Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные антитела серии ИКО в иммунофенотипировании клеток животных

Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского

На правах рукописи

УДК 576.8.097.3

САНДОВА Ольга Михайловна

МОНОНЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА СЕРИИ ИКО В НММУНОФЕНОТИПИРОВАНИИ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1 994

. Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии.

Научные руководители: (

докт. мед. наук, профессор, академик РБА А. Ю. Барышников;

канд. биол. наук, ст. научный сотрудник В. В. Новиков. ' Официальные оппоненты:

докт. биол. наук, профессор Р. В. Ленская;

канд. (иш, наук Т. К. Лопатина.

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова Российской АМН.

Защита состоится « 3 » 1994 г. в [Час,

на заседании специализированного ученого совета К, ^Т* при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Г. Габричевского по адресу: 125212, Москва, ул. адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Н. Г. Габричевского.

-.Л¿Г* ^¿¿с/а

Автореферат разослан «л? » ¿ичлгс/а 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат мед. наук

О. В. Котельникова

• - 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЯВДСТЙКА РАБОТЫ

Актуальность темы, Моаоклоаальныз антитала (МКА) нашли широкое применение в различных областях биологии я медицины, в том числа и ni» ищунофааотиоировании клеток человека я животных. За последние года в Онкологическом научном центре РАМН nia участии Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии была получена панель мышиных МКА к дафферанцировочным антигенам гемопоэ-тических клеток человека, предназначенных для оценни состояния иммунитета в имцунодиагностики лейкозов (антитела серии ИКО). В то же время за рубежом накапливаются сведения о получении-и свойствах МКА к поверхностным антигенам клеток животных. Известны работы, в которых описываются МКА к антигенам иммунной системы крыс в мышей (Bodeue u.et al. 1985).Получены МКА, выявляющие хвлперные и супрессорные популяции Т-лам$оцитов свиней (Saalmul-ler A. et.al.1987), создана панель МКА. к антигенам II класса системы гистосовмеотимостя овец (Purl n.k. et alI987). В России существуют лишь единичные сообщения о МКА, направленных к антигенам лимфоцитов крупного рогатого скота (Куценко Н.Н. и соавт. Í990). •

Кроме того, имеется информация о МКА, реагирующих с антигенами клеток крови как человека, так я животных (watanabe M. et al. 1Э83,Andxewa Е.А. et а11ЭЭ1), Чаще всего явление межвидовой перекрестной реактивности объясняется тем, что мевду гомологичными молекулярными образованиями у различных видов животных существует структурное сходство, которое проявляется в процессе эволюции через сохранение от вида к виду идентичных или близких по строению антигенных детерминант. Это приводит к тому, что МКА, взаимодействующие с какой-то молекулярной структурой одного вида способны давать реакцию о гомологичной структурой другого вида.

Актуальность диссертационной работы определяется том, что

' - 4 -

МКА, рвагирутздие о клетками животных могут быть использованы для язучения именной системы животных, найти применение в ветеринарии я экспериментальной яшунология.

Цель работы. Целью диссертационной работы является скрининг и характеристика МКА против диффвренцировочшк антигенов лейкоцитов животных я оценка возможности их применения для ищуно-фенотипированяя клеток животных различных видов.

Задачи исследования:

1. Провести характеристику МКА, направленных к поверхностный антиге.ам клеток имыдгнной системы лабораторных крыо.

2. Провести окравинг МКА сещи ИКО, перекрестно взаимодай-стнуадах о клетка»« животных.

3. Изучить возможность использования МКА серей ИКО для оценки состояния кдеточясго иммунитета у животных»

4. Провести ию/уаофеаотипирование клеток крови кдгпного рогатого скота, поражааного лейкозом»

Положения, выносимые на защиту; ,

1. МКА ИК0-Ю1 направлены к С14 антигену крысы. Эти антитела реагируют с хелпврно/индукторными Т-лим$оцитами крысы, ин-гибидуют реакцию блаоттрансформации в блокируют связывание аналогичных МКА МАгЗбЭ против антигена СМ крысы.

2. МКА ИК0-109 и Ж0-112' направл9ны к 1а-подобным антигенам крысы. Они имеют спектры активности, характерные для антител к ,1а-аитигену и ингибирутареакцию бласттрансформации. МКА ИК0-Ю9 и КК0-Ы2 выявляет те. >.е оамые или близкие эпитопы, что и аналогичные МКА 0X3, направленные к Ха-подобным антигенам.

. : 3. МКА серии ИЮ,'выявляющие антигены поверхности клеток человека, взаимодействует также о антигенами клеток ряда животных и могут быть использованы для имщунофенотидирования клеток животных.

, . - 5 - . ;..'-.■■■'.■"'■.''.

4. При заболевании лейкозом у крупного рогатого окота в крови увеличивается содержание' тьу -I положительных клеток, определяемое о помощью МКА ИКО-Ю.

Научная новизна. Проведена характеристика вновь полученных МКА. ИКО-101 к антигену Сг4 крысы и МКА ИКО-ЮЭ и ИКО-112 к 1а-подобным антигенам крысы. Проведено сравнение этих моно-клональннх антител с их зарубежными аналогами. Впервые установлено, что МКА серии ИКО, направленные к дифференцаровочным антигенам лейкоцитов человека, взаимодействуют о клетками лабораторных и сельскохозяйственных аивотных. Обнаружена неизвестная ранее повышенная экспрессия Й1У-1 антигена на клетках крови крупного рогатого скота, больного лейкозом. Показано, что МКА ИК0-Ю1, ИКО-ЮЭ и ИКО-112, направленные, к антигенам крысы, а также другие МКА серии. ИКО, выявляющие диффаронцлро-вочные антигены лейкоцитов человека, могут быть попользованы для имиунофенотипирования клеток лабораторных и оельскохозяйг-ственных животных.

Научно-практичоокоа значение. Представленные в работо МКА ИК0-Ю1, ИК0-109 а ИКО-112 против антигенов красы в сочетания ■ с другими охарактеризованными здеоь МКА оерии ИКО,' реагирующими с клетками крысы, а также МКА против дифферэнцировочнык антигенов человека применима для оценки состояния Т- и В-плеточ-' ного звеньев идаунатета лабораторных животных.

Результат работы позволят использовать МКА серии ИКО для исследований в области иммунологии, радиобиологии и трансплантологии -в модельных системах на экспериментальных животных.

Наличие МКА серии ИКО, взаимодействующих с клетками сельскохозяйственных животных позволит приманить их для йммунофвнс-тигтирования клеток животных, а также создаст современную мето-дйчзскугэ базу для разработки иовкс методов оценки состояш:я

клеточного ашуяятвта у сольскохозяйствешшх животных в условиях осложняющейся санитарной я экологической обстановки.

Апробация работы. Подученные результаты доложены на реоф* бликанской конференция "Интерлейкины в другие медиаторы в кЛЙ~ ничесяой ямь^гнологиа" (г. Москва. £989 г.), на республиканский научно-практической конференции "Экология и им^нитет" (г. Ш Новгород. 1990 г.).

Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторной научной конференция Нижегородского научяо-исоледова-тельского института эпидемиологии и микробиологии с участием членов Ученого Совета 8 декабря 1992 г.

Объем и структура диссертации. Работа в объеме 125 листов машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных данных, обсуждения, выводов и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и II таблицами. Библиографический указатель ыигочает 210 источников литературы ( 36 отечественных и 174 иностранных авторов ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Моноклопалыше антитела. В работе была использована панель МКА отечественного а зарубежного производства, представленная в таблице I,

Очистка и мечениз баотином. Очистку МКА проводили с поио-щью сульфата аммония и белок-А-сефарозы. Чистоту МКА контролировали электрофорезом в ПААГ в присутствии додоцилсульфата натрия, йзотип иммуноглобулинов определяли методом радиальной имг^нодиффузни по Оухтерлони.

Таблица I.

Моноклональныэ антитела, использованные в работе

ш Антигенная специфичность Изотип Клеточная специфичность

ИК0-Ю9 Антигены II класса сиотемы гястосовмас-тимости крысы {КТ-1А) 1й01 Часть В-клеток,моноцитов, активированные Т-клетки крысы. 1

ико-ш ХвйЗа

0X3 л

ККО-1 Антягеш II класса систем гистосовмести-моотя человека (Н1А--Б2) ГБОЗ Часть &-клеток,моноцит ов , актигеиро вашто Т-клатки человека.

ЖО-2 1в01

ИКО-8 — 1301

ЛК0-Ю1 •' СМ IgGI Т-хелперные/йндуктор-ные клетки крысн.

МА3368 Н.Т.+

Ш-Ю ТЬу-1 ЗДЛ Тямоциты человека и яивотпых.

ИКО-12 СП22 1801 Зрелые В—клетки (на мембране).

Ж0-20 • сшз 1ес2а Лимфоциты, предшественники ,активарован-• ные клетки.

ИКО-Г-2 СВ15 Хй02а Гранулоциты, часть моноцитов.

+ - а.т. - не тестировано.

Очащашше ЫКА. бистяшстсозаял з-окоасукциптядиым зфяро,м бяотаиа» растворашш: в ^мх'моул^схсздо.. !Ш. и о$зр биотипа смвЕавалп п объешси сооггошшш 10:1, шщубзрзвада с перзпэша-ваняом I час к дяелпзогилн против фззрасЕзерз» мйзфзрапиого

фосфатами.

МКА, моченные флюоресцеинизотиацианатом (ФИТЦ), получали конъюгацией очищенных антител с ФИТЦ при pli 9,0 из расчета 12,5 мкг. ФИТЦ на I мг. белка. От несвязавшегося ФИТЦ освобождались с помощью гель-фильтрации на сефадексе G25.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ). РИФ проводили в двух модификациях: в пробирках и на клетках, прикрепленных к стеклу.

Постановка БИФ на предметных стеклах. В лунки на стекле fi

вноси™ ?'Ю клеток- и инкубировали их с МКА в течение 30 мин. при 20°С. После отмыва в среде Хенкаа клерки окрашивали F(ав)^ фрагментами ФИТЦ-меченных антител к иммуноглобулинам мыши в течение 30 мин. при 4°С. После отшва от вторых антител в лунки вносили 50#-ннй глицерин на физрастворе и покрывали покровными стеклами. Количественной содержание антиген-положительных клеток определяли путем расчета 200 клеток в люминесцентном микроскопе "Люмам И-3".

с

Постановка РИФ в пробирках. В центрифужных пробирках 2*10° клеток инкубировали.о 50 мкл. МКА в течение 30 пин, при 20°С, затем дважды отмывали средой Хенкса и инкубировали в течение 30 мин. при 4°С с 50 мкл. раотвора F(aB^-фрагментов или изо-тип-специфичеокой сыворотки, меченной ФИТЦ или фикоэритравом. После двукратного отмыва средой Хенкса клетки ресуспендирова-ли в физрастворе, содержащем I?» формалина. Затем , используя проточный цитофлюори^етр "Paosoan", определяли содержание ап-тигвн-положительных клеток.

Конкурентное ингибирование связывания МКА» В экспериментах по блокаде связывания МКА склетками клотгаг предварительно обрабатывали раствором МКА в насыщающей концентрации. После инкубации в течение 30 мин. и двукратного отмывания к клеткам

. - Э -

добавляли вторые МКА, меченные ФИТЦ или фикоэритрином. В качос-тве контролзй служили матки, обработанные первыми МКА, с лос-ледувдим проявлением реакции ФИТЦ-меченными Кав^-фрагмантами антител к иммуноглобулинам мыши, а также клетки, обработанные ФИТЦ-меченными вторыми МКА.

Проточно-цитофлюориметраческий анализ. Экспрессию антигенов' на клетках учитывали на проточном цитофяюориметре ^асзсап " (Beotoa Diokinsoa). Анализ реакция при ее постановке на пуле цельной крови проводили с использованием гейтов "лимфоциты", "гранулоциты", "моноциты" на основании комбинации светорассеяния и размера клеток. Анализ данных, полученных с помощью проточно-. го цптофлюориметра "Faoscarf', проводился с использованием программ t'aoacan " и "iaint-a-Qate ". Статистическую обработку результатов ( определение среднего значения, ораднего квадратичного отклонения, статистически значимой достоверности результатов) проводила о использованием программы " stateP. Рисунки выполнены с помощью программы "Boeing graph".

Реакция бласттрансформации опленоцитов в ответ на конкана-валин А. Клетки в концентрации 2*10® кх/ил. инкубировали в при--оутствиа Со а А (Змкг/мл.) и последовательных разведений МКА. В контрольные лунки МКА не добавляли. Через 20 часов в лунки добавляли меченный тритием метялтимидин. Затем спустя 24 часа на ß -сцинцалляционном счетчике (Beokman) регистрировали включение %-тимидана в ДНК контрольных и обработанных МКА сплёноцитов.

Исследуемые клетки. В работе были использованы клетки периферической крови, тииуса, селезенка, лимфоузлов и костного мозга мышай а крыс; клетки периферической крови, тимуса, селезенки кроликов, собак, коз,свиней, овец и крупного рогатого скота (КРС). Кроме того, исследовала мононуклаараые клетки крови пораженного лейкозом КРС о Наличие лейкоза у KFC оценивала по повышенно^

лейкоцитозу(свыше 10 тыс. лейкоцитов в мл.) и по наличию антител к вирусу лейкоза КРС, определяемому в реакции имадунодиффузии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Моноклоналыше антитела ИК0-Ю9 и ИКО-112 против 1а-антигенов крысы.

Гибридомы, продуцирующие МКА Ж0-Ю9 и'ИКО-112, были получены при слиянии клеток миеломы РЗХ63Ае8.653 со спланоцатами мыши, ионизированной лимфоциташ крысы. Тибридома ИК0-109 проду-дтг'ровала МКА, относящиеся к подклассу, гибридома ИКО-112 -иммуноглобулй.ш а2а подкласса.

Обнаружено, что МКА ИК0-Ю9 и ИКО-112 реагируют с лимфоцитами пор1феричаской крови, моноцитами, пар1тонеалъными макрофагами и сшюноцитамп хсрыс линии ^Iiвiaz■ (табл.2)._

Таблица 2. -

Взаимодействие МКА. ИК0-Ю9 и ИКО-112 с клетками крыс линии УПвЪаг.

Содержание антгтен-полоЕительных клеток {%)

Тип клеток

ИК0-109

ИКО-112

Микроскопия Цитофгаоорим. Микроскопия Ця'тофлюорпм.

М*т

№-т

Н±т

М-т,

Лимфоциты 8 32,4*4,5 6 16,2*2,6 7 35,8*8,6 4 21,1*5,0

Моноциты 5 31,3*8,6 H.T.* 5 20,9*7,1 н.т.

Макрофаги 3 18,7*6,6 н.т. 3 22,5*4,5 н.т.

Гранулоци ты 3 б,4*3,2 н.т. 3 5,7*1,8 н.т.

Эритроциты ■ 7 0 7 0 7 0 7 0

Тимоциты н.т. 7 8,4*3,3 н.т. 7 6,6*2,6

Сшшноцятн н.т. 13 20,7*4,8 н.т. II 22,1*2,9

Костный мозг н.т. . 5 6,2*1,7 н.т. 5 10,3*5,2

Лимфатический н.т. 4 8,6*2,9 н.т. 4 8,2*3,1

узол

л

к - н.т. - не тестировали.

. - II -

Проведено сравнение характера взаимодействия МКА ИК0-109 а ИКО-112 о МКА 0X3, направленными против мономорфной детерминанты антигенов II класса системы гистосовместимости крысы. Гистограммы распределения лимфоцитов, тамоцитов и ошшноцитов, окрашенных этими антителами не отличались от гистограмм распределения клеток, окрашенных МКА 0X3, направленных против моаоморфццх Га-белков крысы.(рис.1). ,

¡00-109 . ИКО-112

Ряо.1. Профили имцунофлюоресценции лимфоцитов, тамоцитов и спланоцатов крысы, охране иных МКАИК0-Ю9, ИК0=112 а 0X3.

МКА 0X3 блокировали связывание со спленоцитами крысы биотипа ля ро ванных МКА ИК0-Ю9. Это указывает на то, что оба МКА распознают тот же самый ила близко расположенные эпитопы антигенов XI класса системы гастссовмеотамоота крысы. МКА ИК0-Ю9 я ИКО-112 так?.о бсокароваяз связнваииэ со спдоноцатаыя биотяналироаапных ■МКА ИКО-1 против человеческих шл-вн антигенов.

- 12.- ,

ЛЕСА ИК0-ДО9 а ИКО-112 блокировали пролиферации спланоцитов крыса на коиканавалин-А, что также характерно для МКА против 1а-белков.

Все это указывает на направленность МКА ИК0-109 и ИКО-112 к антигенам гистосовместимости II класса.

Реактивность ИКА ИКО-1, ИКО-2 и ЙКО-8 против ша-ш антигенов человека с клетками животных.

Наш было исследовано взаимодействие с клетками животных ' .МКА ИКО-1, ИКО-гй и ИКО-8, направленных к.кьА-ш антигенам чело-

N

века. С это-х целью были использованы МКА, напрямую меченные ФИТЦ для исключения связывания антител с иммуноглобулинами мыши, которые присутствует аа В-клетках. '

МКА ИКО-1 взаимодействовали в прямой реакции иммунофлюорес-цонции с клетками периферической крови и селезенки и не реагировали с тимоцитами мышей линии ВАЬВ/с (табл.З).

МКА ИКО-1 также взаимодействовали с клетками крыс линии к±а-*аг , выявляя 20,0*2,2% антитеа-положитольных лимфоцитов, 22,4* 4,5% сшшноцитов, а также 9,5% клеток лимфоузлов и 10,4$ клеток костного мозга. МКА ИКО-1 не реагировали с тимоцитами крыс. Характер распределения ИКО-1-положительных клеток у мышей и крыс был сходен с характером распределения ИК0-1-положительных клеток у человека.

Для характеристики ИКА ИКО-1 был использован метод конкурентного ингябирования. Было обнаружено, что МКА ИКО-1 блокируют связывание МКА ИКО-1 ос спленоцитами крысы на 90%, МКА ИК0-Ю9 на 72,3? и МКА ИКО-112 на 72,6^, Это свидетельствует о том, что все »ти антитела распознают один и тот же или близко расположен-ныо эштопы 1а-антигевов крысы (рис.2).

Рис. 2. Блокада связывания биотинилированных МКА ИКО-1 со сплзноцигаш крысы, предобработашшми МКА ИКО-1, ИК0-109,ИК0-112. Ось абсцисс - количество клеток, ось ординат - интенсивность флюоресценции. I - контрольные спленоциты; обработанные страптавидином-ФИТД; 2 - спленоциты, окрашенные ' ФИТЦ-меченшши МКА ИКО-1; 3 - клетка праинкубврованы с -ИКО-1 и окрашены ФИГЦ-вдченныма ИКО-1; 4 - клетки проинкубированы о ИК0-Ю9 и окрашены ФИТЦ-мэченными ИКО-1; 5 - клетки проинкубированы с ИК0-П2 и окрашэны ФСТЦ-ме-пешымя ИКО-1.

ЫКА ИКО-1 взаимодействовали также с клетками других исследо-аанккх тво:пшх (табд.3).

Таблица 3.

Реактивность МКА ИКО-i против Hla-DH антигонов человека с ююткаш животных.

Содержание антиген-положительных клеток {%)

Животные Мононуклеарные клетки Тимоциты Спленоциты

» М*щ а Ы*т п М*га

Мыши БАьВ/с 6 12,5*3,1 3 0 6 44,9*12,8

Крысы И1а1;аг 4 20,0*2,3 4 0 • 6 22,4*4,5

Свиньи 20 19,1*0,9 3 0 4 0

Овцы 4 25,0*9,4 4 0 Н.Т.*

Козы 3 19,5*2,7 3 0 2 21,4

Крупный ро- 20 0 3 0 Н.Т.

гатый скот

Кролики 9 0 4 0 3 0

к - н.т. - не тестировали.

МКА ИКО-I взаимодействовали о мононуклеарными клетками периферической крови свиньи, овцы и козы. МКА. ИКО-I не взаимодействовали о тимоциташ исследованных животных.

МКА ИКО-2 тестировали в РЩ о клетками мышей и крыо. МКА выявляли 15,2$ спленоцитов и не реагировали с тимоциташ мышей линии BALB/c. МКА ИКО-2 окрашивала 23,0% спленоцитов и не реагировали с тимоциташ крыо линии wistaг.

Было исследовано взаимодействие МКА ИК0-8 с клетками мышей, крыс, кроликов л некотг та •сельскохозяйственных животных (табл.4). МКА ИКО-8. выявляли 23,0^ антиген-положительных клеток среди опленоцитов и не реагировали с тимоциташ мышей линии BALB/c.

МКА ИК0-8 окрашивали также у крыо линии Wlstar 16,8$ спленоцитов а не реагировали с тимоцатама.

ИКО-8 реагировали с 18,3$ мононуклеарных клеток крови

семья в 23,0$ монокуклааршгх клеток крова овца. Тимоцитн исследованных животных на несет антигена, выявляемого МКА ИКО-8.

Таблица 4.

Реактивность-МКА ИКО-8 против Ньа-Ш антигенов человека о клетками животных;

Содержание антиген-положительных клеток (%) Животные Мононуклеарные клетки Тимодаты Спленоциты

п И±гц а п М-га

Мыши ВАьВ/с н.т.й 2 0 , 2 23,0

Крысы Мвгаг н.т. 2 о 2

Свиньи 12 18,3±4,9 4 0 н.т.

Овцы 4 23,0^6,2 4 0 н.т.

Кролики 9 , 0 /' 4 0 3 0

Крупный ро- 16 0 4 0 н.т.

гатый скот

к - н.т. - не тестировали.

Суммируя подученные данные, можно заключать, что МКА ЖО-1, ИКО-2 и ИКО-8 сходным образом взаимодействовали с клетками мышей и крыс, а также некоторых сельскохозяйственных животных. Характер распределения антигена, выявляемого этими антителами, не отличается от распределения его у человока. Это свидетельствует о том, что эти антитела также как у чоловека направлены к мономор-фпой части Ха^подобных антигенов животных.

Моноклоналыше антитела ИК0-Ю1 против антигена СЩ к рыси.

Гибридома, продуцирующая МКА ИК0-Ю1 была получена при слиянии спленоцитов мышей линйа ЕАЬЗ/о, иммунизированных ли.ч$оцвтамя крысы, с клетками миалош РЗХ63А8.8.653.- МКА ИКО-Ю1 принадлежат

к 1в01 подкласоу. В РИФ о клетками крысы линии Шв1ят МКА И1С0-101 взаимодействовали с лимфоцитами, тимоцитами, спленоцитами, клетками костного мозга и не реагировали с клетками лимфоузлов, грану лоцитами, моноцитами и эритроцитами (табл.5).

МКА ИК0-Ю1 оказались близки по спектру взаимодействия с клетками крысы к МКА МА3368, выявляпцим &>4 антиген Т-хелперов крысы. Количество антиген-положительных клеток, выявляемых этими антителами статистически значимо не различалось (табл.5).

Таблица 5.

Реактивность МКА ИК0-101 и МАБ368 с клетками крысы.

Содеркаша антиген-положительных клеток (.%)

Микроскопия Проточная цитофлюориметрия

п ИН0-Ю1 • И*« ' а ИК0-Ю1 мгта п МА3368 М*т

Лимфоциты в 36,9±6,4 9 25,5±4,2 I 37,5

Моноциты 4 5,7±1,6 3 2,7±1,5 н.т.*

Макрофаги 3 6,6*2,3 н.т. в.т.

Гранулоциты 4 3,0*1,5 2 0 н.т.

Эритроциты 8 0 13 0 н.т.

Тимоциты н.т. 13 68,5*3,8 3 75,3*5,6

Спленоциты н.т. 10 13,8-1,9 2 21,640,5

Костный мозг н.т. 8 9,9*5,2 н.т.

Лимфоузлы н.т. 3 5,0*2,3 • н.т.'

* - н.т. - не тестировали.

Гистограммы распределения клеток, окрашенных МКА ИКО-101.не отличались от гиотограмм распределения МА3368-положительных клеток. На рисунке 3 представлены гистограммы ша.унофлворасцеиция снлепоцитов, тимоцитоа и лвафоцахов красы, окракзшшх МКА ИК0-101 а М№58. . .

Сеятяка

Тщго

йшфогатн кров*

Рас. 3. Профиля иммунофлюореоценции спленоцитов, тимоцитов и лимфоцитов крысы, окрашенных МКА ИК0-Ю1 я МКА МАэ368. Ось абсцисс - количество клеток, ооь ординат - интенсивность флюоресценции, а - Клетки окрашены ФИТЦ-меченной сывороткой; б - клетки обработаны МКА ИК0-101; в - клетки окрашены МКА Г.1Аз368.

В реакции бласттрансформациа выявлено ингибирупцее дозозави-симое действие МКА ИК0-101 на включение тратий-мэченного тяни дина в сплвноцаты крысы.

Для дальнейшей характеристики МКА ИК0-101 использовали метод конкурентного ингибировапая. Обнаружено, что предобработка тимоцитов МКА МАэЗбв приводила к полной блокаде связывания с этими клетками МКА ИКО-ЮГ»

Методом двойного мечения клеток обнаружено, что среди тимоцитов крысы МКА ИК0-Ю1 и МКА МД3368, направленные к антигейу СМ крысы, выявляли одну и ту же популяцию клеток.

Исходя из получегнных результатов, можно сделать вывод, что-МКА ЦК0-1С1 реагируют с тем же самым или близко расположенным

- 18 -

»питопом антигена Св4 крысы, который определяется МКА МА3368, направленными против крысиного антигена Со4.

Моноклональные антитела ИКО-Ю. МКА ИКО-Ю против 5ЙЦГ—I антигена были получены при иммунизации мышей линии ВАьВ/с клетками эмбрионального тиьуса человека. Они имеют изотип 1в&1. Хотя большинство тимоцитов у лвдей являются тьу-1 отрицательными, обнаружена небольшая поцуляция клеток (0,2*10,0$), которая, несет »тот антиген. Человечеокий тьу-1 антиген является гомологом тьу-1 антигена мыши.

Наш было исследовано взаимодействие МКА ИКО-Ю с клетками различных животных (табл.6).

Таблица 6.

Взаимодействие МКА ИКО-Ю о клетками животных..

Содержание антиген-положительных клеток (

Животные

Мононуклеарные клетки Тимоциты п М*т а

М*т

Сшгеноциты п

Ы*т

Мыши ВАьВ/с 2

Мыши АКБ -

Крысы «1в*аг 4

Крупный рогатый 19 скот

Свиньи 12

Овцы 4 Кролики

Козы 6

Собаки 3

Кошки 3

Морские сванки 3

87,9

н.г.*

23,0*7,0 23,3*3,1

21,6*4,3 24,5*2,9 н.т.

О

О

о о

4 62,3*4,6

2 50,0*0,1

5 61,9*1,6

н.т.

н.т. н.т.

3 61,4*7,1

6 20,3*3,0

н.т. 3 О 3 О

4 47,1*4,8

4 57,6*0,4

4 36,4*4,0

3 56,8*10,5

3 О н.т.

2 18,1

4 40,0*5,0 3 О

3 О

3 0

* - н.т. - ее тестировали

В прямей К©, рагастригегюй о поцощьз проточного цдтофию-рзютра Paosoeute гетвладо 07,9$ ИК0-Х0-»полозатвдш1х дпгфоютов» 62»з£|,б2 47,Х£4«£$ сшюпоцптоэ а 47,5^ шттоз .шш»

фсузгоз нгга лзеяя 3&i3/o0 ffiíá ККО-Ю рзагаровгда о ихаяазт иа-сэй ллппя определяя,» ссотвзтстаоадо© 50в0£ шггатзз-годс-:?'-Tojmvjx .гаимшов а 5-7,сшюпоцятопо Поскольку 12223 ляпзя В&1З/0 яазвтся Thy-I.I пол<тяолъяша4 а шга гяшга АКн -шу»!^» иаг^таяшзя, исто сдала». швод» тао Ш'Л ИКО-ХО вигяляс? сбэ шиши íhy—I аятягова икаой,

ШСА ÍSQ-IQg, штезняш ш, реатяровахи такаэ о 23е0«-7,03 лзгз» фоцзгозд 62,9£ls6$ зшгоцзгов* 36»0±4Я0£ сшганоцигов, в 78„5£ 8210508 £31í$0y3S0B Я О 50ЕЗЗТОЗ, КОСТНОГО газта Крш ЛПИИ Wis-tar (ряеЛ),

PaGo 4в Провала шгцупофгоорзешнцза аштов приза» онрапзз- -BUZ Шк ÍSCO-IOe

. g «. лаафидалц 2 - ташцата! 3 - сшгоаоцитщ 4 ~ клэггз лахфзузяа^ 5 - еяотез еоотпого шага»

В Й5Э о вопожьзоваотец яшааасцзздвого микроскопа "Дшаи И-3" ЖА ИКО-Ю быта протоотаровавы ва взалиодоЗотвяа с рвдоа яиггах завотвиГв UKA ИКО-Ю рыгота 23,3Í3»Ií мопоцукдвараах моток «pona а 56,8^10,5$ салооодатоа крушюто рогатого скота. Обнаружено, что 20,8^-3„3¿ розотвообродуведах влетов кропа арушюго рогатого скота

- 20 -

были ИКО-Ю-положительными.

Сходноо количество антиген-положительных клеток МКА ИКО-Ю выявляли среди мононуклеарных клеток периферической крови свиней (21,6±4,3$), а также ореди розеткообразующих клеток крови свиней (24,0£). Взаимодействия МКА ИКО-Ю со спленоцитами свиньи не было выявлено.

Кроме того, МКА ИКО-Ю взаимодействовали с тимоцитами хсро-лакон, с тимоцитами и спленоцитами коз. Однако не было выявлено взаимодействия ЫКА ИКО-Ю с мононуклеарными клетками крови коз. с мононуклеарными клетками крови, тимоцитами и спленоцитами собак, кошек и морских свинок.

Таким образом, выявлено, что из десяти видов исследованиях животных МКА ИКО-Ю давали реакцию с клетками семи из них. Достаточно высокая частота взаимодействия МКА ИКО-Ю о клетками различных животных является, по-видимоцу, следствием филогенетической консервативности тьу-1 антигена, а детерминанта, определяемая МКА ИКО-Ю, является общей для человека и многих животных.

Взаимодействие МКА ИКО-12, ИК0-20 и ИКО-Г-2 с клетками животных.

МКА ИКО-12 направлены против антигена Сс22 человека, специфичного для В-клеток. При исследовании взаимодействия МКА ИКО-12 с клетками животных было выявлено, что антитела окрашивали 23,7^ 6,3% антиген-положительных клеток среди мононуклеаров крови крупного рогатого скота. Тимоциты крупного рогатого окота не давала реакции о антителами. Розеткообразупцие клетка, выделенные из периферической крови коров, также не реагировали о МКА ИКО-12. Это свидетельствует в дользу направленности МКА ИКО-12, так как и у человека, к В-клеточноцу антигену. МКА ИКО-12 взаимодействовав также с мононуклеарными клетками периферической крови коз л сшавй (табл.7). С тимоцитеш этих животных .МКА ИКО-12 яз рва-

гировали. С мононукле арными клетками и тимоцитами лабораторных мышей, кроликов и овец МКА ИКО-12 не взаимодействовали.

Таблица 7.

Взаимодействие МКА ИКО-12 с кпдткаш животных.

Содержание антиген-положительных клеток (%) Животные Моноцуклеарные клетки Тпмоциты

п , М-и п М*т

Мыши 5 0 5 0

Кролики 9 0 3 0

Крупный рогатый 16 23,7*6,3 7 0 4

скот

Свиньи 3 14,2*4,2 4 0

Овцы 2 0 2 0

Козы 2 26,0 2 0

Таким образом* МКА ИКО-12 обнаруживали положительную реакцию с монопуклеаршиа клетками трех из шести видов тестированных пилотных и пи в одном случае не взаимодействовали с тимоцитами.

МКА ИК0-20 направлены против Сп38 антигена человека я взаимодействуют как оо зрелыми клетками иммунной системы, так к с их предшнственниками. У животных МКА ИК0-20 реагировали с моноцукле-арными клетками шести из семи исследованных видов животных. В непрямой РИФ МКА ИК0-20 выявляли 20,2-2,3% антиген-положитолышх клеток среди мононуклеарных ¡слеток мышей, 20,7*4клеток крупного рогатого скота, 10,5*0,92 - свиньи, 23,0*3,7;I мононуклеар-ных клеток овцы, 23,5$ клеток козы и 41,4*8,7£ моноцуклчарных клеток собаки. С клеткам кроликов МКА 1ГК0-20 но реагировали. Тимоциты исследованных ~яеотннх такие но давали положитолъноП реакции.

МКА ИКО-Г-2 выявляют антиген 0в15 (Х-гаптвн), гкспрсссиропзд-

- 22 - •

нкй у человека на граяулоцитых и, в меньшей степени, на моноцитах» При исследовании экспрессии антигена, выявляемого МКА ИКО-Г-2 было установлено, что он обнаруживается на мононуклеарных клетках периферической крови всех тестированных животных (табл.8).

Таблица 8.

Взаимодействие МКА. ИКО-Г-2 с клетками животных.

Содержание аатиген-полояятольяых клеток ($)

Кивотаыа Моноцуклоарнне клетка Тимоциты

п М±и п Ы*и

Мыши 2 20,4 3 0

Кролики 2 • 26,0 4 0

Крупный рогатый 30 33s5*3,3 2 0

скот

Свиньи 4 ■ 20,4*9,3 3 0'

Овцы 3 19,0*4,6 3 0

Козы 2 28,7 2 0

Собаки 2 19,5 н.т.й

к - н.т. - на тестировали.

В РИФ МКА ИКО-Г-2 вшзляли 33,5-3,3$ антиген-полояпталышх мононуклеарных клеток крупного рогатого скота (КРС). Тдмоциты КРС не давалц полоаитвльной реакции с антителами, однако, 26,7* 4,9$ розеткообразувдих клеток были антиген-долокит е лышм;] * Это позволяет предполагать, что у КРС Х-гаптен вкспросоирован среди мононуклеарных клеток но только на моноцатах, но и на части лимфоцитов.

МКА 'ИКО-Г-2 взаимодействовали также с мононуккеарными югет-хсаьах свиней, однако на вшшшлл антагок-полозштольних клеток среда рогетхообразумои:: клеток. С ткшщтамл свиней МКА ИКО-Г-2 ::& з»а?«рошя». Зауегастрярзтаио взэдкодействяо.ИКО-Г-2 с моно-етклеит-:,. мл клетками коотч лабок-ггорних шлей, кролигюв, овец,

-23-

коз в собак. Реакция МКАИКО-Г-2 с тимоцитами исследоваяиых животных отсутствовала.

Ищунофанотипирование клеток крови крупного рогатого скота, пораженного лейкозом, Моноклональныа антитела ИКО-Ю, ИКО-12, ИК0-20 я ИКО-Г-2, взаимодействующие о мононуклэарными клетками крупного рогатого скота (КРС), были исследованы ваш для имцунофенотяпирования клеток крови коров, больных лэйкозом.

Было исследовано три группы животных: контрольная группа -здоровые животные; вторая группа - животные, инфицированные вирусом лейкоза, но без признаков лейкоцитоза; третья группа -животные с развитой формой лейкоза, ямсвдие положительную реакцию на антитела к вирусу лейкоза КРС (ВДКРС) и содержащие более 10 тыс. «л/ил. лейкоцитов. В РИФ,регистрируемой с помощью люминесцентного микроскопа "Люмам И-3", было обнаружено, что содержание ИКО-Ю-положителышх клеток у инфицированных животных увеличено в 1,5 раза, а у больных - в 2 раза по сравнению со здоровыми животными (рис.5).

12 3

1 2 £

1 г з

Ипо-ю ■ ико-12 ико-го ико-г-г

Рис.5 Взаимодействие ЖА. серии ИКО с мононуклеарными клетками

крупного рогатого скота.

Ось ординат - содержание антиген-положительных клеток (%). I - контрольная группа; 2 ~ инфицированные ВЛКРС вотине; 3 - животные, больные лэйкозом.

-24-

У большие животных при втом' наблюдалось в 1,5-2 раза более высокое содержание ИК0-Ю+ Е-розеткообразупцях клеток, а также ИК0-10+ клеток« содержащихся во фракции, обедненной Ег?Р0К. Ис* следование взаимодействия МКА.ИКО-12, ИК0-20 и ИКО-Г-2 с клетками всех трех групп животных не выявили статистически достоверных различий.

Было проведено изучение характера взаимодействия МКА. ИКО-Ю . ИК0-Х2, ИК0-20 и ИйО-Г-2 с мононуклеарными клетками коров, содержащихся в течение 9 месяцев в обычных условиях животноводческого хозяйства. В конце опыта животные были разделены на две группы: первая - животные, оставшиеся здоровыми; вторая группа - оказавшиеся инфицированными ВЛКРС. Статистически достоверных различай в содержании ИКО-Ю* клеток у втих двух групп животных выявлено на было. Однако, в группа инфицированных животных отчетливо проявилась тенденция к повышению содержания ИКО-ХО+ клеток, которое увеличивалось с 20,=1*2,6# в начале до 28,3*2,6$ в конце опыта.

Таким образом, ями/унофанотипирование клеток крови КРС показало, что при развитии лейкоза у коров увеличевается содержание клеток, несущих тьу-1 антиген, выявляемый МКА. ИКО-Ю* Нарастание ИК0-10+ клеток вкрови КРС идет параллельно с появлением антител к ВЛКРС и может быть использовано для динамического наблюдения за состоянием животных при развитии лейкоза,

выводы

1. Охарактеризованы МКА ИК0-109 и ИК0-112 против антигенов гистосовмеотимости II класса крысы. МКА ИК0-109 и ИК0-П2 ингя-бируют реакцию бласттраасфоршдаи лимфоцитов на конканавалин-А.

2. Охарактеризованы МКА ИКО-Ю1 против антигена С3>4 крысы. Жк выявляют тот же ила блявкай вантоз, что и МКА МА3368 претив

. - 25 - :

антигена Cd4 крысы. МКА ингибируют реакцию блаоттрансформации спленоцатов на конканавалин-А.

3. Обнаружена зкспреосия дифференцаровочных антигенов лейкоцитов человека на клетках крови, тицуоа, селезенки мыши,; крысы, свиньи, кошки, собаки,козы и крупного рогатого скота.

4. МКА ИК0-1, ИК0-2.И ИКО-8, направленные к HIA-DR антигенам человека, выявляет Ia-подобныз антигены на' клетках мышей, крыо, свиней, коз и крупного рогатого скота.

5. МКА ИКО-12 против антигена CB22, ;МКА ИКО-20 против антигена СШ8 и МКА ИКО-Г-2 против антигена CDI5 взаимодействуют с моноцуюгеарнымя клетками и спленоцитами рада видов животных.

6. При развитии лейкоза у коров! увеличивается содержание клеток, несущих " ®Ьу-Г антиген, выявляемый с помощью МКА ИКО-Ю. Нарастание ИК0-Ю+ клеток зз ^.рови крупного рогатого скота идет параллельно, о появлением антител к вирусу лейкоза крупного рогатого окота и может быть попользовано для динамического наблюдения за состоянием животных Ира развитии лейкоза.'

7. МКА против дифференцаровочных антигенов человека могут попользоваться для нмцунофенотипарования клеток животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертация.

1. Короткова О.В., Барышников А.Ю., 1упицын H.H., ЧимишкянКЛ. Кострыкина В.Н., Овумян Г.Ш., Сандова О.М.,Новиков В.В, Монокло-нальные антитела KKQ-I0 К антигену ïby-I// Эксперпм. онкология.-I989,-T.II,J{2.-C.3o-35.

2. Сандова О.М., Новиков В.В. Межвидовая перекрестная активность моноклональных антител к антигенам именной систсмы// Б сб. "Интерлейкины и другие медиаторы в клинической иммунологии". -M.-I989.-C.162-164. ,

3. Сандова Ü.M. Поиск моноклональных. антител перекрестно реагирующих с клетками животных// В Об; "Физиология и молоку-

- 26 -

лирная биология изкрооргаяизмов".-Горький. -I988.-С.97-102.

4. Сандова О.М., Падгана A.B., Новиков В.В. Взаимодействие МКА ИКО-Ю я ИКО-Г-2 о аяотками крови крупного рогатого скота// В сб. "Иммунология я биотехнология".-Горький.1989.-С.99-IQ2.

5. Сандова O.M.f Илларионова М.Ю.»Новиков В.В. Повышенное содержание Thy-I положительных клеток в крови больного лейкозом крупного рогатого скота/Дезисы докладов Всесоюзной конференции "Экология и амкунятет".-Горький.-1990.-С.154-156.

6« Сандова O.U., Илларионова M.K3v, Куцещсо H.H. Исследование имцунофенотипа клеток крови животных// В сб. "Новое в практике лабораторных исследованиЙп.-Н.Новгород.-1991.-С.79-83.

7. Новиков В.В., Сандова О.М., Барышников А.Ю. Взаимодействие МКА серия ИКО с клетками животных// С-х. биол.-1991,-№2,-С.126-130.

* ,

8. Савдова.0*М,, Фролова S.A., Барышников АД)., Новиков В.В. Моноклональные антитела ИКО-IOZ против антигена Col хелпарных/ индукторных Т-лиыфоцитов крысы// Иммунология.-1993.-Ж>.-С.39-41.