Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунобиотехнологические методы определения микобактрий туберкулеза

^ #

На правах рукописи

/

#

ШИПИНА ЛЮБОВЬ КЛИМОВНА

ИММУНОБИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

14.00.36. Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском институте фтизиопульмонологии Министерства здравоохранения РФ

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук М.А.Владимирски

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук,

профессор, чл.корр. РАМН В.И.Литвинов

Доктор биологических наук,

профессор Л.А.Носкин

Ведущая организация:

Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН.

Защита диссертации состоится "...." ......" 1997

в "...." часов на заседании диссертационного совета К 084.18.02. Московского НИИ эпидемиологии и микробиоло] им.Г.Н.Габричевского (125212, Москва, ул.Адмирала Макарова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского

Автореферат разослан "____" ......... 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Л.И.Новикова

За последнее десятилетие заболеваемость туберкулезом возросла во многих странах мира. Ежегодно выявляется около 10 млн. новых случаев заболевания. Отмечается более тяжелое течение туберкулезного процесса и появление острых, быстронрог-рессирующих форм, приводящих к смерти в срок от нескольких недель до нескольких месяцев (Хоменко А.Г., 1995). От туберкулеза умирает более 3 млн. человек в год (Daniel Т.М. et al., 1987). Увеличение смертности от туберкулеза связано с рядом причин, одна из которых - позднее выявление заболевания (Хоменко А.Г., 1995).

В Европе и США некоторый рост заболеваемости туберкулезом связан с увеличением числа ВИЧ-инфицированных и миграцией населения из стран Латинской Америки и Юго-Восточной Азии.

В последние годы обращает на себя внимание ухудшение эпидемиологической ситуации по туберкулезу и в России (рост заболеваемости, увеличение числа бактерно-выделителей, повышение заболеваемости туберкулезом детей и подростков). В 1991 году заболеваемость туберкулезом в России составила 34 человека на 100 тыс. населения (самый низкий уровень). В последующие годы заболеваемость возрастала и в 1994 году составила свыше 48 человек на 100 тыс. населения (Шилова М.В., Сон И.М., 1995), а в 1996 г. - 57 человек на 100 тыс. населения.

В решении проблемы своевременного выявления туберкулеза значительное место принадлежит микробиологическим исследованиям. Общепринятые в практике здравоохранения методы выявления микобактерий туберкулеза являются малочувствительными или длительными и не всегда позволяют своевременно выявлять больных туберкулезом.

Традиционная микроскопия мазка, окрашенного по методу Циля-Нильсена, позволяет выявить микобактерии туберкулеза (МВТ) при концентрации 100 тыс. микробных клеток на 1 мл мокроты. Окрашивание мазка флюоресцентными красителями (аурамин, родамин) позволяет выявить возбудитель при концентрации 1-10 тыс. клеток на 1 мл.

Уровень чувствительности посевов на плотные питательные среды составляет 100-1000 микробных клеток на 1 мл. Однако, рост колоний микобактерий туберкулеза определяется лишь через 4-12 недель после посева.

В этой связи весьма перспективным являются разработка и внедрение в практику противотуберкулезной службы современных иммунобиотехнологических методов определения возбудителя туберкулеза, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Применению иммуноферментного анализа для определения антигенов МВТ посвящен ряд публикаций (Donald P.R. et al.,1987; Ashtekar M.D. et al., 1987). Вместе с тем, до сих пор не разработан удовлетворительный метод ИФА, позволяющий определять МБТ в биологических жидкостях с чувствительностью, не уступающей культу-ральному исследованию.

Применение ПЦР для быстрого определения МБТ отражено в ряде зарубежных работ последних 6-7 лет, показана строгая специфичность и высокая чувствительность этого исследования, что позволяет рассчитывать на довольно широкое использование метода ПЦР (Savic В. et al.,1992; Kolk A.Y. et al., 1996). Однако, в других работах отмечаются трудности применения этой технологии в практических лабораториях (Noordhoek G.T. et al., 1996).

Целью настоящей работы явилось повышение эффективности лабораторной диагностики туберкулеза.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести экспериментальное изучение условий повышения эффективности м дов иммуноферментного анализа для определения антигенов микобактерий туберкул

2. Исследовать возможности определения микобактерий туберкулеза на oci полимеразной цепной реакции и адаптировать этот метод для практического прим ния путем создания отечественного набора реагентов.

3. Провести сравнительный анализ диагностической эффективности полимерам цепной реакции и традиционных микробиологических методов для исследования клх ческих диагностических материалов с использованием разработанного набора реаген-

Научная новизна исследования.

1. В экспериментальных исследованиях с использованием различных соврег ных методов иммуноферментного анализа установлена возможность определе возбудителя туберкулеза с максимальной чувствительностью 10' к л. /мл.

2. Показана возможность определения с помощью ИФА растворимых микоба: риальных антигенов с чувствительностью 10 нг/мл.

3. При определении микобактерий туберкулеза с помощью полимеразной цеп реакции проведено сопоставление чувствительности реакции с использованием р различных пар праймеров, обеспечивающих амплификацию участков генов белю кД и белка МРВ 64.

Установлено, что при высокой специфичности результатов полимеразной цеп реакции, праймеры, амплифицирующие фрагмент гена, кодирующего белок МРВ обеспечивают более высокую чувствительность исследования, соответствующую i центрации МВТ в 10 кл./мл.

4. Показана более высокая чувствительность определения микобактерий тубе! леза (на 63,5 %) при использовании метода полимеразной цепной реакции по cpai нию с методом посева на среду Левенштейна-Иенсена.

Практическая значимость работы. Разработан первый отечественный набор реа тов для быстрого определения возбудителя туберкулеза методом полимеразной цеп реакции в диагностическом материале. Проведены клинические испытания, по рез; татам которых тест-система "Амплитуб" разрешена для практического применения.

Использование метода полимеразной цепной реакции, позволяет определять в течение 1-2 дней и получать достоверные результаты, что особенно важно для на; чения раннего специфического лечения.

Применение разработанного набора реагентов для определения микобактерий беркулеза методом полимеразной цепной реакции позволяет повысить эффективнс лабораторного определения возбудителя туберкулеза. Изучение диагностической ; чимости метода ПЦР с использованием разработанного набора в сравнении с кла< ческими микробиологическими методами при исследовании биологических жщ стей у впервые выявленных больных показало, что эффективность определения Г. повысилась на 65 %.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммуноферментный анализ является перспективным методом определе: микобактерий туберкулеза.

2. Применение полимеразной цепной реакции для быстрого определения микоС терий туберкулеза позволяет значительно повысить эффективность лабораторной агностики туберкулеза.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы освещались на научно-практической конференции "Применение ИФА в медицине" (г.Харь-сов, 1989); на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты юлекулярной биологии" (г.Москва, 1991); на научно-практической конференции "Со-:тояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и шфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" (г.Пермь, 1993); ¡а 4-м национальном конгрессе по заболеваниям органов дыхания (г.С.-Петербург, [994); на 2-м съезде фтизиатров (г.Саратов, 1994); на 1-й Всероссийской научно-практической конференции "Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболева-гай" (г.Сочи, 1996).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 8 иучных работ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на русском языке и 166 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из следующих разде-юв: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных иссле-(ований, заключение, выводы, библиографический указатель. Библиографический ука-¡атель включает 72 отечественных и 167 зарубежных источников. Работа иллюстри-ювана 18 таблицами и 10 рисунками.

Внедрение результатов исследования. По результатам Государственных испыта-шй, тест-система Амплитуб для обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза методом юлимеразной цепной реакции (свидетельство о государственной регистрации меди-щнского иммунобиологического препарата № 010 от 27.02.95 г.) внедрена в прак-ику здравоохранения в Российском НИИ фтизиопульмонологии, в Адыгейском рес-[убликанском противотуберкулезном диспансере, в противотуберкулезных диспансе->ах гг. Кирова, Воронежа, Белгорода.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В соответствии с задачами исследования работа проводи-[ась по двум направлениям.

В процессе выполнения первого раздела работы по изучению чувствительности и пецифичности различных вариантов ИФА было проведено более 250 эксперименте. Использовали разведенные суспензии микобактерий туберкулеза Н1Г11у, г1лп1гасе11и1агае, инактивированные гамма-облучением (в дозе 2,5-3 млн. рад).

Постановку ИФА проводили в 96-луночных полистироловых планшетах для им-1унологических реакций производства Московского ВНИИМТ и фирмы "ЫпЬго".

Конъюгатом служили антитела диагностические против иммуноглобулинов мыши, юченные пероксидазой (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи) и антитела против иммуноглобулинов гьппи, меченные неорганической ппрофосфатазой (получены от О.А.Евтушенко, МГУ).

В ИФА использовали моноклональные антитела (МкАТ) 502, специфичные в от-юшении поверхностных антигенов микобактерий туберкулезного комплекса. МкАТ ыли получены в лаборатории иммунодиагностики РНИИФ МЗ РФ М.В.Андросовой.

В качестве субстратов использовали: для неорганической пирофосфатазы - пиро-юсфат натрия в 0,05 М Трис-НС1 (рН 9,0), содержащий 0,005 М для перокси-

;азы - раствор о-фенилендиамина и НгОг (0,003 %) в цитратно-фосфатном буферном детворе (рН 5,0), а также специальный субстрат для хемилюминесцентного способа етекции результатов ИФА фирмы "АшегзЬаш".

Учет результатов проводили на сканирующем иммуноферментном анализато{ отечественного производства (НПО "Научные приборы") марки "Линкей".

Материалом для исследований методом ПЦР явились музейные штаммы мик< бактерий, полученных из Государственного института стандартизации и контрол им. Л.А.Тарасевича, клинические штаммы МЛиЬегси1о8]з, полученные от больных подтвержденным туберкулезом легких и два штамма неспецифической микрофлорь В качестве диагностического материала для исследования использовали: мокрот (437 образцов), плевральный экссудат (8), промывные воды бронхов (46), спинномозг« вую жидкость (6), мочу (49). Всего исследовано 546 образцов диагностического матер! ала, полученных от 146 больных туберкулезом различной локализации и 77 больны неспецифическими заболеваниями, находившихся на стационарном лечении в Ро> сийском НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ и 59 городской клинической больниц«

При выделении ДНК из бактериальных суспензий для разрушения микобактери использовали лизоцим. Экстракцию проводили с помощью фенол-хлороформенной о1 работки и осаждали ДНК этанолом. Выделение ДНК из диагностических материале проводили путем инкубации осадков, после центрифугирования, в лизирующем буфе] ном растворе, содержащем 0,5 % додецилсульфата натрия в 0,1 М ИаОН при 97 "С, последующей экстракцией ДНК как отмечено выше.

Бактериологические исследования диагностического материала проводили на ба; бактериологической лаборатории РНИИФ МЗ РФ. Они включали бактериоскопию ма ков, окрашенных люминесцентными красителями и культивирование на плотной ш тательной среде Левенпггейна-Иенсена. Обработку материала и посев проводили г общепринятым методикам.

Статистическую обработку результатов исследования проводили по методу Стьюдент; Достоверность определяли с помощью *Ч" критерия. Для малых выборок статистически различия изучали с помощью метода Фишера, использовали критерий "Хи"-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИ]

В целях повышения эффективности лабораторной диагностики туберкулеза для о] ределенля растворимых антигенов МВТ и целых микобактериальных клеток изучал возможность применения методов ИФА в модельных опытах. Для этого использовал различные варианты проведения ИФА: конкурентный и неконкурентный анализ.

Конкурентный ИФА с использованием моноклональных антител и неорганически пирофосфатазы в качестве ферментной метки. В лунках полистиролового планше; адсорбировали МВТ, поверхностные антигены которых в иммунологической реакции св зывают моноклональные антитела. Это связывание определяли с помощью кроличье антител против мыши, конъюгированных с ферментом - неорганической пирофосф тазой.

Применение в качестве ферментной метки неорганической пирофосфатазы обесп чивало более высокую чувствительность анализа по сравнению с иммунопероксида ной реакцией, поскольку это позволяло использовать почти на порядок меньшую ко: центрацию МкАТ для определения одной и той же дозы МВТ, фиксированных в лу ках. Это можно объяснить тем, что уровень сигнала на один моль пирофосфатаз превышает на два порядка уровень сигнала, обеспечиваемого пероксидазой хре! (А.А.Вайкови др., 1987).

Определяемые (нефиксированные) МВТ из разведенных суспензий инкубировали I течение часа при 37 °С с МкАТ или вносили без предварительной инкубации одновременно) с МкАТ. Результат анализа определяли по ингибированию связыва-шя МкАТ с фиксированными МВТ.

Для выбора оптимальных концентраций фиксируемых МВТ и специфических МкАТ >ыла проведена серия экспериментов, где использовали МВТ в концентрации 10°-10т сл./мл, а МкАТ в концентрации от 2,5 мкг/мл до 20 мкг/мл.

При использовании фиксированных МВТ в концентрации 10т к л./мл и МкАТ 2,5 1кг/мл чувствительность конкурентного анализа (реакция ингабирования) была макси-тльной и составила 10' кл./мл. Уровень оптической плотности (ОП) для 10' кл./мл -оставил 0,51±0,02 о.е. (оптических единиц); в контроле без МВТ - 0,73±0,004 о.е.

Чувствительность конкурентного ИФА при ингибировании растворимым антигенным ipeпаратом МВТ (соникат) составила 0,1 мкг/мл. Вследствие того, что соотношение спе-(ифического антигена, выявляемого МкАТ, к общему белку сониката не превышает 1:10, [увствительность анализа составила приблизительно 0,01 мкг/мл или 1 нг в пробе.

Конкурентный ИФА с применением биотинилированных моноклональных ан-ител и ферментного конъюгата - стрептавидин-биотин-пероксидазы. Схема прове-[ения анализа аналогична описанной выше. Моноклональные антитела связывали в :имической реакции с биотином (Хсу С.М., 1988) и инкубировали в конечной концен-рации 5 мкг/мл с тестируемыми МВТ в концентрации от 101 кл./мл до 10° кл./мл.

Чувствительность реакции ингибирования при определении МВТ составила 10* кл./ 1л. Уровень ОП в опыте - 0,62±0,03 о.е., в контроле - 0,75±0,02 о.е. (при Р< 0,01). 1ри этом неспецифические клетки Micrococcus lysodeicticus в концентрации 10® кл./ [л реакцию не ингибировали (ОП составила 0,81±0,01 о.е.).

Зависимость величины ОП при ингибировании реакции в ИФА от концентрации пределяемых МВТ для двух вариантов конкурентного анализа представлена на рис. 1.

0 IQ1 IO2 I03 Ю4 Ю5 Ю3

Концентрация МБТ :<л./кл

'ис. 1 Результаты определения микобактерий туберкулеза в конкурентном ИФА

* * - ИФА с пирофосфатазным конъюгатом 0 0 ■ ИФА с пероксидазным конъюгатом * ■ Micrococcus lysodeicticus

Неконкурентный ИФА с использованием авидин-биотиновой системы включа. определение МБТ, сорбированных непосредственно в лунках планшета с использова нием моноклональных антител 6G2, и сэндвич-вариант ИФА. В качестве конъюгато] при проведении ИФА применяли стрептавидин-биотин-пероксидазный комплекс.

ИФА с прямой сорбцией МБТ в лунках планшета. При выборе температурноп режима и времени для сорбции МБТ в лунках, планшеты выдерживали различно время (от 2 часов до 24 часов) при температуре 37 °С и 56 "С Оптимальным режимо» сенсибилизации выбрали метод высушивания при 56 "С в карбонат-бикарбонатно» буферном растворе pH 9,6 с последующей фиксацией метанолом. В условиях пря мой сорбции МБТ с применением меченных биотином МкАТ уровень чувствительно сти ИФА составил 105 кл./мл (р<0,01).

Если в этом варианте ИФА использовали немеченные биотином МкАТ, а и: связывание с МБТ определяли с помощью биотинилярованных кроличьих антите. против IgG мыши (реакция двойных антител), то чувствительность повышалась в порядок, т.е. составляла 104 кл./мл (р<0,01).

ИФА с применением МкАТ был видоспецифичен при определенных концентраци ях микобактерий. Уровень ОП в лунках с нетуберкулезными микобактериям] M.intracellulare в концентрации 10е кл./мл соответствовал уровню ОП при концентра ции МБТ 104 кл./мл.

Сэндвич-вариант ИФА для определения микобактерий туберкулеза.

1. Кроличьи антитела к МБТ (сульфатная фракция) адсорбированные на твердо] фазе, инкубировали с суспензией МБТ в концентрации от 10! кл./мл до 10е кл./мл. ] качестве вторых антител использовали биотинилированные кроличьи антитела (т; же фракция) или биотинилированные МкАТ. Связывание вторых антител определяя с помощью комплекса стрептавидин-биотин-пероксидазы. Чувствительность анализа применением в качестве вторых антител биотинилированных моноклональных анти тел составила 10® кл./мл, а с биотинилированными кроличьими антителами - 104 кл. мл. Уровень ОП в реакции составил: 0,07±0,003 o.e. (для контролей); 0,17±0,01 о.е и 0,21 ±0,01 o.e. в опытных группах соответственно (Р<0,01).

В системе с двумя кроличьими антителами была изучена чувствительность авали за для определения растворимого микобактериального антигена (соникат). Чувства тельность анализа для растворимого антигена составила 0,1 мкг/мл.

2. Применение аффинно-очищенных кроличьих антител как в первом слое, так и качестве детектирующих антител, меченных биотином, позволило увеличить чувства тельность анализа до 10* кл./мл.

Величина оптической плотности составила в контрольной группе (без МБТ 0,15±0,016 o.e., в опытной группе (10' кл./мл) - 0,33±0,01 o.e.

3. Была изучена возможность учета результатов ИФА (сэндвич-вариант ИФА аффинно-очищенными кроличьими антителами) с помощью хемилюминесценции Чувствительность анализа не превысила уровень 10* кл./мл. Однако, кривая завися мости ОП от концентрации определяемых МБТ была более пропорциональной. P« зультаты сэндвич-ИФА приведены на рис. 2.

Таким образом, изучение возможности применения различных современны вариантов ИФА для определения МБТ в экспериментальных условиях позволило устс новить, что надежный уровень чувствительности составляет 10' кл./мл.

o io2 io3 io4 io5 lo6 o io2 io3 io4 io5

Кегаентрашя кЬТ <л./ыл Рис. 2 Учет результатов иммуноферментного анализа. А ■ с применением хемилюминесцентного субстрата. В - с применением хромогенного субстрата.

Другим важным направлением диссертационной работы было применение технологии полимеразной цепной реакции как перспективно наиболее чувствительной для определения возбудителя туберкулеза в клинических материалах.

Совместно с ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (к.б.н. Т.С.Де-нпсова) была решена задача создания отечественного набора реагентов для определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в биологических жидкостях (мокрота, плевральный экссудат, спинномозговая жидкость, моча). Проведено сопоставление эффективности определения МВТ традиционными методами (люминесцентная микроскопия и посевы на плотную питательную среду Левенштейна-Иенсена) и методом ПЦР при использовании разработанного набора реагентов.

Исследования по выбору мишени для постановки реакции амплификации проводили на базе фрагментов ДНК, кодирующих белок 38 кД М.tuberculosis (Manjunath N. et al., 1991) и белок МРВ 64 M.bovis BCG (Sjobring U. et al., 1990). В первом случае использовали праймеры МТ1, МТ2, во втором - ММ1, ММ2.

Оценку специфичности ПЦР проводили с использованием двух пар праймеров на препаратах ДНК, приготовленных из 17 музейных штаммов 15 видов микобактерий, 23 клинических штаммов М.tuberculosis, полученных от больных с подтвержденным диагнозом туберкулеза легких, и двух штаммов неспецифической микрофлоры. Принадлежность клинических штаммов к человеческому виду микобактерий была подтверждена по ниациновому и нитратредуктазному тестам. По результатам проведенных опытов было установлено, что все препараты ДНК штаммов микобактерий тубер-

кулезного комплекса дали положительную реакцию. Препараты ДНК четырнадцати штаммов атипичных видов микобактерий, а также Staph, aureus и Candida albicans не дали в геле видимых полос (табл. 1).

Таблица 1

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ КОБАКТЕРИЙ

И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ МИКРОФЛОРЫ

№ НАИМЕНОВАНИЕ Результаты реакции

п/п ШТАММА MM1, MM2 MT1, MT2

1. М. tuberculosis + +

2. M.bovis bovinus-8 + +

3. M.bovis В CG + +

4 -26 Клинические штаммы, полученные от больных туберкулезом

+ +

27. М. intracellular # 23

28. М. scrofulaceum N526

29. M.smegraatis ATCC # 607

30. M.kansasii # 30

31. M.marinum # 1218

32. M.simiae N29

33. M.gordonae # 1324

34. M.avium # 10

35. M.avium D4ER

36. M.xenopi AS # 1480

37. M.fortuitum # 389 N122

38. M.ferrae # 1450

39. M.gastrii # 1456

40. M.phlei ATCC 11758

41. Staph, aureus

42. Candida albicans

По результатам исследования была установлена более высокая чувствительность ПЦР с праймерами ММ1 и ММ2, фланкирующими фрагмент гена, кодирующего белок МРВ 64 (240 н.п.). Она составила 10 кл./мл или 0,01 пг очищенной хромосомной ДНК. Посевы на плотную питательную среду Левенпггейна-Иенсена давали рост в две-три колонии из суспензии при концентрации МВТ 101 кл./мл. При посевах из концентрации МВТ 10 кл./мл рост отсутствовал.

Специфичность синтезированного фрагмента ДНК в 240 н.п. была подтверждена методом гибридизации с меченным "Р олигонуклеотидным зондом, комплементарным к нуклеотидной последовательности внутри этого фрагмента.

В процессе исследований для постановки реакции амплификации были определены оптимальные значения для таких параметров как температура отжига, концентрация праймеров и ДНК-полимеразы и количество циклов амплификации.

Создание амплификационной тест-системы "Амплитуб" позволило на очередном этапе исследований добиться возможности обнаружения ДНК микобактерий туберкулеза в диагностических материалах от больных туберкулезом различной локализации и неспецифическими заболеваниями легких. Была подготовлена научно-техничес-

кая документация на разработанную тест-систему, включающая временную фармакопейную статью, экспериментально-производственный регламент и инструкцию по применению тест-системы.

В процессе проведения клинических и государственных испытаний было осуществлено сравнительное изучение эффективности выявления МВТ в образцах диагностического материала бактериологическими методами (люминесцентная микроскопия, посев на среду Левенштейна-Иенсена) и методом полимеразной цепной реакции. Суммарные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МЕТОДА ПЦР И БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ НА НАЛИЧИЕ МБТ

У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

Диагноз Число Число положительных результатов

наблю- люминесцентная

дений микроскопия посев ПЦР

Инфильтративный туберкулез

легких (впервые выявленный) 48 14 18 35

Инфильтративный туберкулез 7

легких 3-4 мес. лечения 31 11 17

Диссеминированный и фиброзно-кавернозны£

туберкулез легких (впервые выявленный) 16 7 11 13

Фиброзно-кавернозный

туберкулез легких (хроническая форма) 12 8 9 9

Всего: абс. 107 36 49 74

% 33,6 45,8 69,2

Внелегочные формы туберкулеза: 0 0

экссудативный плеврит 5 3

менингит 4 0 0 2

туберкулез мочевой системы 7 2 3 6

Всего: абс. 16 2 3 11

% 12,5 18,8 68,7

При исследовании мокроты от 64 больных с впервые выявленным туберкулезом легких (до лечения) положительный результат ПЦР наблюдался у 48 (75 %) больных, тогда как при культуральном исследовании микобактерии выявлены у 29 (45,3 %) больных, а методом люминесцентной микроскопии - у 21 (32,8%) больного. При обследовании 31 пациента с инфильтративным туберкулезом легких, получавших специфическое лечение в течение трех-четырех месяцев, положительные результаты были получены в 17 (54,8 %) случаях при использовании метода ПЦР, в 11 (35,5 %) случаях при культуральном исследовании и 7 (22,6 %) - при люминесцентной микроскопии. Отсутствие значимых различий по числу положительных результатов у больных с фиброзно-кавернозным и диссеминированным туберкулезом легких при использовании ПЦР и традиционных микробиологических методов исследования связано с более массивным бактериовыделением при рассматриваемой патологии.

В группе больных, страдавших плевритом туберкулезной этиологии, положитель ный результат методом ПЦР получен в трех из пяти случаев, тогда как традицион ными методами МВТ не обнаружены. В спинномозговой жидкости от четырех боль ных туберкулезным менингитом обнаружена ДНК микобактерий в двух случаях] традиционные методы давали отрицательный результат. При исследовании мочи 01 семи больных активным туберкулезом мочевой системы в шести случаях методом ПЦР получен положительный результат; при культуральном исследовании мико бактерии обнаружены в трех случаях, а методом люминесцентной микроскопии - I двух случаях.

Сопоставление результатов традиционных микробиологических методов исследо вания и ПЦР у отдельных пациентов в этой группе показало, что за исключением одного случая ПЦР была положительной при наличии роста микобактерий или положительного результата исследования методом люминесцентной микроскопии. Е вышеуказанном случае культура микобактерий, полученная от этого больного, былг исследована методом ПЦР и биохимическими методами. Было установлено, что культура микобактерий не относилась к микобактериям туберкулезного комплекса.

Воспроизводимость метода ПЦР изучали при трехкратном повторении исследо вания одного и того же препарата ДНК, давшего положительный или отрицательный результат. По результатам этого испытания воспроизводимость метода составила 100 %.

При исследовании диагностических материалов (мокрота, смывы из бронхов) от 61 больного неспецифическими заболеваниями легких (пневмония, хронический бронхит, рак легких) ПЦР была положительной в двух случаях. Микобактериальная ДНК был£ выявлена у одного больного раком легких, что могло быть связано с дecтpyкциef легочной ткани при наличии старых очагов туберкулезной инфекции. Во втором случае ПЦР была ложноположительной. При культуральных исследованиях также бых отмечен один ложноположнтельный результат.

При исследовании мочи от девяти больных хроническим неспецифическим пиело нефритом положительные результаты не выявлялись обоими методами.

Сравнительные результаты проведенных исследований представлены в табл. 3.

Таблица £

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ ПО СПЕЦИФИЧНОСТИ МЕТОДА ПЦР И БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ КЛИНИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ ОТ БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Диагноз Число Число положительных результатов

наблю- люминесцентная

дений микроскопия посев ПЦР

Неспецифические заболевания легких 61 0 1 2

Саркоидоз 7 0 1 4

Хронический пиелонефрит 9 0 0 0

Таким образом, при наличии по одному ложноположительному результату сравни ваемых методов, специфичность ПЦР и культурального метода составила 98 %.

При исследовании диагностического материала от семи больных саркоидозом методом ПЦР в четырех случаях была обнаружена ДНК микобактерий туберкулеза. У двух больных саркоидозом на рентгенограммах обнаруживали туберкулезные очаги. У одного из больных были выявлены МВТ в посевах мокроты, произведенных через два месяца. Это свидетельствовало о сочетании саркоидоза и туберкулеза. По данным зарубежных авторов микобактериальная ДНК методом ПЦР обнаруживается у больных саркоидозом в 50 % случаев (Saboor S.A. et al., 1992, Popper H.H. et al., 1994). Этиологическая роль МВТ при саркоидозе остается предметом дискуссий (Eckert Н., 1988).

Таким образом, технология полимеразной цепной реакции позволяет не только ускорить определение возбудителя туберкулеза, но и существенно повысить чувствительность анализа. В нашем исследовании продемонстрирована высокая специфичность метода ПЦР, не уступающая культуральному методу. Частота подтверждения клинического диагноза туберкулеза с помощью ПЦР значительно выше, чем с помощью культуральных методов исследования. Кроме того, как показали результаты исследований мокроты больных получавших специфическое лечение, ПЦР может служить средством контроля за эффективностью лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Набор реагентов "Амплитуб" для обнаружения ДНК возбудителя туберкулеза методом полимеразной цепной реакции может быть применен для быстрого и чувствительного определения микобактерий туберкулеза в диагностических материалах в целях ускоренной диагностики туберкулеза.

ВЫВОДЫ

1. Конкурентный иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител и конъюгатов на основе неорганической пирофосфатазы в качестве ферментной метки позволяет определять микобактерии туберкулеза с чувствительностью не менее 10' кл./мл; для растворимого антигена микобактерий туберкулеза уровень чувствительности анализа составляет 10 нг/мл.

2. Применение сэндвич-варианта иммуноферментного анализа с использованием аффинно-очищенных поликлональных антител и авидин-биотин-пероксидазного комплекса обеспечивает определение микобактерий туберкулеза с чувствительностью 10' кл./мл.

3. При использовании сэндвпч-иммунопероксидазного анализа и поликлональных антител с авидин-биотиновой системой комплекс растворимых антигенов микобактерий туберкулеза определяется в концентрации 100 нг/мл.

4. Разработан и испытан отечественный набор реагентов для определения ДНК микобактерий туберкулеза в клинических материалах методом полимеразной цепной реакции.

5. Диагностический набор для определения микобактерий туберкулеза методом полимеразной цепной реакции позволяет определять возбудитель туберкулеза в клинических материалах в течение 2-х дней с чувствительностью существенно (на 63,5%) превышающей метод посева на среду Левенштейна-Иенсена. Специфичность набора составляет 98%.

6. Применение набора реактивов для определения ДНК микобактерий туберкуле; методом полимеразной цепной реакции позволяет в кратчайший срок дифференцир вать культуру возбудителя туберкулеза от атипичных микобактерий.

СПИСОК РАБ01 ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИ]

1. Владимирский М.А., Шипина JI.K., Денисова Т.С. и др. Быстрое и чувствител ное определение микобактерий туберкулеза в диагностических материалах с помощь ПЦР // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Состояние перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфе ций", Пермь.- 1993.- с.ЗЗ.

2. Владимирский М.А., Шипина JI.K., Калинина М.В. и др. Применение ПЦР д. определения туберкулезного возбудителя в диагностических материалах // 4-й наци нальный конгресс по заболеваниям органов дыхания,- Москва.-1994.- с.209.

3. Владимирский М.А., Шипина JI.K., Калинина М.В. Определение микобактерий т беркулеза методом ПЦР // Материалы 2-п> съезда фтизиатров. Саратов.- 1994,-с.23

4. Приймак A.A., Владимирский М.А., Шипина JI.K. и др. Полимеразная цепн реакция - быстрый и высокочувствительный метод определения возбудителя тубе кулеза в биологических материалах // Пульмонология.- 1995.- N 3.- с.61-64.

5. Шипина JI.K., Владимирский М.А., Евтушенко О. Высокочувствительные м дельные системы с применением моноклональных антител для определения микоба терий туберкулеза. // Материалы научной конференции "Применение иммунофе ментного анализа в медицине".- Харьков, 1989,- с.77-78.

6. Шипина JI.K., Владимирский М.А., Адросова М.В. Стрептавидин-биотинов1 системы для определения микобактерий туберкулеза в биологических жидкостях мет дом ИФА // Материалы 2-го Всероссийского симпозиума "Теоретические и прикла ные аспекты молекулярной биологии".- Москва.- 1991.- с.211.

7. Шипина JI.K., Денисова Т.С., Владимирский М.А., и др. Применение полимере ной цепной реакции реакции для выявления возбудителя туберкулеза в диагностик ких материалах // Материалы научно-практической конференции "Молекулярш основы патогенеза и диагностики туберкулеза и другой легочной патологии".- Мое ва.- 1995.- с.56-56.

8. Шипина JI.K., Владимирский М.А., Денисова Т.С. и др. Полимеразная цепн реакция для определения микобактерий туберкулеза в клиническом материале Материалы 1-й Всероссийской научно-практической конференции "Применение п лимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний. Мето( лечения".- Сочи.- 1996.- с.105-110.