Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение иммунохимических свойств антигенов bordetella pertussis как компонентов бесклеточной вакцины с помощью моноклональных антител

г-—

S На правах рукописи

Буркин Максим Алексеевич

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНТИГЕНОВ BORDETELLA PERTUSSIS КАК КОМПОНЕНТОВ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

14.00.36.- аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена в научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Научный руководитель: - кандидат медицинских наук

В. В. Свиридов

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

В. И. Кувакина - кандидат медицинских наук А. Н. Мац

Ведущая организация - Государственный научно-

исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л. А. Тарасовича

Защита диссертации состоится 16 октября 1997 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01. при НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Российской Академии медицинских наук по адресу: 103064, г. Москва. Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан 16 сентября 1997 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Н. Г. Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

В последние десятилетия в литературе описано достаточно много данных о побочных реакциях, вызванных применением корпускулярной коклюшной вакцины (Ross Е. М., 1988). В связи с этим для снижения её реактогенности был поставлен вопрос о создании бесклеточного препарата, максимально освобожденного от биологически активного материала бактериальной клетки, вызывающего нежелательные проявления.

В последнее время работа по усовершенствованию бесклеточных коклюшных вакцин ведется в русле поиска и получения антигенов, обладающих наибольшей протективной активностью, но лишенных токсических свойств. Мнения о защитных свойствах антигенов В. pertussis различаются, однако, принято считать, что основными протективными антигенами являются коклюшный токсин (Sato Y., 1974), филаментозный гемагглютинин (Kimura А., 1990), агглютиногены 2 и 3 (Robinson А., 1988) и белок 69 кДа (Novotny Р., 1990).

Так, разработанные и прошедшие клинические испытания бесклеточные коклюшные вакцины (например, "Takeda", введенная в Японии с 1981 г., включающая в свой состав ФГА, KT и Агг 2 в соотношении 90:10:1, вакцина "CAMR" - ФГА:КТ:Агг 2+3 (1:1:1), "Biken", "Merieeux" и "Connaught" - ФГА и KT (1:1, 1:1 и 1:6) и однокомпонентные, включающие детоксицированный KT, ("Sekura" и "Biken")), а также лицензированные в 1996 г. КДС-вакцины "Tripedia" (KT : ФГА -1:1) и "Acel-Imune" (ФГА:КТ:Р69:Агг2 -11:4:2:1) проявили достаточную защитную эффективность и оказались менее реакгогенными по сравнению с цельноклеточной вакциной (Robinson А„ 1988).

Для изучения протективных свойств антигенов В. pertussis и их детерминант особо перспективным представляется использование моноклональных антител (МкАт). Так, в программе ВОЗ (Женева, 1983) по разработке новых вакцин один из пунктов включает определение антигенных детерминант, ответственных за формирование реакций иммунитета, а для выявления этих детерминант рекомендуется разрабатывать иммунохимические тесты прежде всего на основе использования МкАт.

В работе по повышению качества коклюшного компонента в АКДС-вакцине целый ряд проблем связан с его стандартизацией. Результаты многолетних исследований, проводимых в нашей стране и за рубежом, свидетельствуют о недостаточной стандартности используемых лабораторных методов оценки качества коклюшного компонента, обусловленной вариабельностью качества животных, взятых в опыт в разное время года, использованием тест-штаммов, питательных сред и другими факторами. Поэтому актуальной на настоящий момент остается проблема разработки и стандартизации методов доклинической оценки качества коклюшной вакцины (остаточной токсичности, антигенной чистоты, сохранности, качественной и количественной оценки протеюгивных эпитопов). Цель исследования.

Изучение иммунохимических свойств и оценка качественных и количественных характеристик антигенных субстанций коклюшного микроба в бес клеточных вакцинных препаратах на основе использования моноклональных антител. Задачи исследооания:

1. Отобрать из имеющихся гибридных клонов продуценты антител к основным антигенам В. pertussis.

2. Пополнить коллекцию имеющихся гибридов вновь полученными гибридными клонами, синтезирующими МкАт с требуемой тонкой специфичностью.

3. Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства МкАт.

4. Оценить пригодность полученных МкАт для создания методов качественной и количественной характеристики антигенных структур Bordetella pertussis в бесклеточных вакцинных препаратах.

Научная новизна.

1. Создана панель гибридом, синтезирующих МкАт к основным антигенам В. pertussis (KT, ФГА, ЛПС и белкам наружной мембраны с молекулярной массой 92 кДа, 69 кДа и 65 кДа).

2. Предполагается участие S1 субъединицы в связывании KT с рецептором, на что указывает нейтрализация гемагглютинирующего действия коклюшного токсина МкАт 1D5A3 к S1 KT.

3. Впервые обнаружена нейтрализующая активность МкАт G3G9 к S5 субъединице коклюшного токсина в СНО-тесте.

4. С помощью МкАт B2G7 частично охарактеризован 65-кДа антиген. Выяснено, что данный антиген является поверхностным мономерным белком вирулентных, так и авирулентных бактерий, выявляется в иммуноблоттинге УЗ-дезин-теграта В. pertussis и в среде культивирования бактерий штаммов 305 и 475.

Теоретическая и практическая значимость.

Моноклонапьные антитела, полученные к 6 различным антигенным структурам Bordetella pertussis и разработанные на их основе системы анализов, позволяющие количественно определять KT и ЛПС и выявлять ФГА и 92, 69 и 65-кДа ОМР, могут служить инструментом для изучения структурно-функциональных характеристик антигенов возбудителя коклюша. В данной работе МкАт использовались для выявления соответствующих антигенов в вакцинных препаратах на разных этапах их приготовления: до детоксикации, после детоксикации, а также в сорбированных на гидроксиде алюминия препаратах на предмет прочности связывания материала с носителем. Кроме того, подобные методы могут найти свое применение для контроля за процессом культивирования микроорганизма, выяснения влияния различных ростовых сред и добавок на накопление антигенных компонентов и их состав, а также для диагностических целей. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создана панель гибридом, синтезирующих МкАт к основным антигенам В. pertussis (KT, ФГА, ЛПС и белкам наружной мембраны (ОМР) с молекулярной массой 92 кДа, 69 кДа и 65 кДа).

2. Разработаны варианты ИФА, позволяющие в недетоксицированных вакцинных препаратах количественно определять KT с чувствительностью 0,2 нг/мл, (что превосходит показатели описанных аналогичных систем), ЛПС с чувствительностью 10 нг/мл и выявлять ФГА и 92, 69 и 65-кДа ОМР в иммуноблоттинге. ИФА-вариант, использующий полимиксин, позволяет измерять содержание ЛПС в детоксицированных препаратах.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва, 1994); на международном

симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И. И. Мечникоза (Уфа, 1995) на заседании секции микробиологии и прикладной эпидемиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова. (Москва, 1997).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН. Структура диссертации.

Диссертация изложена на 1QO страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 8 отечественных и 186 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штвтлш, и мет&ы.

Все исследования проведены в лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова.

В работе использовали: антигены КТ, ЛПС, коклюшный анатоксин (КАТ), адсорбированный на гидроксиде алюминия, штаммы В. pertussis 475 (1.2.3.) и 305 (1.2.0), 338 (wild), 347 (Vir"), 348 (Hly ,Ас"), 349 (Hly), 353 (FHA"), 357 (PT ), предоставленные В. Д. Смирновым (НПО "Иммунопрепарат", Уфа); бесклеточную коклюшно-столбнячно-дифтерийную вакцину "Acel-lmune" (Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company, USA) и препарат антигенного комплекса ("н/о ТХУ"), полученный из среды культивирования В. pertussis шт. 475 кислотным осаиедением в лаборатории иммуномодуляторов НИИВС им. И. И. Мечникова, РАМН.

Работа проводилась при использовании методов гибридомной технологии, иммунохимическими и биохимическими методами.

Для получения МкАт использовали BALB/c мышей, а антисыворотку к КТ получали от кроликов, массой 2,5-3 кг. Иммунизацию проводили КАТ, КТ, ультразвуковым дезинтегратом В. pertussis, приготовленным из микробной массы шт. 475, и вакциной "AceWmuno".

Все процедуры по получению гибридных культур, клонированию, культивированию и хранению выполнялись в соответствии с "Методическими

рекомендациями по получению гибридом-продуцентов МкАт к бактериальным антигенам" (Москва, 1986).

Для исследования свойств МкАт использовали препараты, полученные из среды культивирования шбридом осаждением сульфатом аммония при 50% насыщении.

Изотип МкАт определяли методом встречной радиальной иммунодиффузии в геле по Оухтерлони.

Специфичность секретируемых МкАт определяли в твердофазном иммуноферментном анализе. ИФА проводили в соответствии с общепринятыми принципами на полистироловых разборных 96-луночных планшетах (Dynatech, ФРГ). В качестве твердофазных антигенов использовали KT, ЛПС, УЗ дезинтеграт, "н/о ТХУ" или микробные клетки различных штаммов. Для проявления реакции использовали о-фенилендиамин (0.4 мг/мл). Регистрацию реакции проводили на фотометре Dynatech MR 5000 при длине волны 492 нм.

Для уточнения специфичности МкАт проводили иммуноблоттинг. Антигенный материал (KT, ЛПС, УЗ-дезинтеграт или "н/о ТХУ") подвергали электрофорезу по Laemmli в 10-15% полиакриламидном геле, содержащем 0,1 % ДСН в камере для электрофореза (Hoefer, США) при 50-150 мА. Поело электрофореза образцы переносили на нитроцелпюлозную мембрану (0,2 мкм, Bio-Rad, США) и инкубировали с соответствующим МкАт или антисывороткой. В качестве хромогена использовали 4-хлорнафтол.

Эффекгорные свойства МкАт изучали в реакции агглютинации микробных клеток. Анализ проводили в V-образных 96-луночных планшетах (Greinor). Серийные разведения МкАт, приготовленные в 50 мкл, инкубировали с равным объемом суспензии микробных клеток В. pertussis шт. 475 (А еоо = 0,5).

РТГА использовали для характеристики эффекгорных свойств МкАт к KT и ФГА. Реакцию проводили в V-образных планшетах (Greiner). В качестве геммагглютинирующих агентов использовали KT, УЗ дезинтеграт В. pertussis и "н/о ТХУ". В лунках планшета готовили серийные разведения МкАт в 50 мкл и инкубировали с равными объемами 1 %-ной суспензии эритроцитов человека и препаратов в дозе эквивалентной 4 гемагглютинирующим единицам (ГАЕ). При этом 1 ГАЕ для KT и "н/о ТХУ" составила 1,5 и 2,4 мкг/мл соответственно.

Реакцию нейтрализации цитопатогенного действия KT на культуре клеток СНО использовали для выяснения нейтрализующей способности МкАт к KT, а также для определения содержания KT в неизвестных образцах. Реакцию проводили в соответствии с описанным ранее (Gillenius Р., et al., 1985). Анализ проводили в культуральных планшетах (Falcon). Для разведения реагентов Использовали RPMI-1640, содержащую 10% сыворотки плодов коровы (СПК). МкАт преинкубировали с KT, взятым в дозе, эквивалентной 4 ЦПЕ и затем в лунки вносили по 10* клеток СНО. Учет реакции осуществляли через 24-48 часов. Отсутствие кпастеробразования в лунках, в которые вносили МкАт, свидетельствовало о способности антител нейтрализовать действие токсина.

Для выделения антител было синтезировано несколько иммуносорбентов:

1. Иммуноглобулин G мыши выделяли из мышиной сыворотки на коммерческой протеин А - сефарозе CL-6B (Pharmacia) и присоединяли перйодатным

. методом к сефарозе 4В (Pharmacia) в соответствии с процедурой, описанной ранее (Аффинная хроматография, 1988).

2. Кроличьи антитела против мышиного IgG выделяли из антисыворотки, присоединяли к окисленной перйодатным методом сефарозе 4В.

3. УЗ дезинтеграт В. pertussis шт. 475 присоединяли BrCN-сефарозе 4В согласно методу, описанному ранее (Аффинная хроматография, 1988).

Для выделения МкАт препараты, подлежащие очистке, разводили ФСБ, наносили на колонку и промывали ФСБ до фоновых значений оптической плотности при А.=280 нм под контролем Увикорда S II (LKB). Элюирование осуществляли 0.025М лимонной кислотой, содержащей 0,13 М NaCI (pH 2,0). Содержание и активность антител в полученных фракциях анализировали в ИФА.

1. Для выделения IgG из сыворотки мыши использовали протеин А - софа розу CL-6B.

2. Выделение антител из кроличьей антисыворотки к мышиному IgG проводили на сефарозе 4В с иммобилизованным мышиным IgG.

3. Очистку МкАт из асцитных жидкостей осуществляли, используя сефарозу 4В с иммобилизованным на ней УЗ дезинтегратом В.р.

4. Для выделения МкАт из среды культивирования гибридом использовали колонку с кроличьими антителами к мышиному IgG.

Пероксидазные коныогаты антител готовили на основе аффинно выделенных антител. Синтез проводили перйодатным методом в соответствии с условиями, описанными ранее (Huru А. L. et al„ 1980). С помощью данной процедуры получали конъюгаты кроличьих антител к мышиному !gG (АМ-ПХ), ослиных антител к кроличьему IgG (АК-ПХ) и анти- ЛПС МкАт 1G12 (1G12-TIX).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящая работа, посвященная характеристике антигенов Bordetella pertussis, как потенциальных компонентов бесклеточных коклюшных вакцин с помощью МкАт, состояла из ряда этапов: получения МкАт; изучения их свойств; разработки методов качественного и количественного определения антигенов; и оценки пригодности этих методов для стандартизации бесклеточных вакцинных препаратов.

Нами была получена панель МкАт к KT. В таблице 1 представлены 3 МкАт G3G9, 1D5A3, ЗА8Е1, отличающиеся по своим свойствам, (изотипу, тонкой специфичности и характеру взаимодействия с комплексом КТ-фетуин), а также полученная нами кроличья антисыворотка к KT.

Таблица 1. Иммунохимические и биологические свойства МкАт к KT.

МкАт иэогип иммуно-бпоттжг КТ-ИФА фетуин-КТ-ИФА РТГА нейтрализация ЦПДКТ

G3G9 Igol S5 7290 <10 4 512 I

1D5Ä3 IgSib 7290 >21870 ¿2 N О

3ASE1 |дм - >21870 >21870 0 612 1

Кр акти-КТ S1-S5 7290 21870 16 >4096 , |

Тонкую специфичность антител определяли в иммуноблоттинге (Рис.1). Некоторые МкАт. которые не связывались с субъединицами КТ. взаимодействовали с компонентами "н/о ТХУ" молекулярной массой порядка 5060 кДа. Эти антигены могут представлять недиссоциированные субъединицы или продукты деградации КТ. Другие же МкАт проявляли в данном препарате полосы, соответствующие Б1 и Б5.

Таким образом, полученные МкАт могли выявлять КТ в ИФА, иммуноблоттинге, РТГА и нейтрализовали его действие в тесте на СНО клетках.

Рисунок 1. Взаимодействие МкАт с КТ и "н/о ТХУ".

В

о I

г- тЧ г- -Р

< в гл в

2 N. &

I— т—

1П 1ч Г

Я Л В

т- О г*

о

ГЛ т-

Э р*

РЛ г- ,

О т-

со «

Рч г-

со

■я! СП

Я

»л

Рч

а И

М «Л

а £«

9

. и

сл сч О О

ш го Рч РЛ СЛ

о о

- 66.2

- 45

31

25

- 21.5

- 17.8

= Ы

ЕЕ£

¿*

V*

а

ст\ и

С5

- 92.5

- 66.2

— 45

- 31

- 25

- 21.5

- 17.8

- 14.4 12.3

кт

тху 1.06.94

Кроме того, в ходе исследований было замечено следующее: 1. Анти-31 МкАт 105АЗ оказались в 2 раза активнее кроличьей анти-КТ сыворотки в торможении вызываемой КГ агглютинации эритроцитов. Считается, что механизмы взаимодействия КТ с фетуином и рецептором клеток млекопитающих сходны и опосредуются через Э2 и БЗ. Тем не менее, по антигемагглютинирующей активности анти-31 МкАт и данным литературы о том, что пероксидазные конъюгаты фетуина и гаптоглобина проявляют в иммуноблоттинге субъединицу, можно судить о том, что участвует в связывании КТ с клеточным рецептором и гликопротеинами. Однако, высокая активность данных антител и в РТГА и с комплексом КТ-фетуин, говорит о том, что структуры, принимающие участие в связывании КТ с фетуином и эритроцитами различны.

2. Анти-Эб МкАт СЗС9 нейтрализуют КТ в СНО-тесте. Описанные же в литературе МкАт к в5 не обладали такими свойствами. МкАт С369 могут представлять интерес для изучения стереохимии взаимодействия КТ-рецептор.

Нами получена панель МкАт к ЛПС. В таблице 2 представлены 3 МкАт. Все МкАт реагировали с ЛПС в иммуноблоттинге (Рис.2), активно взаимодействовали в И ФА с ЛПС и всеми используемыми штаммами В. pertussis. Таблица 2. Иммунохимические свойства МкАт к ЛПС.

iiiimiiiiim- МкАт изотоп MMM^IO-блоттинг о ci m Й tT4 1— ? со Й L. Г— Я I to -г го .2-X о> г? < X U. го 8 357 (PT-)J ИФА

1G12 IgGZa + + + + + + + + + >65610

3B9B5F11 к)М + + + + + + + + + 65610

2D9H5 k)M + + + . + + + . + >65610

Рисунок 2. Взаимодействие МкАт с ЛПС.

tt, о т-

ir> m «- т- V-

сч pq « я о я

т- (Ji ö> (Л Г\ VÖ

ö pq - Д д к М

I- П N т- т- (Ч

г: Т"'

<и

pq

I

№

IJ

OJ

С- Сч

О

см

pq. см

I II

ЛПС В.р

- 45

! - 31-' i- 25. ■

- 21.5 17.8

№

Из панели анти-ФГА МкАт в таблице 3 представлены 3 МкАт различных изотипов 1дС1, 1дМ и 1дб2Ь. Все активно взаимодействовали с "н/о ТХУ" в ИФА, но степень ее выраженности не всегда соответствовала антигемагглюгинирую-щим свойствам МкАт, что может говорить о том, что некоторые эпитопы молекулы ФГА не участвуют в связывании с эритроцитами. Таким образом, полученные МкАт могут служить инструментом для изучения структуры молекулы ФГА.

Таблица 3. Иммунохимические свойства МкАт к ФГА.

МкАт изатип м 11 о ы го Ы i t < >» X >ч 1 i 1 t ИФА РТГА |

ю т ■<Г я со fs. со 00 со о со со ю со й СО

2В2А1 IgM + - ± ± ± ± ± ± ± 65610 4096 В

2В9С10 lgG2b + - ± ± - ± ± - ± >65610 2048 8

I 3E6G9 ISG1 + - ± ± - ± ± - ± 65610 128 f

На рисунке 3 приведены картины взаимодействия анти-ФГА МкАт с УЗ дезинтегратом и "н/о ТХУ". Картина взаимодействия МкАт с этими антигенными препаратами может свидетельствовать о ферментативной деградации ФГА в "н/о ТХУ", которая может происходить в ходе культивирования микроорганизма. Это подтверждается характером проявления ФГА в составе дезинтеграта, приготовленного с использованием ингибиторов ферментов (ЭДТА и РМБР).

Нами был получен ряд МкАт, специфичных к 92-кДа белку наружной мембраны (ОМР). В таблице 4 представлены 3 МкАт различных изотипов. Все МкАт взаимодействовали с "н/о ТХУ" в ИФА и иммуноблоттинге (Рис.3).

Таблица 4. Иммунохимические свойства МкАт к 92- кДа ОМР.

___

МкАт изотип О I >> Е 2 Б о сч СО 04 (wild; £ < X I < I U-, £ ИФА

3 С § к t СО 8 г*, ч-СО со -г со СП ■ч-со СО ю со ю со

3CD-H5 lgG2a + + + + - + + + + 7200

3CD-2H3 IgM + + + + - + + + + 2430

3EF-A8 lgG2b + + + + - + + + + 21870 I

Кроме того, было замечено, что имеет место взаимодействие анти-ФГА МкАт с антигеном 92-кДа в составе "н/о ТХУ" и проявление анти-92-кДа МкАт 1АВ-2В4 полосы, соответствующей ФГА. Это может означать, что ФГА и 92-кДа

ОМР имеют общие антигенные детерминанты или один может являться предшественником другого.

Нами были получены МкАт к 65-кДа ОМР. В литературе нет данных об антигене с такой молекулярной массой. В связи с этим было необходимо охарактеризовать его с помощью полученных нами МкАт. Выяснено следующее:

•Связывание МкАт B2G7 со всеми штаммами, в том числе и с 347 (Vir), позволяет предполагать, что ген, отвечающий за синтез белка 65 кДа, локализован вне области Vir.

•Агглютинация микробных клеток МкАт B2G7 свидетельствует о поверхностном расположении данного антигена.

•Было показано, что в электрофорезе полоса, соответствующая данному антигену окрашивается Кумаси R-250, амидо черным и пунцовым красным, что указывает на белковую природу данного антигена.

•В ДСН-ПААГ электрофорезе, проведенном в невосстанавливающих условиях и в присутствии 2-меркаптоэтанола различий выявлено не было, что говорит об отсутствии дисульфидных связей между субъединицами, то есть о мономерной структуре данного белка.

•Данный антиген одинаково выявляется в иммуноблоттинге как УЗ дезин-теграта В. pertussis, так и в среде культивирования бактерий штаммов 305 и 475.

•Обнаружено перекрестное взаимодействие МкАт B2G7 с белком сходной молекулярной массы Branhamella catarrhalis. Это позволяет думать о функциональном сходстве этих белков.

Таблица 6. Иммунохимические свойства МкАт к 65 кДа белку.

_ __,

МкАт иэотил i !п il 305(1.2.0.] CO fsj in TT 338 (wild; 347 (Vir -; i X to T 349 (Hly - 353 (FHA 357 (PT ИФА PA

B2G7 lgG2a + + + + + + + + 2430 400 1

В литературе есть данные о белковом антигене с молекулярной массой 63 кДа, который обнаруживается в мембранной фракции В. pertussis, присутствует как у вирулентых, так и у авирулентных микроорганизмов, связывается МкАт, направленными к 65-кДа белку теплового шока микобактерий.

Рисунок 3. Взаимодействие МкАт с ФГА и 92- и 65-кДа ОМР.

cm \o «H á я ,r t- Í 'я (л s ï-, r i.'..: о t" '«j ö i ni m M i w cm ti cú o t- cm h я пч m i <n! о in i i V- m r-i « сч ч Б t-гн 04 «

1 , ;¡ : • ¡i -i 1© ß] i 1

— —— - - J 351 1

j II

! 1

!¡ .1 X — — — 92.5

— ¡i !. • v'- -Г 80

_ 'I . . '1 Ü, 67

' ■ — 45

"i i| i ) 1 i • J 31

;! .! ■ i - J Y 25

j ( ,1 • 1—> ? ■ jr 21.5

дез .В.р.

1 ш О t» о

«Л Q «" т- СМ Д г W (й

8 «i о ь о w W в

»- co сг>1гч сг> со из

И m м о о w о w «4 _ _ ..

«f Я W OI CU IW , № СП сл и

г

i

•m

I___

— 92.5 ^ ¿o

¿-"67

--гГ'31

тху 1.06

Приведенные выше характеристики не противоречат полученным нами результатам и согласуются с ними. Это позволяет предположить, что описанный (бЗкДа) и изучаемый нами 65-кДа антиген являются одним и тем же АГ, который может встречаться у разных микроорганизмов.

Нами были также получены МкАт к 69-кДа ОМР (таблица 5), которые активно взаимодействуют в ИФА с "н/о ТХУ". Специфичность этих МкАт была подтверждена в иммуноблоттинге с референтными анти-69-кДа МкАт ВРЕЗ (Center for Evaluation and Research FDA) (Рис.4).

Таблица 5. Иммунохимические свойства МкАт к 69-кДа ОМР.

I НМ_||

МкАт изотип иммуно- блоттинг 305(1.2.0.; 475 (1.2.3. Т5 г. со <*5 ГО 347 (Vir - 348 (Hly-Ao X от ГО 353 (FHA ■ 357 (PT ■ ИФА

1E5G8 Ig M + ± ± ± ± ± ± ± ± 21870

Рисунок 4. Взаимодействие МкАт с 69-кДа ОМР. о

т—

es о

со «es es

m гл сл И И о

- 92.5

- 80

- 66.2

- 45

тху 1.06.94

Таким образом, нами были получены и охарактеризованы МкАт к 6 различным антигенам 5. pertussis: протективным KT, ФГА и 69 кДа, белковым антигенам с молекулярной массой 92, и 65 кДа, роль которых в формировании защитного иммунитета еще не выяснена, и ЛПС как антигену, присутствие которого в вакцине нежелательно. Данные антигены можно выявлять с помощью полученных нами МкАт в ИФА, иммуноблоттинге и других тестах.

Следующий этап работы заключался в разработке количественных анализов на основе полученных и изученных МкАт для определения соответствующих антигенов в вакцинных препаратах. В связи с доступностью очищенных и стандартизованных препаратов KT и ЛПС нами были рассмотрены подобные системы количественного определения данных антигенов.

В настоящее время для количественного определения KT широко используется метод, основанный на способности токсина вызывать характерный кластер-эффект на культуре клеток СНО. Данный анализ высокочувствителен, позволяет определять 50-100 пг/мл биологически активного KT. Однако продолжительность (24-48ч.), необходимость специального оснащения и обученного персонала явились стимулом для разработки простых, удобных и чувствительных методов его выявления на основе ИФА.

Нами были рассмотрены 6 различных вариантов ИФА для количественного выявления KT:

1. СНО + KT + 1D5A3 + АМ-ПХ

2. эритроциты + KT + 1D5A3 + АМ-ПХ

3. фетуин + KT + 1D5A3 + АМ-ПХ

4. G3G9 + KT + анти-КТ + АК-ПХ

5. 1D5A3 + KT + анти-КТ + АК-ПХ

6. ЗА8Е1 + KT + анти-КТ + АК-ПХ

Первые три основаны на принципе взаимодействия рецептора или аналога рецептора с KT. В данном случае использовались эритроциты, СНО клетки и фетуин. Связанный таким образом KT выявлялся с помощью протективных анти-SI МкАт.

Другая группа объединяла сэндвич-анализы, использующие твердофазные МкАт. Для этого МкАт выделяли на аффинном сорбенте. Интересно было использовать для этой цели МкАт, которые различались по специфичности, изотипу и характеру взаимодействия с комплексом фетуин-токсин. КТ, связанный МкАт, проявляли с помощью кроличьей антисыворотки к КТ.

Рисунок 5. Кривые титрования КТ в различных вариантах ИФА.

КТ, нг/мл

СНО —«—эритроциты —сЬетуин —»— (5309 —х — 1Р5АЗ—>■—ЗА8Е1 [

Чувствительность анализов, определялась наименьшей концентрацией КТ, которая обеспечивала уровень реакции отличный от фонового на 0,1 Ед 00 (Рис.5). Было обнаружено, что присутствие сыворотки в анализируемых образцах препятствует адекватному выявлению в них КТ. Поэтому, чтобы выяснить степень данного влияния, нами был поставлен эксперимент, в котором определяли концентрацию сыворотки плодов коровы (СПК), вызывающую 50% подавление связывание КТ, взятого в концентрации 100 нг/мл (таблица 7).

Таблица 7. Характеристики методов количественного определения КТ.

анализы количественного определения КГ чувствител ьностъ определения в нг/мл разведение СПК, оказывающее 50% подавление связывания КТ в котентрации 100 нг/мл

культура СНО клеток 0,063 -

фетумн-ИФА эритрсциты-И ФА СНО-ИФА 90 115 15 :110,3 -27,7 :23,5

СЗЗСЗЗ-ИФА 15 1.6

105АЗ-ИФА 1 :4,5

ЗА8Е1-ИФА 0,2 :4.5

Таким образом, было показано, что варианты ИФА, использующие для сенсибилизации МкАт по сравнению с таковыми, использующими твердофазные клеточные рецепторы или фетуин обладают большей чувствительностью и в меньшей мере подвержены возможным помехам, которые могут иметь место со стороны сывороточных белков.

Количественное определение ЛПС В. pertussis является обязательным условием стандартизации вакцинных препаратов, так как полагают, что многие побочные эффекты вакцинации корпускулярными препаратами обусловлены присутствием в них ЛПС. Используемые в настоящий момент методы для количественного определения ЛПС не всегда обладают должной чувствительностью или специфичностью.

Для количественного определения ЛПС нами были рассмотрены 3 варианта ИФА на основе 3 наиболее активных МкАт и синтезированного пероксидазного коньюгата аффинно выделенных МкАт 1G12 (Ю12-ПХ).

Первый вариант представляет собой сэндвич-ИФА и основан на взаимодействии ЛПС с твердофазными МкАт и конъюгатом 1G12-1TX. Чувствительность анализа оказалась относительно низкой (рис.6, табл.8). Однако, взаимодействие молекулы ЛПС и с твердофазными МкАт 1G12 и с 1G12-HX свидетельствует о наличии как минимум двух одинаковых реакционноспособных эпитопов. Вероятно, данными структурами являются производные Сахаров или их последовательности.

Второй вариант основан на связывании ЛПС с адсорбированным на полистироле полимиксином М и выявлении его с помощью МкАт или 1G12-nX. В данном варианте анализа чувствительность была несколько выше. Однако замечено, что присутствие белка (например БСА и др. сывороточных белков) препятствовало выявлению ЛПС в данных анализах (рис.7, табл.8).

Третий вариант основан на конкуренции тестируемого ЛПС с твердофазным ЛПС за связывание с МкАт или с Ю12-ПХ. Чувствительность анализа определялась концентрацией ЛПС, обеспечивающей 20% подавление связывания МкАт, как величиной достоверно отличающейся от 100% контроля и находящейся на линейном участке калибровочной кривой (рис.8, табл.8).

Рисунок 6. Кривые титрования ЛПС в сэндвич-ИФА при использовании различных МкАт на твердой фазе.

- Ю12 -

-ЗВ5В9Р11 ■

-20ВН5

Рисунок 7. Кривые титрования ЛПС в полимиксин М-ИФА при _использовании различных МкАт._

ЛПС, мгЛлл

—•—Ю12 —я—ЗВ5В9Р11 -*—2СВН5 ■- о... 1012-ПХ

Рисунок 8. Кривые титрования ЛПС в конкурентном варианте _ИФА при использовании различных МкАт_

ЛПС, НГ/Ш1

1G12—■—3B5B9F11 —*—2D0HS---O--- 1012-ПХ

Таблица 8. Характеристики различных вариантов количественного определения ЛПС В. pertussis в ИФА.

вариант количественного анализа ЛПС ..............1 чувствител ьность анализа, нг/мл

1. Ю12 + ЛПС + Ю12-ЛХ 1. ЗВ5В9Р11 + ЛПС+ 1Э12-ПХ 1. 2ЮН5 + ЛПС+ 1312-ПХ 120 150 400

2а. ПМ + ЛПС + Ю12 + АМ-ПХ 2а. ПМ + ЛПС + ЗВ5В9Р11 + АМ-ПХ 2а. ПМ + ЛПС + 209Н5 + АМ-ПХ 26. ПМ + ЛПС + Ю12-ПХ 45 180 100 30

За. Я1С + (Ю12 +ЛПС) + АМ-ПХ За. ЛПС + (ЗВ5В9Р11 + ЛПС) + АМ-ПХ За. ЛПС + (209Н5 + ЛПС) + АМ-ПХ | 36. ЛПС + (1 2-ПХ + ЛПС) 10 70 40 1S

Данный вариант анализа позволял выявлять до 10 нг/мл ЛПС (1G12). Кроме того, присутствие белка в тестируемых образцах не являлось помехой.

Таким образом, конкурентный вариант ИФА количественного определения ЛПС оказался наиболее чувствительным по сравнению с остальными рассмотренными вариантами и позволял выявлять ЛПС (полисахаридную часть) в белоксодержаицих средах. Вариант, использующий твердофазный полимиксин (ПМ-ИФА), несмотря на несколько меньшую чувствительность по сравнению с конкурентным вариантом (ЛПС-ИФА), позволял выявлять цельную молекулу ЛПС (липид А и полисахаридную часть).

Итак, проведенный анализ рассмотренных вариантов количественного определения КГ и ЛПС в ИФА позволяет резюмировать, что сэндвич-варианты ИФА биологически активных соединений, включающие как этап биоаффинные, неиммунные взаимодействия (фетуин - KT, полимиксин - ЛПС), не всегда пригодны для измерения содержания этих соединений в белоксодержащих средах. Нами показано, что в таких случаях предпочтительнее использовать сэндвич-анализы с двойными антителами или конкурентный вариант анализа, в которых аффинность связывания антител с антигеном выше таковой биоаффинных взаимодействий. Поэтому влияния со стороны биосред проявляются в них в меньшей степени.

Разработанные варианты ИФА позволяют выявлять KT и ЛПС с чувствительностью 0,2 и 10 нг/мл, соответственно.

Заключительным этапом данной работы явилась оценка пригодности полученных МкАт и разработанных на их основе методов количественного и качественного выявления антигенов В. pertussis в бесклеточных вакцинных препаратах с целью их стандартизации. В данном исследовании была проведена качественная и количественная характеристика 6 антигенов В. pertussis (KT, ЛПС, ФГА и белковых антигенов с молекулярной массой 92, 69 и 65 кДа) в вакцинных препаратах до и после детоксикации формалином, а также в над осад очной жидкости адсорбированных на гидроксиде алюминия вакцин. Объектами исследования служили "н/о ТХУ", а также адсорбированные КАТ и КДС- вакцина "Acel Imune".

Анализ данных проведенного исследования (табл. 9) позволяет заключить, что содержание иммунохимически активного КТ в недетокси-цированных препаратах варьирует в пределах от 20 до 100 мкг/мл.

Таблица 9. Оценка содержания КТ и ЛПС в вакцинных препаратах в ИФА,

использующем полученные МкАт.

концентра ция белка количественное определение в икг/нл

препараты в кт ЛПС |

мкг/мл СЗЗС944ФА 1С6АЗ-ИФА ЗА8Е1-ИФА ПМ-ИФА ЛПС44ФА1

17.02.93 Ф17.02.93 2545 2280 54 0,255 34 0,234 44 0,0*2 240 225 3821 13260

23.02.94 Ф23.02.94 2437 2132 102 0,35 95,6 0,22 80,3 0,015 210 230 3404 12650

02.03.93 Ф02.03.93 2500 2367 25,8 0,255 21,3 0,22 21,3 0,012 260 290 3300 19310

7М-АКДС 17.02.93 85-2-АКДС 23.02.94 86-2-АКДС 23.0294 87-4-АКДС 23.02.94 88-2-АКДС 23.02.94 93-2-АКДС 17.02.93 95-2-АКДС 0203.93 КАТ Асе) !типе 50 50 50 50 50 50 50 10 6.5 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,075 < 0,005 <0,005 < 0,005 0,0075 <0,005 < 0,005 < 0,005 < 0,005 < 0,005 <0,001 < 0,001 <0,001 <0,001 <0,001 < 0,001 <0,001 < 0,001 0,0025 0,22 0,083 0,069 0,3 0,069 0,76 0,3 0,145 0.575 0,417 1 2,63

Примечание: * - "н/о ТХУ" после обработки формалином

** - адсорбированные вакцинные препараты с указанием серии (76), состава (АКДС) и использованного для сорбции детоксициро-ванного "н/о ТХУ" (Ф 17.02.93) *** - показатели со знаком "<я обусловлены чувствительностью анализов принимая во внимание, что анализируемые образцы разводились в 5 раз в ФСБ-1% БСА-твин **** - для комплексных препаратов представлена концентрация белка

коклюшных компонентов () - исследование не проводилось Значения концентраций КТ, полученные в трех МкАт-ИФА несущественно отличаются друг от друга, несмотря на неоднородность препарата и

необходимость предварительного разведения образцов в 1000-10000 раз, вызванную высокой чувствительностью анализов.

Концентрация ЛПС во всех трех препаратах по данным ПМ-ИФА составила в среднем 250 мкг/мл. В конкурентном варианте ИФА ЛПС, содержание эпитопов было эквивалентно их количеству в растворе ЛПС с концентрацией около 3500 мкг/мл.

В связи с химической модификацией антигенов после обработки формалином их количественное определение было неадекватным: ложнонегативным в случае определения КТ и ложнопозитивным - для ЛПС. Однако в ПМ-ИФА не было обнаружено существенной разницы между концентрациями ЛПС в препаратах до и после детоксикации. Поэтому данный вариант анализа можно считать пригодным для количественного определения ЛПС в формалинизированных препаратах.

Остальные антигены выявлялись в иммуноблоттинге с помощью МкАт: анти-ФГА ЗЕ6С9, анти-92-кДа ЗСО-Н5, анти-69-кДа 1Е5в8 и анти-65-кДа В2в7. Указанные антигены были выявлены во всех анализируемых препаратах "н/о ТХУ". Наличие целого ряда полос в препаратах, проявляемых анти-ФГА и анти-65-кДа МкАт свидетельствует, по-видимому, о протеолитической деградации данных антигенов. Тем не менее, картина взаимодействия анти-69-кДа и анти-92-кДа МкАт может говорить о том, что либо реагирующие с ними антигены в меньшей мере подвержены ферментативному расщеплению, либо о том, что детерминанты, взаимодействующие с МкАт не присутствуют в продуктах ферментолиза.

Детоксицированные препараты в связи изменением структуры антигенов или их агрегации плохо проникали в ПАА гель, что влекло возникновение "смазанной" картины (рис.9)

Оценка содержания антигенов в надосадочной жидкости адсорбированных на гидроксиде алюминия вакцин проводилась для выяснения прочности сорбции компонентов на носителе. Концентрация десорбированного КТ в большинстве образцов оказалась меньше чувствительности анализов.

Содержание ЛПС в образцах АКДС 76, 85, 86, 87 и 93 серий по данным ПМ-ИФА соответствовало 0,069 - 0,3 мкг/мл, что составляет в среднем около

Рисунок 9. Выявление ФГА, 92,69 и 65-кДа ОМР в "н/о ТХУ" до и после формалинизации.

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 12 3

; ' '•. г яя|

г,г:н| г 1 м .М тт Ш 1 ШЛ &

»•4 Р"» «4 ' ■ | - —• - л 1

а.-' -—• 1. ЛГ.23, • 4 1. - ■ 4 - - ^

- 92.5 -66.2

-45

_ 31

-25

МкДТ

ЗЕбСЭ ЗИ)-Н5 1Е568 В2Й7 ЗЕ609 ЗСВ-Н5 1Е5С8 В2Й7

Р>»

^ Р?

НИН

- ..

; -92.5.

I

I -66-2.

?

1 1

' • — 1-45

V- 31

— 25

1231 23 1 231 23 1,2,3 - "н/о ТХУ" 02.03.93., 17.02.93., 23.02.94 и соответствующие формалинизированные препараты.

0.06. от общего ЛПС. Данные, полученные в ЛПС-ИФА не отражают истинное

содержание (из-за действия формалина) ЛПС в образце.

ВЫВОДЫ.

1. Получена коллекция гибридом-продуцентов МкАт, которые позволяют идентифицировать 6 антигенов В. pertussis: коклюшный токсин (в том числе субъединицы S1 и S5), липополисахарид, филаментозный гемагглютинин и белки наружной мембраны с молекулярной массой 92,69 и 65 кДа.

2. Показано, что анти-SI 1D5A3 МкАт нейтрализуют гемагтлютинирующее действие коклюшного токсина, что свидетельствует о возможном участии S1 субъединицы в связывании KT с рецептором.

3. Впервые обнаружена нейтрализующая активность МкАт G3G9 к S5 субъединице коклюшного токсина в СНО-тесте.

4. С помощью МкАт B2G7 был частично охарактеризован 65-кДа антиген. Выяснено, что данный антиген является поверхностным мономерным белком как вирулентных, так и авирулентных бактерий, выявляется в иммуноблоттинге УЗ-дезинтеграта В. pertussis и в среде культивирования микроорганизмов штаммов 305 и 475.

5. На основе полученных МкАт разработаны варианты ИФА, позволяющие в недетоксицированных вакцинных препаратах количественно определять KT с чувствительностью 0.2 нг/мл, (что превосходит показатели описанных аналогичных систем), ЛПС с чувствительностью 10 нг/мл и выявлять ФГА и 92, 69 и 65-кДа ОМР в иммуноблоттинге. ИФА-вариант, использующий полимиксин, позволяет измерять содержание ЛПС в детоксицированных препаратах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. "Получение моноклональных антител к антигенам Bordetella pertussis и изучение их свойств с помощью иммунохимических методов". Буркин М. А., Яковлева И. В., Свиридов В. В., Смирнов В. Д. "Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине". Материалы международного симпозиума, посвященного 150-летию со дня рождения И. И. Мечникова и 90-

летию Уфимского НИИВС им. И. И. Мечникова НПО "Иммунопрепарат", Уфа

1995, стр. 75-76.

2. "Количественное определение липополисахарида Bordetella pertussis в различных вариантах ИФА с использованием моноклональных антител" Буркин М. А., Свиридов В. В., Яковлева И. В., Смирнов В. Д. Биотехнология,

1996, №5, стр. 57-62.

3. "Бактериологическая диагностика коклюша с использованием моноклональных антител" Свиридов В. В., Селезнева Т. С., Буркин М. А., Яковлева И. В., Попова О. П. Материалы VII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 1997.

4. "Сравнение пригодности методов количественного определения коклюшного токсина в микрокультуре клеток и некоторых вариантах ИФА при использовании моноклональных антител". Буркин М. А.. Свиридов В. В. Биотехнология, 1997, № 2, 59-64.

5. "ИФА и тест на культуре клеток СНО как методы количественного определения коклюшного токсина в бесклеточных вакцинных препаратах". Буркин М. А., Свиридов В. В., Смирнов В. Д. Биотехнология, 1997, № 5, стр.

6. "Характеристика антигенных компонентов коклюшного микроба как основы бесклеточной вакцины при помощи моноклональных антител". Буркин М. А., доклад на заседании секции микробиологии и прикладной эпидемиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова, 24 июня

1997,