Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Совершенствование преаналитического этапа лабораторной диагностики туберкулезной инфекции

На правах рукописи,

ЧИНКОВА ЮЛИЯ ДМИТРИЕВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРЕАНАЛИТИЧЕСКОГО ЭТАПА ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: Гусякова Оксана Анатольевна,

доктор медицинских наук, доцент.

Официальные оппоненты:

Гладилин Геннадий Павлович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической и лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России;

Девдарилни Зураб Леванович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией иммунодиагностики ФГУЗ

Российский научно-исследовательского противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.

Ведущая организация - Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «/¿» и7 7 2012г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.094.04 при ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Музурова Л.В.

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема туберкулеза с каждым годом привлекает все большее внимание. Это связано с ростом заболеваемости, появлением тяжелых форм заболевания со смертельным исходом в странах Западной Европы, США и России, тогда как еще недавно туберкулез рассматривали как исчезающую болезнь (Хоменко А.Г., 2005; Перельман М.М., 2007). В мире ежегодно заболевают туберкулезом более 8 млн. человек; 85% из них - жители развивающихся стран; 3 млн. человек ежегодно умирают от туберкулеза (World Health Organization, 2000; WHO, Centersfor Disease Control, 2005).

Треть населения планеты сегодня инфицирована микобактериями туберкулеза, которые уносят больше жизней, чем любая другая инфекция: из всех смертей, которых можно было бы избежать, 25 % приходится на туберкулез. Сложившаяся ситуация охарактеризована ВОЗ как кризис глобальной политики в области туберкулеза (World Health Report, 2000).

В связи с этим точная и быстрая лабораторная диагностика инфекции стала особенно востребованной и актуальной (Карпищенко А.И., 2001; Попов С.А., Сабгайда Т.П., Пузанов В.А., 2007). Эффективность лабораторной диагностики туберкулезной инфекции обеспечивается тщательным, продуманным проведением всех этапов диагностического процесса - преаналитиче-ским, аналитическим, постаналитическим.

Исключительно велика значимость преаналитического этапа. Даже незначительные ошибки на этом этапе исследований неизбежно приводят к искажению окончательных результатов, не позволяя получить достоверные данные.

По сведениям, приводимым многими авторами, на преаналитический этап приходится от 57 до 68% всех диагностических ошибок, которые ведут к потере времени и средств на проведение повторных исследований, но, что еще более серьезно, - неправильной постановке диагноза. Таким образом, чтобы повысить качество лабораторных исследований, в первую очередь необходимо повысить качество сбора проб биологического материала.

Самый эффективный путь предотвращения ошибок преаналитического этапа - это разработка стандартов для каждой его процедуры. Опыт наиболее развитых стран Европы и США, где приняты такие стандарты, показывает, что при этом качество лабораторных исследований значительно повышается (Федорин И.М. с соавт., 2005; Дробниевский Ф., Балабанова Я.М., 2011).

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы научно-исследовательских работ: «Новые возможности индивидуализации донозологической диагностики и оптимизации лечебных мероприятий с учетом молекулярно-генетических особенностей организма и алиментарных факторов» (номер гос. регистрации 0120.0809697).

Цель исследования: повышение эффективности лабораторной диагностики туберкулезной инфекции.

Задачи:

1. Оценить влияние условий хранения и способов обработки мокроты на витальные свойства микобактерий туберкулеза (МБТ).

2. В условиях in vitro изучить влияние физических и химических факторов на витальные свойства микобактерий туберкулеза. Исследовать жизнеспособность возбудителей туберкулеза на каждом из этапов окрашивания мазка.

3. Определить диагностическую ценность сред Левенштейна-Иенсена, Финн-П и жидких питательных сред BBL MG1T 7 mL Mycobacteria Growth Indicator Tube для культурального исследования микобактерий туберкулеза. Оценить влияние железа на интенсивность роста микобактерий туберкулеза на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена.

4. Оценить клеточный состав крови и особенности метаболизма у больных туберкулезом 0(1) - AB(IV) групп крови.

5. Оценить диагностическую значимость ПЦР и ИФА - исследований для диагностики туберкулезной инфекции.

Научная новизна. Получен блок новых данных, обеспечивающих повышение эффективности лабораторной диагностики туберкулеза. Результативность бактериологических методов исследования непосредственно зависит от условий хранения и обработки мокроты. Обоснован оптимальный режим преаналитического этапа исследований, обеспечивающий максимальную сохранность и жизнеспособность возбудителя туберкулеза и минимальную контаминацию посторонней микрофлорой при замораживании биоматериала, использование для консервации трехзамещенного фосфата натрия. Получены новые данные, обоснованно позволяющие осуществлять выбор способа хранения и обработки мокроты. Установлено, что из бактерицидных средств, достигающих эффективного подавления роста микрофлоры, преимуществами обладает NALC-NaOH. По данным микробиологических исследований, установлено, что эффективность культуральной диагностики туберкулеза при посеве на среду Финн-П повышается на 36-59% по сравнению с использованием среды Левенштейна-Иенсена.

Получены новые данные, характеризующие витальные свойства микобактерий туберкулеза при обработке биоматериала деконтаминирующими растворами, высушивании мазка, облучении его ультрафиолетом, фиксировании открытым пламенем, пятнадцатиминутной экспозиции в 70°-ном этаноле.

Анализ данных по заболеваемости туберкулезом среди носителей 0(1) -AB(IV) групп крови показал, что большей предрасположенностью обладают пациенты с А(П) группой крови, у которых предиктивным фактором развития туберкулезной инфекции являются достоверно более высокие уровни сывороточного железа; лица с 0(1) группой крови являются более резистентными к данной инфекции.

Сопоставление результатов ПЦР, ИФА и бактериоскопического исследования мокроты показало, что исследование методом ПЦР необходимо для

пациентов с впервые выявленным туберкулезом для уточнения принадлежности МБТ к микобактериальному комплексу.

Научно-практическая значимость. Результаты исследований, проведенных в условиях in vitro, позволили регламентировать оптимальный режим хранения и консервации мокроты в зависимости от реальных условий работы, возможностей транспортировки, быстроты доставки биоматериала для лабораторного исследования. Предлагаемые способы позволяют выбрать оптимальное бактерицидное средство. Обоснованы преимущества использования для культуральной диагностики среды Финн-11 и жидкой питательной среды Middlbrook по сравнению со средой Левенштейна-Йенсена, что оптимизирует аналитический этап исследований и повышает качество диагностики туберкулезной инфекции. Показана аналитическая целесообразность использования жидких питательных сред при впервые выявленных случаях инфицирования микобактериями туберкулеза. В случае хронического течения заболевания для определения чувствительности возбудителя к антибактериальным средствам применение плотных питательных сред адекватно и аналитически надежно. Регламентирован новый эпидемиологический режим приготовления мазков мокроты, предполагающий комплексную обработку биоматериала ультрафиолетовыми лучами и фиксацию открытым пламенем, что обеспечивает безопасность диагностического процесса. Результаты мо-лекулярно-генетического исследования позволили оптимизировать обследование пациентов с впервые выявленным диагнозом «туберкулез». Получены новые данные, характеризующие ассоциированность туберкулезной инфекции с групповой принадлежностью крови. Установлены доминирование А(П) группы крови по частоте развития туберкулезной инфекции; минимальная частота встречаемости туберкулеза - у лиц с 0(1) группой крови. Получены новые сведения, отражающие генетически детерминированные особенности метаболических изменений у лиц с туберкулезной инфекцией с определенной групповой принадлежностью крови.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизация преаналитического этапа исследований с учетом выбора способа консервации мокроты, обеспечивающего сохранение витальных свойств возбудителя туберкулеза и максимального освобождения от конта-минантов, регламентирование условий хранения мокроты.

2. Преимущества среды Финн-П относительно среды Левенштейна-Йенсена по частоте положительных результатов и количеству контаминации; Корреляция результатов посевов, бактериоскопии, ПЦР и ИФА.

3. Неспецифические клинико-лабораторные показатели у больных туберкулезом: снижение содержания эритроцитов, гемоглобина; лейкоцитоз; лим-фоцитопения; моноцитоз; ускорение СОЭ; тенденция к эозинофилии.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на научно-практической конференции, посвященной 25-летию института последипломного образования СамГМУ (Самара, 2007); на Национальных днях

лабораторной медицины России - 2009 (Москва, 2009); Материалах Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Омск, 2009); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); конференциях «Аспирантские чтения» (Самара 2010 и 2011); Всероссийской конференции «Совершенствование оказания медицинской помощи больным туберкулезом» (Санкт-Петербург, 2011); на совместном заседании кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии Самарского государственного медицинского университета; Самарского регионального отделения Всероссийского общества молекулярных биологов и биохимиков; Ассоциации специалистов по клинико-лабораторной диагностике Самарской области (Самара, 2012).

Внедрение результатов в практику. Результаты данных исследований внедрены в практику работы бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной противотуберкулезный диспансер»; ЦРБ Красноярского района; в лекционный материал на постдипломном уровне обучения для клинических ординаторов кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразви-тия России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Ми-нобрнауки РФ; получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2099613356 от 26.06.2009г. Издано учебно-методическое пособие «Лабораторные методы диагностики туберкулезной инфекции», утвержденное центральным координационно-методическим советом ГОУ ВПО «СамГМУ» Росздрава от 03.10.2007 г.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию объектов и методов исследования, трех глав собственных данных, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 150 страницах, иллюстрирована 28 рисунками, содержит 25 таблиц. В работе использованы 220 литературных источников, из них 148 отечественных и 72 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследования проводились в ГБУЗ «СамГМУ» (главный врач - канд. мед. наук И.О. Лебедева) и на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «СамГМУ» Минздравсоц-развития России (зав. кафедрой - засл. деятель науки РФ, д-р мед. наук, профессор Ф.Н. Гильмиярова). Под наблюдением находились 686 пациентов с диагнозом «туберкулез легких» и контрольная группа- 212 практически здоровых лиц. Объектами исследования служили кровь, сыворотка крови, мокрота.

Общий анализ крови проводился с использованием автоматического гематологического анализатора «Sysmex КХ - 21» («Roche», Япония) с помощью коммерческого набора реактивов фирмы «Roche» (Германия). Получали аналитические результаты: количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина. Морфологическое исследование форменных элементов крови проводили с помощью светового микроскопа «Zeiss» по унифицированной методике, принцип которой состоит в микроскопии окрашенных мазков крови с дифференцированием различных форм лейкоцитов.

Определение наличия кислотоустойчивых микобактерий туберкулеза в мазке, приготовленном по унифицированной методике, в окраске по Циль -Нильсену, выполняли с помощью метода световой микроскопии на микроскопе «Прима Стар». Культуральные исследования на микобактерии туберкулеза проводили на плотных питательных средах Левенштейна-Иенсена, Финн-П (собственного приготовления) и на жидких питательных средах BBL MGIT 7 mL Mycobacteria Growth Indicator Tube; производство «Бэктон Ди-кенсон» (США). Идентификацию возбудителя осуществляли на плотных питательных средах. Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам (моксифлоксацину) выполняли с помощью наборов антибактериальных препаратов для определения лекарственной чувствительности производства «Бектон Дикенсон» (США) на плотных питательных средах (собственного приготовления) и на жидких средах, BBL MGIT 7 mL Mycobacteria Growth Indicator Tube, производство «Бэктон Дикенсон» (США).

Определение группы крови системы АВО проводили перекрестным способом и с помощью моноклональных антител, в случаях сомнительной детекции группы крови использовались тест-системы на основе методов агглютинации и гель-фильтрации (Scangel), производства Bio-Rad (США).

В сыворотке крови определяли концентрацию общего белка, мочевины, суммарных иммуноглобулинов G, общего билирубина, активность аланина-минотрансферазы, аспартатаминотрансферазы; исследовали концентрацию глюкозы, уровень железа. Исследования выполняли на автоматическом биохимическом анализаторе «Hitachi - 902», «Интегра 800» («Roche», Япония) с помощью коммерческого набора реактивов фирмы «Roche» (Германия). Внутрилабораторный контроль качества при выполнении исследований осуществляли с использованием контрольной сыворотки "Precinorm", "Precipat" («Roche», Германия).

Плазменное звено свертывающей системы крови исследовали с помощью автоматического анализатора STA-Compact («Roche», Франция) с использованием реактивов «Roche» (Франция); определяли концентрацию фибриногена, протромбиновый индекс.

Исследование уровня суммарных антител к микобактерии туберкулеза определяли методом иммуноферментного анализа с реагентами «Вектор-Бест» (производство России) с использованием «sandwich» - варианта одноступенчатого твердофазного ИФА на планшетах на иммуноферментном анализаторе «Униплан» (Россия) с применением термостатируемого шейкера

Е1гш (Литва) и автоматического промывающего устройства «Проппам» (Россия).

Определение наличия ДНК микобактерии туберкулеза проводили с помощью полимеразной цепной реакции на термоциклере 105, «Био Рад» (Индонезия) с помощью реагентов Био Рад (США).

Статистическая обработка результатов. Исследование формы распределения количественных показателей осуществляли визуально по гистограммам и графикам. Гипотезу о нормальности распределения проверяли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса и Ша-пиро-Уилки. Использовали критерий Стъюдента I и критерий Манна-Уитни-Вилкоксона и для сравнения двух групп и однофакторный дисперсионный анализ в классическом и непараметрическом вариантах (Краскела -Вилкоксона) для сравнения трех или четырех групп. При сравнении нескольких групп после собственно дисперсионного анализа выполняли апостериорные тесты по методу наименьшей значимости разности для выяснения, какие именно группы значимо различаются. Проводили анализ таблиц сопряженности качественных признаков. Рассчитывали критерии хи-квадрат Пирсона с поправкой Иетса и хи-квадрат отношения подобия.

Для разработки стандарта сбора мокроты с целью выявления микобак-терий туберкулеза микробиологическими методами было проведено сопоставление результатов культурального и бактериоскопического методов, полученных при аликвотировании мокроты одних и тех же пациентов при различных условиях хранения до посевов. После предварительного замораживания мокроты при температуре -20°С в течение 7 дней положительных посевов на питательной среде Левенштейна-Иенсена оказалось 23,25%, на Финн-II- 53,6%; отрицательные результаты на среде Левенштейна-Иенсена составили 75,55%, на Финн-Н - 45,3%; уровень контаминации составил - 1,2% и 1,1%, соответственно (рис. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

□ ЛевеншгеГш-Иенсен И Фннн-Н

положительным рост посторонне!! отрицательный результат посева флоры на результат посева

питательной среде

Рис. 1. Результаты посева диагностического материала, полученные после хранения мокроты в замороженном состоянии

в течение 7 дней.

Количество отрицательных результатов при микроскопии составило 78%. При обнаружении единичных микобактерий в препарате от 1 до 9 КУМ на 100 полей зрения - 5,2%, результат микроскопического исследования мокроты на 1+ -9,2%, на 2+-2,8% и на 3+составил 5,2% (рис.2).

1-9 КУМ на 100 полей зрения

10-99 КУМ на 100 полей зрения (1+) ■ 1-10 КУМ в 1 поле зрения (2+)

более 10 КУМ в 1 поле зрения (3+)

Рис. 2. Результаты микроскопического исследования мокроты после замораживания на 7 дней.

Анализ результатов влияния хранения мокроты при комнатной температуре в течение 2-3 дней позволил установить, что количество положительных посевов на питательных средах снижается, а также отмечается низкий уровень контаминации.

Частота получения положительных результатов на плотных питательных средах Левенштейна-Иенсена составляет 8,0%, на среде Финн-Н -14,5%; количество отрицательных результатов посевов - 88,4% и 81,5%; уровень контаминации 3,6% - 4,0% соответственно (рис. 3).

положительный рост посторонней отрицательный

результат посева флоры на результат посева питательной среде

□ Левенштейн-Иенсен □ Финн-П

Рис. 3. Результаты посева мокроты, полученные после ее хранения при комнатной температуре в течение 2-3 дней.

Количество отрицательных результатов микроскопии составило 91,0%. При обнаружении единичных микобактерий в препарате от 1 до 9 КУМ на 10 полей зрения - 3,0%, на 1+ - 3,0%, на 2+ - 2,0% и на 3+ - 1,0% (рис.4).

в отрицательный результат микроскопии в 1-9 КУМ на 100 полей зрения

10-99 КУМ на 100 полей зрения (1+)

■ 1-10 КУМ в 1 поле зрения (2+)

более 10 КУМ в 1 поле зрения (3+)

Рис. 4. Результаты микроскопического исследования мокроты, хранившейся при комнатной температуре в течение 2-3 дней.

Значительное снижение количества положительных результатов, возможно, связано с тем, что при длительном хранении мокроты в условиях комнатной температуры происходит размножение быстрорастущей микрофлоры, которая потребляет оставшийся кислород и питательные вещества быстрее в отличие от медленнорастущих микобактернй туберкулеза.

При оценке эффективности микробиологического исследования мокроты при хранении биологического материала в течение суток с использованием в качестве консерванта 10%-ного раствора трехзамещенного фосфата натрия, получены следующие данные: частота получения положительных результатов на плотных питательных средах Левенштейна-Иенсена составляет 18,6%; на среде Финн-11 - 36,5%; уровень контаминации на средах Левенштейна-Иенсена - 2,9%, на Финн-П - 2,8%; количество отрицательных результатов посевов - 79,0% и 60,7% соответственно (рис.5).

18,60%

36,50%

положительный рост посторонней отрицательный результат посева флоры на результат посева питательной среде

□ Левенштепн-Йенсен и Финн-П

Рис. 5. Результаты посева мокроты после хранения ее мокроты в консервирующем растворе натрия фосфорнокислого.

Применение трехзамещенного фосфата натрия также оптимизирует и результаты микроскопического исследования. Количество отрицательных результатов микроскопии составило 77,0%. Результаты микроскопии при об-

наружении единичных микобактерий в препарате от 1 до 9 КУМ на 100 полей зрения было 4,0%; результат микроскопического исследования мокроты на 1+ составил 8,0%; результаты микроскопии на 2+ - 4,0% и на 3+ составили 7,0% (рис.6).

Однако удлинение времени хранения мокроты в консервирующем растворе ведет к гибели микобактерии туберкулеза. Если экспозицию не удастся строго регламентировать, предпочтительным способом сохранения микрофлоры является замораживание биоматериала.

Для микробиологического исследования также доставлялась мокрота, полученная не позднее двух часов после отделения ее пациентом. Установлено: частота получения положительных результатов на плотных питательных средах Левенштейна-Йенсена составляет 15,5%; на среде Финн-П -23,3%; количество отрицательных результатов посевов - 79,9% и 72,8%; уровень контаминации - 4,6% и 3,9% соответственно (рис.6).

отрицательный результат микроскопии я 1-9 КУМ на 100 полей зрения

10-99 КУМ на 100 полей зрения (1+) ■ 1-10 КУМ в 1 поле зрения (2+)

более 10 КУМ в 1 поле зрения (3+)

Рис. 6. Результат микроскопического исследования мокроты, хранившейся в консервирующем растворе с натрием фосфорнокислым трехзамещенным.

Отрицательных результатов микроскопии было выявлено 82,0%. При обнаружении единичных микобактерий в препарате от 1 до 9 КУМ на 10 полей зрения - 3,0%, на 1 + - 6,0%, на 2+ - 4,0% и на 3+ - 5,0% (рис. 8).

положительный рост посторонней отрицательный

результат посева флоры на результат посева питательной среде

□ Левенштейн-Пенсен □ Финн II

Рис.7. Результаты культурального исследования мокроты, не подвергавшейся хранению более 2 часов.

Таким образом, установлено, что оптимальным способом обработки мокроты является быстрое, в течение 1 часа, замораживание биоматериала при -20'С без применения консерванта, что обеспечивает оптимальную сохранность микобактерий, снижение контаминации образцов посторонней флорой.

Действие низких температур оказывается особенно губительным для сапрофитных микроорганизмов, попадающих в мокроту из полости рта, в отличие от высокоустойчивых возбудителей туберкулезной инфекции. Более низкий процент положительных высевов при стабилизации пробы консервантом, вероятнее всего, связан с его с угнетающим действием не только на сапрофитную флору, но и на возбудителя туберкулеза.

в отрицательный результат микроскопии

■ 1-9 КУМ на 100 полей зрения

10-99 КУМ на 100 полей зрения (1+)

■ 1-10 КУМ в 1 поле зрения (2+)

более 10 КУМ в 1 поле зрения (3+)

Рис. 8. Результаты микроскопического исследования мокроты не подвергавшейся хранению более 2 часов.

Условием проведения эффективного микробиологического исследования, безусловно, является полное уничтожение контаминантной микрофлоры при сохранении витальных свойств возбудителя туберкулеза. Это позволяет исключить конкуренцию между сапрофитной и патогенной микрофлорой в процессе роста на питательных средах.

В настоящее время антимикробные средства, используемые для декон-таминации, не обладают избирательным действием и оказывают бактерицидный эффект не только на нетуберкулезную микрофлору, но и на возбудителя туберкулеза. Уникальное строение, состав клеточной стенки микобактерий не защищают ее от губительного действия применяемых деконтаминирую-щих растворов.

Проведенная сравнительная оценка используемых бактерицидных средств при анализе результатов посевов и микроскопических исследовании, полученных при воздействии на биоматериал разных деконтаминантов. показала, что оптимальным является NALC-NaOH, который при хорошем угнетении посторонней флоры достаточно щадяще воздействует на микобактерию туберкулеза, что проявляется и в интенсивности роста, и при визуальной оценке микроскопическим методом (рис.9).

Мокрота, обработанная натрием фосфорнокислым зрехзамещенным

60^09«

Мокрота, обработанная >чгА1.С->.тАОН 13 рост посторонне!! флоры на питательной среае в положительный результат посева □ отр|шательный результат посева

Рис. 9. Результаты посевов на плотные питательные среды при декон-таминации мокроты натрием фосфорнокислым трехзамещенным и

1Ч АЬС - N3011.

Безопасность работы медицинского персонала - важное направление развития лабораторной диагностики, наряду с повышением аналитического качества и надежности методик. Любое нововведение как в диагностике, так и в лечении, может считаться прогрессивным только тогда, когда не несет дополнительной угрозы токсического или контагиозного воздействия.

90,9% 100,0%

iuu,u-/o 90,9% iu

27,0%

®HF ШШШ

мазки высушенные ';. пришитом сеем мазки вшгушмшые 6« фтхашт нал при дйешюы;свете с пламенем горенки, фиксацией над ' шмыемем горсчки

0

ори УФ с фиксацией ■ , над пламенем

•..л-:-.".; • /: . «ч»™ ■

Шояожтааиый результат п

il результат посева

Рис. 10. Результаты посевов соскобов с мазков, приготовленных из культуры микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах Левенштейна -Иснсена и Финн-П

Преаналитический этап клинико-лабораторной диагностики возбудителя туберкулеза несет в себе высокий эпидемиологический риск заражения. В проделанной нами работе проведена серия экспериментов для оценки качества обеспложивания биологического материала в процессе его обработки. При посеве материала, полученного после соскоба с препаратов мокроты, высушенных при комнатной температуре в вытяжном шкафу, на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-П, получен рост микобактерий туберкулеза. Также получены результаты посевов при инокуляции соскобов с мазков, высушенных при комнатной температуре в вытяжном шкафу и после фиксации над пламенем горелки: жизнеспособность микобактерий в больше степени сохранена. Более того, витальные свойства микобактерий сохраняются и после ультрафиолетового облучения, рекомендованного в качестве бактерицидного фактора.

Биологическая безопасность достигается при сочетании высушивания мазка при комнатной температуре с облучением ультрафиолетовыми лучами и последующей фиксацией открытым пламенем, в результате чего происходит полная потеря жизнеспособности микобактерий туберкулеза (рис. 10).

Известно, что микобактерии туберкулеза за счет особенностей структуры и состава клеточной оболочки и цитоплазмы обладают высокой гидро-фобностью, а также щелоче- и кислотоустойчивостью, обусловленных наличием в протеогликолипидном слое миколевой кислоты и ее производных (Перельмаи М.М., 2007).

* ] 0 день ■ 1 3 день I 6 день 32 день

Ри.11. Влияние этанола на витальные свойства микобактерий туберкулеза.

Изучение степени бактерицидного действия этилового спирта на мико-бактерии туберкулеза показало, что при десятиминутной экспозиции в семидесятиградусном растворе этанола наблюдается появление роста на плотных питательных средах Левенштейна-Йенсена и Финн-11 на 32-е сутки, что свидетельствует о высокой жизнеспособности бактериальных клеток, сохранившейся при действии этанола, водоотнимающего, денатурирующего белки и экстрагирующего липиды из мембранных образований. Это обусловлено защищенностью сложных липидов и белков клеточных мембран микобактерий углеводным компонентом. Полная инактивация роста микобактерий наступает при пятнадцатиминутной экспозиции в 70°-ном этаноле (рис. 11).

Для повышения результативности культурального метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на нескольких питательных средах (2-3). Для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза чаще всего применяют различные по составу плотные питательные среды. В качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя и определения его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендована среда Левенштейна-Йенсена. Как известно, это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают на 15-25-й день после посева бактериоскопически положительного материала. В последние годы широкое распространение в нашей стране получила яичная среда, предложенная Э.Р.Финном (среда Финна-!!). Она отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что вместо Ь-аспарагина в ней используется глутамат натрия. При сопоставлении данных посевов, полученных на средах Левенштейна-Йенсена и Финн-П и результатов бактериоскопии, нами установлены явные преимущества среды Финн-11 как в частоте положительных результатов, так и в частоте контаминации, причем наблюдается положительная корреляция количества положительных результатов, полученных на среде Финн-11, и уровня бактериовыделения, оцененного при бактериоскопии, что не отмечено при использовании среды Левенштейна-Йенсена. Таким обра-

зом, культуральная диагностика при посеве на среду Финн-П улучшается на 36-59% (табл. 1).

Таблица 1

Сопоставление аналитической чувствительности питательных сред

Результат бактериоскопии Результат посева на среде Фппн-11 (%) Результат посева на среде Левепштеипа-Йепсепа (%) Результат посева па жидкие питательные среды (%)

(+) (-) Коит. (+) (-) Копт. (+) (-) Копт.

Отрицательный 16,5 80,4 3,1 4,8 95,0 0,2 20,6 77,2 2,2

1-9 КУМ на 100 п/з 80,0 18,5 1,5 44,6 55,4 0,0 83,6 14,6 1,8

1+КУМ 85,4 10,4 4,2 41,7 56,3 2,0 87,3 10,2 2,5

2+ КУМ 94,7 5,3 0,0 34,0 64,2 1,8 90,6 6,3 3,1

3+КУМ 91,8 1,4 6,8 35,6 61,6 2,8 95,6 1,2 3,2

При применении сред, сбалансированных по солевому составу и источникам азотистого питания, отличающихся от среды Левенштейна-Иенсена, культуральная диагностика туберкулеза улучшается в среднем на 36-59%. Это особенно важно при таких формах туберкулеза, при которых возбудитель паразитирует в условиях ацидоза и анаэробиоза и при интенсивной химиотерапии, в процессе которой происходит повреждение различных метаболических систем микробной клетки.

Таблгща 2

Чувствительность микобактерии туберкулеза

На жидкой питательной среде М01Т 960 (%) Время получения результата (дни) На плотной питательной среде Леиепштейна-Иепсепа (%) Время получения результата (дни)

Чувствительность | 81,25 Устойчивость | 18,75 9.2 Ч у в ств ител ь и ость 81,9 21

10,2 Устойчивость 18,1 21

Полученные нами данные свидетельствуют о значительном преимуществе по скорости получения результатов культивирования микобактерий туберкулеза для исследования чувствительности к моксифлоксацину (среднее время детекции микобактерий на анализаторе ВАСТЕС 960 составляет 9,2 суток против 21 на плотных питательных средах), однако результаты специфичности исследования существенно не отличались (табл. 2).

Таким образом, использование жидких питательных сред в проведенном исследовании показало свою аналитическую обоснованность, особенно в случаях впервые выявленной инфекции. При хронической инфекции, когда

временной интервал начала терапии имеет более гибкие рамки, применение плотных питательных сред обосновывает свою адекватность и достаточную аналитическую надежность.

Своевременное выявление лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза, и быстрое подтверждение диагноза - это лишь один, хотя и важный, фактор, определяющий успех противотуберкулезных, в том числе и профилактических, мероприятий; другой не менее важный фактор - поиск предикторов развития туберкулезной инфекции.

60%

33,60%

Ü Больные туберкулезом У Группа сравпения

Рис. 12. Частота встречаемости туберкулезной инфекции у обследованных с различной групповой принадлежностью крови по системе

ABO.

При обследовании 686 пациентов в сравнении с частотой распределения групп крови по системе ABO у населения Самарской области выявлена взаимосвязь частоты развития туберкулезной инфекции с групповой принадлежностью крови по системе ABO.Туберкулезная инфекция встречалась достоверно чаще у лиц А (II) группы крови - в 65% (р<0,001). Достоверно реже у пациентов с 0(1) группой крови - 25% (р<0,001) (рис 12).

При изучении метаболизма у больных туберкулезом отмечаются незначительное увеличение содержания билирубина, снижение уровня мочевины, незначительное повышение глюкозы в крови (рис.13).

150,0%

Рис. 13. Особенности метаболизма п клеточного состава крови больных туберкулезом.

Анализируя колебание метаболических показателей у больных туберкулезом с 0(1) - AB(IV) группами крови, можно отметить, что все они находятся в пределах референтных величин, однако при сопоставлении с данными группы сравнения наблюдается формирование определенных тенденций. В частности, более низкое содержание белка у клинически здоровых лиц с В(Ш) группой крови, а у обследованных - выявлено с А(П); самое низкое содержание мочевины - у лиц AB(IV) группы крови, при туберкулезе с B(III) и 0(1)группами крови; самое высокое содержание у клинически здоровых с 0(1)группой крови у больных AB(IV). У обследованных с АВ(1У)группой крови наблюдается тенденция к более низкой концентрации глюкозы (рис. 14). Следует отметить, что у пациентов В(Ш) имеются тенденции к более низкой активности обмена аминокислот. Активность АЛАТ и АСАТ характеризуется относительно низкой активностью. С этим согласуется и меньшее содержание мочевины и фибриногена в сыворотке крови.

У всех пациентов с туберкулезной инфекцией обнаружены повышенный уровень сывороточного железа при низких цифрах эритроцитов и гемоглобина. Железо необходимо для реализации иммунных функций, для роста бактерий, оно также влияет на экспрессию ключевых генов, ответственных за вирулентность микроорганизмов. Так, избыток железа может повлиять на исход инфекции. При синдроме высокого содержания железа у больных, которым дополнительно вводили железосодержащие средства или эритромассу при лечении анемии, повышается чувствительность к инфекциям, вызванным Yersinia spp., Salmonella spp. и M.tuberculosis. В проведенном исследовании максимальный уровень железа был отмечен именно у носителей А(П) группы крови, среди которых выявлена высокая заболеваемость туберкулезом. Содержание форменных элементов крови и гемоглобина в группе больных туберкулезом также характеризуется рядом особенностей. Отмечено снижение

количества эритроцитов, гемоглобина; характерны лейкоцитоз; лимфоцито-пения; моноцитоз; эозинофилия; ускорение СОЭ. Известно, что характер гемограммы характеризует фазу патологического процесса. Установленные лейкоцитоз, ускорение СОЭ, лимфопения отражают остроту туберкулезного процесса (рис. 13).

Моноциты Эозннофнлы

Лцмфошггы

Сетментонлерпые ПСИТрофн.ТЫ

Палочкоилерные неГгтрофши

Протромбин

-А(П)

Глюкоза

—Ш111)

Фибриноген

Билирубин

AB(IV)

Сывороточное нмуноглобулнны G

Генеральная совокупное! ь

Рис. 14. Группоспецифнческпе особенности метаболизма н клеточного состава крови при туберкулезе.

При сопоставлении содержания форменных элементов крови у больных с группой сравнения 0(1) - AB(IV) групп крови выявлены особенности, характерные для AB(IV) группы крови (рис. 14). И у больных, и у клинически здоровых - наиболее низкое содержание сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, более высокое - лимфоцитов, по сравнению с данными для других групп крови. Отличие - у больных туберкулезом AB(IV) группы крови содержание превышает их количество в 0(1), A(II), B(III) группах.

Особенности, характерные для AB(JV) группы крови, очевидно, являются одним из факторов, обуславливающих более легкое течение этого заболевания у больных с этой группой крови, чему способствуют, на наш взгляд, относительно более высокое содержание лимфоцитов и моноцитов, обеспечивающих гуморальный и клеточный иммунный надзор, более низкая аллергическая настроенность организма. Несколько более низкие величины СОЭ при относительно низком содержании эритроцитов отражают не только состояние клеточных мембран этих клеток, но и характерные сдвиги в составе плазмы крови, в частности, за счет гамма-глобулинов. Наиболее выражен анемический синдром у носителей 0(1) и AB(IV) групп крови (Гильмиярова Ф.Н. с соавт., 2007; Гусякова O.A., 2009). При изучении распределения больных туберкулезом по группам крови выявлено преобладание А(П) группы

крови среди пациентов с туберкулезом; у пациентов с 0(1) группой крови отмечается более редкая частота встречаемости туберкулеза.

Левенштейн-Йенсен Финн-II ЛевенштеГш-Ненсеп

с добавлением оксида железа

■ положительный результат рост посторонней флоры отрицательный результат

Рис. 15. Влиянне оксида железа на интенсивность роста микобак-терин туберкулеза.

Группоспецифическими особенностями метаболизма и клеточного состава крови при развитии туберкулезной инфекции, ассоциированными с 0(1) группой крови, являются максимально стабильные показатели белкового обмена - наиболее высокая концентрация общего белка, максимальный про-тромбиновый индекс и содержание фибриногена, низкие значения количества эритроцитов, лимфоцитов, уровня гемоглобина. Для пациентов-носителей А (II) группы крови характерны, напротив, самые низкие показатели метаболизма белков - минимальный уровень общего белка, протромбина, билирубина при максимальном уровне гликемии; максимальные значения количества лейкоцитов.

В опытах in vitro (рис. 15) подтверждена повышенная потребность микобактерии туберкулеза к наличию этого важного микроэлемента путем сопоставления роста на традиционной среде Левенштейна-Иенсена и модифицированной с добавлением оксида железа в конечной концентрации 2%. Получено значительное преимущество в скорости роста микобактерии на 25,6 %; количество КОЕ увеличилось практически вдвое; частота положительных высевов - на 12,2%.

Получены данные о результативности применения полимеразной цепной реакции у больных туберкулезом (рис. 16). При исследовании одних образцов результаты бактериоскопии были позитивными в 12,1% случаев, результаты ПЦР - в 14,6%, культурального исследования - в 16,7%. Таким образом, ПЦР оказалась достаточно информативной, доступной и главное - бы-

стровыполнимой. Она достаточно информативна при необходимости подтверждения диагноза туберкулеза у детей, подростков и впервые выявленных больных при отрицательных результатах традиционных микробиологических методов исследования.

-Н7,90»/о

-85,40%

■ Положительный результат иОтрнцательнмй результат

Рис. 16. Сопоставление информативности бактериоскопии, культураль-иого исследования и ПЦР-диагностпки при туберкулезе.

Таким образом, совершенствование микробиологической диагностики туберкулеза невозможно без изучения не только биологических свойств возбудителя, но и особенностей взаимодействия с макроорганизмом, поиска биологических маркеров хозяина, обуславливающих природу и тяжесть специфической инфекции, стандартизации и унификации используемых рутинных методик, оптимальной организации микробиологических исследований и внедрения в лабораторную практику всех составляющих системы обеспечения качества.

ВЫВОДЫ

1. Эффективность микробиологических методов диагностики туберкулезной инфекции зависит от условий хранения и обработки мокроты: оптимальным условием хранения биоматериала является замораживание при -20°С, обеспечивающее максимальную сохранность возбудителя и минимальную контаминацию материала посторонней флорой. Хранение мокроты при комнатной температуре в течение 2-3 дней снижает количество положительных посевов на питательных средах. 10%-ный натрий фосфорнокислый трехзамещенный обеспечивает высокий положительный результат бактериоскопического и культурального исследования. Удлинение времени хранения биоматериала в консервирующем растворе свыше 72 часов ведет к гибели микобактерий туберкулеза, в связи с чем при невозможности строго регламентировать длительность хранения мокроты предпочтительным способом является ее замораживание. Оптимальный для сохранения витальных свойств ми-

кобактерий туберкулеза и угнетения посторонней флоры, является NaLc-NaOH.

2. Витальные свойства возбудителя туберкулезной инфекции угнетаются при высушивании мазка мокроты при комнатной температуре и облучении его ультрафиолетовыми лучами, фиксации открытым пламенем или после пятнадцатиминутной экспозиции 70°-ным этанолом.

3. Культуральная диагностика туберкулеза при посеве на питательную среду Финн-11 повышается на 36-59% по сравнению с использованием среды Левенштейна-Иенсена. Рост колоний на плотной питательной среде наблюдался на 21 день, на жидкой питательной среде - на 14-й день.

4. Выявлено преобладание лиц с А(П) группой крови среди пациентов с туберкулезом (65%). Группоспецифическими особенностями метаболизма и клеточного состава крови при развитии туберкулезной инфекции, ассоциированными с 0(1) группой крови, являются максимально стабильные показатели белкового обмена — наиболее высокая концентрация общего белка, максимальный протромбиновый индекс и содержание фибриногена, низкие значения количества эритроцитов, лимфоцитов, уровня гемоглобина. Для пациентов-носителей А (II) группы крови характерны самые низкие показатели метаболизма белков - минимальный уровень общего белка, протромбина, билирубина при максимальном уровне гликемии; максимальные значения количества лейкоцитов.

5. При подозрении на наличие у пациента туберкулезной инфекции и при отрицательных результатах микроскопического исследования мокроты показано ПЦР исследование, которое дает больший процент положительных результатов в первые дни исследования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для повышения эффективности лабораторной диагностики туберкулезной инфекции рекомендуется на преаналитическом этапе исследований проводить замораживание биоматериала при температуре -20°С в течение 10 дней, что обеспечивает сохранение витальных свойств возбудителя и минимальную контаминацию; использовать в качестве консервирующего раствора 10%-ный раствор трехзамещенного фосфата натрия, в случае если длительность хранения не превышает 72 часов. При удлинении времени хранения мокроты, целесообразно использовать замораживание, а также применять NALC-NaOH в качестве деконтаминирующего средства для подавления посторонней микрофлоры и сохранения жизнеспособности микобактерий туберкулеза.

2. На аналитическом этапе исследований бактериологическими методами рекомендуется использовать плотную питательную среду Финн-П и жидкую питательную среду MGIT. Показана аналитическая эффективность использования жидких питательных сред в случаях впервые выявленного туберкулеза.

В случае хронического течения заболевания для определения чувствительности возбудителя к антибактериальным средствам применение плотных питательных сред адекватно и аналитически надежно.

3. В целях обеспечения эпидемиологической безопасности лабораторных исследований целесообразно перед фиксацией мазка мокроты над пламенем проводить ультрафиолетовое облучение.

4. У пациентов с впервые выявленным туберкулезом для уточнения принадлежности МБТ к микобактериальному комплексу необходимо проводить ПЦР исследование, что позволит своевременно назначить адекватное лечение.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Машкова, Ю.Д. Лабораторные методы диагностики туберкулезной инфекции: учебно- методическое пособие / И.А. Зубова, Маломанова H.A., Ю.Д. Машкова. - Самара: ГОУ ВПО «СамГМУ» Росздрава, 2007. - 38 с.

2. Особенности метаболического и клеточного состава крови, ассоциированные с групповой принадлежностью в системе ABO, в норме и патологии / Ф.Н. Гильмиярова, Ю.В. Мякишева, Ю.Д. Чинкова и др. // Астраханский медицинский журнал. -2008. -Том 3,- №3. - С.76-79.

3. Чинкова, Ю.Д. Факторы, определяющие повышенный риск инфицирования туберкулезной инфекцией / Аспирантский вестник Поволжья.- Самара. - 2009. - №7-8. - С.73-74.

4. Фундаментальные исследования молекулярных признаков AB0-принадлежности, реализованных в показателях метаболизма и клеточного состава крови в норме и патологии / Ф.Н. Гильмиярова, O.A. Гусякова, Ю.Д. Чинкова //Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии: Материалы Российской конференции, посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. - Челябинск, 2009.-С.27-29.

5. Повышение эффективности скрининга инфицированности доноров вирусом гепатита С / Л.С Карслян, O.A. Кизирова, Ю.Д. Чинкова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009,- С. 229-230.

6. Чинкова, Ю.Д. Использование автоматизированной системы ВАСТЕС 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г.Самаре / Я.М. Балабанова, И.М. Федорин, Ю.Д. Чинкова // Туберкулез и болезни легких. -2009. -№10. - С.63-70.

7. Влияние малых молекул на процессы межмолекулярного взаимодействия, лежащие в основе лигандных технологий лабораторной диагностики / Ф.Н. Гильмиярова, O.A. Гусякова, Ю.Д. Чинкова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №7. - С. 14-18.

8. Аналитические подходы к лабораторной диагностике социально значимых вирусных заболеваний / Ф.Н. Гильмиярова, O.A. Гусякова, Ю.Д. Чинкова // Клиническая лабораторная диагностика.- 2010. - №9. - С.30.

9. Чувствительность и специфичность молекулярно-генетической тест-системы НАПЧ MTBDRPLUS для экспресс - диагностики лекарственной

чувствительности микобактерий туберкулеза на материале мокроты / В.В.Николаевский, Я.М. Балабанова, Ю.Д. Чинкова и др. //Туберкулез и болезни легких. - 2010. - №4,- С. 28-34.

10. Чинкова, Ю.Д. Оптимизация алгоритма лабораторной диагностики туберкулеза и оценка его экономической эффективности/Ю.Д.Чинкова // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: Материалы Всероссийской научно-практической конференции,- СПб., 2011,- С. 121 -122.

Изобретения

1. Программа для обработки данных биохимического, гематологического, иммунологического, гемостазиологического исследований крови человека путем сравнения их с референтными величинами 0 (I) - AB (IV) групп крови / O.A. Гусякова, И.А. Зубова, Ю.Д. Чинкова и др.; Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2099613356 от 26.06.2009г.

Список сокращений ИФА - иммуноферментный анализ КОЕ - колонии образующие единицы КУМ - кислотоустойчивые микобактерии МБТ - микобактерия туберкулеза ПЦР - полимеразная цепная реакция СОЭ - скорость оседания эритроцитов NaLc - М-ацетил-Ь-цистеин

Подписано в печать 01.02.2012 г. Объем - 1 печ.л. Тираж 100. Заказ №

Отпечатано в типографии клиник Самарского государственного медицинского университета по адресу: 443079, г. Самара, пр. Карла Маркса. 165-6.

л*

ф

2011355851

2011355851