом преимуществ моноклональные антитела, отличающиеся высокой специфичностью и полной гомогенностью. В современной иммунологии моноклональные антитела являются необходимым инструментом для изучения свойств антигенов различной природы, идентификации антигенов в составе различных штаммов микроорганизмов и для анализа межштаммовой антигенной вариабельности. Использование моноклональных антител позволяет более эффективно, чем с поликлональными антителами, изучать перекрестные реакции между микроорганизмами. Такого рода исследования позволяют расширить наши представления об общих для различных микроорганизмов молекулярных механизмах осуществления тех или иных функций. В частности, таксономическое сходство В. catarrhalis с другими грам-

отрицательными бактериями (Neisseria), сходство их, как этиопатогенетических факторов, позволили нам применить известные сведения об антигенах этих микробов для исследования свойств антигенов В. catarrhalis.

Отсутствие отечественных работ по В. catarrhalis приводит к тому, что исследователи, в частности, сотрудники диагностических микробиологических лабораторий, не располагают специфическими средствами выявления этого возбудителя и дифференциации его от других родственных микроорганизмов. Это, в свою очередь, не позволяет им оценить реальную частоту заболеваний, вызываемых В. catarrhalis, и патогенетическую значимость тех или иных ее антигенов и, соответственно, разработать меры профилактики и специфической терапии.

Цель исследования: Сравнительное изучение антигенного состава В. catarrhalis из коллекции штаммов НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН. Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ профилей антигенов штаммов В. catarrhalis с применением препаратов поликлональных антител.

2. Получить панель моноклональных антител к различным антигенам В. catarrhalis.

3. Исследовать штаммовую вариабельность антигенов В. catarrhalis с помощью моноклональных антител.

4. Определить функциональные характеристики некоторых антигенов В. catarrhalis, выявляемых моноклональными антителами.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые получена панель моноклональных антител к антигенам В. catarrhalis с молекулярной массой 67 kDa, 41 kDa, 94 kDa, 68 kDa, 15 kDa, 53 kDa, 56 kDa, 40 kDa, 72kDa и 114 kDa.

Впервые проведен сравнительный анализ антигенного состава штаммов В. catarrhalis, выделенных в Московском регионе.

Установлен железозависимый характер экспрессии белков 67 kDa и 114 kDa В. catarrhalis.

Обнаружено антигенное сходство группы железорегупируемых белков и поринов Neisseria meningitidis и В. catarrhalis, поринов Esherihia coli, N. meningitidis и В. catarrhalis, выявляемое моноклональными антителами, позволяющее предположить существование общих консервативных эпитопов этих белков у

микроорганизмов этих родов.

Полученная панель из 23-х моноклональных антител может служить инструментом для дальнейшего изучения антигенного состава штаммов В. catarrhalis.

Положения, выносимые на защиту:

1. Создана панель гибридом-продуцентов антител к антигенам В. catarrhalis с молекулярной массой 67 kDa, 41 kDa, 94 kDa, 68 kDa,15 kDa, 53 kDa, 56 kDa, 40 kDa, 72kDa и 114 kDa.

2. С помощью полученных моноклональных антител охарактеризованы антигены B.catarrhalis из колекции штаммов НИИВС им. Мечникова, исследована их штаммовая гетерогенность. Обнаружены общие эпитопы на антигенах N. meningitidis и Е. coli, имеющих сходную функциональную роль с белками В. catarrhalis.

Структура диссертации. Диссертация изложена на Qb страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего//¿^источников. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 13 рисунками.

Апробация диссертации

Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова (Москва, 1994), 26-й и 27-й конференциях Скандинавского Общества Иммунологов (Гётеборг, Швеция, 1995; Турку, Финляндия, 1996), на 8-м международном конгрессе по бактериологии и прикладной иммунологии (Иерусалим, Израиль, 1996).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова РАМН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа по получению МкАт к В. catarrhalis выполнена в лабаратории иммунохимической диагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.

В работе применяли традиционные методы гибридомной технологии, иммунохимические и электрофоретические методы.

В исследовании использовали микробные клетки 11 штаммов В. catarrhalis.

Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили клетками штамма 36621.

Для определения изотипа МкАт применяли кроличьи антисыворотки против мышиных иммуноглобулинов А, М, G1, G2a, G2b, G3.

В качестве партнера для для гибридизации использовали миеломную клеточную линию P3-X63-Ag8.653. Для культивирования миеломных и гибридных клеток использовали среду RPMM640 с 10% СПК, селективную среду ГАТ и переходную к обычной среду ГТ. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля молекулярной массы 4000 (Serva, Германия).

«Питающим» слоем служили перитонеальные макрофаги и сггпеноциты в концентрации 5x10" клеток на лунку.

Изотип МкАт определяли методом встречной радиальной иммунодиффузии в геле по Ухтерлони (1948).

Культивирование, гибридизацию клеток, клонирование проводили согласно Kennst R.H. et al. (1981).

Очистку МкАт с помощью раствора сульфата аммония, замораживание и размораживание гибридных и миеломных клеток проводили методами, описанными в «Методических рекомендациях по получению гибридом-лродуцектов моноклональных антител к бактериальным антигенам» (Москва, 1986).

В работе были использованы препараты кроличьих антисывороток к штаммам В. catarrhalis 36621, 8193, 321, 494, 36, 120, 513, 1480, 460, 1488, полученных в лаборатории условно патогенных бактерий НИИВС им. И.И. Мечникова.

Выращивание В. catarrhalis производили на питательных средах нескольких типов. Избыток железа в среде культивирования создавался добавлением FeCb, железо-дефицитная среда содержала хелатор DTPA (Sigma).

Комплексные препараты антигенов В. catarrhalis получали методом ультразвукового разрушения.

Концентрация белка в антигенных препаратах определялась методом Лоури (Lowry.1951).

Препараты железозависимых белков, серотипового порина и аутолизатов N. meningitidis любезно предоставлены Т.Н. Филатовой (Gorbacheva В., Filatova Т. 1991).

Электрофорез проводили по методу Laemmli (Laemmli, 1970).

Иммуноферментный анализ проводили в 96-луночных полистироловых планшетах (Nunc, Медполимер) и на нитроцеллюлозе.

Результаты исследования и обсуждение

Первым этапом при изучении антигенного состава штаммов В. catarrtialis был анализ их белковой гетерогенности в реакции иммуноблоттинга с использованием иммунных кроличьих сывороток. Целью данного исследования являлся сравнительный анализ профилей иммунохимически активных белков различных штаммов и выбор штамма, несущего в наибольшем количестве антигены, представленные в других штаммах возбудителя, для последующего использования этого штамма при получении моноклональнх антител.

В соответствии с количеством исследованных штаммов использовали 9 антисывороток. Образцы ультразвуковых лизатов каждого штамма, перенесенные из геля после электрофоретического разделения на нитроцеллюлозную мембрану, были инкубированы с гомологичной антисывороткой и 8-ью гетерологичными сыворотками. После иммунохимического проявления были получены следующие результаты:

1. 8 из 9 исследованных антисывороток прореагировали с 8-ью из 9-ти препаратов гомологичных и гетерологичных штаммов. Антисыворотка к штамму 1488 прореагировала только с антигенным препаратом штамма 1488. Ни одна из гетерологичных сывороток не прореагировала с этим штаммом.

2. На картине иммуноблоттинга наблюдается некоторая гетерогенность профилей иммунохимически активных белков разных штаммов, наиблее выраженная в области от 70 kDa и выше (Рис1). Выявляются белковые полосы 48 kDa и 60 kDa, присутствующие у всех исследованных штаммов (кроме штамма 1488) и антигены, присутствующие у некоторых штаммов (32 kDa, 40kDa, 51 kDa, 79kDa, 95kDa).

3. Белковые полосы, присутствующие только у одного штамма, то-есть штаммоспецифичные антигены, не были обнаружены.

При сравнении результатов проявления гомологичными и гетерологичными сыворотками отмечен следующий факт: антисыворотка к штамму 494 выявляет

Иммуноблоттинг стандартных штаммов и клинических изолятов В.са*а/тЛа//5 с антисыворотками к штаммам 120,1480, 36621, 494.

нммунопроявление антисывороткой к шт. 120

нммунопроявление антисывороткой к шт.1480

^ ^Т* ' -« 94№а

ж*—" ^'—Г—55**

67Ы)а

«""••Ж

пгтаммы: 123456789

. нммунопроявление антисывороткой к шт.36621

т 1 1 1,2 » ' 'А''- ™

штаммы: 123456789

нммунопроявление антисывороткой к шт.494

й ' - 0: -

1 о

а

94кБа

I

-ч 67к1>а

43Ша 1 | 43кБа

тЦ

— ш— —

-я

штаммы: 123456789

штаммы: 123456789

1- шт.36, 2 - шт.1480, 3 - шт. 1488, 4 -шт.460, 5 - шт.513, 6 - шт.494, 7 - шт.321, 8 - шт. 120, 9 -шт.36621 Рис. 1

белковую полосу 79 кОа у гетерологичных по отношению к сыворотке штаммов 36, 1480, 460 и 513 и не выявляет антиген указанной молекулярной массы у гомологичного штамма; антисыворотка к штамму 513 выявляет белковую полосу 95 кОа у гетерологичных по отношению к сыворотке штаммов 460, 494, 321, 36621 и не выявляет антиген 95 кОа у гомологичного штамма. Вероятно, это связано с межштаммовым белковым полиморфизмом, когда функционально и структурно сходные белки имеют несколько отличные молекулярные массы.

Сравнение профилей иммунохимически активных белков разных штаммов позволило сделать вывод о сходном белковом составе штаммов 36621, 321,494, 36, 120,1480, 460, 513.

Наиболее ярко выраженные белковые антигены, выявляемые в иммуноблоттинге с кроличьими гомологичными и гетерологичными антисыворотками приведены в Табл.1.

Табл.1 Антигены В. catarrhalis, выявляемые в иммуноблоттинге

поликлональными антителами

Штаммы В. catarrhalis

Антигены B.catarrhalis М.м, kDa 36 1488 1480 460 513 494 321 120 36621

32 + + + +

40 + + + + + + + +

48 + + + + + + + +

51 + + + + + + +

60 + + + + + + + +

67 + + + + + + + +

79 + + + +

95 + + + +

На основании этих данных для иммунизации мышей с целью получения моноклональных антител был выбран штамм 36621, являющийся стандартом, и по анализу белковой гетерогенности штаммов имеющий в своем составе основные иммунохимически активные белки характерные для большинства штаммов В. catarrhalis.

Штамм 1488, прореагировавший только с собственной антисывороткой обнаружил значительное иммунохимическое отличие от остальных исследованных штаммов. Выраженное антигенное отличие штамма 1488 от остальных

исследованных штаммов В. са1аггЬаНз позволяет предположить, что данный штамм идентифицирован неверно. Возможно, он относится к сходным морфологически, но не иммунохимически микроорганизмам другого вида (рода).

Получение панели моноклональных антител к антигенам В. саГа/гАа/ю.

В результате проведения 6-ти гибридизаций было получено 467 устойчивых к аминоптерину первичных культур. Скрининг культуральных жидкостей на наличие продукции антител к антигенам В. са1аггЬаНз осуществлялся методом ИФА и точечного иммуноблоттинга. Культуральные жидкости 84 гибридом положительно прореагировали в той и/или другой системе скрининга. 23% гибридом-продуцентов антител обнаружили продукцию антител только с помощью метода точечного иммуноблоттинга, в ИФА реакция отсутствовала или была слабо-положительной, отличаясь незначительно от фонового уровня. Такое поведение антител в различных системах скрининга можно объяснить следующими причинами: 1. изменением конформации антигенов при посадке на разные типы носителей, в результате чего могут закрываться эпитопы, узнаваемые антителами; 2. как следствие комплексного характера используемых антигенных препаратов В. catarrhalis, возникающей конкуренцией различных антигенов В. са(агтЬаНв за места связывания с носителем, вследствие чего интенсивность реакции может определяться количеством связавшегося с носителем антигена, узнаваемого антителами, а не интенсивностью антителопродукции исследуемой гибрид омы.

После тестирования культуральных жидкостей методом иммуноблоттинга были отобраны 23 первичные культуры, наиболее активно синтезирующие антитела, обладающие специфичностью к различным, отличающимся по мол. массам антигенам 6. са/аггЛа//5.

По результатам иммуноблоттинга клоны были разбиты на группы по признаку специфичности синтезируемых ими антител к различным по мол. массе антигенам штамма 36621 В. са(аггЬаНз (Табл.2). Внутри каждой группы картины иммуноблоттинга были сходны по мол. массам узнаваемых антителами антигенов и по количеству выявляемых ими белковых полос.

Параллельно со скринингом первичных культур проводилось их клонирование с целью получения стабильных в отношении продукции антител гибридом.

Трехкратно клонировались стабильные гибридомы и до шести раз - гибридомы с неустойчивой продукцией антител. Для 9-ти клонов были определены изотипы антител (Табл. 3).

Табл.2. Специфичность моноклональных антител к антигенам В. са1аггЬаН5, штамм 36621

Антигены М.м, кРа клоны - продуценты антител

67, 40 1С6 4Е1 4в11 1Р5 1А5Р5

94, 68 4А6 2С12

15 2В10 4Р11 Я5В4

53 4Р8 4вЗ 2С4 2А504

56 . ЗйЮ ЗН1 1С9 ЗС5 2Е8 4С12

41 ЗЕ10 1Н1

72 1Н6

Табл. 3 Изотипы моноклональных антител

КЛОН ЗОЮ ЗЕ10 4Р8 166 2В10 Я5В4 4А6 2А504 1Н6

изо-тип |дм |дв1 1дв1 1дв2Ь |дм |дв1 |дм |дм |дв1

Исследование вариабельности антигенов стандартного штамма 36621 В. cataгrhalls, связанной с изменениями условий культивирования.

В процессе подбора условий культивирования В. catarrhalis были использованы несколько вариантов питательных сред. Для стандартизаций условий проводимых экспериментов необходимо было сравнить белковые профили одного и того же штамма, выращенного на различных типах питательных сред. Сравнительный анализ электрофоретических профилей (Рис.2) показал отличие белкового профиля штамма 36621, культивируемого на различных типах питательных сред, и схожесть белковых профилей антигенов возбудителя, выращенного в разных экспериментах на питательной среде того же состава.

Те же бактериальные препараты были исследованы в иммуноблоттинге с панелью МкАт. Три препарата моноклональных антител, 1С6, 4А6, 2В10, обнаружили изменение молекулярных масс узнаваемых ими антигенов в образцах ультразвуковых лизатов бактерий, полученных при разных условиях их культивирования. А именно, антиген, реагирующий с МкАт 1С6 в условиях культивирования бактерии на среде «25 вариант», выявляется в виде двух полос

Электрофореграмма лизатов В. са1аггЬаИз штамм 36621, выращенного на двух различных питательных средах

а - культивирование на среде 199 в - культивирование на среде «25 вариант»

Рис. 2

с мол. массой около 67кОа и полосы 40кйа, тогда как при культивировании на среде 199 - в виде полосы с мол. массой 67кОа; антиген, реагирующий с МкАт 4А6 в условиях культивирования бактерии на среде «25 вариант» выявляется в виде двух полос с мол. массой около 68кЭа и полосы 94кОа, а при культивировании на среде 199 - в виде двух полос с мол. массой около 68кОа; антиген, реагирующий с МкАт 2В10 в условиях культивирования бактерии на среде «25 вариант» выявляется в виде полосы с мол. массой около 15кОа, при культивировании на среде 199 - в виде полосы с мол. массой 65 кйа (Рис.3). В препаратах штамма 36621, выращенного в разных экспериментах на одной и той же питательной среде, изменения мол. масс антигенов, узнаваемых моноклональными антителами, не были обнаружены.

ИммуноблоггиНг моноклональных антител с штаммом 36621, выращенным на различных питательных средах

, в а

а в

94 kD

67 kD

МгсАт 1Стб

43 kbi

!> •■-•-. V-IIVV

^••V'l^v

1 67 kD *»

25 kD«~

Ш

>-'-3 - ■ ^

МкАт 4A6 МкАт 2B10

a - культивирование на среде 109 в - культивирование на средо «25 Вариант» Рис. 3

Таким образом:

1. Валковый профиль, следовательно, и белковый состав В. catarrhalis зависит от условий культивировании бактерии.

2. Бактериальные Препараты, полученные при культивировании В, catarrhalis на одной и той же питательной среде в разных экспериментах имеют сходный белковый состав и могут использоваться для сравнительных экспериментов.

Резонно предположить, что белковый профиль В. catarrhalis, культивируемой :п vitro, может значительно отличаться or белкового сосгава бактерий размножающихся в челойочэском организме, что необходимо учитывать при создании диагностикумов и разработке вакцинных препаратов.

Исследование вариабельности белковых антигенов, выявляемых монокпональными антителами у различных штаммов В. са(аггЬаЧз.

Исследование вариабельности белковых антигенов, выявляемых панелью моноклональных антител, проводилось в иммуноблоттинге.

Результаты иммунопроявления представлены на Рис.4

Было обнаружено что все препараты МкАт прореагировали со всеми исследованными штаммами. Моноклональные антитела, разбитые на группы по признаку распознования у штамма 36621 одного и того же белка, дали идентичные картины иммунопроявления и с другими штаммами. Это может быть следствием направленности всех антител одной группы к одному и тому же консервативному эпитопу распознаваемого белка и/или консервативности нескольких узнаваемых группой МкАт эпитопов одного белка.

Некоторые из белков, выявляемых МкАт, обнаружили небольшую степень вариабельности по мол. массе. Антиген 67к0а, узнаваемый моноклональным антителом Ю6 у штаммов 460, 494, 321, 120, антигены 94кОа и 68кОа, реагирующие с МкАт 4А6, и антиген 72кОа у штаммов 513 и 120 выявляются в виде 2-х полос близкой мол. массы, что, возможно, является следствием различной биохимической модификации белка (например, разной степенью гликозилирования или фосфорилирования). Кроме антигена 67к0а МкАт 1С6 выявляют антиген 40кЭа у штаммов 36621, 460; МкАт 4А6 выявляют антигены 94кОа и 68кОа у всех исследованных штаммов и дополнительно к ним антиген 44кЭа у штаммов 321 и 120; МкАт 1Н6, выявляющие антиген 72к0а у всех исследованных штаммов, у штамма 36 дополнительно реагируют с антигенами 48кйа, ЗЭкОа, 34к0а. Эти полосы могут соответствовать; а) белку структурно отличному от основного, выявляемого у всех штаммов антигена, имеющего конформационно общий с ним эпитоп, узнаваемый МкАт; б) продуктом деградации основного, более тяжелого белка, выявляемого МкАт у всех штаммов; в) 94кОа и 68кОа белки, реагирующие с МкАт 4А6, могут являтся мономерными единицами гетеродимерного белка, мономеры которого имеют общий эпитоп, узнаваемый МкАт. Препарат МкАт ЗЕ10 у 7 штаммов выявил антиген 41 кОа, у штамма 1480 - 42,5 кРа, у штамма 8193 - 42кЭа. Выявленная вариабельность мол. масс вероятно является следствием штаммового белкового полиморфизма. Нижеописанные эксперименты указывают на

то, что данный антиген относится к поринам, штаммовая вариабельность мол. масс которых описана в литературе (Филатова Т., 19891).

Иммуноблоттинг моноклонапьных антител с штаммами В. catarrhalis.

.--¡К-

1 2 5 4 5 « 7 » »

67 кО

43 №

67Ю

43кИ

штаммы: 1

МкАтЗШО

МкАт4Г8

94Ш 67Ш ».

штаммы: ,1254547,,

• МкАтШб

Чос>

. : ■ •

— • ■ ■ :Л л-Т

• :■

-■ ■*•■' -■ . . '.л:,-. .; -л

1 3 < 5 4 1 I 1 .1

94 кИ — 67 ко

43 кО»-

. . ' л • ■' ■ ■.-..

(г ' • •

штаммы:

1

94 С'...

Ь-:

61 Ы) Г V V —~

К;,. ; -.. / (■■■ : • . '..... . .

3* * 5 6 7 8 9

мклтгсб

МкАтЗЕЮ

МкАт4Л6

1 - шт. 36,2 - шт. 1480, 3 - шт. 8193,2 - шт. 1480, 4 - шт. 460, 5 - шт. 513, 6 - шт. 494, 7 - шт. 321, 8 - шт. 120,9 - шт. 36621.

штаммы:

1 2

Рис. 4

Препарат МкАт 4F8, реагирующий с антигеном 53 kDa, обнаружил гетерогенность в интенсивности окрашивания полос, соответствующих данному антигену: от ярких полос у штаммов 36 и 36621 до слабовыраженных у штаммов 8193 и 513, при том, что суммарное количество белка, вносенного в каждую лунку при электрофорезе было одинаковым. Возможно, это связано: а) с разной степенью экспрессии этого белка для разных штаммов; б) с разной аффиностью МкАт 4F8 к эпитопам антигена 53kDa у разных штаммов, являющейся следствием некоторой вариабельности структуры антигена.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о некоторой вариабельности структуры белков, узнаваемых моноклональными антителами ЗЕ10, 3D 10, 1G6, и о консервативности эпитопов, распознаваемых моноклональными антителами ЗЕ10, 3D10,1G6, 1Н6, 4А6.

Сопоставляя полученные нами данные с работами Murphy и соавт. (1988), выделивших основные ОМР В. catarrhalis и определивших их мол. массы, можно предположить, что, по меньшей мере, два узнаваемых МкАт антигена, являются ОМР. Это относится к антигену с мол. массой 67kDa, узнаваемому МкАт 1G6 и соответствующему ОМР C/D, и антигену с мол. массой 41 kDa, узнаваемому МкАт ЗЕ10 и соответствующему ОМР F. Относительно ОМР C/D было показано, что он обладает высокой степенью консервативности, за исключением трех регионов с минорными изменениями, предположительно экспонированными на поверхностности бактерии. Эти данные полностью согласуются с нашими результатами об отсутствии штаммовой гетерогенности мол. масс этого белка.

Агглютинация бактериальных клеток моноклональными антителами.

У большинства штаммов В. catarrhalis наблюдалась спонтанная агглютинация бактериальных клеток в ростовой среде и в фосфатно-солевом буфере, которая уменьшалась при добавлении 0.5% Tween-20.

Было обнаружено, что у штамма 8193 в присутствии 0.5% Tween-20 спонтанная агглютинация отсутствует и этот штамм был выбран для выявления агглютинирующей способности МкАт.

При использованных условиях постановки реакции из всех исследованных два

МкАт - ЗЕ10 и 3D10 агглютинировали бактериальные клетки В. catarrhalis штамма 8193. Агглютинация, вызванная моноклонапьными антителами, указывает на поверхностную локализацию на бактериальной клетке распознаваемых ими структур и их белковую природу. Было показано (К. Ahmed., et al., 1991), что капсула В. catarrhalis имеет полисахаридную природу, а поскольку при обработке антигенных препаратов В. catarrhalis протеиназой К исчезала реакция с моноклональными антителами, можно заключить, что антигены, распознаваемые МкАт ЗЕ10 и 3D10, являются белками с мол. массами 41 kDa и 56kDa, ориентированными во внешней мембране бактерии таким образом, что их эпитопы доступны для антител.

Перекрестные реакции МкАт к В. catarrhalis с антигенами N.meningitidis.

Несмотря на активное изучение белков внешней мембраны В. catarrhalis, функциональное значение большинства ОМР остается неизвестным. Имея в своем распоряжении панель моноклональных антител к различным, функционально и структурно неохарактеризованым антигенам В. catarrhalis, мы решили провести сравнительный анализ антигенов В. catarrhalis, выявляемых моноклональными антителами, с изученными белковыми антигенами другого микроорганизма, таксономически близкого к В. catarrhalis. Мы предположили, что общие антигены, выявляемые моноклональными антителами, могут иметь не только иммунохимическое, но и функциональное сходство. Для сравнительного анализа был выбран менингококк, так как он таксономически наиболее близок к В. catarrhalis, и его внешнемембранные белки изучены более подробно, чем соответствующие белки В. catarrhalis.

В качестве антигенных препаратов были использованы ультразвуковой дезинтеграт В. catarrhalis, аутолизаты N.meningitidis, полученные при культивировании менингококка в условиях дефицита и избытка железа, и очищенные белковые препараты, полученные из этих аутолизатов N.meningitidis: белок 40kDa (порин) и железорегулируемый белок (ЖРБ) с мол. массой 70kDa в одном препарате и белок 40kDa.

Первичный анализ показал, что две группы моноклональных антител реагируют со всеми использованными препаратами N. meningitidis. В следущей серии экспериментов было обнаружено, что МкАт 1G6 выявляют белок с мол. массой 40kDa у всех использованных антигенных препаратов В. catarrhalis и

N.meningitidis, 67kDa - только у В. catarrhalis и белки с мол. массой 50, 55kDa ) препаратов N.meningitidis, выращенной в условиях дефицита железа в среде культивирования (Рис.5).

Иммуноблоттинг с МкАт ЗЕ10 выявил белковую полосу 41kDa у антигенногс препарата В. catarrhalis и 40kDa у всех используемых антигенных препаратоЕ N. meningitidis и полосы, соответствующие белкам с мол. массами 50 и 70kDa > препарата аутолизата менингококка, культивируемого в условиях дефицита железг в питательной среде (Рис.5).

Иммуноблоттинг моноклональных антител с клеточными лизатами В. catarrhalis, E.coli и препаратами N.meningitidis

67kDa

43kDa _

а б В Г .

— МкАт ЗЕ10 ":

а - препарат N.meningitidis, обогащенный порином 40kDa б - препарат N.meningitidis, обогащенный порином 40kDa и белком 70kDa в - лизат В. catarrhalis г - лизат E.coli

Рис.5

а б г в МкАт1G6

Белок с мол. массой 40kDa N.meningitidis описан как порин, образующи трансмембранные каналы и регулирующий поступление ионов в бактериальну!

клетку (Clark V., et al.,1987). Белки с мол. массами 50, 55 и 70kDa, выявленные МкАт только в препарате аутолизата менингококка, культивируемого в условиях дефицита железа в среде, соответствуют железорегулируемым белкам N. meningitidis с пока еще неизвестной функцией (Genco С., et al., 1996). Железорегулируемые белки 50 и 55 kDa N. meningitidis, были обнаружены нами в составе препарата ЖРБ 70kDa только с помощью МкАт. Видимо, физико-химические свойства этих белков и белка 70kDa сходны и они входят в общую с белком 70kDa фракцию при выделении его использованным методом.На основании этих данных было высказано предположение, что, поскольку МкАт к белкам 40kDa и 41 kDa В. catarrhalis перекрестно реагируют с менингококковым порином сходной мол. массы, вышеуказанные белки В. catarrhalis также являются поринами.

Black et. al., (1984). сравнивая аминокислотный состав и аминокислотную последовательность поринов гоноккоков с аминокислотным составом некоторых поринов из E.coli, обнаружили высокую степень гомологии с поринами ОМрС и ОМрА. В связи с этим, мы предположили, что, поскольку белки 40kDa и 41 kDa B.catarrhalis являются поринами, то, возможно, МкАт ЗЕ10, узнающие эти белки и порин менингококка, будут реагировать с аналогичным белком кишечной палочки.

Было обнаружено, что препарат МкАт ЗЕ10, узнающий белок 41 kDa В. catarrhalis и порин 40 kDa менингококка, реагирует с белком мол. массы 40kDa E.coli штамма К59. Препарат МкАт 1G6, узнающий белок 67kDa В. catarrhalis и порин менингококка, с ультразвуковым дезинтегрзтом E.coli штамма К59 не прореагировал (Рис.5).

Мы предположили, что 1) возможно, порин E.coli не имеет общего для поринов В. catarrhalis и менингококка эпитопа, узнаваемого МкАт 1G6 или 2) белок 41 kDa В. catarrhalis, узнаваемый МкАт ЗЕ10, и белок 40 kDa, узнаваемый МкАт 1G6 являются различными белками с близкими мол. массами. В пользу второго предположения говорит исследование вариабельности белков в зависимости от условий культивирования, где белок 40 kDa В. catarrhalis, узнаваемый МкАт 1G6, в отличие от белка 41 kDa, узнаваемого МкАт ЗЕ10, обнаруживался в иммуноблоттинге при культивировании на пительной среде «25 вариант» и не обнаруживался при культивировании на синтетической питательной среде.

Характерной особенностью структуры серотиповых поринов нейссерий

является то, что, в отличие от других бактериальных поринов, они частично экспонированы на поверхности наружной мембраны (Frasch С., 1979). На поверхностную локализацию белка 41kDa В. catarrhalis указывает вышеописанная агглютинация клеток В. catarrhalis моноклональными антителами ЗЕ10.

Относительно серотипового менингококкового порина В2 известно, что трипсин отщепляет от него низкомолекулярный фрагмент с мол. массой 4kDa (Frasch С., 1979). Предполагая некоторое структурное сходство порина 40kDa менингококка и белка 41kDa В. catarrhalis, мы решили сравнить чувствительность этих белков к действию протеолитических ферментов. В эксперименте были использованы препараты серотипового порина менингококка и ультразвуковой лизат В. catarrhalis обработанные трипсином. Было обнаружено, что: а) препараты серотипового порина менингококка и ультразвукового лизата В. catarrhalis, обработанные трипсином, в реакции точечного иммуноблоттинга сохранили свою активность; б) препараты серотипового порина менингококка и ультразвукового лизата В.catarrhalis, подвергнутые электрофоретическому разделению, электропереносу на нитроцеллюлозу и затем обработанные трипсином с МкАт не реагировали; в) препараты серотипового порина менингококка и ультразвуковой лизат В. catarrhalis, обработанные трипсином и затем подвергнутые электрофоретическому разделению и электропереносу на нитроцеллюлозу, прореагировали с МкАт, но в реакции участвовали низкомолекулярные фрагменты с мол. массой от 6kDa. Мы пришли к выводу, что серотиповой порин менингококка и белок 41 kDa В. catarrhalis чувствительны к действию трипсина. Эпитоп, узнаваемый МкАт ЗЕ10 трипсиноустойчив и выявляется в низкомолекулярных продуктах протеолиза обоих белков. Обнаруженное нами антигенное сходство белка 41 kDa с поринами N. meningitidis и Е. coli и локализация белка 41 kDa на поверхности бактериальной клетки позволяют предположить, что белок 41 kDa относится к поринам.

Ранее сообщалось о том, что ЖРБ 70kDa является общим белком для различных менингококковых и гонококковых штаммов (Genco С., Desai Р.,1996), хотя, в зависимости от природы штамма, для него отмечена вариабельность как в количественной экспрессии, так и в величине мол. массы. Можно предположить, что структура предположительно железорегулируемых белков В. catarrhalis должна быть

близка к структуре соответствующих белков, экспрессируемых N.meningitidis, и эти ЖРБ имеют по меньшей мере один общий консервативный поверхностный эпитоп для указанных микроорганизмов.

Для выявления экспрессии ЖРБ В. catarrhalis штамм 36621 этого микроорганизма был выращен на трех вариантах питательной среды, отличающихся по содержанию ионов Fe1*. Иммуноблоттинг МкАт ЗЕ10 и 1G6 с подвергнутыми электрофоретическому разделению ультразвуковыми дезинтегратами дал следущие результаты:

1. МкАт ЗЕ10 реагируют с белком 41kDa во всех препаратах ультразвуковых дезинтегратов В. catarrhalis, выращенной при различном содержании железа в среде культивирования.

2. МкАт 1G6 выявляют белковую полосу 67kDa только в образцах ультразвуковых дезинтегратов В. catarrhalis, выращенной в среде не обогащенной железом и в условиях дефицита железа, вызванного внесением хелатора в среду в культивирования. При этом интенсивность полосы, соответствующей белку 67kDa, выражена значительно сильнее в образцах ультразвуковых дезинтегратов В. catarrhalis, полученных в условиях дефицита железа в среде культивирования.

3. МкАт 1G6 обнаружили белковую полосу 114kDa в образцах ультразвуковых дезинтегратов В. catarrhalis, выращенной в среде с дефицитом железа. В остальных элеюрофоретических образцах ультразвуковых дезинтегратов В. catarrhalis полоса 114 kDa не обнаружена ( Рис.6). Полученные результаты позволяют предположить, что экспрессия белков 67kDa и 114 kDa зависит от концентрации железа в среде культивирования. Это предположение в отношении белка 114kDa согласуется с работой Campagnari et. al., в которой при сравнении элеюрофоретических образцов В. catarrhalis, полученных в условиях различного содержания железа в среде культивирования, был обнаружен белок 115kDa, экспрессия которого зависела от присутствия железа в среде культивирования. Однако возможно, что отсутствие белков 67kDa и 114 kDa в наших препаратах В. catarrhalis, культивируемой в условиях избытка железа, связано не с репрессией синтеза этих белков, а с некоторым иммунохимическим отличием в структуре комплементарного антителам 1G6 эпитопа, обусловленным особенностями их биосинтеза в данных условиях.

Иммуноблотгинг лизатов В. catarrhalis, выращенной при различном содержании железа в среде культивирования и препаратов N.meningitidis

67kDa »- _ __ —•

43kDa _

МкАт ЗЕ10

МкАт1G6

а - препарат N.meningitidis, обогащенный белком 70 kDa

б - лизат В. catarrhalis, выращенной в условиях избытка железа в среде культивирования

в - лизат В. catarrhalis, выращенной в условиях дефицита железа в среде культивирования

г - лизат В. catarrhalis, выращенной в немодифицированной среде культивирования

Рис.6

Для подтверждения репрессии синтеза белков 114 kDa и 67kDa при условиях культивирования в среде обогащенной железом были проведен сравнительный анализ электрофоретических профилей ультразвуковых дезинтегратов В. catarrhalis, выращенной в условиях различного содержания железа в среде культивирования. Сравнение электрофореграмм полученных препаратов 8. catarrhalis обнаружило различие в белковом составе исследуемых препаратов

(Рис.7). В области 67кРа у препарата В. са/аггЛа//5, культивируемой в условиях дефицита железа и в обычных условиях, обнаруживается белковая полоса, отсутствующая у препаратов В. са1агг11аНз, выращенных в условиях избытка железа в среде культивирования. Следовательно, экспрессия белка 67кОа зависит от концентрации железа в среде культивирования.

Электрофореграмма лизатов В. са1аггЬаЧ5, выращенной при различном содержании железа в среде культивирования и препаратов Ы.тептдШШз

а • б в г ■

а - препарат N.meningitidis, обогащенный белком 70 kDa

б - лизат В. catarrhalis, выращенной в условиях избытка железа в среде культивирования

в - лизат В. catarrhalis, выращенной в условиях дефицита железа в среде культивирования

г - лизат В. catarrhalis, выращенной в немодифицированной среде культивирования

Рис.7

ЖРБ и порины объединяет мембранная локализация и общая функция транспорта внутрь клетки воды и некоторых ионов, в том числе ионов железа. Мы

можем предположить, что трансмембранное заякоривание белка и функци? транспорта ионов внутрь клетки требует от белка наличия определенных, возможнс консервативных структур, которые в данной ситуации проявляют себя как общие эпитопы этих белков.

ВЫВОДЫ

1. С помощью полученной панели из 23 различных моноклональных антите; выявляются антигены Branhamella catarrhalis с молекулярными массами 67 kDa, 41 kDa, 94 kDa, 68 kDa, 15 kDa, 53 kDa, 56 kDa, 40 kDa, 72kDa и 114 kDa. При этом бели 67, 40, 114kDa, как и белки 94 и 68kDa имеют общие эпитопы, распознаваемыб соответствующими группами моноклональных антител.

2. Антигены 67kDa, 41 kDa, 72kDa, 56kDa, 94kDa и 68kDa, 53kDa, узнаваемые моноклональными антителами 1GB',3E10, 1H6, 3D10, 4A6, 4F8, выявляются у все; исследованных штаммов и обладает штаммовой вариабельностью.

3. Антигены, выявляемые мрноклональными антителами 1G6 (67 и

40 kDa), 2В10 (15 и 65 kDa), 4А6 (68, 94 и 44 kDa), отличаются вариабельность« молекулярных масс, зависящей от состава среды и условий культивирована микроорганизма.

4. Выявляемый моноклональными антителами ЗЕ10 эпитоп антигена 41kDc является общим для поринов 40kDa N. meningitidis и Е. coli и железорегулируемы: белков 70kDa и 50kDa N. meningitidis. Выявляемый моноклонапьным антителом 1 G( эпитоп антигена 67kDa является общим для поринов 40kDa N. meningitidis i железорегулируемых белков 55kDa и 50kDa N. meningitidis.

5. Экспрессия белков 67 kDa и 114 kDa В. catarrhalis регулируете; содержанием железа в среде культивирования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Моноклональные антитела к антигенам Branhamella catarrhalis реагируют с серотиповым порином и железорегулируемым белком N.meningitidis] Гончаренко А.В., Филатова Т.Н., Батуро А.П., Падюков Л.Н., ЖМЭИ, 1998, N1.

2. Possible cross reaction between Bordetella pertussis and Branhamella catarrhalis, detected with the use of monoclonal antibodies; Goncharenko A., Padyukov L., Abstracts of SSI 26th Meeting, Scand. J. Immunol., v.42, p.619, 1995.

3. Detection of heterogeneity of Branhamella catarrhalis antigenes with use of monoclonal antibodies; Goncharenko A., Zhilina I., Baturo A., Katosova L., Padyukov L., Abstracts of SSI 27th Meeting, Scand. J. Immunol., v.43, p.710, 1996.

4. Variability of the antigenic composition of Branhamella catarrhalis strains; Goncharenko A., Zhilina I., Baturo A., Katosova L., Padyukov L., Abstracts of of 8th International congress of bacteriology and applied microbiology, Jerusalem, p. 163, 1996.