Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка новых подходов к оценке функциональной активности иммуноглобулина G сыворотки крови человека

/ ' / > ж

' ^ - . V ^¿Г.....

•.С

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР - ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Ни правах рукописи

КЛИМОВА

Светлана Валентиновна

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ К ОЦЕНКЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНА в СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин

Москва 1999

Список принятых сокращений

АГ - антиген АК - аминокислота AT - антитело

БСА - бычий сывороточный альбумин ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ГМГМ - теграсахарид, состоящий из N-ацеггилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты

ПУГДГТ - N-ацетилглюкозамин - N-ацетилмурамил - L-аланил - D-изоглютамин

ИА - индекс аффинности ИФ А - иммуноферментный анализ КГ - коэффициент гликозизирования НБ - неврологические больные OA - относительная аффинность

ОП - оптическая плотность ч. :

ОПАТ -остаточный процент антител

ОПРНП - острая полирадикулоневропатия Гийена-Барре

ОСМ - опухоль спинного мозга

ОФД - ортофенилендиамин

ПГ - пептидогликан Staphylococcus aureus

ПД - после десиалирования

PC - рассеянный склероз

СК - секреторный компонент

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦСЖ -цереброспинальная жидкость

ЦФБ - цитратно-фосфатный буфер

ЧДБ - часто и длительно болеющие

ЧРВИ - частые респираторно-вирусные инфекции

ЧТиБ - частые трахеиты и бронхиты

ВС - антиген Branchamella catarrhalis

BS2 - лектин Bandeiraea simplicifolia

С - константный участок молекулы иммуноглобулина

СопА - лектин Canavalia ensiformis

ЕС - лектин Erythrina cristagalli

FcR -Fc-рецептор

Gal - галактоза

GlcNAc - N- ацетилглюкозамин

H - тяжелая цепь молекулы иммуноглобулина

Ш - антиген Haemophilus influenza

Ка, - константа ассоциации

Kd, - константа диссоциации

kafft - кинетическая константа распада комплекса

коп, - кинетическая константа образования комплекса

L - легкая цепь молекулы иммуноглобулина

Man - манноза

PhA - лектин Phytolacca americana Pn - белковый антиген Streptococcus pneumoniae RHAV - Relative High Affinity Value RU - единицы ответа (responce units)

SPR - поверхностный плазмон-резонанс (surface plasmon resonance) V - вариабельный участок молекулы иммуноглобулина

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ.........6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......9

1.1. Физико-химические свойства иммуноглобулинов человека. 9

1.1.1. Характеристика строения и особенностей основных

классов иммуноглобулинов 9

1.1.2. Антигеннезависимые функции иммуноглобулинов 14

1.1.3. Антигензависимые функции иммуноглобулинов 17

1.1.4. Свойства продуктов частичного протеолиза иммуноглобулинов 20

1.2. Некоторые методы оценки аффинности антител ... 22

1.2.1. Определение констант равновесия .... 22

1.2.2. Методы определения динамических констант. 24

1.2.3. Методы оценки относительной аффинности антител . 26

1.3. Гликозилирование антител ...... 28

1.3.1. Общие представления о гликопротеинах животного происхождения .... 28

1.3.2. Расположение и функции углеводного компонента в

составе иммуноглобулинов ..... 29

1.3.3. Строение олигосахаридного фрагмента ^О человека. 30

1.3.4. Биосинтез М-гликанов ...... 33

1.3 .5. Влияние уровня гликозилирования иммуноглобулинов на их

биологические функции . 35 1.3.6. Лектины как детекторы углеводного компонента гликопротеинов. 40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....46

2.1. Характеристика обследованных групп населения ... 46

2.2. Реактивы и расходные материалы 48

2.3. Оборудование ........ 49

2.4. Получение антигенных препаратов ..... 49

2.5. Определение основных показателей гуморального иммунитета 50

2.5.1. Определение иммуноглобулинов О, А, М сыворотки крови . 50

2.5.2. Определение субклассов иммуноглобулина в . 51

2.6. Определение константы диссоциации. .... 53

2.6.1. Выделение анти-ГМДП-антител из исследуемых сывороток. 53

2.6.2. Контроль специфичности элюции .... 53

2.6.3. Проведение ингибиторного анализа .... 54

2.6.4. Расчет константы диссоциации ..... 55

2.7. Статистическая обработка результатов 55 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .... 56 3.1. Разработка методов определения функциональной активности

иммуноглобулина G человека . 56

3.1.1. Оценка относительной аффинности IgG-антител 56

3.1.1.1. Методика оценки относительной аффинности антител. 5 6

3.1.1.2. Отработка условий оценки относительной аффинности 57

3.1.1.3. Определение константы диссоциации анти-ГМДП-антител 58

3.1.1.4. Сравнение показателей аффинности антител, полученных разными методами . 61

3.1.2. Методика оценки уровня гликозилирования IgG сыворотки крови человека ........ 63

3.1.2.1. Проверка лектинов на неспецифическое связывание с другими компонентами системы ..... 64

3.1.2.2. Проверка связывания лектинов с IgG человека . 65

3.1.2.3. Определение оптимальных рабочих концентраций лектинов 65

3.1.2.4. Проверка лектинов на взаимодействие с очищенным IgG человека и с IgG сыворотки крови доноров, связанным с белком A St. aureus ...... 66

3.1.2.5. Применение нейраминидазы для десиалирования углеводного компонента IgG и определение ее оптимальной концентрации .... 68

3.1.2.6. Контроль специфичности взаимодействия некоторых лектинов с соответствующими углеводными остатками методом конкурентного ингибирования. 71

Заключение ........ 71

3 .2. Количественная характеристика основных показателей гуморального

иммунитета у обследованных групп населения ... 72

3.2.1. Содержание основных классов иммуноглобулинов у обследованных лиц ...... 72

3.2.2. Субклассовый состав часто и длительно болеющих лиц 75 3 .2.3. Определение содержания антител к основным бактериальным

антигенам........ 77

3.2.3.1. Условия проведения иммуноферментной реакции 77

3.2.3.2. Содержание антител к основным бактериальным антигенам у обследованных групп населения . 78

Заключение ........ 80

3.3. Относительная аффинность антител к некоторым бактериальным

антигенам у обследованных лиц 83

Заключение ........ 85

3 .4. Оценка уровня связывания меченых лектинов с углеводным

компонентом 1§0 сыворотки крови ..... 86

3.4.1. Абсолютные показатели связывания лектинов с . 86

3.4.2. Относительные показатели связывания различных лектинов . 91 Заключение ........ 93

ВЫВОДЫ.........95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......97

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы диссертации.

Оценка иммунного статуса человека является одной из главных задач клинической иммунологии, которая заключается в определении основных компонентов иммунной системы: фагоцитоза, гуморального и клеточного иммунитета [15, 21]. Количественное определение основных классов иммуноглобулинов - ^А и IgM - является одним из основных методов оценки гуморального иммунитета. Иммуноглобулины выполняют важные функции по защите организма от чужеродных веществ антигенной природы [7, 32, 64]. Выполнение этих функций в значительной степени зависит от аффинности антител и степени их гликозилирования.

Определение аффинности (и авидности) антител имеет большое диагностическое и прогностическое значение. В эксперименте отмечено снижение аффинности антител с возрастом [113]. Важную роль играет аффинность антител при аутоиммунных нарушениях [38, 49, 88]. Уровень авидности антител свидетельствует о давности инфицирования: при первичном иммунном ответе вырабатываются специфические антитела низкой авидности, при повторном инфицировании и при длительном стаже заболевания -высокоавидные антитела [58, 71, 87].

Оценка уровня гликозилирования антител также представляет собой важную проблему. Углеводный компонент в комплексе с тяжелыми цепями иммуноглобулина обеспечивает такие антигеннезависимые функции молекулы, как связывание с Рс-рецепторами фагоцитов и активацию системы комплемента, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, скорость выведения комплексов антиген-антитело из кровотока [43, 44, 55, 59, 68, 69, 79]. Особое внимание к проблеме гликозилирования появилось после того, как были обнаружены дефекты гликозилирования при целом ряде заболеваний: ревматоидном артрите, системной красной волчанке, туберкулезе, болезни Крона, реакции «трансплантат против хозяина» [3,93].

Таким образом, при оценке способности антител выполнять свои эффекторные функции важно определять уровень их аффинности и

гликозилирования. Поэтому целью работы явилась разработка методов оценки аффинности и гликозилирования, возможных для применения в практике лабораторий клинической иммунологии.

Задачи исследования.

1. Разработать методику определения аффинности антител на основе иммуноферментного анализа.

2. Создать метод оценки степени гликозилирования сыворотки крови человека с применением фермент-меченых лектинов.

3. Апробировать методики на больных, страдающих различными заболеваниями, сопровождающимися недостаточностью гуморального звена иммунной системы.

Научная новизна.

Впервые модифицирована и адаптирована методика, позволяющая оценивать относительную аффинность ^О-антител сыворотки крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) человека с использованием химической элюции.

Впервые предложен метод оценки уровня гликозилирования 1дО, основанный на последовательном связывании 1дО сыворотки крови с белком А стафилококка и фермент-мечеными лектинами. Разработанный метод не требует предварительного выделения

Показано, что у больных, страдающих частыми респираторно-вирусными инфекциями, и у ВИЧ-инфицированных лиц снижена относительная аффинность естественных антител к пептидогликану стафилококка (ПГ).

Обнаружено, что при фурункулезе показатель относительной аффинности анти-ПГ антител высоко коррелирует с содержанием антител в сыворотке крови.

Показано, что при ВИЧ-инфекции снижается количество доступных остатков (5-галактозы и И-ацетилглюкозамина на поверхности углеводного фрагмента ^О-антител.

Практическая значимость работы.

Определение относительной аффинности антител к бактериальным антигенам позволит оценивать давность инфицирования, зрелость иммунного ответа к этиологическому агенту. Оценка аффинности аутоантител может помочь в прогнозировании тяжести развития заболевания.

Разработанная методика определения уровня гликозилирования 1§0-антител сыворотки крови человека с использованием меченых лектинов позволяет оценивать конформационные изменения в структуре углеводного фрагмента молекулы ^О без предварительной очистки иммуноглобулина. Применение методики в клинической практике может помочь в понимании механизмов нарушения гуморального иммунного ответа при различных патологических состояниях.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л. Физико-химические свойства иммуноглобулинов человека.

1.1.1. Характеристика строения и особенностей основных классов

иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины - семейство сывороточных белков со сходной структурной организацией молекул, способных в качестве антител специфически взаимодействовать с антигеном [8]. Существует пять классов иммуноглобулинов - IgG, IgA, IgM, IgD и IgE (табл. 1). Кроме того, в пределах классов IgG и IgA выделяют субклассы.

Основные биологические функции иммуноглобулинов заключаются в следующем: IgG осуществляет вторичный иммунный ответ и переносится через плаценту; IgA в большом количестве присутствует в секретах и наряду с другими факторами обеспечивает «первую линию обороны» слизистых оболочек; IgM участвует в первичном иммунном ответе, к этому классу относится ревматоидный фактор; IgD является основной молекулой поверхности лимфоцитов; IgE осуществляет защиту слизистых оболочек организма путем локальной активации факторов плазмы и эффекторных клеток, индуцируя таким образом острую воспалительную реакцию, а также обусловливает проявление аллергических реакций [6].

Иммуноглобулины состоят из одной субъединицы (IgG, мономерный IgA, IgE, IgD) или из нескольких, соединенных J-цепью (joint - связь) (димер IgA, пентамер IgM). Кроме того, в секретах в состав IgA входит секреторный компонент (СК), защищающий его от протеолиза.

В состав каждой субъединицы входит 2 тяжелых (Н, high) и 2 легких цепи (L, light). L-цепи построены из двух, а Н-цепи - из четырех (IgG, IgA, IgD) или пяти (IgM, IgE) доменов, каждый из которых состоит примерно из 110 аминокислотных остатков (АК). N-концевые участки как легких, так и тяжелых цепей разнообразны и называются вариабельными (V, variable region), а С-концевые относительно постоянны и называются константными (С, constant

Таблица 1. Физико-химические свойства основных классов иммуноглобулинов человека (А. Кульберг, 1985, А. Ройт, 1991).

Параметр IgG IgA IgM IgD IgE

Количество основных четырехцепочечных единиц 1 1,2 5 1 1

Валентность при связывании антигена 2 2,4 5(10) 2 2

Молекулярная масса, килодальтон 150 160-350 900 185 200

Константа седиментации 7S 7S, 9S, 11S (+СК) 19S 7S 8S

Тяжелые цепи Т а Ц 5 е

Легкие цепи к, X к, X к, X к, X к, X

Молекулярная масса тяжелых цепей, килодальтон 51 - 60 56 70 70 70

Молекулярная масса легких цепей, килодальтон 22 22 22 22 22

Молекулярная формула * Y2K2, 72^2 (a2K2)i-2, (a2X2)i-2 (а2к2)2СК, (а2)^)2СК (!*zk2)5, (112X2)5 52к2, (52Ая?) е2к2, £2X2

Аллотипы тяжелых цепей Gm (около 20) Am (2) Mm (2) - -

Концентрация в сыворотке (норма) 8-16 г/л 1,4-4 г/л 0,5 - 2 г/л 0, - 0,4 г/л 17-450 мкг/л

Процент от общего количества иммуноглобулинов сыворотки 80 13 6 0-1 0,002

Содержание углеводов, % 3 8 12 13 12

Время циркуляции (1/2), сутки 21 6 5 3 2

* - IgM и димеры IgA содержат J-цепь.

region). Гипервариабельные участки Vh и Vl образуют антигенсвязывающий центр антитела и сосредоточены на одном конце вариабельной области. Константные области Н-цепей различаются у разных классов и субклассов антител и обеспечивают особенности их функционирования в организме. Основные свойства субклассов IgG человека приведены в таблице 2. Биологические функции субклассов также различны. Например, к IgGl-субклассу относятся антитела к дифтерийному, столбнячному токсинам и к другим белковым антигенам; к IgG2 субклассу - антитела к тейхоевым кислотам и к прочим полисахаридам. Было выявлено [56], что специфические антитела к Branhamella catarrhalis относятся к IgG3-субклассу. 1§С4-антитела принимают участие в аллергических реакциях, к этому субклассу относятся также антитела к фактору VIII свертывания крови [89].

L-цепи в комплексе с Cv и Сн1 -доменами образуют Fab-фрагмент (fragment antigen binding), ответственный за связывание антигена, а С-концевые домены константной области Н-цепей - Fc-фрагмент (fragment crystallizable), определяющий эффекторные функции антител [119].

Полипептидные цепи в молекуле субъединицы объединены дисульфидными и нековалентными связями, прежде всего гидрофобными. Существует два вида межцепочечных связей: между одноименными участками тяжелых цепей и между тяжелыми и легкими цепями. Дисульфидные связи между Н-цепями IgG расположены в регионе, получившем название «талии» молекулы. Поскольку ось вращения Fab- и Fc-фрагментов проходит через район талии, его также называют шарнирным участком. Этот регион обладает уникальными особенностями строения. Его протяженность составляет 15-60 АК остатков, причем отрезок из 15-16 АК может неоднократно дуплицироваться. Например, у IgG3 человека он повторяется четыре раза. Кроме того, в этом районе очень высокое содержание остатков пролина. Особенности состава и пространственной структуры обеспечивают высокую чувствительность района талии к протеолитическим ферментам. Число дисульфидных связей в этом регионе неодинаково у различных классов и субклассов иммуноглобулинов и является отличительным признаком субклассов.

В кислой среде (рН 3,0 - 3,5) молекула иммуноглобулина диссоциирует на две половины, связи же между Н и L цепями не разрушаются без участия денатурирующих агентов. Внутрицепочечные дисульфидные связи также

Таблица 2. Сравнительные свойства субклассов 1§0 человека [89].

Свойства IgGl 1^2 1§СЗ IgG4

Содержание в нормальной сыворотке, в % от общего 65 23 8 4

Молекулярная масса, килодальтон 146 146 170 146

Молекулярная масса Н-цепи, килодальтон 51 51 60 51

Электрофоретическая подвижность Медленная Медленная Медленная Быстрая

I Спонтанная агрегация - - +++ "

Аллотипические маркеры От a, z, f, х п ьо, ы, ьз, & Б, 1 и т.д. ?

Сайт Оа, реагирующий с ревматоидным фактором * +++ +++ - +++

Связывание с белком А стафилококка +++ +++ - +++

Преодоление плацентарного барьера -н- ± ++ ++

Связывание комплемента (классический путь) -НН- ++ 1 1 м ±

Связывание с моноцитами -н-+ + +++ ±

Связывание с гетерологич-ными клетками кожи ++ - ++ ++

Блокирование связывания 1&Е - - - +

Доминирующие антитела Анти-Rh Антидекст-рановые, антилева-новые Анти-КЬ Антитела к фактору VIII

* - другие ревматоидные факторы, по-видимому, реагируют со специфическими

сайтами Gm.

сохраняются, поэтому третичная структура не претерпевает необратимых изменений. После повышения рН до 7,8 - 8,0 дисульфидные связи вновь образуются и возникает молекула, сходная с первоначальной. На принципе самосборки молекулы иммуноглобулина из изолированных цепей, закодированном в третичной структуре цепей, основана сборка молекул в клетках, синтезирующих иммуноглобулины [26, 28, 45].

Вторичная структура молекулы иммуноглобулина - антипараллельная (3-складчатая. Вариабельные и константные районы образуют автономные компактные домены цилиндрической формы. При определенном сходстве строения они различаются тем, что вариабельные домены